CN105998022A - 8-取代氧化异阿朴菲衍生物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一系列8-取代氧化异阿朴菲衍生物的应用。具体是8-取代氧化异阿朴菲衍生物或其药学上可接受的盐在制备Aβ聚集抑制剂药物中的应用，以及在制备同时具有抑制乙酰胆碱酯酶和抗Aβ聚集的药物中的应用。申请人发现该类衍生物不仅在体外对乙酰胆碱酯酶具有很好的抑制活性，在体内也同样具有很好的抗乙酰胆碱酯酶效果，而且化合物无论在分子水平还是在细胞水平都具有很好的抗Aβ聚集活性。更难得的是该类化合物大部分能够透过血脑屏障并且具有较低的毒性，在治疗阿尔茨海默病和脑血管痴呆等疾病方面具有良好应用前景。所述8-取代氧化异阿朴菲衍生物的结构如下述式(I)所示：其中，n＝1～5。

Description

8-取代氧化异阿朴菲衍生物的应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及8-取代氧化异阿朴菲衍生物的新应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是由德国的神经病理学家阿尔茨海默(Alois Alzheimer)于1907年首先发现,并以其名字而命名的一种疾病，AD是一种渐进性的神经变性性疾病，这种疾病表现为全面的认知障碍，包括记忆、定位、判断和推理。其临床特点是以潜隐性病，逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。通常病情呈进行性加重，逐渐丧失独立生活能力。由于AD病涉及多种病理过程，其发病机制是个很复杂、多机制、多因素的过程。

尽管AD的发病机制目前仍未完全清楚，但由淀粉样β蛋白(Aβ)沉积造成的老年斑和包含tau蛋白的神经纤维原缠结被认为是AD的主要发病机理。

现有已经上市的五种治疗AD病的药物：Donepezil；Rivastigmine；Galantamine；Tacrine和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体调节剂Memantine。这类药物的靶点为乙酰胆碱酯酶(AChE)，它们虽然不能彻底治愈疾病，但能改善病人的症状。目前较为先进的缓解疾病候选药物(disease-modifyingdrug DMD)包括以Aβ抑制产生和清除为目标的Tramiprosate(已进入三期临床研究)；调节γ-分泌酶的Tarenflurbil(已进入三期临床研究)；淀粉样蛋白的主动免疫疫苗ACC-001和被动免疫疫苗Bapineuzumab和LY2062430(已进入二期临床研究)等。

上述已经上市的和正在开发的药物都是单一靶点的治疗药物，鉴于AD发病的复杂性，这类药物很难从根本上解决问题。因为一方面AD本身发病机理中往往由多个信号通路参与，而单靶点的理论忽视了细胞内或体内生物大分子的相互影响及信号通路中构成的网络系统的相互影响，靶分子在细胞内多存在备份，当药物抑制一种信号分子时，信号通路可以通过回路或启用备份，最终抵消药物的作用。另一方面，现有药靶有多功能性，强烈抑制或激活某一药靶会导致副作用的产生，如使用抗胆碱酯酶药物往往会导致外周的乙酰胆碱的积累增加而引起恶心、呕吐等外周胆碱样反应。

多靶点药物的设计是旨在利用生物结构信息和药效团模型，获得所需的多样生物活性，同时去除不需要的生物活性，其化合物的特点是针对疾病的不同病理环节发挥作用而增强疗效。另外,多靶点化合物对诸靶点作用的联合较相应各单靶点药物对其作用的相加要有效的多，原因在于这种不完全的多靶向作用具有适度阻断分子之间的相互作用的优点。AD的发病机制复杂，多种信号通路参与此过程，许多信号分子在其中发挥重要作用，近年来科学研究者尝试将多靶向治疗策略应用于治疗，发现较单靶点药物治疗具有更优越的疗效和临床前景。

本申请人在之前的研究中发现，具有下述式(A)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物在体外对乙酰胆碱酯酶具有很好的抑制作用(具体请见公开号为CN103923009A的发明专利)，但目前尚未发现有该类衍生物单独具有抗Aβ聚集作用以及在乙酰胆碱酯酶的同时还具有抗Aβ聚集作用的相关报道。

其中，n＝1～5。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种8-取代氧化异阿朴菲衍生物的新应用。

具体地说，本发明提供具有下述式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物或其药学上可接受的盐在制备Aβ聚集抑制剂药物中的应用；

其中，n＝1～5。

进一步地，本发明还提供具有下述式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物或其药学上可接受的盐在制备同时具有抑制乙酰胆碱酯酶和抗Aβ聚集的药物中的应用；

其中，n＝1～5。

本发明所述技术方案中涉及的具有式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物可参考公开号为CN103923009A的发明专利进行合成。

与现有技术相比，本发明提供了具有式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物或其药学上可接受的盐在制备Aβ聚集抑制剂药物中的应用，以及该类衍生物在制备同时具有抑制乙酰胆碱酯酶和抗Aβ聚集的药物中的应用。申请人发现该类衍生物不仅在体外对乙酰胆碱酯酶具有很好的抑制活性，在体内也同样具有很好的抗乙酰胆碱酯酶效果，而且化合物无论在分子水平还是在细胞水平都具有很好的抗Aβ聚集活性。更难得的是该类化合物大部分能够透过血脑屏障并且具有较低的毒性，在治疗阿尔茨海默病和脑血管痴呆等疾病方面具有良好应用前景。

附图说明

图1为本发明所述的8-取代氧化异阿朴菲衍生物对Aβ42转基因果蝇脑内乙酰胆碱酯酶的抑制活性条形图；

图2为本发明所述的8-取代氧化异阿朴菲衍生物对SH-SY5Y-APP_SW细胞Aβ₄₂的抑制活性条形图；

图3为平行人工膜渗透模型的示意图；

图4为采用图3所示模型检测9个市售药物的PAMPA-BBB实验数据与文献值的相关性曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

本发明中按下述合成路线合成得到式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物。

实施例1：4-氯-2-苯基异二氢吲哚-1,3-二酮(化合物1)的合成

将57g(0.1mol)3-氯邻苯二甲酸酐和45g(0.1mol)苯乙胺加入到1L的三孔圆底烧瓶中，再加入500ml甲苯，回流6小时，趁热倒出，冷却，析出结晶，抽滤，得到化合物1(白色片状结晶)，产率约98％。

对化合物1进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ3.00～3.04(m,2H),3.94～3.97(m,2H),7.23～7.34(m,5H),7.65(d,J＝1.7,1H),7.66(s,1H),7.78(dd,J₁＝5.0and J₂＝3.2,1H)；ESI-MS(m/z):287[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物1为4-氯-2-苯基异二氢吲哚-1,3-二酮，其结构式如下式所示：

实施例2：8-Cl-1-氮杂苯并蒽酮(化合物2)的合成

将75g(0.56mol)的无水三氯化铝和15g氯化钠加入1L的三孔圆底烧瓶中，混合加热至140℃熔融，再向其分批缓慢加入53g(0.2mol)的化合物1，加入完毕，升温至220℃，搅拌反应3小时，乘热倒入研钵中，冷却，捣碎，得到红棕色固体，放置于干燥器皿中。

取600ml浓硫酸加入到2L的三孔圆底烧瓶中，升温到80℃时，开始分批加入上述得到的红棕色固体，加完后升温至230℃，搅拌反应2.5小时，冷却，倒入到约600g的冰水中，用NaOH调节pH值约2-3，析出大量固体，抽滤，水洗，得到粗产品。粗产品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20:1)纯化，得到化合物2(黄色粉末)，产率约35％。

对化合物2进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ7.72(d,J＝5.6Hz 1H),7.76(t,J＝8.2Hz,1H),7.89(t,J＝7.3Hz,1H),8.12(d,J＝8.2Hz,1H),8.64(d,J＝7.3Hz,1H),8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.76(d,J＝5.6Hz,1H),9.07(d,J＝7.3Hz,1H)；ESI-MS(m/z):266[M+H]⁺.因此，可确定上述化合物2为8-Cl-1-氮杂苯并蒽酮，其结构式如下式所示：

实施例3：8-氨基-7H-二苯并喹啉-7-酮(化合物3)的合成

取1.5g化合物2于高压釜内胆中，再加入100ml的氨水，于180℃下反应12h后，停止反应。待冷却后用3mol/L的HCl调pH至7-8，抽滤，烘干。粗产品经硅胶柱层析(石油醚/氯仿＝7:1)纯化，得到化合物3(红色固体)，产率40％。

对化合物3进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(500MHz,DMSO):δ8.73(d,J＝5.5Hz,1H),8.45(d,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.2Hz,1H),8.06(d,J＝8.4Hz,1H),8.02–7.97(m,1H),7.94(d,J＝5.6Hz,1H),7.55–7.48(m,1H),7.00(d,J＝7.3Hz,1H),2.51(t,J＝2.8Hz,2H)；ESI-MS(m/z):247[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物3为8-氨基-7H-二苯并喹啉-7-酮，其结构式如下式所示：

实施例4：8-(2-哌啶乙酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮(化合物4)的合成

取0.3g(0.0012mol)化合物3于25mL圆底烧瓶中，加入15mL CH₂Cl₂使其全部溶解后，向装有2.95g(0.0183mol)2-(1-哌啶基)乙酰氯的反应瓶中缓慢滴加，滴加完毕后TLC追踪反应2.5h，用NaHCO₃调pH值至2-3，并用蒸馏水洗涤3-4次，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥，粗产品用硅胶柱层析(石油醚/氯仿＝5:1)纯化，得到化合物4(橙黄色粉末)，产率89.0％。

对化合物4进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ13.45(s,1H),9.10(d,J＝7.3Hz,1H),8.78(d,J＝5.5Hz,1H),8.73(d,J＝6.7Hz,1H),8.66(d,J＝7.2Hz,1H),8.14(d,J＝7.2Hz,1H),7.95–7.88(m,1H),7.79(t,J＝8.1Hz,1H),7.74(d,J＝5.6Hz,1H),3.27(s,2H),2.67(s,4H),1.97–1.82(m,4H),1.28(s,2H).ESI-MS(m/z):372[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物4为8-(2-哌啶乙酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮，其结构式如下式所示：

实施例5：8-(3-哌啶丙酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮(化合物5)的合成

取0.3g(0.0012mol)化合物3于25mL圆底烧瓶中，加入15mL CH₂Cl₂使其全部溶解后，向装有3.2g(0.018mol)3-(1-哌啶基)丙酰氯的反应瓶中缓慢滴加，滴加完毕后TLC追踪反应3h，用NaHCO₃调pH值至2～3，并用蒸馏水洗涤3～4次，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥，粗产品用硅胶柱层析(石油醚/氯仿＝5:1)纯化，得到化合物5(橙黄色粉末)，产率90％。

对化合物5进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ12.81(s,1H),8.97(d,J＝8.4Hz,1H),8.79(d,J＝5.5Hz,1H),8.70(d,J＝7.9Hz,1H),8.61(d,J＝7.3Hz,1H),8.16(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(t,J＝7.7Hz,1H),7.78(t,J＝8.1Hz,1H),7.75(d,J＝5.7Hz,1H),2.92(t,J＝7.2Hz,2H),2.82(t,J＝7.3Hz,2H),2.58(s,4H),1.79–1.60(m,4H),1.28(s,2H).ESI-MS(m/z):386[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物5为8-(3-哌啶丙酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮，其结构式如下式所示：

实施例6：8-(4-哌啶丁酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮(化合物6)的合成

取0.2g(0.0008mol)化合物3于25mL圆底烧瓶中，加入15mL CH₂Cl₂使其全部溶解后，向装有2.3g(0.012mol)4-(1-哌啶基)丁酰氯的反应瓶中缓慢滴加，滴加完毕后TLC追踪反应2.5h，用NaHCO₃调pH值至2～3，并用蒸馏水洗涤3～4次，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥，粗产品用硅胶柱层析(石油醚/氯仿＝20:1)纯化，得到化合物6(橙黄色粉末)，产率85％。

对化合物6进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ12.83(s,1H),8.95(d,J＝8.4Hz,1H),8.79(d,J＝5.5Hz,1H),8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.62(d,J＝7.2Hz,1H),8.17(d,J＝8.2Hz,1H),7.97–7.89(m,1H),7.79(d,J＝8.1Hz,1H),7.76(d,J＝5.5Hz,1H),3.85–3.71(m,2H),3.29(t,J＝12.6Hz,2H),2.91–2.76(m,4H),2.69(t,J＝7.0Hz,2H),1.92–1.77(m,4H),1.28(s,2H).ESI-MS(m/z):400[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物6为8-(4-哌啶丁酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮，其结构式如下式所示：

实施例7：8-(5-哌啶戊酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮(化合物7)的合成

取0.3g(0.0012mol)化合物3于25mL圆底烧瓶中，加入15mL CH₂Cl₂使其全部溶解后，向装有3.7g(0.018mol)5-(1-哌啶基)戊酰氯的反应瓶中缓慢滴加，滴加完毕后TLC追踪反应2.5h，用NaHCO₃调pH值至2-3，并用蒸馏水洗涤3-4次，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥，粗产品用硅胶柱层析(石油醚/氯仿＝20:1)纯化，得到化合物7(橙黄色粉末)，产率75％。

对化合物7进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ12.84(s,1H),8.94(d,J＝8.4Hz,1H),8.80(d,J＝5.5Hz,1H),8.73(d,J＝7.9Hz,1H),8.64(d,J＝7.3Hz,1H),8.18(d,J＝8.2Hz,1H),7.99–7.91(m,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,1H),7.78–7.76(m,1H),4.15(q,J＝7.2Hz,2H),3.12–3.00(m,2H),2.68(t,J＝7.1Hz,4H),2.39(t,J＝7.1Hz,2H),1.92(dd,J＝15.2,7.5Hz,4H),1.76–1.63(m,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,2H).ESI-MS(m/z):414[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物7为8-(5-哌啶戊酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮，其结构式如下式所示：

实施例8：8-(6-哌啶己酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮(化合物8)的合成

取0.3g(0.0012mol)化合物3于25mL圆底烧瓶中，加入15mL CH₂Cl₂使其全部溶解后，向装有3.9g(0.018mol)6-(1-哌啶基)己酰氯的反应瓶中缓慢滴加，滴加完毕后TLC追踪反应2.5h，用NaHCO₃调pH值至2～3，并用蒸馏水洗涤3～4次，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥，粗产品用硅胶柱层析(石油醚/氯仿＝20:1)纯化，得到化合物8(橙黄色粉末)，产率66％。

对化合物8进行分析，其波谱特性如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ12.80(s,1H),8.97(dd,J＝8.4,1.1Hz,1H),8.79(d,J＝5.5Hz,1H),8.70(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),8.62(dd,J＝7.3,1.0Hz,1H),8.17(dd,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.93(dd,J＝8.1,7.4Hz,1H),7.78(d,J＝8.1Hz,1H),7.77–7.73(m,1H),2.99(s,2H),2.93–2.84(m,2H),2.61(t,J＝7.3Hz,2H),1.97(m,6H),1.89(m,2H),1.63(s,2H),1.54(m,2H),1.27(s,2H).ESI-MS(m/z):428[M+H]⁺.

因此，可确定上述化合物8为8-(6-哌啶己酰氨基)-7H-二苯并喹啉-7-酮，其结构式如下式所示：

为进一步说明8-取代氧化异阿朴菲衍生物的用途，申请人进行了以下实验：

实验例1：8-取代氧化异阿朴菲衍生物体外乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的测定

应用Ellman(Ellman,G.L.；Courtney,K.D.；Andres,V.；et al.Biochem.Pharmacol.1961,7,88.)的方法测试化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制的IC₅₀值。所有测试都是用Microplate reader ELX808^TM型酶标仪(美国BioTek公司)，在37℃条件下测定。数据分析软件使用Origin软件进行数据处理，使用Tacrine作为对照品。

1、抑制剂储备液的配制：所测试的抑制剂配成10mM的DMSO溶液。

2、酶储备液的配制：乙酰胆碱酯酶(从电鳗中提取)和丁酰胆碱酯酶(从马的血浆中提取)购自Sigma公司；用pH＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成0.1mg/mL，0.5mg/mL。

3、底物储备液的配制：乙酰巯基胆碱(乙酰胆碱酯酶底物)和丁酰巯基胆碱(丁酰胆碱酯酶底物)购自Sigma公司；用pH＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成2mg/mL，2mg/mL。

4、显色剂储备液的配制：显色剂DTNB购自Sigma公司；用pH＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成4mg/mL和2mg/mL。

5、测试：每次测试的体积都为150μL的pH＝8.0的磷酸盐缓冲液。

往96孔酶标板中加入pH＝8.0磷酸盐缓冲溶液150μL，10μL显色剂储备液，10μL酶储备液，再分别加入20μL不同浓度抑制剂溶液(用pH＝8.0磷酸盐缓冲溶液稀释抑制剂储备液)，在37℃的酶标仪中保温15min，立即加入20μL底物储备液，混匀后立即测其在λ＝420nm处一分钟吸光度变化(斜率)。参比液为pH＝8.0磷酸盐缓冲溶液。

6、结果判断：以未加样品所测得的吸光度变化(斜率)作为100个活力单位；相对酶活力＝(加入抑制剂的吸光度变化(斜率)/没有加入抑制剂的吸光度变化(斜率))×100，当酶的相对活力为50时的抑制剂的浓度即为抑制剂的IC₅₀值。

7、实验结果：

化合物4-8对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的IC₅₀值和抑制的选择性如下述表1所示。

表1：化合物4-8对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的IC₅₀值和抑制的选择性

^a对乙酰胆碱酯酶的选择性＝IC₅₀(丁酰胆碱酯酶)/IC₅₀(乙酰胆碱酯酶)。

由表1可知，所合成的8-取代氧化异阿朴菲衍生物(4～8)对乙酰胆碱酯酶的抑制IC₅₀值都在微摩尔水平。而对丁酰胆碱酯酶的抑制，也达到了微摩尔的水平。化合物5在所有测试的化合物中具有最高的对乙酰胆碱酯酶的抑制活性(IC₅₀＝0.081μM)，且其对乙酰胆碱酯酶的选择性大约是对照品他克林的56倍。

实验例2：8-取代氧化异阿朴菲衍生物对Aβ42转基因果蝇脑内乙酰胆碱酯酶的抑制活性测定

将各组果蝇同时饲养25天，每种取100只雄果蝇，显微镜下切下脑部，液氮研磨，加入400μl生理盐水，在冰水浴中以3000r/min匀浆10s，反复进行3次，制成组织匀浆；再以6000r/min离心10min，取上清液。按CHE测定试剂盒说明操作。

结果：化合物4-8对Aβ42转基因果蝇脑内乙酰胆碱酯酶的抑制活性如图1所示。

实验例3：8-取代氧化异阿朴菲衍生物对Aβ42自诱导聚集的抑制活性测定

1.溶液的配制

(1)0.215M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液：向500mL 0.215M Na₂HPO₄水溶液中缓慢滴加0.215M NaH₂PO₄水溶液，搅拌混匀，用pH计将溶液pH值调至8.0,存储于4℃备用；

(2)用HFIP使Aβ(1-42)单体化(2mg/ml)：称取0.2mg Aβ溶于4℃的HFIP，定容至100μL；室温孵育60min，然后将Aβ(1-42)/HFIP溶液于4℃静置10min，再使其在室温下自然挥发，过夜；真空冷冻干燥除去剩余的HFIP；

(3)2mM Aβ(1-42)/DMSO储备溶：将冷冻干燥后的Aβ溶于DMSO溶液，配制成2mM的储备液，静置于4℃备用；

(4)1.5μM硫黄素T溶液：称取一定量的硫黄素T用10mM pH 8.5甘氨酸-NaOH缓冲溶液配置成1.5μM硫黄素T储备液，存储于4℃备用；

(5)1mM抑制剂溶液：用0.215M pH8.0磷酸盐缓冲溶液将10mM的样品DMSO储备液稀释至1mM的待测液。

2.化合物对Aβ₄₂自诱导聚积抑制作用分析方法

取2μL Aβ(1-42)储备液分别加入16μL的缓冲溶液和2μL的抑制剂溶液(抑制剂的最终浓度为10μM)，混匀，37℃共同孵育8h；然后加入180μL 1.5μM硫黄素T的甘氨酸-NaOH溶液混匀后，立即在446nm激发波长和490nm发射波长下测定其荧光值；以0.215M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液为参比，并设置Aβ加缓冲液作为空白；存在抑制剂时荧光值为IF_i(Aβ+AChE+抑制剂)，无抑制剂下的荧光值为IF₀(Aβ+AChE)，化合物的抑制率＝100-[(IF_i/IF₀)×100]。

结果：化合物4-8对Aβ₄₂自诱导聚集的抑制率如下述表2所示：

表2：化合物4-8对Aβ₄₂自诱导聚集的抑制

^aAβ₄₂浓度为20μmol·L^-1，化合物浓度为10μmol·L^-1，每个化合物至少平行测试三次，结果表示为：平均值±标准误

实验例4：8-取代氧化异阿朴菲衍生物对SH-SY5Y-APP_SW细胞Aβ₄₂的抑制活性测定

1.细胞培养：将SH-SY5Y-APP_SW细胞培养于含有w＝10％FBS和w＝1％青链霉素的DMEM培养液中，在37℃、100％饱和相对湿度的恒温细胞培养箱中培养。观察细胞贴壁生长密度超过80％时，用w＝0.25％胰蛋白酶消化传代。

2.取对数生长期的细胞，消化后以1×10⁶个/mL的浓度接种于6孔板。24h后加入终浓度为1μmol/L的药物，另设只加0.1％DMSO的对照组，每组设3个复孔。24h后分别收集细胞培养液，4℃、12000r/min离心5min后取上清，将上清置于-20℃保存。

3.按照试剂盒的说明将标准品稀释、加样(分别设空白孔与待测样品孔)、温育、配洗涤液、洗涤、加入酶标试剂(空白孔除外)、再温育、再洗涤、加入显色剂避光显色15min、每孔加入50μL的终止液终止反应、用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。

结果：化合物4-8对SH-SY5Y-APP_SW细胞Aβ₄₂的抑制如图2所示。

实验例5：8-取代氧化异阿朴菲衍生物对SH-SY5Y细胞毒性的测定

1.细胞培养：将SH-SY5Y细胞培养于含有w＝10％FBS和w＝1％青链霉素的DMEM培养液中，在37℃、100％饱和相对湿度的恒温细胞培养箱中培养。观察细胞贴壁生长密度超过80％时，用w＝0.25％胰蛋白酶消化传代。

2.MTT法测定细胞相对活力：药物对细胞生存能力的影响可用MTT试验检测。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，每孔含200μl培养基，24h后，加入终浓度为50和100μmol/L的药物，另设只加0.1％DMSO的对照组，每一个浓度组设5个复孔。24h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，作用4-6h，弃去液体，每孔加入150μl的DMSO,于摇床上振荡10min，用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(OD值)。各加药组与对照组相比得到的数值即代表细胞的相对活力(Cell viability)。

结果如下述表3所示：

表3：化合物4-8对SH-SY5Y细胞的毒性

实验例6：8-取代氧化异阿朴菲衍生物的血脑屏障透过能力测定

血脑屏障平行人工膜渗透模型(Parallel artificial membrane permeationassay for Blood-Brain Barrier,PAMPA-BBB)的实验装置如图3所示：上层板由聚四氟乙烯和池底的聚偏氟乙烯(PVDF)多孔过滤膜构成，实验中将不同的磷脂溶于链烷中使其均匀分布于PVDF膜上形成模拟生物膜，然后向池内注入相应的缓冲溶液作为受体池(Acceptor plates)；下层的供体池(Donor plates)加入一定体积的样品溶液后将制备好的受体池转移至供体池中，使磷脂膜与供体液相互接触形成“三明治”结构——上层为受体池，中间为人工磷脂膜，底部为待测药物的供体液。

药物分子通过被动扩散从供体池中透过模拟生物膜进入上层受体池中(见图3)，扩散完毕后，分别移取受体液和供体液用紫外分光光度计测定其浓度[drug]_Acceptor和[drug]_Donor，根据公式算得药物的有效透过率：

$P_e=-\left(\frac{V_D\×V_A}{\left(V_D+V_A\right)A\×t}\right)\×\ln \left(1-\frac{{\[drug\]}_{Acceptor}}{{\[drug\]}_{equilibrium}}\right)$ 公式1

其中，V_D为供体池中化合物待测液的体积；V_A为受体池中缓冲液的体积；A为多孔过滤的有效面积(cm²)；t为扩散时间(s)；[drug]_Acceptor为受体池中药物的浓度；[drug]_equilibrium为药物的理论吸收浓度；P_e的单位为cm s^-1。

表4：9个市售药物的PAMPA-BBB实验数据和文献值

^a来至参考文献：Di L.；Kerns E.H.；Fan K.；et al.High throughput artificial membranepermeability assay for blood-brain barrier[J].Eur.J.Med.Chem.2003,38(3):223-232.

^b实验数据为至少三次平行独立实验的平均值

表4为采用猪脑磷脂提取物模拟人脑内磷脂膜建立的PAMPA-BBB模型。通过检测9个市售的药物的血脑屏障透过率与文献值对比，得到相关性方程：y＝0.866x+0.7068(R²＝0.9408)(如图4所示)。根据相关性方程和Di等人建立的评价条件，我们对化合物的血脑屏障透过能力可作如下定义：

(a)‘CNS+’(能够透过血脑屏障):Pe(10^-6cm s^-1)>4.2；

(b)‘CNS-’(不能够透过血脑屏障):Pe(10^-6cm s^-1)<2.5；

(c)‘CNS+/-’(无法确定是否能够透过血脑屏障):Pe(10^-6cm s^-1):2.5～4.2；

1.溶液的配制

1)0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)：向500mL 0.1M Na₂HPO₄水溶液中缓慢滴加0.1M NaH₂PO₄水溶液，搅拌混匀，用pH计将溶液pH值调至7.4，存储于4℃备用；

2)20mg/ml十二烷/PBL溶液：称取20mg PBL溶于十二烷中，定容至1.0mL；

3)25μg/ml样品待测溶：称取一定量的样品用DMSO配制成5mg/ml的储备液，然后用PBS:乙醇(9:1,体积比)溶液稀释200倍，即得到25μg/ml样品待测溶液；

2.化合物血脑屏障透过能力的分析方法

取4μL 20mg/ml十二烷/PBL溶液均匀分布于96#Multi-well Filter plate的聚偏氟乙烯膜上制成磷脂膜，然后将配好的PBS:乙醇(9:1,体积比)溶液300μL加入到受体池中；取300μL已配好的25μg/ml样品待测溶加入到供体池中，然后将其静置于不受干扰的地方，再将已制备好的受体池缓慢地移至供体池内，形成“三明治”结构；25℃下静于被动扩散10h；扩散实验完毕后，将受体池从供体池中小心取出，并将供体池和受体池的溶液分别移至96#UV透射板内，然后用紫外分光光度计测定其浓度[drug]_Donor和[drug]_Acceptor；根据公式1，计算出化合物的PAMPA-BBB有效渗透率Pe值，并以9个市售药物的实验值和文献值标定化合物BBB有效透过率的可靠性。

化合物4-8的血脑屏障透过率如下述表5所示：

表5：化合物4-8的血脑屏障透过率

^a‘CNS+’(能透过血脑屏障):P_e(10^-6cm·s^-1)>4.2；

‘CNS-’(不能透过血脑屏障):P_e(10^-6cm·s^-1)<2.5；

‘CNS+/-’(不确定):P_e(10^-6cm·s^-1)在2.5和4.2之间

通过体内外乙酰胆碱酯酶的抑制实验，证明了本发明的8-取代氧化异阿朴菲衍生物对乙酰胆碱酯酶具有很强的抑制活性。体外实验中对AChE抑制的IC₅₀值达到微摩尔水平，体内实验表明，化合物能有效抑制Aβ42转基因果蝇脑内的乙酰胆碱酯酶，特别是化合物5和6，它们能使转基因果蝇脑内的乙酰胆碱酯酶降低到正常果蝇水平，甚至更低。同时，无论在体外实验还是细胞水平实验，化合物都表现出明显的抑制Aβ42聚集的活性。化合物的毒性实验数据表明，大部分化合物的对SH-SY5Y细胞的毒性IC₅₀值在100μmol·L^-1左右，其毒性较少。血脑屏障透过率实验表明了化合物具有一定的透过血脑屏障的能力。

Claims (2)

1.具有下述式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物或其药学上可接受的盐在制备Aβ聚集抑制剂药物中的应用；

其中，n＝1～5。

2.具有下述式(I)所示结构的8-取代氧化异阿朴菲衍生物或其药学上可接受的盐在制备同时具有抑制乙酰胆碱酯酶和抗Aβ聚集的药物中的应用；

其中，n＝1～5。