CN105985979A - 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法 - Google Patents
一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105985979A CN105985979A CN201510075992.9A CN201510075992A CN105985979A CN 105985979 A CN105985979 A CN 105985979A CN 201510075992 A CN201510075992 A CN 201510075992A CN 105985979 A CN105985979 A CN 105985979A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- prey
- sequence
- coding gene
- gene sequence
- bait
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法。本发明公开了一种膜外酵母双杂交系统及其应用，所述系统包括钓饵表达载体和猎物表达载体，所述钓饵表达载体包括钓饵表达单元序列，所述钓饵表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得，所述猎物表达载体包括猎物表达单元序列，所述猎物表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得。所述系统可用于研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种新型膜外蛋白酵母双杂交系统及其应用。
背景技术
酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的重要方法之一。该方法基本原理是：将钓饵蛋白和猎物蛋白在酵母菌体中共表达，如果钓饵蛋白和猎物蛋白双方发生相互作用，与双方所融合表达的效应蛋白会重新组装成为有功能的效应蛋白，通过转录报告基因报告钓饵蛋白与猎物蛋白的相互作用。
目前酵母双杂交的各种变体技术可以研究的分子相互作用包括蛋白质间相互作用，蛋白质与核酸相互作用，以及小分子介导的蛋白质相互作用。所涉及的相互作用蛋白质包括胞质蛋白之间、胞质蛋白与膜蛋白之间、膜蛋白之间。
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限。由于其基本原理是基于Gal4蛋白或其他的转录因子的DNA结合部分(DNA Binding Domain，BD)和转录激活部分(Activating Domain，AD)可以断裂后再组合，这势必要求双杂交系统分析的蛋白之间的相互作用发生于细胞核内。一些非核蛋白被系统中的核定位信号强制性地拉到核内，其相互作用很难在其天然状态下检测，特别是膜蛋白之间的相互作用，更是不适合在传统的酵母双杂交系统中进行研究。这限制了酵母双杂交方法在膜蛋白相互作用方面的应用。
也就是说，虽然，酵母双杂交方法对蛋白质相互作用研究做出了突出的贡献，但是该方法目前缺乏能够研究发生在细胞膜外侧的相互作用的技术，包括细胞因子与膜受体，病毒外壳蛋白与膜受体的相互作用。这类相互作用的研究方法的开发对基础研究、药物研发、快速检测方法开发都具有重要意义。
因为这类相互作用的互作双方都存在一定的特殊性：一方为分泌蛋白或病毒外壳蛋白，本身无法与细胞内建立联系，因此目前的酵母双杂交技术无法将其互作信号转化为胞内的宏观生物学效应；而另一方为膜蛋白，离开细胞膜支持通常不具有天然构象。因此不论传统的胞内酵母双杂交技术还是目前的膜蛋白酵母双杂技术都无法完成此类相互作用研究。目前此类研究依赖于放射性标记或酶联标记竞争结合实验、表面离子共振、以及化学交联等方法，这些方法存在通量低，操作繁琐等缺点，无法满足目前的高通量研究需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种膜外酵母双杂交系统，用于研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用。该系统所要研究的目的蛋白质与分泌信号肽、跨膜肽融合表达，通过分泌信号肽将该目的蛋白质分泌至细胞膜外侧，并通过跨膜肽将该目的蛋白嵌入于细胞膜并与内侧的效应蛋白偶联，从而使得所研究的目的蛋白质能够与膜蛋白的胞外结构域发生相互作用，并将该相互作用的信息通过胞内效应蛋白转换成为宏观的生物学效应，通过肉眼观测或检测器获取实验结果。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面公开了一种膜外酵母双杂交系统，所述系统包括钓饵表达载体和猎物表达载体，所述钓饵表达载体包括钓饵表达单元序列，所述钓饵表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得，所述猎物表达载体包括猎物表达单元序列，所述猎物表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得。
优选的，所述分泌信号肽是指一类能够引导蛋白质进入内质网，并进而分泌至胞外的氨基酸序列。所述分泌信号肽为存在于哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞的天然序列或人工设计的能够完成蛋白质分泌出胞的序列。
更优选的，所述分泌信号肽为来自酵母细胞的Wbp1信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体为：
MARVMRTDWNFFFCILLQAIFVVGTQTSRTLVLYSK。
优选的，所述跨膜肽是指一类疏水性极强、能够将融合蛋白嵌合至细胞质膜的氨基酸序列。所述跨膜肽为来源于哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞的天然序列，或人工设计的能够将融合蛋白嵌合至细胞质膜的序列。
更优选的，所述跨膜肽为来自酵母细胞的Wbp1跨膜肽序列，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，具体为为：
TGEFILPDRHGVFTFLTDYRKIGLSFTTDKDVKAIRHLANDEYPRSWEISNSWVYISAICGVIVAWIFFVVSFVTTSSVGKKLETFKKT。
优选的，所述胞内效应蛋白结构域是指任何互补后产生功能的蛋白结构域，所产生的效应包括产生发荧光能力、释放转录因子转录报告基因、以及产生化学发光功能。
更优选的，所述胞内效应蛋白结构域为荧光蛋白C端与N端结构域、泛素蛋白C端与N端结构域或萤光素酶N端与C端结构域。
优选的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白EGFP、黄色荧光蛋白YFP。
优选的，泛素蛋白C端与N端结构域为泛素蛋白Cub和NubG结构域，Cub末端连接转录因子GAL4或LexA-VP16。
所述泛素蛋白C端结构域Cub的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为GIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG。
所述泛素蛋白N端结构域NubG的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为
MQIFVKTLTGKTGTLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIP。
所述转录因子GAL4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为KLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAELIPEPPKKKRKVELGTAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKE。
优选的，所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、钓饵编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列。(如图2A所示)。其中，所述钓饵表达单元所表达的分泌信号肽负责将钓饵表达并分泌至细胞膜外，跨膜肽负责连接胞外的钓饵与胞内效应蛋白结构域。(如图2B所示)。含有所述钓饵表达序列的钓饵表达载体更适合单一钓饵的表达。
本发明的实施例中列举的钓饵表达载体中，所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、钓饵蛋白编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列。所述分泌信号肽为来自酵母细胞的Wbp1信号肽序列，其氨基酸序列为：
MARVMRTDWNFFFCILLQAIFVVGTQTSRTLVLYSK(SEQ ID NO.1所示)。所述跨膜肽序列为来自酵母细胞的Wbp1跨膜肽序列，其氨基酸序列为：
TGEFILPDRHGVFTFLTDYRKIGLSFTTDKDVKAIRHLANDEYPRSWEISNSWVYISAICGVIVAWIFFVVSFVTTSSVGKKLETFKKT(SEQ ID NO.2所示)。所述胞内效应蛋白为荧光蛋白结构域或泛素蛋白C端与N端结构域。
优选的，所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、钓饵蛋白编码基因序列。(如图2C所示)。含有所述钓饵表达单元序列的钓饵表达载体更适合表达文库的构建。
上述两种钓饵表达载体均能够将钓饵表达至胞外，但是两者所表达的钓饵的N末端朝向相反。但是两种钓饵表达载体均能够将那些N、C端同时在细胞质膜外侧的膜蛋白准确表达于细胞膜上。
优选的，所述钓饵表达载体是将所述诱饵表达单元克隆至具有筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得。更优选的，所述具有筛选标签的酵母表达质粒为pGAD-T7质粒。
具体的，本发明钓饵表达载体的制备方法为：通过PCR的方法在钓饵表达单元的两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将钓饵表达单元插入具有筛选标签的酵母表达质粒，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本发明的钓饵表达载体。所述具有筛选标签的酵母表达质粒pGAD-T7质粒。
优选的，所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、猎物编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列。含有所述所述猎物表达单元序列的猎物表达载体用于表达可溶性蛋白。
优选的，所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、猎物编码基因序列。含有所述所述猎物表达单元序列的猎物表达载体用于表达可溶性蛋白。
上述两种猎物表达载体所表达的猎物的N末端朝向相反。但是两种猎物表达载体均能够将那些N、C端同时在细胞质膜外侧的蛋白准确表达于细胞膜上。
优选的，所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、猎物编码基因序列。所述猎物表达单元所表达的猎物的N端在胞内。(如图3A所示)。含有所述猎物表达单元序列的猎物表达载体用于表达膜结合蛋白或表达文库。
本发明的一个优选实施例中列举的猎物表达载体中，胞内效应蛋白结构域为泛素蛋白N端结构域NubG。
优选的，所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、猎物编码基因序列。所述猎物表达单元所表达的猎物的N端在胞外。融合一段跨膜肽，能够使得胞内效应蛋白结构域保留在胞内。(如图3B所示)。含有所述猎物表达单元序列的猎物表达载体用于表达膜结合蛋白或表达文库。
本发明的一个优选实施例中列举的猎物表达载体中，胞内效应蛋白结构域为泛素蛋白N端结构域NubG。
优选的，所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的猎物编码基因序列、胞内效应蛋白结构域编码基因序列。所述猎物表达单元所表达的猎物的C端在胞内。(如图3C所示)。
本发明的一个优选实施例中列举的猎物表达载体中，胞内效应蛋白为荧光蛋白。
本发明的另一个优选实施例中列举的猎物表达载体中，胞内效应蛋白结构域为泛素蛋白N端结构域NubG。
优选的，所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的猎物蛋白编码基因序列、跨膜肽编码基因序列，胞内效应蛋白N端结构域编码基因序列。所述猎物表达载体所表达的猎物的C端在胞外。融合一段跨膜肽，能够使得胞内效应蛋白N端结构域保留在胞内。(如图3D所示)。
本发明的一个优选实施例中列举的猎物表达载体中，胞内效应蛋白结构域为泛素蛋白N端结构域NubG。
优选的，所述猎物表达载体将所述猎物表达单元克隆至具有筛选标签筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得。优选的，所述具有筛选标签筛选标签的酵母表达质粒是pGBK-T7质粒。
具体的，猎物表达载体的制备方法为：通过PCR的方法在猎物表达单元的两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将猎物表达单元插入具有筛选标签筛选标签的酵母表达质粒，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本发明的猎物表达载体。所述具有筛选标签筛选标签的酵母表达质粒优选pGBK-T7。
需要说明的是钓饵与猎物为相对称呼，两者在本质上没有区别。
优选的，所述钓饵或猎物为细胞因子、病毒外壳蛋白或能够表达为上述物质的遗传物质。
优选的，在一些实施方式中，所指的细胞膜包括真核、原核活体细胞的细胞质膜，或细胞破碎后提取的细胞质膜成分。
进一步的，所述膜外酵母双杂交系统还包括酵母菌株Y2HGold。
膜蛋白酵母双杂交系统的技术体系和实现步骤相对比较复杂，这主要体现在诱饵蛋白的表达需要在细胞上准确定位。也就说说与诱饵蛋白融合的效应蛋白结构域必须位于在细胞膜内，才能启动下游反应，进而实现胞内效应蛋白转换成为宏观的生物学效应。现有的膜蛋白双杂交系统可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用。任何一种膜蛋白都可以作为诱饵，能使与待测蛋白融合的相互作用模块定位在细胞质内。现有系统所研究的蛋白质融合表达的效应蛋白结构域端必须定位于胞质内，才能激活报告基因的表达。因此，并非所有的膜蛋白都适用该系统，比如那些N、C端同时在细胞质膜外侧或内质网腔内的蛋白质则不适用这种方法。
然而，如前所述，采用本发明的膜外酵母双杂交系统，则能够将那些N、C端同时在细胞质膜外侧或内质网腔内的蛋白准确表达于细胞膜上，从而研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用。
本发明第二方面还公开了一种研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用的方法，所述蛋白中至少有一种是膜外蛋白，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将目的蛋白作为诱饵，构建诱饵表达载体：将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得钓饵表达单元序列，并将所述诱饵表达单元克隆至具有筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得表达诱饵的诱饵表达载体；
(2)将与目的蛋白互作的蛋白作为猎物，构建猎物表达载体：将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得猎物表达单元序列，并将所述猎物表达单元克隆至具有筛选标签筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得表达猎物的猎物表达载体；
(3)将步骤(1)或的诱饵表达载体和步骤(2)获得的猎物表达载体共转化酵母中，筛选，分析相互作用情况。
优选的，所述方法还包括以下特征中的任一项或多项：
a)所述分泌信号肽为来自酵母细胞的Wbp1信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
b)所述跨膜肽为来自酵母细胞的Wbp1跨膜肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
c)所述胞内效应蛋白结构域为荧光蛋白C端与N端结构域、泛素蛋白C端与N端结构域或萤光素酶N端与C端结构域。
优选的，步骤(1)中，所述钓饵表达单元序列还包括以下特征中的任一项：
a)所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、钓饵编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列；
b)所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、钓饵蛋白编码基因序列。
优选的，步骤(2)中，所述猎物表达单元还包括以下特征中的任一项：
a)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、猎物编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列；
b)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、猎物编码基因序列；
c)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、猎物编码基因序列；
d)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、猎物编码基因序列；
e)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的猎物编码基因序列、胞内效应蛋白结构域编码基因序列；
f)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的猎物蛋白编码基因序列、跨膜肽编码基因序列，胞内效应蛋白N端结构域编码基因序列。
优选的，步骤(1)中所述具有筛选标签的酵母表达质粒为p GBKT7。步骤(2)中，所述具有编码筛选标签基因的酵母表达质粒为p GADT7。步骤(3)中，所述酵母菌株为Y2HGold。
本发明第三方面公开了前述的膜外酵母双杂交系统或方法在研究发生细胞膜外侧的蛋白相互作用的应用。
优选的，所述发生细胞膜外侧的蛋白相互作用具体是指分泌蛋白或病毒外壳蛋白与膜蛋白之间的相互作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明能够用于非膜结合蛋白之间或非膜结合蛋白与膜结合蛋白之间的相互作用研究和高通量相互作用酵母双杂交筛查。
附图说明
图1：酵母双杂交(YTH)和重要的变体。(a)经典酵母双杂交。钓饵蛋白(绿色)和转录因子的DNA结合结构域融合，猎物蛋白(红色)或猎物蛋白表达文库和激活结构域(DBD)融合。钓饵蛋白与猎物蛋白相互作用介导产生有功能的转录因子，导致报告基因表达，用于阳性筛选。YTH转录因子通常是GAL4或者LexA激活蛋白。(b)膜酵母双杂交系统。猎物蛋白与泛素碳末端结构域(Cub)融合表达，并随后融合一个转录因子(TF)，猎物蛋白(膜蛋白或胞质蛋白)与泛素氮末端结构域融合(Nub)。猎物蛋白与钓饵蛋白互作，重组出活性的泛素，其C末端的转录因子被内源性泛素特异性蛋白酶切开，进入细胞和激活报告基因转录。(c)分裂的TEV系统。烟草蚀纹病毒蛋白酶在钓饵蛋白和猎物蛋白互作时被重组，TEV识别特定序列，并释放转录因子。(d)哺乳动物蛋白质互作陷阱(MAPPIT)，钓饵蛋白与细胞因子受体突变体(灰色)融合，单独并不能募集STAT3转录因子，猎物蛋白与功能性受体融合，其上含有STAT3停泊微点(绿色)，钓饵蛋白与猎物蛋白相互作用导致STAT3转录因子磷酸化，磷酸化的STAT3转移至细胞核，激活报告基因。(引自Bernhard Suter et al.2008,Current Opinion in Biotechnology)
图2：钓饵蛋白-跨膜肽-效应蛋白表达模式图
图3：膜蛋白作为猎物蛋白的载体构建模式图
图4：钓饵蛋白与猎物蛋白互作示意图
图5：CXCL12钓饵蛋白的载体构建与表达定位
图6：CXCR受体家族猎物蛋白载体构建和表达定位
图7：趋化因子CXCL12受体互作研究。(A)CXCL12-Cub-GAL4载体构建示意图。CXCL12成熟肽编码序列与分泌信号肽、跨膜信号肽、Cub、GAL4转录因子融合构成钓饵蛋白编码框；(B)受体-Nub载体构建示意图。受体基因(7次跨膜受体)C末端融合泛素蛋白N端结构域(Nub)。(C)相互作用示意图。钓饵蛋白表达并结合于细胞膜上，其中CXCL12基因定位于细胞膜外侧，效应蛋白定位于细胞膜内侧；受体基因同样定位于细胞膜上，并且其融合的Nub表达与细胞膜内侧。(D)杂交细胞表型鉴定结果。将含有钓饵质粒的菌株分别与含有不同猎物蛋白的菌株杂交，将杂交细胞等量滴加于营养缺陷型平板(SD/Leu-Trp-His-Ade-X-gal+)上培养，培养48～72小时，观察菌落大小差异和底物显色浓度差异。
图8：乙肝病毒肝细胞受体筛查。(A)钓饵蛋白表达质粒结构示意图。乙肝病毒外壳蛋白preS1/S2/S作为钓饵蛋白和分泌信号肽和跨膜信号肽融合，跨膜信号肽末端融合泛素蛋白C端结构域和转录因子构成钓饵蛋白编码框；(B)肝细胞表达文库质粒结构示意图。肝脏cDNA分别以两种方式构建表达文库：(1)N端融合NubG和跨膜信号肽；(2)N段仅融合NubG，两种融合方式将形成不同的跨膜结构。(C)两种文库与钓饵蛋白相互作用示意图。文库(1)中猎物蛋白N端在细胞膜外侧，因此通过一个跨膜肽形成正确的跨膜方向，因而能够与钓饵蛋白结合；文库(2)猎物蛋白N端在细胞膜内侧，因此不需要跨膜肽过渡，即可直接形成正确的跨膜方向，与钓饵蛋白结合。(D)表达钓饵蛋白的细胞与酵母文库杂交，使用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆结果(蓝色克隆)。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。
实施例1.CXCL12钓饵蛋白的载体构建与表达定位
目的：通过将CXCL12基因与信号肽基因、跨膜肽基因融合表达，达到定位于细胞膜的效果。
质粒构建：将小鼠趋化因子CXCL12成熟肽编码序列(SEQ ID NO.5所示，具体为：KPVSLSYRC PCRFFESHIA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQEYLEKALNK)扩增并测序，与分泌信号肽序列(来自酵母Wbp1信号肽序列，SEQ ID NO.1所示，具体为：
MARVMRTDWNFFFCILLQAIFVVGTQTSRTLVLYSK)和跨膜信号肽序列(来自酵母Wbp1跨膜肽序列，SEQ ID NO.2所示，具体为：
TGEFILPDRHGVFTFLTDYRKIGLSFTTDKDVKAIRHLANDEYPRSWEISNSWVYISAICGVIVAWIFFVVSFVTTSSVGKKLETFKKT)融合，其后连接绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，整个融合蛋白克隆至酵母表达载体pGAD-T7中，形成如图5A所示结构，记为CXCL12-EGFP质粒。
融合蛋白跨膜结构预测：使用TMHMM2.0在线分析软件分析融合蛋白的跨膜拓扑结构。软件计算结果表明，该融合蛋白能够达成将CXCL12蛋白部分表达至细胞膜外侧，并通过跨膜肽与细胞膜内侧EGFP连接的拓扑结构(图5B)。
质粒转染：通过LiAc转化方法转化CXCL12-EGFP质粒至GoldY2H细胞株(MATα,Trp1-901,Leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-Gal2TATA-His3,GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2,URA3::MEL1USA-Mel1TATA,AUR1-C,MEL1)，转化子在SD Leu-营养缺陷型培养基上30摄氏度筛选5天。
细胞定位观察：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的细胞定位。如图5C所示，观察结果显示，细胞膜表面有明显的绿色荧光信号，证明CXCL12钓饵蛋白能够如所预测的正确表达在细胞膜表面。
实施例2.CXCR受体家族猎物蛋白载体构建与定位
目的：明确CXCR受体在酵母细胞中的表达定位。
载体构建：将CXCR受体家族7个成员基因克隆，并与黄色荧光蛋白(YFP)融合，克隆至酵母表达载体pGBK-T7中(图6A)，记为：CXCRx-YFP质粒。其中，CXCR受体家族7个成员的相关信息详见：
1)CXCR1参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/Q810W6；
2)CXCR2参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/P35343；
3)CXCR3参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/O88410；
4)CXCR4参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/P70658；
5)CXCR5参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/Q04683；
6)CXCR6参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/Q9EQ16；
7)CXCR7参考HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/P56485；
融合蛋白跨膜结构预测：使用TMHMM2.0在线分析软件分析融合蛋白的跨膜拓扑结构。软件计算结果表明，该融合蛋白能够将受体蛋白正确表达至细胞膜，并将C端所融合的YFP蛋白表达至胞内(图6B)。
质粒转染：通过LiAc转化方法转化CXCRx-YFP质粒至Y187细胞株，转化子在SD-Trp-营养缺陷型培养基上30摄氏度筛选5天。挑选单克隆菌株用于荧光观察。
细胞定位观察：使用激光共聚焦显微镜，以514nm激发光观察YFP的细胞定位。观察结果显示，所有受体家族成员的菌株细胞膜表面均有明显的黄色荧光信号，证明CXCRx钓饵蛋白能够如所预期地正确表达在细胞膜表面。
实施例3.CXCL12与CXCR受体家族相互作用筛查
实施例目的：研究CXCL12与CXCR受体家族成员的相互作用
原理：当配体基因CXCL12与受体基因发生相互作用时，细胞内测泛素Cub和Nub结构域即被拉近，形成有活性的完整泛素蛋白，随后被细胞内源性泛素特异性蛋白酶消化，释放Cub末端所连接转录因子GAL4，进入细胞核转录报告基因His3、Ade2和LacZ。前两个报告基因帮助细胞在SD-His-Ade-营养缺陷培养基上生长，后者催化培养基中X-a-gal底物显色。
质粒构建：CXCL12-Cub-GAL4质粒构建：
将小鼠趋化因子CXCL12成熟肽编码序列(SEQ ID NO.5所示，具体为：KPVSLSYRCPCRFFESHIARANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQVCIDPKLKWIQ EYLEKALNK)
与分泌信号肽序列(来自酵母Wbp1信号肽序列，SEQ ID NO.1所示，具体为：MARVMRTDWNFFFCILLQAIFVVGTQTSRTLVLYSK)
和跨膜信号肽序列(来自酵母Wbp1跨膜肽序列，SEQ ID NO.2所示，具体为：TGEFILPDRHGVFTFLTDYRKIGLSFTTDKDVKAIRHLANDEYPRSWEISNSWVYISAICGVIVAWIFFVVSFVTTSSVGKKLETFKKT)
融合，其后连接泛素蛋白C端结构域Cub(SEQ ID NO.3所示，具体为：GIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG)
和酵母转录因子GAL4(SEQ ID NO.4所示，具体为：
KLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAELIPEPPKKKRKVELGTAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKE)，整个融合蛋白克隆至酵母表达载体PGAD-T7中，形成如图:7A所示结构，记为CXCL12-Cub-GAL4质粒。
CXCRx-Nub质粒构建：将CXCR受体家族7个成员基因(CXCR受体家族7个成员的相关信息同实施例2中所述)分别构建猎物蛋白表达载体，载体中受体基因末端与泛素蛋白N端结构域(NubG)融合，所述泛素蛋白N端结构域NubG的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为MQIFVKTLTGKTGTLEVESSDTIDNVKSKIQDKEGIP。其表达的蛋白结构如图7B所示。所得质粒记为：CXCRx-Nub质粒。
对照载体构建：
阴性对照：
使用无关的酵母膜蛋白质OST1(HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/P41543)融合NubG构成阴性对照载体，因为OST与CXCL12理论上无相互作用(见图7C)。
阳性对照：
使用酵母膜蛋白Wbp1(HTTP://WWW.UNIPROT.ORG/UNIPROT/P33767)融合完整泛素蛋白Ubi和GAL4作为阳性对照(见图7C)。
质粒转染：通过LiAc转染方法转染质粒至相应细胞株，CXCL12-Cub-GAL4质粒转染至GoldY2H菌株，CXCRx-Nub质粒转化至Y187菌株。菌株分别在SD Leu-和SD Trp-营养缺陷型培养基上30摄氏度培养5d。
双杂交实验：表达载体分别转染至GoldY2H酵母菌株和Y187酵母菌株。将含有钓饵表达质粒的GoldY2H菌株和含猎物表达载体的菌体用YPD重悬，等量混合，过夜培养，将少量杂交的菌液涂布于SD Leu-Trp-双缺陷培养基，培养3d，获得二倍体杂合酵母。
表型检测：将二倍体酵母涂布于SD Leu-Trp-Ade-His—X-a-gal四缺培养基，培养3～7天，观察菌落生长和显色情况。
结果：配体基因CXCL12与各受体基因间存在不同程度的相互作用，其中与CXCRR4和CXCRR7存在最强的相互作用，而与CXCRR3之间几乎不存在相互作用；阴性对照无菌落生长，阳性对照菌落明显生长，并伴随底物显色，说明该实验系统正确可靠，本方法能够定性的研究趋化因子与受体间的相互作用(图7D)。
实施例4乙肝病毒外壳蛋白的受体筛选
实施例目的：筛选人乙肝病毒(HBV)外壳蛋白受体基因。
原理：HBV通过其病毒外壳蛋白与肝细胞表面受体结合从而侵入肝细胞，因此明确HBV受体对于预防和治疗乙肝具有重要意义。使用本发明的研究方案，将HBV外壳蛋白与分泌肽、跨膜肽以及胞内效应蛋白融合构建钓饵蛋白，将肝脏cDNA构建表达文库(猎物蛋白文库)。通过酵母双杂交使钓饵蛋白宿主菌与肝脏基因表达文库宿主菌杂交，一旦钓饵蛋白与猎物蛋白相互作用，胞内效应蛋白结构域互补，释放转录因子转录报告基因，通过营养缺陷型培养基筛查，获得阳性相互作用菌落，最后通过提取质粒、测序获得猎物蛋白序列。
钓饵蛋白载体构建：
将人乙肝病毒外壳蛋白基因preS1/S2/S(SEQ ID NO.6所示，具体为：MGGWSSKPRQGMGTNLSVPN PLGFFPGHQL DPAFGANSNN PDWDFNPNKD QWPAANQVGVGSFGPGFTPP HGNLLGWSPQ AQGILTTVPA APPPASTNRQ SGRQPTPISP PLRDSHPQAMQWNSSTFHQA LLDPRVRGLY FPAGGSSSGT VNPVPTTASP ISSIFSRTGD PAPNMESTTSGFLGPLLVLQ AGFFLLTRIL TIPQSLDSWW TSLNFLGGAP TCPGQNLQSP TSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFI LLLCLIFLLV LLDYQGMLPV CPLLPGTSTT STGPCKTCTIPAQGTSMFPS CCCTKPSDGN CTCIPIPSSW AFARFLWEWA SVRFSWLSLLVPFVQWFVGL SPTVWLSVIW MMWYWGPSLY NILNPFLPLL PIFFCLWVYI)
按照图8A所示与酵母Wbp1信号肽(来自酵母Wbp1信号肽序列，SEQ ID NO.1所示，具体为：
MARVMRTDWNFFFCILLQAIFVVGTQTSRTLVLYSK)、
跨膜肽(来自酵母Wbp1跨膜肽序列，SEQ ID NO.2所示，具体为：
TGEFILPDRHGVFTFLTDYRKIGLSFTTDKDVKAIRHLANDEYPRSWEISNSWVYISAICGVIVAWIFFVVSFVTTSSVGKKLETFKKT)、
泛素蛋白C端结构域Cub(SEQ ID NO.3所示，
具体为：GIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG)、(SEQ ID NO.4所示，具体为：
KLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAELIPEPPKKKRKVELGTAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKE)
构成融合蛋白(HBVe-Cub-Gal4)，形成表达于细胞膜上的跨膜蛋白。
猎物蛋白表达文库构建：另一方面，使用人肝脏cDNA按照图8B所示方式建立酵母表达文库。文库有两种构建模式，第一种是按照泛素蛋白N端结构域(Nub)、跨膜肽、cDNA顺序融合，该融合方式针对N末端位于细胞外的受体基因(图5C左)；第二种是将Nub、cDNA两部分序列直接融合，该融合方式针对N末端位于细胞质膜内测的受体(图7C右)。这两种融合蛋白方式可以将不同类型的膜蛋白以正确的方向定位于细胞膜，并且与胞内效应蛋白偶联。
杂交筛选：将转化有HBVe-Cub-Gal4的酵母与酵母文库杂交，在含有15mM 3-AT(杀草强)的SD Leu-Trp-Ade-His—X-a-gal营养缺陷型培养基上筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养并提取质粒送测序鉴定。
结果：通过营养缺陷型培养基生长和显色筛选，筛选出阳性克隆15个(部分结果见图8D)，经过测序鉴定获得基因7条。7条基因通过后续一系列实验验证均能够与病毒外壳蛋白基因preS1/S2/S互作。
Claims (9)
1.一种膜外酵母双杂交系统，所述系统包括钓饵表达载体和猎物表达载体，所述钓饵表达载体包括钓饵表达单元序列，所述钓饵表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得，所述猎物表达载体包括猎物表达单元序列，所述猎物表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得。
2.根据权利要求1所述的膜外酵母双杂交系统，其特征在于，所述系统还包括以下特征中的任一项或多项：
(1)所述分泌信号肽为来自酵母细胞的Wbp1信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)所述跨膜肽为来自酵母细胞的Wbp1跨膜肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)所述胞内效应蛋白结构域为荧光蛋白C端与N端结构域、泛素蛋白C端与N端结构域或萤光素酶N端与C端结构域。
3.根据权利要求1所述的膜外酵母双杂交系统，其特征在于，所述钓饵表达单元序列还包括以下特征中的任一项：
a)所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、钓饵编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列；
b)所述钓饵表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、钓饵蛋白编码基因序列。
4.根据权利要求1所述的膜外酵母双杂交系统，其特征在于，所述猎物表达单元序列还包括以下特征中的任一项：
a)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的分泌信号肽编码基因序列、猎物编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列；
b)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、猎物编码基因序列；
c)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、猎物编码基因序列；
d)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的胞内效应蛋白结构域编码基因序列、跨膜肽编码基因序列、猎物编码基因序列；
e)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的猎物编码基因序列、胞内效应蛋白结构域编码基因序列；
f)所述猎物表达单元序列含有从N端到C端依次排列的猎物蛋白编码基因序列、跨膜肽编码基因序列，胞内效应蛋白N端结构域编码基因序列。
5.根据权利要求1所述的膜外酵母双杂交系统，其特征在于，所述钓饵表达载体是将所述诱饵表达单元克隆至具有筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得；所述猎物表达载体将所述猎物表达单元克隆至具有筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得。
6.根据权利要求1所述的膜外酵母双杂交系统，其特征在于，所述系统还包括酵母菌株Y2HGold、Y187中的至少一种。
7.一种研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用的方法，所述蛋白中至少有一种是膜外蛋白，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将目的蛋白作为诱饵，构建诱饵表达载体：将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得钓饵表达单元序列，并将所述诱饵表达单元克隆至具有筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得表达诱饵的诱饵表达载体；
(2)将与目的蛋白互作的蛋白作为猎物，构建猎物表达载体：将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得猎物表达单元序列，并将所述猎物表达单元克隆至具有筛选标签的酵母表达质粒上，构建获得表达猎物的猎物表达载体；
(3)将步骤(1)或的诱饵表达载体和步骤(2)获得的猎物表达载体分别转化至不同结合型酵母菌株进行双杂交，或共转化至酵母中，筛选，分析相互作用情况。
8.根据权利要求1-6任一权利要求所述的膜外酵母双杂交系统或权利要求7所述的方法在研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用具体是指分泌蛋白或病毒外壳蛋白与膜蛋白之间的相互作用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510075992.9A CN105985979B (zh) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510075992.9A CN105985979B (zh) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105985979A true CN105985979A (zh) | 2016-10-05 |
| CN105985979B CN105985979B (zh) | 2020-03-24 |
Family
ID=57041255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510075992.9A Active CN105985979B (zh) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105985979B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1384878A (zh) * | 1999-09-02 | 2002-12-11 | 耶达研究发展有限公司 | Iren蛋白,其制备和应用 |
| US7700728B2 (en) * | 2005-03-24 | 2010-04-20 | Schering Corporation | Use of chimeric receptors in a screening assay for identifying agonists and antagonists of cell receptors |
| CN103290034A (zh) * | 2012-03-01 | 2013-09-11 | 华中农业大学 | 一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因及应用 |
-
2015
- 2015-02-12 CN CN201510075992.9A patent/CN105985979B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1384878A (zh) * | 1999-09-02 | 2002-12-11 | 耶达研究发展有限公司 | Iren蛋白,其制备和应用 |
| US7700728B2 (en) * | 2005-03-24 | 2010-04-20 | Schering Corporation | Use of chimeric receptors in a screening assay for identifying agonists and antagonists of cell receptors |
| CN103290034A (zh) * | 2012-03-01 | 2013-09-11 | 华中农业大学 | 一种参与豆科植物共生结瘤的泛素连接酶基因及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105985979B (zh) | 2020-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69532127T2 (de) | Interaktions-fullensysteme zum nachweis von protein-interaktionen | |
| Khmelinskii et al. | Seamless gene tagging by endonuclease-driven homologous recombination | |
| JP7419248B2 (ja) | ペリプラズム空間中におけるタンパク質の酵母ディスプレイ | |
| Vidal | The reverse two-hybrid system | |
| US20180187272A1 (en) | G-protein coupled receptor (gpcr)-based biosensors and uses thereof | |
| Zhang et al. | Manipulating the 3D organization of the largest synthetic yeast chromosome | |
| Jansen et al. | Identification of host factors binding to dengue and Zika virus subgenomic RNA by efficient yeast three-hybrid screens of the human ORFeome | |
| US10704040B2 (en) | Triple-mode system for antibody maturation, surface display and secretion | |
| CN105985979A (zh) | 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法 | |
| Barreto et al. | Screening combinatorial libraries of cyclic peptides using the yeast two-hybrid assay | |
| Durfee et al. | New tools for protein linkage mapping and general two‐hybrid screening | |
| WO2015163745A1 (ko) | 바코드 이동 분석을 위한 이중 리포터 시스템을 보유한 효모 균주 | |
| Hastie et al. | Yeast two-hybrid interaction partner screening through in vivo Cre-mediated Binary Interaction Tag generation | |
| Serebriiskii et al. | Analysis of protein-protein interactions utilizing dual bait yeast two-hybrid system | |
| Zapanta Rinonos et al. | Sequential logic of polarity determination during the haploid-to-diploid transition in Saccharomyces cerevisiae | |
| EP1131419A1 (en) | Methods for validating polypeptide targets that correlate to cellular phenotypes | |
| KR100785417B1 (ko) | 폴리펩티드 기능 분석용 시스템 및 분석방법 | |
| RU2802770C2 (ru) | Дрожжевой дисплей белков в периплазматическом пространстве | |
| US20220112470A1 (en) | Systems and methods for metabolic engineering | |
| Wang et al. | A novel genetic system based on zinc finger nucleases for the identification of interactions between proteins in vivo | |
| Shen | Rapid Evolution by Scrambling Semisynthetic Yeast Genomes | |
| EP1847604A1 (en) | Intracellular method for selecting a peptide or polypeptide which binds to a bait peptide or polypeptide | |
| Meng et al. | Engineered yeast multicellularity via synthetic cell-cell adhesion and direct-contact signalling | |
| Möckli | Development of a split-ubiquitin based, cytosolic yeast two-hybrid system and its application to the structure-function analysis of scUri1p | |
| ETH | Development of split-ubiquitin based |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |