CN105985428A - 人重组凝血因子ⅹⅲ的促凝血功能 - Google Patents

Abstract

人重组凝血因子ⅩⅢ的促凝血功能，本发明应用基因工程技术将XIII因子活性部分(即XIIIa部分)亚克隆入酵母表达载体，将鉴定测序无误后的表达载体导入酵母细胞，获得表达，有效的纯化其目的蛋白，可得到分子量约为83kd的蛋白质，经过凝血凝集实验进行活性鉴定后，证实其具有活性，可供临床研究。此外，本发明提供的人重组凝血因子XIII因其与人体自身的凝血因子结构完全相同，因而具有高度的组织相容性，避免了动物源性纤维蛋白原存在的致过敏等免疫反应，并且基因工程技术生产的XIII因子，质量可以控制，解决了生产工艺中关键因素可控制问题，具有广阔的市场应用前景。

Description

人重组凝血因子ⅩⅢ的促凝血功能

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及人重组凝血因子XIII的制备方法和促凝血功能。

背景技术

现代医学技术日新月异的发展，为人类的救死扶伤作出了重大贡献。然而，在外科手术中，创口止血和创伤愈合仍然是一个未能有效解决的问题，目前一般使用结扎、缝合和电凝进行止血。结扎和缝合操作繁琐，缝线还会引起异物反应，在一些脆性较大的组织如血管、肺组织等，传统的缝合常易导致针眼渗漏，延缓愈合；电凝会增加组织损伤，极易造成组织坏死；另外，在空腔脏器和大血管附近也不宜使用电凝止血。因此，长期以来，科学家们致力于寻求一种既能快速有效止血，又能简化甚至替代传统缝合技术的新方法和新材料，这种材料要求具有无毒性、能被机体完全吸收、无免疫反应等特性。纤维蛋白封闭剂(Fibrin Sealant，简称FS)的出现正好满足了这种社会需求，到目前为止，没有任何一种止血材料可以与纤维蛋白封闭剂的止血功能相媲美。

现在临床使用的纤维蛋白封闭剂是从人或动物血浆中提取的蛋白质所制成的生物止血材料，也称之为生物胶，其主要成份为纤维蛋白原(Fibrinogen)、凝血酶、XIII因子、Ca²⁺等，在医学领域发挥创面止血、封闭缺损组织、促进组织愈合、防止组织粘连等功效，已经广泛应用于外科手术和腔镜手术、内窥镜手术等。其作用机制是模拟人体自身凝血反应的最后阶段，即凝血酶酶切纤维蛋白原分子，释放出纤维蛋白肽A和肽B，形成纤维蛋白单体，纤维蛋白单体可由氢键及静电力作用聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白多聚体。同时凝血酶激活XIII因子，活性因子XIIIa在钙离子作用下参与纤维蛋白的交联，使之形成稳定的不溶性三维网状纤维蛋白胶。蛋白胶形成后，能网住红细胞及血小板，形成血凝块，发挥止血作用。同时，还能防止坏死组织细胞内溶酶体酶向细胞外泄漏，避免周围组织进一步受损。成胶后的纤维蛋白机械强度显著增强，可粘合及封闭缺陷组织，刺激毛细血管内皮细胞及成纤细胞生长，并以纤维蛋白网为支架形成肉芽组织，从而促进伤口愈合。自上世纪80年代Immuno AG公司(奥地利)将其产品Tisseel推出市场后，FS已在外科领域如普外科、心胸外科、骨科、妇产科、神经外科、整形外科等手术中得到广泛应用，充分证明了其临床有效性，大大推动了外科学止凝血的发展。国外的FS是从人血提取纤维蛋白原和牛血中提取凝血酶制成。以人血为原料，生产成本昂贵，而且也难以避免血源性传染病(如乙型、丙型肝炎和艾滋病)的传播危险；以牛血为原料，则存在疯牛病等动物源性疾病的传播危险。另外，我国有限的人血资源也限制了人血产品的大规模生产。

纤维蛋白胶作为一种新型外用止血剂具有广泛的应用前景，作为一种新型的生物载体则具有更深远的意义，而XIII因子在医用生物蛋白胶成胶过程中起关键作用。如将药物或生物制剂与纤维蛋白胶形成混 合物，使药物在局部缓慢释放并维持有效的浓度，直接发挥作用，延长有效作用时间，提高药物生物利用度和药物疗效，能提高难溶药物的溶解率和吸收率，亦可减少用药量、避免药物在循环系统中的降解、破坏，以降低毒副作用等；纤维蛋白胶与抗生素联合可用于烧烫伤病人，在局部发挥抗感染作用；与抗肿瘤药合用可抑制肿瘤生长；与生长因子合用可促进伤口愈合和组织再生；与局麻药合用可降低手术后疼痛。可见纤维蛋白胶这一生物止血剂的临床应用不仅仅局限于外科止血和粘合方面，在其他许多医学领域里将可能发挥更多更广的作用。

XIII因子作为生物胶中的主要因子，其本身是一个转酰胺酶，正常情况下XIII因子是以酶原形式存在，多数XIII因子与纤维蛋白原一起在血液中循环。在凝血过程中XIII因子由凝血酶激活成为因子XIIIa，凝血酶作用于A亚单位37位和38位氨基酸将其切断，释放出N端37个氨基酸残基，暴露埋藏在游离A亚单位中的活性位点，使其成为有活性的A亚单位。随后Ca²⁺依赖性B亚单位分离，使因子XIII的激活继续进行。活化的A亚单位选择性催化纤维蛋白单体交联以及纤维蛋白与其他蛋白的交联，随着因子XIIIa产生的广泛交联活动，纤维蛋白多聚体的血凝块结构从二聚体到三聚体再到四聚体，其机械力量和对纤溶的抵抗力增强，形成了稳定的血凝块。通过凝血因子XIIIa形成的可溶性纤维蛋白交联是止血的最后一步也是关键一步。

凝血因子XIII除了具有上述功能外，还参与了其他的生理过程。凝血因子XIII可使肌动蛋白与纤维蛋白单体、肌动蛋白与肌球蛋白之间产生交联。还有许多其他作为FXIIIa酶作用底物的蛋白质，包括血管假性血友病因子、凝血酶敏感素凝溶胶蛋白、玻璃体结合蛋白、纽蛋白、脂蛋白和胶原质等，细胞内结构蛋白的交联与血块凝缩和细胞移行有关。通过凝血因子XIII的作用产生复杂的胶原网状结构在创伤愈合、细胞黏着、细胞移行中起着重要的作用。因此FXIII在细胞内水平对包括血浆蛋白在内的广泛的交联活动起着许多不同的作用。

基因工程技术生产的XIII因子，可以选用大肠杆菌表达系统和酵母表达系统生产。大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。而且酵母分泌性表达由于本底蛋白水平低，表达的外源蛋白存在于酵母培养基中而不是菌体 中，减少了裂解酵母菌的环节，节约了时间和成本，简化了纯化过程，为顺利进入产业化铺平了道路。

发明内容

本发明的目的是应用基因工程技术生产人重组凝血因子XIII，制成新型第二代纤维蛋白封闭剂及其他衍生产品，改进产品的粘性、拉伸度、结构强度和稳定性，起到快速止血的作用，发挥人重组凝血因子XIII的促凝血功能。

本发明的实现过程如下：

构建酵母表达人凝血因子XIII载体pPICZαC-XIIIa。

PCR及双酶切法进行pPICZαC-XIIIa重组质粒的鉴定。

pPICZαC-XIIIa重组质粒在毕赤酵母中的表达及其鉴定。

通过亲和柱和离子交换柱的方式进行重组pPICZαC-XIIIa蛋白的提取及纯化。

通过凝集实验进行重组pPICZαC-XIIIa蛋白的活性鉴定。

上述人重组凝血因子XIII的制备方法，其通过载体构建、载体鉴定、酵母表达及鉴定、酵母表达产物提取及纯化、酵母表达产物的活性鉴定等步骤完成人重组凝血因子XIII的制备，通过冷冻干燥技术形成人重组凝血因子XIII蛋白产品。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、本发明应用基因工程技术生产的凝血因子XIII因其与人体自身的凝血因子结构完全相同，因而具有高度的组织相容性，避免了动物源性纤维蛋白原存在的致过敏等免疫反应。

2、本发明应用基因工程技术生产的XIII因子，质量可以控制，解决了生产工艺中关键因素可控制问题。3、本发明通过酵母表达系统生产人重组凝血因子XIII，酵母分泌性表达由于本底蛋白水平低，表达的外源蛋白存在于酵母培养基中而不是菌体中，减少了裂解酵母菌的环节，节约了时间和成本，简化了纯化过程，为顺利进入产业化铺平了道路。

4、本发明应用基因工程表达凝血因子XIIIA产品，添加到目前使用成熟的FS产品中，理论上可以缩短生物胶的成胶时间，帮助大量失血病人迅速止血为抢救生命获得时间；也为大面积创伤患者创口愈合提供帮助而减少缝合带来的二次损伤，同时给XIII因子缺乏病人提供特异效治疗基础。

附图说明

图1为酵母表达载体pPICZαC-FXIIIa构建示意图

图2为pPICZαC-FXIIIa重组质粒结果电泳图

泳道1为10000bp的marker；泳道2、3为阴性对照(pPICZαC空质粒)，条带大小为3600bp；泳道4、5、6、7为pPICZαC-FXIIIa重组质粒，条带大小为5850bp左右。

图3为重组pPICZαC-FXIIIa质粒PCR结果电泳图

泳道1为250bp的marker。泳道2为重组pPICZαC-FXIIIa质粒，条带大小为2250bp左右。

图4为重组质粒双酶切鉴定电泳图

泳道1为250bp的marker；泳道2、3、4、5、7为重组质粒双酶切条带，出现大小为3600bp左右和2250bp左右的条带；泳道6、8、9为阴性对照。

图5为重组质粒酵母基因组PCR电泳图

泳道1为250bp的marker；泳道2为阴性对照，泳道3为重组pPICZαC-FXIIIa质粒，条带大小为2250bp左右。

图6为重组蛋白表达24h，48h，72h，96h，120h的SDS-PAGE电泳图

泳道1为阴性对照；泳道2、3、5、6、7为表达24h，48h，72h，96h，120h后蛋白上清，前3条不明显，条带大小为83kd左右；泳道4为蛋白质的marker。

图7为重组蛋白表达24h，48h，72h，96h，120h，144h的Western-Blot结果图

泳道1为BMGY培养48h后蛋白上清，泳道2为BMMY培养24h后蛋白上清，其他泳道为表达24h，48h，72h，96h，120h及144h后蛋白上清，条带大小为83kd左右。FactorXIIIAAntibody(B-8)：sc-376312，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY。

图8为重组质粒表达产物浓缩结果SDS-PAGE电泳图

泳道1为阴性对照；泳道2为蛋白质marker；道3、4为未浓缩蛋白上清，条带大小为110kd左右；泳道5为浓缩后蛋白上清，条带大小为83kd左右；泳道6为猪的凝血XIII因子

图9为表达产物纯化SDS-PAGE电泳图

泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10为重组质粒的酵母表达产物，2到10分别用咪唑浓度为20、40、60、80、100、250、500、750、1000mM的洗涤及洗脱缓冲液。

图10为凝集结果图a

底物为猪源纤维蛋白原，1添加猪FXIII；2添加浓缩后的重组蛋白上清；3添加纯化后的重组蛋白上清；4添加浓缩后的重组蛋白上清与0.05mol/l CaCl₂的混合液；5添加纯化后的重组蛋白上清与0.05mol/l CaCl₂的混合液。

图11为凝集结果图b

底物为人血浆，1添加猪FXIII；2添加重组蛋白上清；3重组蛋白上清与0.05mol/l CaCl₂的混合液；40.5mol/l CaCl₂溶液。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的人重组凝血因子XIII的制备方法及促凝血功能作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1人重组凝血因子XIII的制备

一、通过基因工程技术构建XIII因子基因表达载体pPICZαC-FXIIIa

构建含至少一种编码XIII因子或其变体的多肽链的表达载体(图1)，筛选稳定的转化子，分泌表达XIII因子或其变体或亚基XIII因子或其变体或亚基分离纯化。

二、pPICZαC-FXIIIa重组质粒的鉴定

1、大提法制备质粒DNA：取50μL重组pPICZαC-FXIIIa质粒菌液加入5mL含有5μLzeocin的LB培养液，37℃振荡培养过夜；在1.5mL离心管中加入菌液1.5mL-3mL，12000g离心2min，收集细菌沉淀，倒掉上清；将细菌沉淀中加入溶液I 200μL，剧烈震荡将菌液充分混匀；加溶液II200μL(NaOH和SDS用之前等体积混匀)，盖严管盖颠倒微型离心管5次以合内容物，不要强烈震荡，至溶液变的澄清，冰浴防止5min(根据不同菌株可适当缩短)；溶液澄清后加入预冷的溶液III200μL，温和震荡10s，室温放置3-5min，12000g，4℃离心10min，取上清移至一个新的Eppendorf管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，去除杂蛋白，12000g，4℃下离心10min，取上清至另一个Ep管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，-20℃放置20min，12000g，离心10min，弃上清；70％乙醇洗脱，直接倒去70％乙醇，再离心30s，将管壁上的乙醇沉淀，用枪头吸去多余的乙醇，将管放置在滤纸上，室温下蒸发恒量的乙醇10-15min；最后加入50μL的TE(含Rnase 20μg/mL)溶液溶解，37℃水浴30min，降解RNA。电泳检测试验结果(图2)。

2、重组质粒PCR鉴定：在PCR管中依次加入以下试剂(冰上操作)

表1 PCR反应体系

反应体系共50μL，进行PCR扩增。经优化的PCR循环参数为30个。

表2 PCR反应程序

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图3)。

3、重组质粒双酶切鉴定：在Eppendorf管中依次加入以下试剂

表3 双酶切反应体系

重组质粒8μL

37℃反应24小时，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果(图4)。

三、pPICZαC-FXIIIa重组质粒在毕赤酵母中的表达及鉴定

1、重组质粒线性化：在1.5mL的Eppendoff管中依次加入以下试剂

表4 酶切反应体系

反应体系共40μL，37℃酶切过夜。进行割胶回收：

(1)灌注一块1％的琼脂糖凝胶，充分凝固，取PCR产物50μL加入到上样孔内电泳；电泳完毕，在紫外灯下割下目的基因条带，用纸巾吸尽凝胶表面液体，置Eppendorf管中。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

(3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2mL离心管)中(室温，静置5分钟)，12，000×g离心1min。弃滤液。

(5)将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(6)将制备管置回离心管，加700μLBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min。

*确认在Buffer W2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

(7)将制备管置于2ml离心管中，12,000×g离心1min。

(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

2、酵母感受态的制备：

(1)取5mL YPD培养基于50mL锥形瓶中，接种酵母X33于30℃过夜培养。

(2)用0.1-0.2mL培养物接种于500mL新鲜培养基中，在一个2L的培养瓶中摇至OD₆₀₀＝1.3-1.5。

(3)4℃，1500×g，5min离心收集细胞，用500mL冰冷的无菌水重悬细胞，同上离心。

(4)重悬细胞于250mL冰冷的无菌水中，同上离心。

(5)用20mL 1M冰冷的山梨醇重悬细胞，同上离心。

(6)用1mL 1M冰冷的山梨醇重悬细胞至终体积为1.5mL。

注释：用于电转化的细胞可以冻存，但是转化效率会降低。

3、电转化

(1)混合80μL从上面第六步获得的细胞与5-20μg线性化的重组质粒DNA，将它们转移至冰冷的0.2cm的电转杯中。

(2)将电转杯的细胞在冰上放置5min。

(3)根据电转仪说明进行电转化。

(4)立即加入1mL冰冷的1M的山梨醇到电转杯中，将电转杯中内容物转移到一个无菌的离心管中。

(5)取200-600μL上述内容物涂布于zeocin MD平板。

(6)30℃培养，直至单克隆菌落出现，检测Mut+/Muts表型。

4、重组酵母阳性克隆的筛选

(1)挑取zeocin MD板中的单菌落于5mL YPD培养液中震荡过夜(28℃，225rpm)。

(2)取1mL(或500μL)于1.5mL Ep管，3000g离心5min，收集菌体，蒸馏水洗一次，1mL山梨醇洗一次(轻轻吹打)，离心，收集菌体。

(3)溶于100μL蒸馏水，80℃下加热10min(可在PCR仪中完成)。

(4)3000g离心5min，收集上清。

(5)PCR。(图5)

5、诱导表达

(1)取已鉴定的阳性克隆，接种于100mL BMMY培养基中，28-30℃，250-300rpm振摇培养至OD₆₀₀＝2-6。

(2)1500-3000g，室温，5min，收集细胞。去除上清，将细胞重悬于原体积1/5至1/10体积的BMMY培养基中。

(3)瓶口覆盖无菌纱布，继续于28-30℃，250-300rpm振摇培养。

(4)加100％甲醇使终浓度为0.5％，每24小时加一次，保持诱导浓度。

(5)在0h，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，108h和120h取1mL表达产物置于1.5mL离 心管中，这些样品将用于分析表达水平和收获细胞的最佳时间点。样品在室温，15000g离心5min。

(6)对于分泌表达，将上清放入一个新管中，将上清和细胞分别保存于-80℃直至检测。

(7)用SDS-PAGE和分析蛋白表达情况。

(8)根据表达情况调整培养温度、诱导剂浓度和取样时间点，以获取最佳的表达浓度和最好的取样时间点。

(9)样品冻存于-80℃。

6、表达产物鉴定

(1)SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达情况。

(2)SDS-PAGE电泳板的处理：用中性洗涤剂清洗后，再用双蒸水淋洗，然后用无水乙醇浸润的棉球擦拭，用吹风机吹干备用。

(3)分离胶的制备：在一50mL小烧杯中加入下列试剂

表5 分离胶配制体系

充分混匀，立即灌胶：将上述胶液缓慢倒入固定在垂直电泳槽中的两电泳板之间的狭槽中(注意不要产生气泡)。立即在分离胶上面轻轻覆盖一层ddH₂O；室温静置30min，使胶完全聚合，除去上层水相，然后用滤纸吸干水份；

(4)浓缩胶的制备：在一50mL小烧杯中加入下列试剂

表6 浓缩胶配制体系

充分混匀，立即灌胶：将上述胶液缓慢倒入分离胶上的狭槽中(注意不要产生气泡)，插入样品梳；室温静置聚合，待聚合完全后拔去梳子。

(5)样品的准备：取裂解液和细菌沉渣与等量5×上样缓冲液混合，煮沸10min，12000g离心5min，取上清。

(6)电泳：在电泳槽中加满缓冲液。用微量玻璃注射器上样。稳流15mA电泳约3.5h，至溴酚蓝迁移至胶下缘结束电泳。

(7)染色：电泳完毕，小心取出凝胶，置于有盖的大培养皿中，倒入染色液至浸没凝胶，于水平摇床上染色45min。

(8)脱色：倒去染色液，用少量水淋洗凝胶，倒入脱色液至浸没凝胶，于水平摇床上脱色至蓝色背景消失，再根据分子量大小进行分析(图6)。

(9)Western-Blot分析蛋白(图7)

四、重组pPICZαC-FXIIIa质粒的纯化

(1)取表达5天后的酵母菌液(合约12mL)，4℃下，4500g离心3h，收集上清(图8)。

(2)制备结合、洗涤、洗脱缓冲液。

(3)确定蛋白质纯化所需的柱子体积。大多数情况下，1毫升固定树脂足以纯化1升培养液(OD₆₀₀＜6.0)中的蛋白量。假如表达量十分高(如50mg/liter)，那么没升培养液需要2毫升树脂。

(4)一旦确定了所需固定树脂的体积，吸取等量的水到柱子中，立刻标上最顶端水位所指示刻度，这个标记表示固定树脂的顶端，树脂填柱前流尽之前的水。

(5)树脂填满到标记处，树脂沉淀，必要时用吸管添加或移除来校准树脂。

注：吸取HisLink^TM树脂时，动作迅速并确保它是完全悬浮的。树脂颇重且下沉迅速。假如10-15秒内不能吸取完，会出现重大沉淀，那么树脂需重新悬浮。或者，用磁力搅拌棒，保持在转移时树脂的悬浮。为避免树脂破裂，转移树脂时也不要停下搅拌树脂。

(6)柱子外流时，保持树脂与5个柱子体积的结合缓冲液相平衡，直到缓冲液完全进入树脂基床。

(7)轻轻地滴加澄清的裂解液到树脂中直到裂解液完全进入柱子流速不得超过1-2mL/min。标准重力流条件下，流速约1mL/min。实际的流速取决于使用柱子的体积与裂解因为澄清和过滤的程度。

注：对于HQ标记的蛋白，建议在结合、洗涤缓冲液中添加NaCl，使其终浓度为500mM。盐改善了树脂上标记蛋白间的结合，使非特异性蛋白结合情况降到最低。

*加入裂解液后不要让树脂变干！

(8)至少用10-20个体积柱子体积的洗涤缓冲液冲洗已释放的蛋白质。把洗涤缓冲液分为2或3份，滴加下一份前要使之前的缓冲液完全进入树脂基床。

(9)一旦洗涤缓冲液完全进入树脂基床后，滴加洗脱缓冲液并开始收集片段(5-50mL)。洗脱与蛋白质相关，但多聚组氨酸或HQ标记的蛋白通常在头一个一毫升中洗脱下来。给予足够高的咪唑浓度以有效洗脱，通常，每1mL固定树脂收集3-5ml缓冲液后，洗脱完成。

注：HQ标记淡定蛋白多聚组氨酸标记的蛋白相比，洗脱需要一个相对较低的咪唑浓度(50-100mM)。

(10)以凝胶电泳分析，来确定蛋白量及蛋白纯度(图9)。

实施例2人重组凝血因子XIII的促凝血功能检测

重组pPICZαC-FXIIIa蛋白的活性测试

(1)准备6份等量的猪源纤维蛋白于试管或载玻片，每份100μL。

(2)分别于6份猪源纤维蛋白上滴加等量猪凝血酶、0.05mol/L CaCl₂、浓缩后的人重组蛋白上清、纯化后的人重组蛋白上清、浓缩后的人重组蛋白上清与0.05mol/L CaCl₂的混合液(等量混合)、纯化后的人重组蛋白上清与0.05mol/L CaCl₂的混合液(等量混合)。(图10)

实施例3人重组凝血因子XIII的促凝血功能检测

重组pPICZαC-FXIIIa蛋白的活性测试

(1)准备4份等量的人血浆于试管或载玻片，每份100μl。

(2)分别于4份人血浆上滴加等量猪凝血酶、重组蛋白上清、重组蛋白上清与0.05mol/l CaCl₂的混合液、0.5mol/l CaCl₂溶液(图11)。

Claims (10)

1.人重组凝血因子XIII(FXIII)的制备方法及其促凝血功能的应用。

2.根据权利要求1的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)是通过重组蛋白质来提供。

3.根据权利要求2的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)是通过酵母表达人凝血因子XIII载体pPICZαC-XIIIa。

4.根据权利要求1至3的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)是人A亚基的单体或二聚体。

5.根据权利要求1至4的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)是以浓缩物或纯化物来使用或施用。

6.根据权利要求1至5的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)用于在手术期间或手术之后在患者中减少与手术相关的失血的用途。

7.根据权利要求1至5的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)用于治疗血小板异常的用途。

8.根据权利要求1至5的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)在制备用于减少失血的药物组合中的用途。

9.根据权利要求1至5的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)在制备用于在手术期间或手术之后在患者中减少与手术相关的失血的药物组合中的用途。

10.根据权利要求1至5的方法，其所述的人重组凝血因子XIII(FXIII)在制备用于治疗血小板异常的药物组合中的用途。