CN106048089A - 一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的ssr标记及其应用 - Google Patents

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许向阳
李景富
赵婷婷
姜景彬
刘冠
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Abstract

本发明公开了一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记及其应用，所述SSR标记的引物为：上游引物T5‑F：5′‑CAATCAATCGATGCACAAAACACC‑3′；下游引物T5‑R：5′‑GACTGACTGCATTGGATTTGGCTT‑3′。该标记在CLN32120a‑23中可以扩增出580bp的条带，在Moneymaker中可以扩增出640bp的条带，在F1中可以扩增出上述2条条带，标记结果与田间鉴定基本一致，证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料，是与抗番茄黄化曲叶病毒病基因ty‑5紧密连锁的共显性标记。分子标记检测与田间检测结果吻合率达90％。该标记可用于番茄抗黄化曲叶病毒ty‑5基因的PCR快速检测，为ty‑5分子标记辅助选择育种的应用提供一定的理论和实践依据。

Description

一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记及利用SSR标记辅助选择抗TYLCV抗病品种的选育的PCR方法。
背景技术
番茄黄化曲叶病毒病作为一种新型病毒病，具有毁灭性大、病害蔓延迅速等特点，已成为威胁各国番茄生产的主要病害之一。目前，培育抗病品种仍是防治黄化曲叶病毒病的最有效方法。目前现已挖掘的抗性基因包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、ty-5等。最早鉴定出的抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)基因Ty-1源自智利番茄LA1969，其中VERLAAN等研究表明，Ty-1和Ty-3是1对等位基因，它们编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RDR)属于RDRγ类型，它有1个典型以DFDGD为主的催化结构域。Ty-1/Ty-3这对基因完全揭示了一种新类型的抗病基因。Ty-2来自多毛番茄S.habrochaites B6013，位于第11条染色体上的TG36和TG393标记间；杨晓慧等构建了Ty-2基因目的区域染色体片段内高分辨率遗传图谱，将Ty-2基因定位到分子标记UP8和M1之间，遗传距离0.4cM，Ty-2基因为完全显性遗传。JI等在智利番茄LA1932中获得1个新的菜豆金黄花叶病毒抗性位点Ty-4，并被定位于3号染色体。Ty-3和Ty-4基因的重组自交系有着较高水平的TYLCV抗性。杨晓慧等研究结果表明，只含有Ty-2、Ty-3、Ty-4基因的植株分别表现为抗、中抗和感病；同时含有Ty-2和Ty-3或者Ty-2和Ty-4基因的植株均表现抗病；同时含有Ty-3和Ty-4基因的植株表现中抗；不同基因之间的抗性表现出累加效应，含有这3个基因的材料抗病效果最好。
ANBINDER等最早发现ty-5基因来源于秘鲁番茄的TY172品系，对黄化曲叶病毒有很强的抗性，位于第4条染色体。HUTTON等发现ty-5连锁标记SlNAC1与第4号染色体上的1个隐性位点共分离。近年来，国内研究者也通过不同的遗传群体对番茄抗黄化曲叶病毒病ty-5基因的遗传规律做了一些研究，杨欢欢等对番茄6个世代进行遗传规律分析，结果表明，ty-5为隐性遗传基因。目前只有Ty-1/Ty-3被克隆。但不同抗病基因所调控的抗性机制仍然存在差异，这使得番茄黄化曲叶病毒病抗病机制的研究仍较为重要。当前国内对ty-5分子标记辅助育种的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记及其应用，利用与番茄抗黄化曲叶病毒病ty-5连锁较近的SSR标记，对抗TYLCV番茄材料进行快速准确的PCR检测，以期为ty-5分子标记辅助选择育种的应用提供参考依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记，其引物为：
上游引物T5-F：5′-CAATCAATCGATGCACAAAACACC-3′；
下游引物T5-R：5′-GACTGACTGCATTGGATTTGGCTT-3′。
上述SSR标记可用于番茄抗黄化曲叶病ty-5基因的PCR快速检测，具体检测方法如下：
上下游引物各10mol/L，DNA模板0.1mg，Taq-Mix(cwbiotech China)8μL，用无菌水补足体系至20μL，在94℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃50s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min，即得PCR产物；PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶电压5V/cm条件下电泳40min，Bio－RAD凝胶成像系统拍照。
本发明以番茄抗病材料CLN32120a-23(含ty-5基因)和感病材料Moneymaker(不含抗病基因)为试材，通过杂交、自交获得的F1、F2代，采用SSR分子标记技术筛选出一个与抗病性状共分离的共显性SSR标记。研究表明：该标记在CLN32120a-23中可以扩增出580bp的条带，在Moneymaker中可以扩增出640bp的条带，在F1中可以扩增出上述2条条带，标记结果与田间鉴定基本一致，证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料，是与抗番茄黄化曲叶病毒病基因ty-5紧密连锁的共显性标记。分子标记检测与田间检测结果吻合率达90％。该标记可用于番茄抗黄化曲叶病毒ty-5基因的PCR快速检测，为ty-5分子标记辅助选择育种的应用提供一定的理论和实践依据。
附图说明
图1为SSR标记在不同抗、感材料中的扩增条带。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记及其应用，具体内容如下：
1材料与方法
1.1试验材料
供试番茄抗病亲本CLN32120a-23(亚洲蔬菜研究与发展中心提供)和感病亲本Moneymaker(中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供)均为番茄品种稳定自交系。通过有性杂交、自交和回交，获得F1、F2代。黄化曲叶病毒由江苏农业科学院蔬菜研究所提供；用于PCR反应的试剂均购自北京华大科技生物技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1田间发病情况统计
利用网笼接种法进行病毒接种。8月中旬，将长至3～4片真叶的6个世代的幼苗转入饲养烟粉虱的温室中，每天驱赶2次烟粉虱使其与番茄幼苗充分接触，7d后将幼苗定植于温室内。发病期间不喷施任何药剂，4周后逐株调查发病情况，将病情分为0～4级：0级，无明显症状；1级，叶片只表现有黄色斑点或斑驳症状；2级，叶片黄化，比正常植株略微矮小且轻微变形；3级，植株矮化，叶片变小、卷曲且边缘黄化；4级，植株严重矮化，叶片皱缩、黄化、卷曲并导致叶片面积大大减小。0～1级归为抗病，2～4级归为感病。
1.2.2DNA提取及引物筛选
DNA提取参照蔡凌云等方法，利用CTAB法提取。番茄抗黄化曲叶病毒病ty-5基因引物序列来源于(http://solgenomics.net/)，(http://marker.kazusa.or.jp/)网站已公布的引物序列，并对选取的SSR引物进行筛选。
1.2.3SSR标记的PCR扩增
上下游引物各10mol/L，DNA模板0.1mg，Taq-Mix(cwbiotech China)8μL，用无菌水补足体系至20μL。最适反应条件：94℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃50s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶电压5V/cm条件下电泳40min，Bio－RAD凝胶成像系统拍照。
2结果
经过筛选，得到1个与抗病性状共分离的SSR标记，引物序列见表1。该标记在抗病纯合自交系P1(CLN32120a-23)中可以扩增出1条580bp的条带，在感病纯合自交系P2(Moneymaker)中可以扩增出1条640bp的条带，而在CLN32120a-23×Moneymaker F1中则可以同时扩增出580bp和640bp左右的条带(图1)。580bp和640bp 2个片段能将抗病材料和感病材料加以区分，是与ty-5抗病基因连锁的标记。
表1鉴定引物序列
3结论
该试验利用大量SSR分子标记筛选出1个与抗病性状共分离的共显性SSR标记。该标记在CLN32120a-23中可以扩增出大小为580bp的条带，在Moneymaker中可以扩增出640bp的条带，在F1中可以扩增出上述2条条带，标记结果与田间鉴定基本一致，证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合感病材料，是与抗番茄黄化曲叶病毒病基因ty-5紧密连锁的共显性标记，可以应用于分子标记辅助选择育种。
<110>东北农业大学
<120>一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记及其应用
<160>2
<210>1
<211>24
<212>DNA
<400>1
Caatcaatcg atgcacaaaa cacc 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<400>2
gactgactgc attggatttg gctt 24

Claims (3)

1.一种抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记，其特在于所述SSR标记的引物为：
上游引物T5-F：5′-CAATCAATCGATGCACAAAACACC-3′；
下游引物T5-R：5′-GACTGACTGCATTGGATTTGGCTT-3′。
2.如权利要求1所述的抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记用于番茄抗黄化曲叶病ty-5基因的PCR快速检测。
3.如权利要求2所述的抗番茄黄化曲叶病性状共分离的SSR标记用于番茄抗黄化曲叶病ty-5基因的PCR快速检测，其特征在于所述PCR快速检测的具体方法如下：
上下游引物各10mol/L，DNA模板0.1mg，Taq-Mix8μL，用无菌水补足体系至20μL，在94℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃50s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min，即得PCR产物；PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶电压5V/cm条件下电泳40min，Bio－RAD凝胶成像系统拍照。
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