CN106047880A - 抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA‑1055及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA‑1055及其应用，涉及siRNA及其应用领域。本发明所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA‑1055能高效抑制PVT1表达，有效抑制血液肿瘤细胞的增殖。对于开发新的抗血液肿瘤基因药物和提高血液肿瘤的治疗效果有重要意义。人类生存环境日益恶化，血液肿瘤(包括白血病和淋巴瘤)发病率和死亡率越来越高，已经成为影响人们健康和寿命的主要肿瘤性疾病之一。绝大多数的血液肿瘤均有PVT1表达增加，而PVT1具有癌基因的功能，因此靶向PVT1的治疗将具有比较普遍的意义，适用于绝大多数血液肿瘤，将具有巨大的市场潜力。

Description

抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055及其应用
技术领域
本发明涉及siRNA及其应用领域，具体涉及一种抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1siRNA-1055及其在制备治疗和/或预防血液肿瘤药物中的应用。
背景技术
RNAi技术是一种高效的高特异性抑制基因表达的新途径。体内外的研究已显示了RNAi技术在癌症基因治疗方面比反义核酸具有更好的应用前景。大量的研究表明，体外通过RNAi抑制肿瘤相关基因的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、生长，诱导细胞凋亡，增加肿瘤细胞对药物的敏感性。
长链非编码RNA(lncRNA)是长度超过200个核苷酸的不具有编码蛋白质功能的RNA，在调控细胞增殖和分化中发挥重要作用。许多lncRNA在器官发育和肿瘤发生中起转录调控或转录后调控作用，并在其中具有重要作用。LncRNA PVT1(plasmacytoma varianttranslocation 1)基因定位于染色体8q24[Graham M,Adams JM.Chromosome 8breakpointfar 3'of the c-myc oncogene in a Burkitt's lymphoma 2；8variant translocationis equivalent to the murine pvt-1locus.EMBO J.1986Nov；5(11):2845-51.]，PVT1在肿瘤发生发展中占有重要作用，具有癌基因的功能，在多种肿瘤(包括血液肿瘤)显著高表达[Wang F,Yuan JH,Wang SB,Yang F,Yuan SX,Ye C,Yang N,Zhou WP,Li WL,Li W,SunSH.Oncofetal long noncoding RNA PVT1 promotes proliferation and stem cell-like property of hepatocellular carcinoma cells by stabilizingNOP2.Hepatology.2014Oct；60(4):1278-90；Colombo T,Farina L,Macino G,PaciP.PVT1:a rising star among oncogenic long noncoding RNAs.Biomed Res Int.2015；2015:304208.]，并与c-Myc表达呈显著相关。进一步研究表明，PVT1通过调控c-Myc蛋白的稳定性而控制c-Myc蛋白水平，并与c-Myc协同作用促进癌细胞的增殖[Tseng YY,Moriarity BS,Gong W,Akiyama R,Tiwari A,Kawakami H,Ronning P,Reuland B,Guenther K,Beadnell TC,Essig J,Otto GM,O'Sullivan MG,Largaespada DA,Schwertfeger KL,Marahrens Y,Kawakami Y,Bagchi A.PVT1 dependence in cancerwith MYC copy-number increase.Nature.2014Aug 7；512(7512):82-6.]。
现有的研究表明PVT1与血液肿瘤的发生相关，但目前还没有PVT1 siRNA可用于肿瘤，尤其是血液肿瘤治疗和/或预防的证据。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055。该PVT1 siRNA-1055可抑制PVT1表达和血液肿瘤细胞增殖。
本发明的另一目的在于提供所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055，序列如下所示：
正义链的序列为：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3′；
反义链的序列为：5′-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3′。
所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055在制备治疗和/或预防血液肿瘤药物中的应用。
所述的血液肿瘤包括白血病和淋巴瘤。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055能高效抑制PVT1表达。
(2)本发明所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055能有效抑制血液肿瘤细胞的增殖。
(3)本发明所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1 siRNA-1055对于开发新的抗血液肿瘤基因药物和提高血液肿瘤的治疗效果有重要意义。人类生存环境日益恶化，血液肿瘤(包括白血病和淋巴瘤)发病率和死亡率越来越高，已经成为影响人们健康和寿命的主要肿瘤性疾病之一。绝大多数的血液肿瘤均有PVT1表达增加，而PVT1具有癌基因的功能，因此靶向PVT1的治疗将具有比较普遍的意义，适用于绝大多数血液肿瘤，将具有巨大的市场潜力。
附图说明
图1是转染PVT1 siRNA-1055后K562细胞中的PVT1 RNA表达量图。
图2是转染PVT1 siRNA-1055后Raji细胞中的PVT1 RNA表达量图。
图3是转染PVT1 siRNA-1055后K562细胞增殖抑制率。
图4是转染PVT1 siRNA-1055后Raji细胞增殖抑制率。
图5是流式细胞仪检测转染PVT1 siRNA-1055后K562细胞周期图。
图6是流式细胞仪检测转染PVT1 siRNA-1055后Raji细胞周期图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、实验材料和方法
(1)PVT1 siRNA的设计和合成
依据Ambion公司在网上提供的设计工具软件(参见www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)针对PVT1 RNA设计4条siRNA序列，分别命名为PVT1 siRNA-1055、PVT1 siRNA-845、PVT1 siRNA-176和PVT1 siRNA-54，同时设计无关的阴性对照序列(negative control，NC)siRNA作为对照，由上海吉玛基因化学技术有限公司合成。
PVT1 siRNA-1055的序列如下：
正义链：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3′；
反义链：5′-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3′；
PVT1 siRNA-845的序列如下：
正义链：5′-CCUGUUACACCUGGGAUUUTT-3′；
反义链：5′-AAAUCCCAGGUGUAACAGGTT-3′；
PVT1 siRNA-176的序列如下：
正义链：5′-GCUGAAUGCCUCAUGGAUUTT-3′；
反义链：5′-AAUCCAUGAGGCAUUCAGCTT-3′；
PVT1 siRNA-54的序列如下：
正义链：5′-CCUGAUGGAUUUACAGUGATT-3′；
反义链：5′-UCACUGUAAAUCCAUCAGGTT-3′；
阴性对照-siRNA的序列如下：
正义链：5′-GCUACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3′；
反义链：5′-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3′。
(2)细胞培养
将K562细胞(美国ATCC细胞库)和淋巴瘤细胞系Raji(美国ATCC细胞库)分别接种于含体积分数10％新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积分数5％CO2的培养箱37℃连续培养。
(3)细胞转染
①转染前一天，将细胞密度调至2×105/mL，然后重悬在24孔板中，每孔加入0.5mL的细胞悬液，37℃、5％CO2培养箱中培养。
②转染当天，将24孔板中每孔的细胞重悬在100μL含有体积分数10％新生牛血清的RPMI1640培养基中。
③用100μL不含血清的RPMI1640培养基稀释siRNA，siRNA的终浓度为100nM。再加入6μL Hiperfect转染试剂，混匀。室温孵育混合液5～10分钟。
④将以上准备好的混合液分别加入到细胞悬液中，摇动培养板，轻混匀。37℃、5％CO2培养箱中培养。
⑤6h后，每孔加入400μL含有体积分数10％新生牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)荧光定量RT-PCR检测转染细胞PVT1 RNA表达水平
将单纯细胞组即空白组、单纯转染试剂组即空转组、NC-siRNA组、PVT1 siRNA-1055组、PVT1 siRNA-845组、PVT1 siRNA-176组和PVT1 siRNA-54组细胞以(4～8)×105/mL起始浓度接种于24孔板，每孔接种1mL，按HiPerfect转染试剂盒说明进行转染后继续培养48h，离心收集细胞。RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco，BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript II Kit，Invitrogen，USA)反转录合成cDNA第一链。并经GAPDH基因的RT-PCR确定所合成cDNA的质量。均按常规方法进行，具体抽提过程如下所述。
1)细胞总RNA的提取和纯化
①收集离心细胞，去其上清，用PBS(0.01M：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g，pH7.4)洗两次后，将细胞转移入1.5mL离心管中，每管加Trizol试剂1mL，摇匀，室温下静置15min后，反复吹打裂解细胞；
②将各管内消化好的细胞裂解液吸到DEPC处理过的1.5mL EP管中，加氯仿0.2mL(Trizol：氯仿约为5：1)，轻摇15s，并在冰上孵育15min；
③4℃、12,000rpm离心15min。然后取上清无色水相到DEPC处理过的EP管，加0.5mL异丙醇，室温下静置10min；
④4℃、12,000rpm离心10min。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上 清；
⑤加入用DEPC水新配制的经预冷的体积百分比75％的乙醇溶液1.0mL，轻轻洗涤沉淀，4℃、12,000rpm离心5min；
⑥去上清，瞬时离心，用小Tip头吸干液体；使沉淀自然干燥，DEPC处理水20～30μL加入，混匀，55～60℃水浴10min溶解总RNA；
⑦用紫外分光光度仪测总RNA纯度和浓度，用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA是否降解，鉴定后于-70℃保存备用。
2)细胞总RNA的鉴定
浓度分析和纯度鉴定：从提取的RNA中吸取1μL，以DEPC水稀释至100μL，用紫外分光光度仪分别测总RNA的浓度，光吸收度A260和A280的比值(A260/A280)。
3)逆转录反应
取上述RNA样品，将其稀释成1μg/μL，在PCR管中加入下列试剂的混合物：
RNase Free H2O 10μL
5×RT Buffer 4μL
dNTP Mixture(各10mM) 2μL
RNase inhibitor(10U/μL) 1μL
Random Primer(25pmol/μL) 1μL
RNA 1μL(1μg)
M-MLV 1μL
在PCR仪上按照下列条件反应：30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min，瞬时离心，-20℃保存备用。
4)PCR扩增
实时定量PCR试剂盒购于北京天根生物公司。实时定量PCR反应管和反应仪器为美国BIO-RAD公司产品。PVT1上游引物5′-GTCTTGGTGCTCTGTGTTC-3′，下游引物5′-CCCGTTATTCTGTCCTTCT-3′。以GAPDH为内参照，GAPDH上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。
利用SYBR GreenⅠ染料法检测细胞PVT1表达情况，并将GAPDH作为内参照。总反应体积为20μL。反应条件：95℃10min变性后，共进行40个循环扩增，每一循环包括95℃15s，60℃30s和80℃5s，并在80℃读板1 次。随后，以0.17℃/s变化速度从65℃到95℃，每隔2s记录1次荧光值，获得熔解曲线。将所扩增的PCR产物熔解曲线分析，同时随机进行质量体积比2％琼脂糖凝胶电泳，以确定产物是否为所扩增的目的片段。采用相对定量公式：2-△Ct×100％，△Ct＝Ct(PVT1)-Ct(GAPDH)，计算细胞PVT1的相对量。
5)CCK8法测细胞生长抑制率
将对数生长期的K562细胞和Raji细胞分别接种于96孔培养板中，按照上述步骤(步骤(3))进行转染，置于37℃、饱和湿度、5％CO2条件下常规培养24、48和72h后，向每孔内加入30μL CCK8，再置于37℃孵育4h。然后直接在酶联检测仪上450nm波长处测A450值，以A450间接反映细胞存活数量。结果按照以下公式计算：细胞增殖抑制率(％)＝(对照组A450值-实验组A450值)/(对照组A450值-空白组A450值)×100％。实验重复3次，据此可推算PVT1siRNA转染后各时间点对细胞的抑制率。
6)流式细胞仪检测细胞周期
按照以上转染方法将各组siRNA序列转到K562细胞和Raji细胞，转染48、72h后收集细胞，用70％乙醇4℃固定过夜，次日按照碘化丙锭(PI)染液说明书进行染色，过滤后用流式细胞仪检测细胞周期。
9)统计学处理
采用SPSS13.0软件进行数据的统计学分析。实验数据以均值±标准差表示，多组间数据比较采用完全随即区组设计的单因素方差分析，组间的比较选用可进行多个样本均数间两两均数比较的S-N-K检验。
二、实验结果
1.荧光定量RT-PCR检测细胞PVT1 RNA表达水平
提取的总RNA经紫外分光光度计检测其吸光度A260/A280的比值，都在1.8～2.0，说明提取的RNA纯度较高。
首先，在4条PVT1 siRNA中siRNA-1055转染K562细胞24、48h下调PVT1 RNA的表达，其值显著低于空白组(即指未经任何处理的细胞组)、空转组(即指单纯转染试剂处理组)和NC-siRNA组(P<0.05)，而其它的3条siRNA(PVT1 siRNA-845、PVT1 siRNA-176和PVT1siRNA-54)、空转组及NC-siRNA组分别与空白组细胞的PVT1 RNA表达量间无显著差异(P>0.05)。同样，siRNA-1055转染Raji细胞24、48h显著下调PVT1 RNA的表达(P<0.05)，可见，PVT1 siRNA-1055可特异性抑制K562细胞和Raji细胞中PVT1的表达(结果如图1和2所示)。
2.PVT1 siRNA-1055对K562和Raji细胞生长的影响
根据CCK8结果得出：PVT1 siRNA-1055转染组细胞的增殖活性较低，其细胞增殖抑制率显著高于其它对照组(即空转组、NC-siRNA组与空白组(0％))(P<0.05)，而空转组及NC-siRNA组分别与空白组细胞的增殖能力间差异无显著性(P>0.05)(见图3和4)。可见PVT1siRNA-1055可抑制K562和Raji细胞的生长。
3.流式细胞仪检测细胞周期
PVT1-siRNA-1055和NC-siRNA序列转染K562和Raji细胞48、72h后细胞周期结果见图5和6。siRNA-1055组转染K562和Raji细胞48、72h后细胞周期G1期细胞比例均增多，分别与NC-siRNA组、空转组和细胞组相比有统计学差异(P<0.05)，并且以48h的G1期阻滞更明显。转染K562和Raji细胞48h后G2、S期细胞比例均减少，与NC-siRNA组、空转组和细胞组相比有统计学差异(P<0.05)。而转染72h后G2期变化不明显，与NC-siRNA组和细胞组相比差异无统计学意义。S期细胞比例明显减少，与NC-siRNA组、空转组和细胞组相比有统计学差异(P<0.05)。可见PVT1 siRNA-1055可通过阻滞K562和Raji细胞周期的进展而抑制细胞的增殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1siRNA-1055，其特征在于：所述的PVT1siRNA-1055的序列如下所示：
正义链的序列为：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3′；
反义链的序列为：5′-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3′。
2.权利要求1所述的抑制血液肿瘤细胞增殖的PVT1siRNA-1055在制备治疗和/或预防血液肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的血液肿瘤包括白血病和淋巴瘤。
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CN106047880B (zh) 2019-02-12

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