CN106010633B - 一种在油水两相体系下高效脱除二苯并噻吩中硫的方法 - Google Patents

一种在油水两相体系下高效脱除二苯并噻吩中硫的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在油水两相体系下高效脱除二苯并噻吩中硫的方法，属于生物脱硫技术领域。本发明基于单因素考擦菌体生长、脱硫及响应面优化分析获得油水两相体系的最佳脱硫条件：油水体积比1:5；转速200rpm；β‑CD 4.44g/L；烟酰胺：1.57mmol/L；核黄素20.7μmmol/L。脱硫效率是对照体系的4.1倍。此外，该菌株对国Ⅳ，国Ⅴ标准模拟油的处理效果较好，最终能达到无硫水平。本发明模式显著提高了戈登氏菌种脱除二苯并噻吩中硫的能力，有望广泛应用于工业燃料油的脱硫。

Description

一种在油水两相体系下高效脱除二苯并噻吩中硫的方法
技术领域
本发明涉及一种在油水两相体系下高效脱除二苯并噻吩中硫的方法，属于生物脱硫技术领域。
背景技术
石油的开发与利用促进经济快速发展，但也带来了一系列污染问题。其中最突出的是其燃烧所释放的会对释放的硫氧化物，硫氧化物所形成酸雨酸雾，对人体健康，环境和国民经济带来恶劣影响。随着人们环保意识的加强，国家相应出台了一系列的法律法规来限制车用燃料油的含硫量。中国在2003年允许车用汽油的硫含量为800ppm，到2011年时，车用汽油的硫含量要控制在50ppm以下。随着人们对硫氧化物(SOX)污染的重视和越来越苛刻的控制硫含量的指标给石油精炼产业带来了巨大的成本压力。而传统燃料油深度加氢脱硫技术要求反应条件苛刻，需要高温高压、氢气消耗大、产生二氧化碳多且反应成本高，尤其是对二苯并噻吩类(CX-DBT)含硫化合物脱硫效率低，难以满足控硫指标的要求。
生物脱硫技术即利用微生物的自身代谢，通过体内的酶促作用将燃料油中硫在温和条件下高效脱除。该技术因其能在常温常压不影响石油热值的情况下，高效的脱除二苯并噻吩类顽固性硫化物中的硫，而受到世界各国研究者的广泛重视。然而尽管生物脱硫在原油精炼的研究中已经有50多年的历史，但目前仍处于小试或中试阶段。微生物在水相体系中进行快速繁殖，同时从油相中获取维持其生长代谢所需要的硫源。脱硫酶DSZ D能提供脱硫酶DSZ C和脱硫酶DSZ A还原力，该酶的活力直接影响着菌体整个脱硫酶系的脱硫能力。而且，有研究表明合适的油水体积比对菌体脱硫影响很大。
因此，培养模式选择是脱硫工艺非常重要的环节，直接影响脱硫的效率和成本，有必要开发新的最佳脱硫模式以克服以上存在的问题与不足。
发明内容
为了实现上述目的，本发明以典型脱硫菌-Gordonia sp.JDZX13为模型，比较了不同模式下在油水两相体系中培养脱除二苯并噻吩中硫的效果，得到了最佳脱硫模式。
由于脱硫酶DSZD在提供还原力的过程中需要两个辅基参与(FAD和NADPH)，因此发明人猜测提高这两个辅基的量可能对该酶的活力具有一定的促进作用。为此实验考查了FAD和NADP的前体物质核黄素和烟酰胺的添加对菌体脱硫的影响。于此同时，表面活性剂不仅能提高二苯并噻吩(DBT)的传质，同时能解除2-HBP对菌体的抑制作用。鉴于此，本发明在考虑以上方面的基础上，首先分别考察不同浓度核黄素、烟酰胺、β-CD对菌体的生长的影响，接着分别考察了不同浓度核黄素、烟酰胺、β-CD对菌体静息细胞脱硫的影响，确定各条件的最佳水平；采用Box-Behnken方案设计实验，其中中心点为上述研究确实的最佳点，响应值为DBT脱除率。
本发明提供了一种在油水两相体系中脱除二苯并噻吩中硫的方法，所述方法是将脱硫微生物接种到含二苯并噻吩的培养液中，在油水两相体系中添加添加β-CD、烟酰胺和核黄素，振荡培养。
在本发明的一种实施方式中，所述接种脱硫微生物的浓度为1-1.4g/L(接种量1％v/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述脱硫微生物为戈登氏菌(Gordonia sp.)JDZX13，购自中国高校工业微生物资源和信息中心，在该信息中心的保藏编号为CICIMB7054，地址为中国无锡江南大学。Gordonia sp.JDZX13来源于克拉玛依油田油污土壤。
在本发明的一种实施方式中，所述戈登氏菌JDZX13应用于脱硫的噻吩类含硫有机物有4,6-二甲基二苯并噻吩，二苯并噻吩，苯并噻吩和噻吩等，可将二苯并噻吩类化合物降解为二羟基联苯(2-HBP)。
在本发明的一种实施方式中，所述培养液中含有：无硫无机盐、微量元素、碳源、水；所述无硫无机盐(g/L)：K2HPO45.0，NaH2PO4·2H2O 2.0，NH4Cl 2.0，MgCl2·6H2O 0.2；微量元素(mg/L)：CaCl220.0，FeCl3·6H2O 4.0，CoCl2·6H2O 4.0，MnCl2·4H2O 0.8，NH4Mo4·2H2O0.2，ZnCl20.2，CuCl2·2H2O 0.1，AlCl3·6H2O 0.1和H3BO30.05；碳源：蔗糖15g/L；pH调至7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述脱硫微生物，在接种前进行活化，活化培养基中含有：无硫无机盐、微量元素、碳源、硫源，其余为水；所述无硫无机盐(g/L)：K2HPO45.0，NaH2PO4·2H2O 2.0，NH4Cl 2.0，MgCl2·6H2O 0.2；微量元素(mg/L)：CaCl220.0，FeCl3·6H2O4.0，CoCl2·6H2O 4.0，MnCl2·4H2O 0.8，NH4Mo4·2H2O 0.2，ZnCl20.2，CuCl2·2H2O0.1，AlCl3·6H2O 0.1和H3BO30.05；碳源：蔗糖15g/L；硫源：二苯并噻吩(DBT)0.15mM；pH调至7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述接种的脱硫微生物为对数生长期的Gordoniasp.JDZX13细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述油水两相体系中的油，为以正十六烷为模拟油、DBT(0.15mM)为模式有机含硫化合物配置成的，油符合国Ⅱ(含硫15mmol/L)、国Ⅲ(含硫5mmol/L)、国Ⅳ(含硫1.5mmol/L)或者国Ⅴ(含硫0.3mmol/L)标准油品。
在本发明的一种实施方式中，所述油水两相体系中的油为国Ⅳ(含硫量1.5mmol/L)、国Ⅴ(含硫量0.3mmol/L)标准油品。
在本发明的一种实施方式中，所述油水两相体系的油水体积比1:5。
在本发明的一种实施方式中，油水两相体系中的β-CD浓度为4.44g/L；烟酰胺浓度为1.57mmol/L，核黄素浓度为20.7μmmol/L。
在本发明的一种实施方式中，振荡培养是在170-220rpm下振荡培养。
在本发明的一种实施方式中，培养温度为28-35℃。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：
(1)以正十六烷为模拟油、DBT为模式有机含硫化合物，分别配置成含国Ⅱ(含硫15mmol/L)、国Ⅲ(含硫5mmol/L)、国Ⅳ(含硫1.5mmol/L)、国Ⅴ(含硫0.3mmol/L)标准油品；分别将上述油品与培养液配成油水体积比1:5的油水混合体系，并添加β-CD 4.44g/L；烟酰胺1.57mmol/L，核黄素20.7μmmol/L；
(2)按照1％的接种量接种脱硫微生物(1-1.4g/L，菌体湿重计)到油水混合体系中，170-220rpm，30-35℃培养；
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括每过12h取一次样，将离心后的上层油相进行GC-MS检测二羟基联苯(2-HBP)和DBT含量。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的培养是在200rpm、35℃培养。
本发明的有益效果：
本发明在油/水两相体系中，通过添加核黄素、烟酰胺、β-CD有效提高了戈登氏菌脱除DBT中硫的效率，所获得的DBT脱除率平均值为99.6％(n＝10)，标准偏差差为0.395，是优化前(即不添加前体物质的油水混合体系)的4.1倍，说明菌株在该油水反应条件下脱硫能力性能稳定，效率高。此外，本发明方法操作简单易行、对设备要求低，为改善各种燃料油的脱硫提供了一种新的技术手段。
附图说明
图1：Gordonia sp.JDZX13在不同因素下培养的生长曲线；(a)烟酰胺对菌体生长的影响，(b)核黄素对菌体生长的影响，(c)β-CD对菌体生长的影响；
图2：不同因素对Gordonia sp.JDZX13的脱除DBT曲线图；(a)β-CD浓度对菌体脱硫的影响，(b)核黄素对菌体脱硫的影响，(c)烟酰胺对菌体脱硫的影响；
图3：Box-Behnken实验设计下Gordonia sp.JDZX13脱硫结果；(a)实验值与预测值的相互关系，(b)残差正态图，(c)DBT脱除率Y＝f(A,B)响应面，(d)DBT脱除率Y＝f(A,C)响应面；
图4：Gordonia sp.JDZX13对不同模拟油的脱硫曲线；(a)2-HBP产量随时间变化曲线图，(b)DBT脱除率随时间变化曲线图。
具体实施方式
实施例1：烟酰胺、核黄素、β-CD对菌体生长的影响
将处于对数生长期的Gordonia sp.JDZX 13细胞按1％的接种量接种到无硫无机盐培养基(g/L)，K2HPO45.0,NaH2PO4·2H2O 2.0,NH4Cl 2.0,MgCl2·6H2O 0.2.微量元素(mg/L):CaCl220.0,FeCl3·6H2O 4.0,CoCl2·6H2O 4.0,MnCl2·4H2O 0.8,NH4Mo4·2H2O 0.2,ZnCl20.2,CuCl2·2H2O 0.1,AlCl3·6H2O 0.1and H3BO30.05。碳源：蔗糖15g/L；硫源：0.15mM二苯并噻吩(DBT)。
将菌体分别培养在不同溶度核黄素(0、20、40、60、80μmol/L)、烟酰胺(0、3、6、9、12mmol/L)、β-CD(0、2、4、6、8、10g/L)条件下，每过12小时测发酵液的菌浓。pH调至7.0，200rpm，30℃培养96h。每隔12小时取一次样，测定细胞干重。
菌体在不同烟酰胺浓度下的生长情况见图1a。菌体的生长强度在烟酰胺浓度小于9mmol/L时随其浓度的提高而逐渐加强，而大于9mmol/L时其生长有轻微抑制。烟酰胺在低浓度范围时，烟酰胺浓度的提高为菌体提高充足的NAD前体，促进菌体生长代谢；当烟酰胺浓度达到菌体生长所需浓度以上时，烟酰胺浓度的增加不仅对菌体生长没有促进作用，反而对菌体生长存在抑制作用。
菌体在不同核黄素浓度下的生长见图1b。菌体的生长强度在核黄素浓度小于60μmmol/L时随其浓度的增加逐渐加强，而高于80μmmol/L时其生长强度明显下降，说明高浓度的核黄素不适合菌体生长。
菌体在不同β-CD浓度下的生长情况见图1c。菌体的生长强度在β-CD浓度小于4g/L时随其浓度的增加逐渐加强，而高于6g/L时其生长强度逐渐下降。可能原因是β-CD在低浓度范围时能加快菌体对DBT的利用及解除2-HBP的抑制而促进菌体生长；当β-CD浓度较高时对菌体生长有不良影响。但相对于不添加β-CD的发酵液，菌体在含有β-CD的培养基中都普遍存在二次生长的现象。菌体在后期通过降解β-CD来促进菌体生长。
实施例2：β-CD、烟酰胺、核黄素对菌体脱硫的影响
在25ml锥形瓶中，分别加入不同溶度核黄素(0、20、40、60、80μmol/L)、烟酰胺(0、3、6、9、12mmol/L)、β-CD(0、2、4、6、8、10g/L)，同时加入4ml含有8.0g/L静息细胞的磷酸缓冲液及0.3mmol/L DBT，放入35℃，反应12h。用乙酸乙酯萃取后于GC-MS对代谢产物的定性、定量分析。色谱柱型号为SE-54(30m×0.32nm×0.33μm)，检测器和进样器为280℃。柱温初始温度为150℃，保持15min，然后以5℃/min升至200℃，保持3min，再以10℃升至270℃，保持5min，分析时间为40min。
β-CD作为一种表面活性剂，相比于吐温-80、吐温-20、大豆卵磷脂等表面活性剂更能解除2-HBP对菌体脱硫的抑制。图2a为β-CD浓度在0、2、4、6、8、10g/L时菌体的脱硫的情况。当β-CD浓度为6g/L时，DBT脱除率最大。
核黄素作为FAD的前体物质，其浓度的添加可能提高FAD的浓度，从而提高脱硫酶DSZ D的供氢能力。为此，实验考查了核黄素浓度范围在0、20、40、60、80μmmol/L时对菌体脱硫的影响(图2b)。核黄素浓度在40μmmol/L时，DBT脱除率最大。
烟酰胺作为NAD的前体物质，其浓度的添加可能提高NAD的浓度，从而提高菌体的供氢能力，加速菌体的脱硫速率。为此，实验室考查了烟酰胺范围在0、3、6、9、12mmol/L时对菌体脱硫的影响。结果如图2c所示，烟酰胺在3mmol/L时，DBT脱除率最大。
实施例3响应面优选最佳脱硫方案
先前用单因素实验分别考察了β-CD、烟酰胺、核黄素对菌体脱硫的影响，最终分别确定β-CD为6g/L，核黄素为40μmmol/L，烟酰胺为3mmol/L时，菌体的脱硫效率最高。接下来用β-CD、烟酰胺、核黄素在单因素实验中确定的最佳点作为中心点(低水平为β-CD为4g/L，核黄素为20μmmol/L，烟酰胺为1mmol/L；高水平β-CD为8g/L，核黄素为60μmmol/L，烟酰胺为5mmol/L)，用Box-Behnken实验进行响应面优化。实验方案与结果见表1所示。
表1Box-Behnken实验设计与结果
利用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行回归分析与拟合，其回归模型及方差结果见表2所示，模型的F＝12.7，P＝0.0015。一般认为当P值小于0.05时，模型显著，因此该模型显著。模型失拟项F＝1.2，P＝0.4161。一般认为P值大于0.05时，不显著，因此模型失拟项不显著。模型中A、AB、AC和A2的P值小于0.05，说明这些因素显著。其他因素的P值大于0.1，说明不显著。通过进一步优化后得到DBT脱除率响应值Y与各因子X之间的回归拟合方程Y＝98.63-0.48*A+0.08*B-0.29*C+1.95*A*B+1.00*A*C-1.84*A2。
表2响应面的二次多项回归模型及方差分析
注：R2＝0.939；R2 adj＝0.903；CV＝0.49％
图3a为实验值与预测值的相互关系。实验值与预测值成一直线，相关系数R2＝0.9392，表明模型具有较好的预测性。图3b为残差正态图，由图可知残差值接近一条直线，说明模型拟合的较好。回归方程可为预测菌体脱硫提供一个较好的模型。利用Design-Expert.V8.0.6.1软件对上述拟合方程绘制相应曲面图(图3c和图3d)，进一步考察β-CD、烟酰胺、核黄素三个因素交互作用效果，从而确定各自最优点。当核黄素浓度保持不变时，DBT脱除率随β-CD和烟酰胺浓度的升高而降低；当烟酰胺浓度保持不变时，DBT脱除率随β-CD和核黄素的增加而下降。根据先前的单因素实验和Design-Expert.V8.0.6.1软件优化程序分析，最终获得菌体在油水两相体系脱硫的最佳反应条件为：β-CD 4.44g/L；烟酰胺1.57mmol/L；核黄素20.7μmmol/L。
为进一步验证模型的可靠性，将上述同样浓度的细胞，在最佳的油水反应条件下处理0.3mmol/L DBT 12h，所获得的DBT脱除率平均值为99.6％(n＝10)，标准偏差差为0.395(表3)，是优化前(即不添加前体物质的油水混合体系)的4.1倍。实验结果表明菌株在该油水反应条件下脱硫能力性能稳定，效率高。本发明脱硫模式非常适合燃料油的脱硫，有望应用于大规模燃料油脱硫。
表3Gordonia sp JDZX13脱硫优化模型的验证
实施例4：Gordonia sp.JDZX13处理不同标准模拟油的研究
以正十六烷为模拟油，用0.15mM DBT为模式有机含硫化合物，配成含硫油品。分别将上述油品与培养液(无硫无机盐+微量元素+碳源)混合，得到油水体积比1:5的油-水混合体系，115℃，灭菌30min。按1％接种种子液到油-水混合体系中，200rpm，35℃培养。每过12h取一次样，将离心后的上层油相，进行GC-MS检测。
基于已确定最佳培养模式及反应条件，研究菌株处理不同标准的油品的效果，确定最佳处理油品。实验考查了菌株在最佳培养条件及培养模式下对国Ⅱ、国Ⅲ、国Ⅳ、国Ⅴ标准模拟油的脱硫情况(图4)。由图可知，处理12h后，各模拟油中2-HBP的产量随时间的变化逐渐增加(图4a)。12-24h阶段，各模拟油中的2-HBP产率均达到最大，分别为0.0322mmol/L/h，0.0449mmol/L/h，0.0556mmol/L/h，0.0206mmol/L/h。国Ⅴ模拟油在36h时，2-HBP产量不再增加，此时DBT脱除率达到99.8％(图4b)。国Ⅳ模拟油在48h后，2-HBP产率在逐渐下将，原因是随着2-HBP产量的增加导致较强的底物反馈抑制。96h时，DBT脱除率达到100.0％。菌体处理国Ⅱ和国Ⅲ模拟油96h的DBT脱除率分别为：5.6％和19.0％(图4b)。国Ⅱ和国Ⅲ模拟油中2-HBP的产量相比于国Ⅳ模拟油显著下降，原因是国Ⅱ和国Ⅲ中过高的DBT抑制菌体的活性。综上分析，该菌株对低硫含量的国Ⅳ，国Ⅴ模拟油的脱硫效果较好，96h处理后最终均可达到无硫水平。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.一种在油水两相体系中脱除二苯并噻吩中硫的方法，其特征在于，所述方法是将脱硫微生物接种到含二苯并噻吩的培养液中，在油水两相体系中添加β-CD、烟酰胺和核黄素，振荡培养；所述脱硫微生物为戈登氏菌(Gordonia sp.)JDZX13；油水两相体系中的β-CD浓度为4.44g/L；烟酰胺浓度为1.57mmol/L，核黄素浓度为20.7μmol/L；所述接种脱硫微生物的浓度为1-1.4g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油水两相体系中的油为以正十六烷为模拟油、DBT为模式有机含硫化合物配置成的含硫量为15mmol/L、5mmol/L、1.5mmol/L或者0.3mmol/L的油品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油水两相体系的油水体积比1:5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液中含有：无硫无机盐、微量元素、碳源、水；所述无硫无机盐，按g/L计，含有：K2HPO45.0，NaH2PO4·2H2O 2.0，NH4Cl 2.0，MgCl2·6H2O 0.2；微量元素，按mg/L计，含有：CaCl220.0，FeCl3·6H2O 4.0，CoCl2·6H2O4.0，MnCl2·4H2O 0.8，NH4Mo4·2H2O 0.2，ZnCl20.2，CuCl2·2H2O 0.1，AlCl3·6H2O 0.1和H3BO30.05；碳源：蔗糖15g/L；pH调至7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：
(1)以正十六烷为模拟油、DBT为模式有机含硫化合物，分别配置成含硫量为15mmol/L、5mmol/L、1.5mmol/L或者0.3mmol/L的油品；分别将上述油品与培养液按油水体积比1:5混合得到油水混合体系；并添加β-CD 4.44g/L、烟酰胺1.57mmol/L、核黄素20.7μmol/L；
(2)接种浓度为1-1.4g/L的脱硫微生物到油水混合体系中，170-220rpm，30-35℃培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油水两相体系中的油为国Ⅳ或国Ⅴ标准模拟油，含硫量为1.5mmol/L或者0.3mmol/L；标准模拟油是以正十六烷为模拟油、DBT为模式有机含硫化合物配置成的。
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