CN105985431A - 结合近红外染料的转铁蛋白及含该蛋白的光声成像用造影剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供呈现在近红外波长区中的高吸收系数，高肿瘤蓄积性，高肿瘤/血中比和高成像对比度的新的结合近红外染料的转铁蛋白，及包括所述转铁蛋白的光声成像用造影剂。本发明提供转铁蛋白和具有吸收近红外波长区的光的特定的结构的有机染料共价结合的化合物。
Description
【技术领域】
本发明涉及结合近红外染料的转铁蛋白，及包括结合近红外染料的转铁蛋白的光声成像用造影剂。
【背景技术】
光声层析成像(在下文中,有时缩写为"PAT")设备已知为可视化活体内信息的设备之一。在使用PAT设备的测量中，可通过测量当向待测量对象照射光时，在待测量对象中吸收光的物质(光学吸收体)所发射的光声信号的强度和产生时间来获得计算待测量对象中的物质分布的图像。
作为光学吸收体，可使用在活体内吸收光及发射声波的任何物质。例如，可采用人身体中的血管或恶性肿瘤作为光学吸收体。此外，也可将吲哚氰绿(在下文中,有时缩写为"ICG")等分子施用进身体，及作为造影剂利用。ICG良好吸收近红外波长区的光，照射到人身体时影响小、且具有高活体通透性的光，由此在PAT设备中可适宜地作为造影剂(有时缩写为"光声造影剂")使用。在本说明书中，ICG指称以下式的结构表示的化合物。
在本文中，对离子可不是Na+，及可使用任何对离子诸如H+或K+。
已知，，但是，ICG在血中具有约几分钟的非常短的半衰期。
NPL 1(Photochemistry and Photobiology,72,234～241(2000))和NPL 2(Molecular Imaging,6,85～95(2007))各公开了作为血清蛋白(有时缩写为"TF")的，使吸收近红外波长区的光的有机染料(在下文中,有时缩写为"近红外染料")结合到转铁蛋白的化合物。在本文中的近红外染料是指吸收近红外波长区的光的有机染料。近红外波长区的光在本文是指600nm～1300nm波长的光。
在NPL 1中公开的结合了近红外染料的转铁蛋白中，要固定的染料的数是2.4个/分子，和该染料是在分子内具有多个磺酸的亲水近红外染料。化合物被显示作为肿瘤的荧光造影剂。根据描述于此文献中的动物实验结果，肿瘤和正常组织之间的荧光对比度(在下文中,有时缩写为"成像对比度")在施用后24小时时是1.9，及光声肿瘤成像需求对比度的进一步增强。
在NPL 2中公开的结合了Alexa Fluor(注册商标)680染料的转铁蛋白中，要固定的染料的数是2个/分子，和该染料是在分子中具有多个磺酸的亲水近红外染料。如下在本文比较例中所述，NPL 2中公开的结合了Alexa Fluor(注册商标)680染料的转铁蛋白的肿瘤和正常组织之间的成像对比度在施用后24小时时是1.2，及光声肿瘤成像需求对比度的进一步增强。
因此，需求呈现在近红外波长区中的高吸收系数，高肿瘤蓄积性，高肿瘤/血中比和高成像对比度的化合物作为光声肿瘤造影剂。
本发明考虑到这些问题而进行，且旨在提供呈现在近红外波长区中的高吸收系数，高肿瘤蓄积性，高肿瘤/血中比和高成像对比度的新的结合近红外染料的转铁蛋白。
【发明概述】
本发明的光声成像用造影剂包括结合近红外染料的转铁蛋白，其中转铁蛋白和具有特定的结构的近红外染料结合。
另外，本发明的光声成像用造影剂包括以下式(I)表示的化合物。
TF-(L-D)n (I)
在式(I)中，TF表示转铁蛋白，L表示接头，D表示近红外染料，n表示1以上的数，和L任选地缺失。
在式(I)中，D由以下式(d1)～(d4)之任一个表示。
在式(d1)中，L11，L12，L13，L14和L15可各相同或不同，且表示CH或CR15，及R15表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L11，L12，L13，L14和L15可一起形成4-元环～6-元环。R11，R12，R13和R14可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD1-SO3 -或-RE1-SO3X11。RD1和RE1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X11表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC1-SO3 -，-RG1-SO3X15或-RF1-CO2X14。X14和X15表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC1，RF1和RG1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子。RB1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。Z11表示氢原子，或与结合于Z11的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(d2)中，L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可各相同或不同，且表示CH或CR105，及R105表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可一起形成4-元环～6-元环。R101，R102，R103和R104可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD11-SO3 -或-RE11-SO3X101。RD11和RE11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X101表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC11-SO3 -，-RG11-SO3X105或-RF1-CO2X104。X104和X105表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC11，RF11和RG11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子。RB11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。Z101表示氢原子，或与结合于Z101的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(d3)中，R201～R212可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，或-SO3X24。X24表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。L21，L22，L23，L24和L25可各相同或不同，且表示CH或CR25，及R25表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L21，L22，L23，L24和L25可一起形成4-元环～6-元环。R21，R22，R23和R24可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD2-SO3 -或-RE2-SO3X21。RD2和RE2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X21表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC2-SO3 -，-RG2-SO3X25或-RF2-CO2X26。X25和X26表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC2，RF2和RG2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可作为对离子包括卤素离子诸如氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子诸如乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子。RB2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(d4)中，R301～R312可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，或-SO3X34。X34表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可各相同或不同，且表示CH或CR35，及R35表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可一起形成4-元环～6-元环。R31，R32，R33和R34可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD3-SO3 -或-RE3-SO3X31。RD3和RE3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X31表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC3-SO3 -，-RG3-SO3X35或-RF3-CO2X34。X34和X35表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC3，RF3和RG3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可作为对离子包括卤素离子诸如氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子诸如乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子。RB3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(I)中，当包括L时，L由以下式(l1)～(l5)之任一个表示。
在式(l1)～(l5)中，*表示与转铁蛋白或近红外染料结合。在式(l1)中，n在1～500的范围内，及可在1～120的范围内。当考虑与转铁蛋白受体的结合能力时，式(l1)中的n可在1～50的范围内。
参照附图，从以下例示实施方式的说明可知本发明的进一步特征。
【附图说明】
图1是显示在施用在本发明的实施例中制备的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)，及在比较例中的ICG和在比较例中的AlexaFluor 680-TF(2.0)之后24小时时各携带癌的小鼠的荧光像的图。各箭标指示肿瘤位点。
【实施方式】
以下根据附图详细描述本发明的优选的实施方式。
对于根据本发明的一实施方式的化合物，及包括该化合物的光声成像用造影剂(在下文中,有时缩写为"PAI")进行描述。
在本实施方式的化合物中，转铁蛋白和近红外染料(具有特定的结构的有机染料)共价结合。即，本实施方式提供结合近红外染料的转铁蛋白。在本文中，近红外波长区的光是指600nm～1300nm波长的光。
近红外染料诸如ICG，在向血中施用时吸附于血中的蛋白，及容易自身体清除。结果，近红外染料，甚至当单独向活体血中施用时，也血中滞留性低和肿瘤蓄积性低。因此，当近红外染料作为光声成像用造影剂单独使用时，自肿瘤产生的光声信号强度低。
另一方面，在本实施方式的化合物中，近红外染料与转铁蛋白共价结合，由此转铁蛋白抑制血中蛋白吸附于近红外染料。因此，本实施方式的化合物，甚至当在活体血中施用时，难以吸附于血中蛋白，及难以自身体清除。此外，转铁蛋白具有经在癌细胞中高度表达的转铁蛋白受体被摄取到细胞的性质，由此相比单独施用近红外染料时，该化合物的肿瘤蓄积性增强。由于这样的原因，相比单独施用近红外染料时，本实施方式的化合物的血中滞留性及肿瘤蓄积性更高，由此预期发挥增加自肿瘤产生的光声信号强度的效应。此外，本发明的化合物被摄入肿瘤组织的癌细胞内，由此也预期肿瘤蓄积性在施用之后短时间内增加，及在细胞内长时期维持。因此，发挥增加肿瘤/血中比的效应。因此，本实施方式的化合物可作为PAI用造影剂，尤其是，肿瘤的PAI用造影剂。
本实施方式的化合物的近红外染料具有与吲哚环结合的苯环或萘环上无亲水性高的磺酸基的结构。疏水性高的结构，诸如苯环和萘环，贡献于近红外染料的疏水性。意外地，近红外染料的疏水性大大地贡献于本实施方式的化合物整体的疏水性。因此，包含在苯环或萘环上无磺酸基的近红外染料的本实施方式的化合物呈现适度疏水性，不从血快速清除地循环，及在该循环期间由于EPR效应而在肿瘤中蓄积。可推测，本实施方式的化合物的疏水性在肿瘤位点增加化合物本身和肿瘤细胞之间的相互作用，导致肿瘤细胞的化合物摄取增强。另一方面，在吲哚环上的2个氮原子中，当化合物在不与转铁蛋白结合的氮原子上直接或经接头具有磺酸基时，化合物可附加特定程度的亲水性。血中的本实施方式的化合物由于该亲水性而自活体清除，及其血中浓度在经过特定时间之后减小。即，可由本实施方式的化合物的疏水性和亲水性的平衡而附加增加的肿瘤蓄积性和肿瘤/血中比。
在本实施方式的化合物中，至少一个转铁蛋白和至少一个近红外染料可共价结合，或多个转铁蛋白和多个近红外染料可共价结合。当化合物包括转铁蛋白和多个近红外染料时，该近红外染料中的至少一个可与转铁蛋白共价结合，和其余的近红外染料可与之非-共价结合。类似地，当化合物包括近红外染料和多个转铁蛋白时，该转铁蛋白中的至少一个可与近红外染料共价结合，及其余转铁蛋白可与其非-共价结合。
特别是，在本发明和本说明书中提及的短语"转铁蛋白和近红外染料共价结合"是指除去转铁蛋白的一部分(一般H或OH)而得到的部分(其也可被称为"自由基")和除去近红外染料的一部分(一般H或OH)而得到的部分共价结合。"化合物"从另一角度观点也可指"分子"。短语"非-共价结合"是指由共价键之外的键，诸如离子键，配位键，金属键，氢键或分子间力结合。
【标记的染料的数】
在本文中，与一分子的转铁蛋白共价结合的近红外染料的平均数被称为"经标记的近红外染料的数"。在下文中，经标记的近红外染料的数可简称为"标记的染料的数"。当本实施方式的化合物形成为一分子时，标记的染料的数n是整数值。另一方面，当本实施方式的化合物多种聚集而形成混合物时，在化合物中标记的染料的数由形成混合物的化合物的标记的染料的数的平均值表示。因此，在本文中标记的染料的数不限于整数，但对转铁蛋白实际上标记的该数是整数值。在PAI用造影剂中，根据本实施方式，标记的染料的数优选是1以上且优选9以下，还优选2以上且8以下，特别优选4以上且7以下。原因在于，当标记的染料的数在以上范围内时，达到高肿瘤蓄积性和肿瘤/血中比。
在本文中，标记的染料的数通过分别测定近红外染料的浓度和转铁蛋白的浓度，及计算其比(近红外染料的浓度/转铁蛋白的浓度)来测定。近红外染料的浓度由在该染料的特异性吸附波长的吸光度和吸收系数计算。尽管在使用，例如，ICG-Sulfo-OSu(由以下式(d5-1)表示的化合物)作为近红外染料的情况下，可采用790nm作为特异性吸附波长，其他值也可作为特异性吸附波长采用。转铁蛋白的浓度可通过使用在观察到蛋白特有的吸收的280nm处的吸光度，及该波长的转铁蛋白的吸收系数来测定，或也可通过BCA方法等测定。在本文中，将描述于NPL 1的92300(M-1×cm-1)用作转铁蛋白的在280nm处的摩尔吸收系数。
根据本实施方式的PAI用造影剂可包括以下式(I)表示的化合物。
TF-(L-D)n (I)
在式(I)中，TF表示转铁蛋白，L表示接头，D表示近红外染料，及n表示标记的染料的数。标记的染料的数是通过使用各转铁蛋白和近红外染料的吸光度，及在该波长处的摩尔吸收系数计算的值。L任选地缺失。
在式(I)中，D由以下式(d1)～(d4)之任一个表示。
在式(d1)中，L11，L12，L13，L14和L15可各相同或不同，且表示CH或CR15，及R15表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L11，L12，L13，L14和L15可一起形成4-元环～6-元环。R11，R12，R13和R14可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD1-SO3 -或-RE1-SO3X11。RD1和RE1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X11表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC1-SO3 -，-RG1-SO3X15或-RF1-CO2X14。X14和X15表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC1，RF1和RG1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子。RB1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。Z11表示氢原子，或与结合于Z11的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(d2)中，L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可各相同或不同，且表示CH或CR105，及R105表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可一起形成4-元环～6-元环。R101，R102，R103和R104可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD11-SO3 -或-RE11-SO3X101。RD11和RE11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X101表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC11-SO3 -，-RG11-SO3X105或-RF1-CO2X104。X104和X105表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC11，RF11和RG11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子。RB11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。Z101表示氢原子，或与结合于Z101的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(d3)中，R201～R212可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，或-SO3X24。X24表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。L21，L22，L23，L24和L25可各相同或不同，且表示CH或CR25，及R25表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L21，L22，L23，L24和L25可一起形成4-元环～6-元环。R21，R22，R23和R24可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD2-SO3 -或-RE2-SO3X21。RD2和RE2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X21表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC2-SO3 -，-RG2-SO3X25或-RF2-CO2X26。X25和X26表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC2，RF2和RG2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可作为对离子包括卤素离子诸如氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子诸如乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子。RB2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在式(d4)中，R301～R312可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，或-SO3X34。X34表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可各相同或不同，且表示CH或CR35，及R35表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基。L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可一起形成4-元环～6-元环。R31，R32，R33和R34可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD3-SO3 -或-RE3-SO3X31。RD3和RE3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。X31表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC3-SO3 -，-RG3-SO3X35或-RF3-CO2X34。X34和X35表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子。RC3，RF3和RG3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。当RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可作为对离子包括卤素离子诸如氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子诸如乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子。RB3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基。*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
在相应的式中，RA1，RA11，RA2和RA3可各表示-RC1-SO3 -或-RG1-SO3X15。RA1，RA11，RA2和RA3可各具有磺酸基，由此给本实施方式的化合物附加特定程度的亲水性，由此化合物容易在经过特定时间之后自血消除。
在式(I)中，L由以下式(l1)～(l5)之任一个表示。
在式(l1)～(l5)中，*表示与转铁蛋白或近红外染料结合。在式(l1)中，n在1～500的范围内，优选在1～120的范围内。考虑到与转铁蛋白受体的结合能力，式(l1)中的n可在1～50的范围内。
在PAI用造影剂中，根据本实施方式，D在式(I)中可由以下式(d5)～(d6)之任一个表示。
在式(d5)和(d6)中，*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。在式(d6)中，Y-表示下列之任一个：卤素离子诸如氯离子、溴离子或碘离子，或有机酸离子诸如乙酸根离子、酒石酸根离子或琥珀酸根离子。
在本文中，本实施方式的化合物可还具有捕获分子。当本实施方式的化合物可作为多种聚集的混合物使用时，此时n的平均值优选是1以上，和n的平均值还优选是4以上且7以下。
在本实施方式的化合物中，式(I)表示的化合物可特别具有以下式(I-1)表示的结构。
TF-(D)n (I-1)
在式(I-1)中，TF表示转铁蛋白，D表示以下式(d5)表示的近红外染料，及n表示标记的染料的数。标记的染料的数是通过使用各转铁蛋白和近红外染料的吸光度，及在该波长处的其摩尔吸收系数计算的值。
在式(I-1)中，TF表示除去转铁蛋白的用于与近红外染料结合的一个或更多氨基而得到的部分。在本实施方式的一例中，式(I-1)中的n可在4以上且7以下的范围内。
本实施方式的化合物或PAI用造影剂也可具有与靶位点特异性地结合的捕获分子。本实施方式的化合物可作为包括多种该化合物的混合物使用。在混合物中包括的相应化合物的n可彼此不同。在混合物中包括的化合物的n的平均值优选是1以上，及n的平均值还优选是4以上且7以下。
【转铁蛋白】
本实施方式的转铁蛋白是存在于血浆中且具有约80kDa的分子量的蛋白。转铁蛋白主要具有运输铁离子的作用。本实施方式的转铁蛋白可源于人血清或可源于人血清之外的动物血清，诸如牛血清，大鼠血清或小鼠血清，或可为其片段。本实施方式的转铁蛋白可为被认为对人身体安全性高的源于人血清的转铁蛋白，及其变体和片段之任何。本实施方式的转铁蛋白可为自人血的提取物，可为基因重组体，或可为自大肠埃希氏菌(E.coli)，酵母，培养的细胞等的产物。
显示人转铁蛋白的序列的一例。该例中的转铁蛋白包括698个氨基酸残基及具有76960的分子量。
MRLAVGALLVCAVLGLCLAVPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSIGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPGAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP
(SEQ ID NO:1)
本实施方式的转铁蛋白与以上全序列或取自所述全序列的部分序列具有至少95％同源性。转铁蛋白在近红外染料可共价结合的位置包括多个赖氨酸残基。由转铁蛋白和近红外染料形成的化学键的一例包括由转铁蛋白的赖氨酸残基的氨基和近红外染料的羧基形成的酰胺键。
【近红外染料】
在本实施方式中，近红外染料未特别限制，只要近红外染料是吸收近红外波长区的光而产生声波的有机染料。在本实施方式中近红外染料的例可包括吖嗪型染料，吖啶型染料，三苯甲烷型染料，吨型染料，卟啉型染料，花青苷型染料，酞菁型染料，苯乙烯基型染料，吡喃鎓型染料，偶氮型染料，醌型染料，四环素型染料，黄酮型染料，聚烯型染料，BODIPY(注册商标)型染料和靛蓝型染料。花青苷型染料的例包括吲哚氰绿(ICG)和其衍生物。
在本实施方式中，用于制备本发明的化合物的近红外染料具有可在染料内与转铁蛋白共价结合的官能团。实例包括氨基，氢硫基，羧基，羟基或N-羟基琥珀酰亚胺基。可使用的用于制备本发明的化合物的近红外染料的一例是以下式(d5-1)表示的染料。当使用染料时，染料的N-羟基琥珀酰亚胺基与转铁蛋白的亲核基团，例如，赖氨酸残基的氨基形成酰胺键，由此染料被固定到转铁蛋白。
【制备化合物的方法】
在本实施方式中，转铁蛋白和近红外染料可由知道的偶联反应经氨基，氢硫基，羧基或羟基共价结合。尤其是，转铁蛋白和近红外染料可经转铁蛋白的氨基结合。在转铁蛋白中存在多个该氨基时，及尤其是，赖氨酸残基的伯氨基在弱碱性pH区，以有效和选择性方式与近红外染料的N-羟基琥珀酰亚胺基亲核地反应。通过所述反应与转铁蛋白结合的近红外染料可由知道的蛋白纯化方法诸如超滤方法，尺寸排阻柱层析方法或透析洗涤及纯化。
【接头】
在PAI用造影剂中，根据本实施方式，转铁蛋白和近红外染料可通过转铁蛋白表面上存在的氨基，氢硫基，羧基或羟基和近红外染料的衍生物直接键合而结合，或可通过经各种接头(也被称为"交联剂(crosslinking agent)"或"交联物(crosslinker)")结合转铁蛋白和近红外染料而结合。
在本实施方式中，可使用以下式(l1)～(l5)表示的任何接头。
在式(l1)～(l5)中，*表示与转铁蛋白或近红外染料结合，及2个*之任一个可与转铁蛋白或红外染料结合。
【分散介质】
PAI用造影剂，根据本实施方式，可在所述化合物之外包括分散介质。在本文中，PAI是指包括光声层析成像(体层摄影方法)的概念。分散介质的例包括盐水，注射用蒸馏水，磷酸盐缓冲液和葡萄糖水溶液。根据本实施方式的PAI用造影剂可，如果必需，具有药理学可接受的添加剂，例如，表面活性剂。
根据本实施方式的PAI用造影剂可预先分散到该分散介质中，或可为试剂盒形式，且可在施用到活体之前分散到分散介质中而使用。
根据本实施方式的PAI用造影剂可通过利用增强的通透性和保留(EPR)效应，在施用到活体时，相比活体中的正常位点，更蓄积到肿瘤位点。结果，当将粒子施用于活体，然后对活体照射光，和自活体检测声波时，可使自肿瘤位点发出的声波相比自正常位点发出的声波放大。因此，根据本实施方式的PAI用造影剂可用于肿瘤成像。PAI用造影剂，根据本实施方式，是以转铁蛋白作为基质的化合物，及具有经癌细胞中表达的转铁蛋白受体被摄入癌细胞的性质。因此，尽管不仅由EPR效应而且由细胞中本发明的化合物的摄取而预期肿瘤蓄积性长时期维持，血中浓度经时降低及，结果，可预期呈现高肿瘤/血中比。因为转铁蛋白的半衰期约为血清白蛋白的半衰期的一半，在施用之后，转铁蛋白不太可能保留在血中。因此，转铁蛋白可优选作为造影剂，及预期贡献于高肿瘤/血中比。
【捕获分子】
本实施方式的化合物或PAI用造影剂可具有与靶位点特异性地结合的捕获分子。捕获分子是指与靶位点诸如肿瘤特异性地结合的物质，与在靶位点周围存在的物质特异性地结合的物质，等，及可任意选自生物分子和化学物质诸如药品。特定例包括蛋白，抗体，抗体片段，酶，生物活性肽，糖肽，多肽，肽，糖链，脂质和分子-识别化合物。该物质可单独使用或可组合多种使用。捕获分子与之化学结合的化合物可由此用于实施靶位点的特异性检测，及靶物质的动态，定位，药物功效，代谢等的跟踪。在本实施方式中，蛋白指称90个以上天然的或非天然的氨基酸由酰胺键连接的分子。在本实施方式中，多肽指称30个以上和不足90个天然的或非天然的氨基酸由酰胺键连接的分子。在本实施方式中，肽指称不足30个天然的或非天然的氨基酸由酰胺键连接的分子。在本实施方式中，蛋白，多肽和肽依赖于连接的氨基酸数分类，无论是否存在各种修饰。在本实施方式中，捕获分子可为蛋白，多肽或肽。
【添加剂】
本实施方式的光声成像用造影剂也可包括用于冷冻干燥的添加剂。添加剂的一例包括葡萄糖，乳糖，甘露糖醇，聚乙二醇，甘氨酸，氯化钠和磷酸氢钠。添加剂可单独使用或组合多种使用。
【光声成像方法】
描述了通过使用光声成像设备检测施用到活体内的根据本实施方式的PAI用造影剂的方法。检测根据本实施方式的PAI用造影剂的方法包括以下步骤(a)及(b)。在本文中，本实施方式的光声成像方法也可包括以下步骤之外的步骤：
(a)向施用了PAI用造影剂的样本照射600nm～1300nm波长区的光的步骤；以及
(b)检测从存在于样本中的造影剂发出的声波的步骤。
本实施方式的光声成像方法可包括自以上步骤(b)中获得的声波的波长，位相，时间信息等重建空间光声信号强度分布的步骤。在本文中，3-维成像重建可基于以上步骤(b)中获得的光声信号的波长，位相和时间信息进行。由图像重建获得的数据可取任何形式，只要可自数据掌握光声信号的强度分布的位置信息。例如，可取在3-维空间呈现光声信号强度的形式，或可取在2-维平面呈现光声信号强度的形式。此外，也可取以下形式：对相同的观察对象由不同成像方法获得信息，和获取该信息和光声强度分布之间的位置对应关系。
在以上步骤(a)中，可使用由方法诸如口服施用或注射施用根据本实施方式的PAI用造影剂的样本。
在以上步骤(a)中，发出照射样本的光的设备，及检测自根据本实施方式的PAI用造影剂发出的光声信号的设备不特别限制。
在以上步骤(a)中，给样本照射光的光源无限制，只要光源可向样本照射具有选自600nm～1300nm的范围内的至少一个波长的激光脉冲光。向样本照射激光脉冲光的设备的例包括钛蓝宝石激光(LT-2211-PC,生产自Lotis TII)，OPO激光(LT-2214OPO,生产自LotisTII)和翠绿宝石激光。
光声成像设备无特别限制，及可使用各种设备。例如，该检测可通过使用可商购的光声成像设备(Nexus128,生产自Endra Inc.)进行。
使用根据本实施方式的PAI用造影剂的成像方法可通过以上步骤(a)及(b)对于对象位点诸如肿瘤或血管成像。
【实施例】
在下文中，参照实施例更详细描述本发明，但本发明不限于这些实施例，且只要可获得具有相同的功能和效应的染料-修饰的转铁蛋白，材料，组成条件，反应条件等可自由地变化。
【标记的染料的数的计算】
在本发明的实施例中，通过测量化合物的吸光度来计算对于转铁蛋白标记的染料的数。换言之，制备化合物的水溶液，及测量各染料和转铁蛋白的吸光度，由此测定各染料和转铁蛋白的浓度，及染料浓度除以转铁蛋白的浓度，由此测定标记的染料的数。
特别是，在通过使用ICG-Sulfo-OSu(由以下式(d5-1)表示的化合物)制备的化合物的情况中，测量化合物的水溶液中用5％十二烷基硫酸钠(在下文中,缩写为"SDS")稀释的化合物的在790nm处的吸光度。此吸光度来自ICG。ICG浓度通过使用从预先制成的SDS中的校准曲线计算的在790nm处的120000(M-1×cm-1)的吸收系数来计算染料浓度来测定。转铁蛋白的浓度通过测量磷酸盐缓冲液(有时缩写为"PBS")中转铁蛋白的在280nm处的吸光度，及使用该吸光度和转铁蛋白的92300(M-1×cm-1)的摩尔吸收系数计算。标记的染料的数通过染料浓度除以转铁蛋白的浓度来确定。在本文中，关于转铁蛋白的在280nm处的吸光度，通过自在280nm处测量的吸光度减去ICG的在790nm处的吸光度乘以0.4而获得的值，由此校正ICG-Sulfo-OSu的在280nm处的吸光度对转铁蛋白的在280nm处的吸光度的贡献。
【实施例1：结合近红外染料的转铁蛋白的制备】
本实施例中的化合物由近红外染料与转铁蛋白表面的氨基的共价结合获得。在下文中，显示制备方法的一例。
首先，将10mg的转铁蛋白(人转铁蛋白,T3309,产自Sigma-Aldrich日本K.K.)溶于1mL的碳酸缓冲液(pH：9.0)而提供转铁蛋白溶液。将以下式(d5-1)表示的1mg的近红外染料(ICG-Sulfo-OSu,I254,产自Dojindo Laboratories)溶于0.1mL的二甲基亚砜(在下文中,有时缩写为"DMSO")。在相应溶液在塑料管中混合，及于室温旋转搅拌3小时。将得到的反应溶液由0.22μm注射器式滤器过滤，及回收滤出液。将聚丙烯酰胺葡聚糖Gel S-400加入回收的溶液，并将所得物于室温旋转及搅拌1小时。接下来，对含有凝胶的溶液进行离心，及回收上清部分，而存在于塑料管底部的凝胶未分级分离。最终，将回收的绿色溶液由0.22μm注射器式滤器过滤，由此提供根据本发明的化合物(在下文中,有时缩写为"iTF")，其中近红外染料和转铁蛋白共价结合。
将通过改变反应中的补给摩尔比(近红外染料:转铁蛋白)获得的相应化合物的标记的染料的数显示于表1。自表1发现，通过改变近红外染料与转铁蛋白的补给摩尔比，由此在任何范围内改变标记的染料的数。在下文中，将具有2.0，4.8，7.0，8.3和8.4个标记的染料的数的该化合物分别缩写为"iTF(2.0)"，"iTF(4.8)"，"iTF(7.0)"，"iTF(8.3)"和"iTF(8.4)"。
表1
| 样品名称 | 补给摩尔比(近红外染料:转铁蛋白) | 标记的染料的数 |
| iTF(2.0) | 3.0 | 2.0 |
| iTF(4.8) | 8.0 | 4.8 |
| iTF(7.0) | 15.0 | 7.0 |
| iTF(8.3) | 25.0 | 8.3 |
| iTF(8.4) | 50.0 | 8.4 |
【实施例2：光声信号的测量】
测量在实施例1中获得的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)的水溶液、及在比较例中以下式表示的ICG的水溶液的光声信号。
光声信号通过向样品水溶液照射脉冲激光，通过使用压电元件自样品检测光声信号，由高速前置放大器扩增信号，然后由数字示波器获取信号来测量。具体条件如下。将钛蓝宝石激光(LT-2211-PC,生产自Lotis TII)用作光源。激光波长是790nm。能量密度是约10～20mJ/cm2，脉冲宽度是约20ns，及脉冲重复频度是10Hz。作为检测光声信号的压电元件，使用具有1.27cm的元件直径和1MHz的中心条带的非-收敛型超声变换器(V303,生产自Panametrics-NDT)。测量容器是具有0.1cm的光路长度和约200μl的样品容积的聚苯乙烯比色杯。将测量容器和压电元件浸入填充水的玻璃容器中，并将它们之间的距离设置为2.5cm。作为扩增光声信号强度的高速前置放大器，使用具有+30dB的放大度的超声前置放大器(模型5682,生产自Olympus Corp.)。将放大的信号输入数字示波器(DPO4104,生产自Tektronix)。将聚苯乙烯比色杯用从玻璃容器之外的脉冲激光照射。由光电二极管检测此时产生的部分散射光，及作为引发信号输入数字示波器。将数字示波器设置为32次平均显示模式，以测量激光脉冲照射32次平均的光声信号强度。
将本发明的实施例中涉及的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)的水溶液、及在比较例中ICG的水溶液的光声信号强度显示于表2。在表2中显示将ICG的光声信号强度作为1的相对强度。自表2可知，发现，大量的近红外染料可结合到各转铁蛋白，由此自各转铁蛋白的光声信号自ICG的光声信号增加1.8倍～甚至10.8倍。结果指示，本发明的iTF各是可以高灵敏度实施光声成像的光声成像用造影剂。
表2
| 样品名称 | PA信号强度(ICG＝1) |
| ICG | 1.0 |
| iTF(2.0) | 1.8 |
| iTF(4.8) | 5.0 |
| iTF(7.0) | 8.8 |
| iTF(8.3) | 10.4 |
| iTF(8.4) | 10.8 |
【实施例3：癌细胞中摄取能力的评估】
测量在实施例1中获得的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)、及在比较例中结合Alexa Fluor(注册商标)680近红外染料的转铁蛋白(来自人血清的转铁蛋白,Alexa Fluor(注册商标)680缀合物,产自Life Technologies,产品No.T35357,标记的染料的数：2.0)被癌细胞的摄取能力。在下文中，将结合Alexa Fluor(注册商标)680近红外染料的转铁蛋白缩写为"Alexa Fluor 680-TF(2.0)"。
如下实施摄取能力的测量方法。首先，将结肠26小鼠结肠癌细胞(RIKEN)接种到24-孔塑料板及培养。次日，除去培养基及用新鲜培养基交换，及然后添加各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)，及Alexa Fluor 680-TF(2.0)，从而各染料的浓度是10μM。将所得物在37℃和5％CO2条件下温育24小时。接下来，除去培养基，及将细胞用PBS洗涤两次，及然后将细胞由胰蛋白酶-EDTA剥离及回收。对细胞数进行计数，然后通过使用1％Triton×100溶液裂解细胞。在将DMSO加入细胞裂解物之后，测量裂解物的ICG荧光强度，由此测量细胞中摄取的ICG的量。
摄取的各染料的量的相对值显示于表3。相比在比较例中Alexa Fluor 680-TF(2.0)的摄取能力，本发明的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)呈现约20～60倍高的摄取能力。比较标记的染料的数接近的Alexa Fluor 680-TF(2.0)和本发明的iTF(2.0)时，本发明的iTF(2.0)呈现摄取能力增强甚至60倍。该差异被认为是由于染料的亲水性和疏水性的影响。尽管Alexa Fluor 680的结构未公开，结构被认为通过磺酸的导入而附加有高亲水性。另一方面，iTF(2.0)的染料骨架不包括磺酸及呈现疏水性。因此认为，转铁蛋白由染料标记而由此呈现疏水性，及向细胞的吸附被促进，导致细胞中摄取能力的增加。基于癌细胞中的摄取，化合物被显示是作为肿瘤造影剂非常有用的化合物。
表3
| 样品名称 | 掺入的染料量的相对值 |
| iTF(2.0) | 60.3 |
| iTF(4.8) | 27.7 |
| iTF(7.0) | 21.2 |
| iTF(8.3) | 24.1 |
| iTF(8.4) | 30.1 |
| AlexaFluor680-TF(2.0) | 1.0 |
【实施例4：由荧光成像的肿瘤-成像对比度的评估】
由通过使用携带癌的小鼠的荧光成像评价在实施例1中获得的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)，及在比较例中获得的ICG和Alexa Fluor 680-TF(2.0)的肿瘤-成像对比度。在荧光成像实验中，使用雌性远亲杂交种BALB/c Slc-nu/nu小鼠(购买时6周龄)(日本SLC,Inc.)。在使小鼠带癌之前1周，使用正常膳食和寝床使小鼠顺应环境，其中膳食和饮用水可随意利用。在成像实验约1周之前，将1×106结肠26小鼠结肠癌细胞(RIKEN)皮下注射到小鼠的股骨区，由此制备带癌的模型小鼠。
关于施用了各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)，iTF(8.4)，ICG和AlexaFluor 680-TF(2.0)的携带癌的小鼠的全身荧光像，在施用之后24小时，通过使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(XENOGEN)获取小鼠的明视场像和荧光像。施用的iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)，及ICG的量，作为染料量，是各10nmol/小鼠，施用的Alexa Fluor 680-TF(2.0)的量，作为染料量，是31nmol/小鼠，及向各小鼠的尾静脉各注射作为100μL的PBS溶液的该染料。
图1例证在施用各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)，iTF(8.4)，ICG和Alexa Fluor 680-TF(2.0)之后24小时时各小鼠的荧光像的代表性的例。在图1中，各箭标指示股骨区中肿瘤的位置。如从图1可知，在比较例中关于ICG完全未观察到荧光信号，但关于本发明的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)，观察到自肿瘤位点的荧光信号。已自结果发现，本发明的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)可在肿瘤中蓄积。
为了评价肿瘤-成像对比度，自图1中显示的荧光成像数据定量肿瘤位点的荧光强度(测量面积：0.5×0.5cm)和腿根的荧光强度(作为正常位点选择的,测量面积：0.5×0.5cm)。强度比，即，通过肿瘤位点的荧光强度值除以正常位点的荧光强度值获得的值，作为成像对比度由数字值表达。成像对比度是显示各化合物的肿瘤-成像能力的参数，及更高成像对比度导致更有效的肿瘤造影剂。表4显示各化合物的成像对比度。本发明的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)的成像对比度是2.3以上，及相比在比较例中各ICG和Alexa Fluor 680-TF(2.0)的成像对比度更高。自结果可知，根据本发明的实施例的结合近红外染料的转铁蛋白显示在肿瘤-成像能力中优良。本发明的化合物的成像对比度相比Alexa Fluor 680-TF(2.0)的成像对比度更大被认为是由于肿瘤蓄积性的差异，如下所述。达到最高成像对比度的标记的染料的数是4.8。另一方面，当标记的染料的数超过8时，观察到成像对比度减少的趋势。
表4
| 样品名称 | 成像对比度 |
| ICG | 1.2 |
| iTF(2.0) | 3.3 |
| iTF(4.8) | 4.1 |
| iTF(7.0) | 3.4 |
| iTF(8.3) | 3.3 |
| iTF(8.4) | 2.3 |
| AlexaFluor680-TF(2.0) | 1.2 |
【实施例5：化合物的肿瘤蓄积性和血中滞留率的评估】
定量测定在实施例4中实施的肿瘤-成像实验中各小鼠的肿瘤中染料量和血中染料量，由此评价各化合物的肿瘤蓄积性和血中滞留率。
肿瘤蓄积性表示为相对于每克肿瘤施用的染料量的向肿瘤的染料迁移率(％ID/g)。首先，在施用之后24小时将小鼠由二氧化碳气体无痛处死，然后手术切除肿瘤。将肿瘤转移到塑料管，以肿瘤重量的1.25倍添加1％Triton-X100水溶液，及将肿瘤通过使用塑料研杵压碎。接下来，以肿瘤组织重量的20.25倍添加DMSO。在塑料管中，使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(XENOGEN)测量如上述处理的压碎的肿瘤溶液的荧光强度，由此测量肿瘤中染料的量。
血中滞留率表示为相对于每克血施用的染料量的向血的染料迁移率(％ID/g)(将比重设为1而1mL)。在施用之后24小时从小鼠尾静脉获取血样品，及在塑料管中以2:9:9的比混合血样品、1％Triton(注册商标)X-100和DMSO。在塑料管中使用IVIS(注册商标)成像系统200系列(生产自XENOGEN)测量上述处理的血溶液的荧光强度，由此测量血中染料的量。
由以上测量计算肿瘤/血中比。该比对应于肿瘤蓄积性与血中滞留率的比，且更高比表示更高肿瘤-成像能力。
结果显示于表5。本发明的各iTF(2.0)，iTF(4.8)，iTF(7.0)，iTF(8.3)和iTF(8.4)的肿瘤蓄积性是0.8～7.1％ID/g，及在iTF(4.8)中呈现7.1％ID/g的最高肿瘤蓄积性。在比较例中ICG无肿瘤蓄积性，及肿瘤蓄积率是0。在比较例中Alexa Fluor 680-TF(2.0)的肿瘤蓄积率是0.6％ID/g。本发明的各化合物的肿瘤蓄积率相比Alexa Fluor 680-TF(2.0)的肿瘤蓄积率更高被认为是由于染料的亲水性和疏水性的影响。尽管Alexa Fluor 680的结构未被公开，该结构被认为通过磺酸的导入附加有高亲水性。另一方面，本发明的iTF的染料骨架不包括磺酸，及呈现疏水性。因此认为，转铁蛋白由染料标记，由此呈现疏水性，及在细胞中摄取能力增加，导致肿瘤蓄积率增加。在本发明的化合物中，肿瘤蓄积性依赖于标记的染料的数的差异而变化。
在具有4.8的标记的染料的数的iTF(4.8)中达到最高肿瘤蓄积率。结果被认为由对于肿瘤蓄积率的各化合物的亲水性和疏水性之间的最佳平衡达到。当标记的染料的数超过以上值时，认为各化合物的整体疏水性增至促进血中的蛋白吸附或诱导转铁蛋白自身的修饰，由此减小血中滞留性，导致肿瘤蓄积率减小。
肿瘤/血中比相比在比较例中各ICG和Alexa Fluor 680-TF(2.0)的肿瘤/血中比增加为3.5倍～甚至11倍。获得该结果的原因是因为本发明iTF的血中滞留率低，而呈现更高肿瘤蓄积率。换言之，这表明，本发明的各化合物的肿瘤蓄积维持性高。结果也提示肿瘤细胞中的高摄取能力。
如从表4中的成像对比度可知，在具有4.8的标记的染料的数的iTF(4.8)中达到3.3的最大肿瘤/血中比。上述结果表明，根据本发明的实施例的iTF各是使高灵敏和高肿瘤-选择性肿瘤光声成像成为可能的光声成像用造影剂。
表5
| 样品名称 | 肿瘤蓄积率(％ID/g) | 血中滞留率(％ID/g) | 肿瘤/血中比 |
| ICG | 0.0 | 0.1 | 0.1 |
| iTF(2.0) | 1.8 | 2.8 | 0.7 |
| iTF(4.8) | 7.1 | 2.1 | 3.3 |
| iTF(7.0) | 4.8 | 1.8 | 2.7 |
| iTF(8.3) | 2.1 | 0.7 | 2.9 |
| iTF(8.4) | 0.8 | 0.4 | 1.9 |
| AlexaFluor680-TF(2.0) | 0.6 | 2.8 | 0.2 |
本发明的光声成像用造影剂包括化合物，其中转铁蛋白和在近红外波长区具有吸收的近红外染料(诸如ICG)结合，由此，该造影剂相比单独施用ICG时，肿瘤蓄积性高和自肿瘤产生的光声信号强度高。转铁蛋白具有由转铁蛋白受体被癌细胞摄取的性质，结果，具有增加肿瘤/血中比的效应。
已参照例示实施方式描述了本发明，需知，本发明不限于公开的例示实施方式。以下权利要求的范围应以最宽范围解释，如此包括全部该修饰和相当的结构和功能。
Claims (17)
1.以下式(I)表示的化合物：
TF-(L-D)n (I)
其中在式(I)中，
TF表示转铁蛋白，
L表示接头，
D表示近红外染料，
n表示经标记的近红外染料的数及
L任选地缺失；
在式(I)中，D由以下式(d1)～(d4)之任一个表示：
其中在式(d1)中，
L11，L12，L13，L14和L15可各相同或不同，且表示CH或CR15，及R15表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L11，L12，L13，L14和L15可一起形成4-元环～6-元环；
R11，R12，R13和R14可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD1-SO3 -或-RE1-SO3X11；
RD1和RE1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X11表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC1-SO3 -，-RG1-SO3X15或-RF1-CO2X14；
X14和X15表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC1，RF1和RG1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
Z11表示氢原子，或与结合于Z11的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；
在式(d2)中，
L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可各相同或不同，且表示CH或CR105，及R105表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可一起形成4-元环～6-元环；
R101，R102，R103和R104可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD11-SO3 -或-RE11-SO3X101；
RD11和RE11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X101表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC11-SO3 -，-RG11-SO3X105或-RF1-CO2X104；
X104和X105表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC11，RF11和RG11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
Z101表示氢原子，或与结合于Z101的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；
在式(d3)中，
R201～R212可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
X24表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
L21，L22，L23，L24和L25可各相同或不同，且表示CH或CR25，及R25表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L21，L22，L23，L24和L25可一起形成4-元环～6-元环；
R21，R22，R23和R24可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD2-SO3 -或-RE2-SO3X21；
RD2和RE2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X21表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC2-SO3 -，-RG2-SO3X25或-RF2-CO2X26；
X25和X26表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC2，RF2和RG2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；
在式(d4)中，
R301～R312可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
X34表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可各相同或不同，且表示CH或CR35，及R35表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可一起形成4-元环～6-元环；
R31，R32，R33和R34可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD3-SO3 -或-RE3-SO3X31；
RD3和RE3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X31表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC3-SO3 -，-RG3-SO3X35或-RF3-CO2X34；
X34和X35表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC3，RF3和RG3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；以及
在式(I)中，L由以下式(l1)～(l5)之任一个表示：
在式(l1)～(l5)中，*表示与转铁蛋白或近红外染料结合，及2个*之任一个任选地与转铁蛋白或近红外染料结合。
2.以下式(I-1)表示的化合物：
TF-(D)n (I-1)
其中在式(I-1)中，
TF表示转铁蛋白，
D表示以下式(d5)表示的近红外染料，及
n表示标记的染料的数；
在式(I-1)中，D由以下式(d1)～(d4)之任一个表示：
其中在式(d1)中，
L11，L12，L13，L14和L15可各相同或不同，且表示CH或CR15，及R15表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L11，L12，L13，L14和L15可一起形成4-元环～6-元环；
R11，R12，R13和R14可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD1-SO3 -或-RE1-SO3X11；
RD1和RE1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X11表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC1-SO3 -，-RG1-SO3X15或-RF1-CO2X14；
X14和X15表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC1，RF1和RG1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB1表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
Z11表示氢原子，或与结合于Z11的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；
在式(d2)中，
L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可各相同或不同，且表示CH或CR105，及R105表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L101，L102，L103，L104，L105，L106和L107可一起形成4-元环～6-元环；
R101，R102，R103和R104可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD11-SO3 -或-RE11-SO3X101；
RD11和RE11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X101表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC11-SO3 -，-RG11-SO3X105或-RF1-CO2X104；
X104和X105表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC11，RF11和RG11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，可包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB11表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
Z101表示氢原子，或与结合于Z101的吲哚环一起形成包括下列的环状芳族环：苯并[e]吲哚环，苯并[f]吲哚环或苯并[g]吲哚环，及环状芳族环中的氢原子可被具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷氧基取代；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；
在式(d3)中，
R201～R212可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
X24表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
L21，L22，L23，L24和L25可各相同或不同，且表示CH或CR25，及R25表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L21，L22，L23，L24和L25可一起形成4-元环～6-元环；
R21，R22，R23和R24可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD2-SO3 -或-RE2-SO3X21；
RD2和RE2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X21表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC2-SO3 -，-RG2-SO3X25或-RF2-CO2X26；
X25和X26表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC2，RF2和RG2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB2表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；及
*表示与L结合、或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白结合的连键；以及
在式(d4)中，
R301～R312可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
X34表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可各相同或不同，且表示CH或CR35，及R35表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基；
L31，L32，L33，L34，L35，L36和L37可一起形成4-元环～6-元环；
R31，R32，R33和R34可各相同或不同，且表示氢原子，具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RD3-SO3 -或-RE3-SO3X31；
RD3和RE3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
X31表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基，-RC3-SO3 -，-RG3-SO3X35或-RF3-CO2X34；
X34和X35表示下列之任一个：氢原子，钠原子，钾原子，或源于氨、三乙基胺、赖氨酸或精氨酸的阳离子；
RC3，RF3和RG3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；
当RA3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的烷基时，包括卤素离子或有机酸离子作为对离子；
RB3表示具有1～10个碳原子的线性或分支的亚烷基；及
*表示与L结合，或当结合近红外染料的转铁蛋白不包括L时与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
3.权利要求1的化合物，其中D由以下式(d5)～(d6)之任一个表示：
其中在式(d5)和(d6)中，*表示与L结合，或当化合物不包含L时与转铁蛋白结合的连键；以及
在式(d6)中，Y-表示卤素离子或有机酸离子。
4.权利要求1的化合物，其中所述n是4以上且7以下。
5.权利要求2的化合物，其中所述n是4以上且7以下。
6.权利要求3的化合物，其中所述n是4以上且7以下。
7.以下式(I-1)表示的化合物：
TF-(D)n (I-1)
其中在式(I-1)中，TF表示转铁蛋白，D表示近红外染料，及n表示经标记的近红外染料的数；以及
D表示以下式(d5)表示的近红外染料，和式(I-1)中的n是4以上且7以下：
其中在式(d5)中，*表示与转铁蛋白中的氨基结合的连键。
8.权利要求1的化合物，其中所述转铁蛋白是下列之任何：人转铁蛋白、人转铁蛋白的变体、人转铁蛋白的片段和人转铁蛋白的变体的片段。
9.权利要求1的化合物，其还包含捕获分子。
10.光声成像用造影剂，其包含权利要求1的化合物及分散介质。
11.权利要求10的光声成像用造影剂，其用于肿瘤成像。
12.权利要求10的光声成像用造影剂，其还包含添加剂。
13.混合物，其包含多种权利要求1的式(I)表示的化合物，其中各n相互不同，其中所述n的平均值是1以上。
14.混合物，其包含多种权利要求2的式(I-1)表示的化合物，其中各n相互不同，其中所述n的平均值是1以上。
15.混合物，其包含多种权利要求3的式(I-1)表示的化合物，其中各n相互不同，其中所述n的平均值是1以上。
16.权利要求13的混合物，其中所述混合物中包含的所述化合物的n的平均值是4以上且7以下。
17.权利要求14的混合物，其中所述混合物中包含的所述化合物的n的平均值是4以上且7以下。
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