CN105980566A - 新型杀昆虫蛋白及其使用方法 - Google Patents
新型杀昆虫蛋白及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105980566A CN105980566A CN201380050024.1A CN201380050024A CN105980566A CN 105980566 A CN105980566 A CN 105980566A CN 201380050024 A CN201380050024 A CN 201380050024A CN 105980566 A CN105980566 A CN 105980566A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xaa
- leu
- glu
- val
- phe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 147
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 143
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 62
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 16
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 379
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 298
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 285
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 285
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 204
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 138
- -1 His Chemical compound 0.000 claims description 122
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 102
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 79
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 67
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 63
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 claims description 59
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 38
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 38
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 22
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 15
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 7
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 6
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 claims description 6
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 claims description 6
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 6
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 claims description 6
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical compound 0.000 claims description 4
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 claims description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 4
- 230000008117 seed development Effects 0.000 claims description 4
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 claims description 3
- 241001249699 Capitata Species 0.000 claims description 3
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 claims description 3
- 241000207199 Citrus Species 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- 235000005983 Crescentia cujete Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 claims description 3
- 241000628997 Flos Species 0.000 claims description 3
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009797 Lagenaria vulgaris Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 240000005498 Setaria italica Species 0.000 claims description 3
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims description 3
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000219095 Vitis Species 0.000 claims description 3
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019519 canola oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000828 canola oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002252 panizo Nutrition 0.000 claims description 3
- 101100381997 Danio rerio tbc1d32 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100381999 Mus musculus Tbc1d32 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 claims 1
- 240000008384 Capsicum annuum var. annuum Species 0.000 claims 1
- 240000009087 Crescentia cujete Species 0.000 claims 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 34
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 25
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 abstract description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 8
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 abstract description 8
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 7
- 241000255925 Diptera Species 0.000 abstract description 6
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 abstract description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 401
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 399
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 385
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 379
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 352
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 306
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 306
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 296
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 273
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 269
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 238
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 236
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 190
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 188
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 186
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 155
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 152
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 131
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 128
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 104
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 16
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 16
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 15
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 14
- 239000002585 base Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 11
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 8
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 7
- JNQYNXFGVRUFNP-JGVFFNPUSA-N 4-amino-1-[(2r,5s)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 JNQYNXFGVRUFNP-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 6
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 6
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 6
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 108010057392 tocopherol cyclase Proteins 0.000 description 6
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 5
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 5
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 5
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 5
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 5
- 101150078024 CRY2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 125000000534 N(2)-L-lysino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 4
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 4
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 4
- 241000607757 Xenorhabdus Species 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 4
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 3
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 3
- 241001556359 Fusarium solani f. sp. glycines Species 0.000 description 3
- 125000000205 L-threonino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])O[H] 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 3
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 2
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 2
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 2
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 2
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 2
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000002068 L-phenylalanino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 240000007741 Lagenaria siceraria Species 0.000 description 2
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 2
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 2
- 241000193418 Paenibacillus larvae Species 0.000 description 2
- 241001310339 Paenibacillus popilliae Species 0.000 description 2
- 101000624394 Pseudomonas entomophila (strain L48) Monalysin Proteins 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000012681 biocontrol agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 231100000290 environmental risk assessment Toxicity 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3s,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-10,13-dimethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 description 1
- 235000008121 Agrocybe aegerita Nutrition 0.000 description 1
- 244000045069 Agrocybe aegerita Species 0.000 description 1
- 241000625753 Anticarsia Species 0.000 description 1
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001367803 Chrysodeixis includens Species 0.000 description 1
- 241001148495 Cibotium barometz Species 0.000 description 1
- 241001429695 Colletotrichum graminicola Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 description 1
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 1
- 208000035126 Facies Diseases 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000958205 Hogna carolinensis M-lycotoxin-Hc1a Proteins 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- 241000254043 Melolonthinae Species 0.000 description 1
- 241000589325 Methylobacillus Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100438748 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 description 1
- 241000193157 Paraclostridium bifermentans Species 0.000 description 1
- 241000607568 Photobacterium Species 0.000 description 1
- 241000178953 Photorhabdus sp. Species 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 241000254101 Popillia japonica Species 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101800001072 Protein 1A Proteins 0.000 description 1
- 101100457857 Pseudomonas entomophila (strain L48) mnl gene Proteins 0.000 description 1
- 241000467496 Pseudomonas protegens Species 0.000 description 1
- 241000589630 Pseudomonas pseudoalcaligenes Species 0.000 description 1
- 241001468880 Pseudomonas taiwanensis Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 101001000732 Rhodococcus jostii (strain RHA1) Glucose-6-phosphate isomerase 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001489223 Saccharomycodes Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000332749 Setosphaeria turcica Species 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101710099833 Venom protein Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 241000500606 Xenorhabdus sp. Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108010089166 aegerolysin Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 101150109293 cyt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 238000003499 nucleic acid array Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000012865 response to insecticide Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002795 scorpion venom Substances 0.000 description 1
- APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M sodium docusate Chemical compound [Na+].CCCCC(CC)COC(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 108010014657 sortilin Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000001113 umbilicus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
- A01N37/46—N-acyl derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/225—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Alcaligenes (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明提供了用于防治害虫的组合物和方法。所述方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列转化生物体。具体地讲，所述核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是细菌物种的杀昆虫核酸和蛋白。所述序列可用于构建表达载体以用于后续转化到包括植物的所关注的生物体中，用作分离其他同源(或部分同源)基因的探针。所述杀虫蛋白可用于防治、抑制生长或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫害虫种群，以及用于产生具有杀昆虫活性的组合物。
Description
对以电子方式提交的序列表的引用
创建于2013年6月13日、大小为1499千字节的文件名为“4244PCT_sequence_listing.txt”的序列表以计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新型基因。这些杀虫蛋白以及编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂并且可用于产生转基因抗虫害植物。
背景技术
使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，可提供具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。
已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些种对于一系列昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)害虫以及其他害虫。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。昆虫致病性也被认为是由幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的菌株引起的。微生物杀昆虫剂，特 别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。
最近，已通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了昆虫抗性增强的作物。例如，已对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从Bt的菌株分离的杀虫蛋白。这些经遗传工程改造的作物目前在农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在商业上十分成功，但它们仅对较窄范围的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。在一些情况中，昆虫可产生对不同杀昆虫化合物的抗性，使得有必要寻找替代的生物防治剂来进行害虫防治。
因此，仍然需要针对昆虫害虫具有不同范围杀昆虫活性的新杀虫蛋白，例如对于鳞翅目和鞘翅目的多种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述多种昆虫包括但不限于已对现有杀昆虫剂产生抗性的昆虫害虫。
发明内容
提供了将杀虫活性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的载体以及含有所述载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列以及那些多肽的抗体。核酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，该DNA构建体或表达盒用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以为设计用于在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。
具体地讲，提供了分离的或重组的核酸分子，所述核酸分子编码产碱菌属(Alcaligenes)杀昆虫蛋白-1A和产碱菌属杀昆虫蛋白-1B(AfIP-1A和AfIP-1B)多肽，所述多肽包含氨基酸置换、缺失、插入和其片段以及它们的组合。此外，涵盖与AfIP-1A和AfIP-1B多肽对应的氨基酸序列。提供了分离的或重组的核酸分子，所述核酸分子能够编码SEQID NO：2的AfIP-1A多肽以及氨基酸置换、缺失、插入、其片段以及它们的组合。还提供了分离的或重组的核酸分子，所述核酸分子能够编码SEQ ID NO：4的AfIP-1B多肽以及氨基酸置换、缺失、插入、其片段以及它们的组合。还涵 盖与所述实施例的核酸序列互补或杂交至所述实施例的序列的核酸序列。还提供了分离的或重组的SEQ ID NO：2的AfIP-1A多肽以及氨基酸置换、缺失、插入、其片段以及它们的组合。还提供了分离的或重组的SEQ ID NO：4的AfIP-1B多肽以及氨基酸置换、缺失、插入、其片段以及它们的组合。
提供了用于产生多肽以及使用那些多肽防治或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、半翅目和/或双翅目害虫的方法。所述实施例的转基因植物表达本文所公开的杀虫序列中的一者或多者。在各种实施例中，转基因植物还包含具有昆虫抗性的一个或多个另外的基因，例如，用于防治鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫害虫的一个或多个另外的基因。本领域技术人员应当理解，转基因植物可包含赋予所关注的农艺性状的任何基因。
还包括用于检测样品中的所述实施例的核酸和多肽的方法。提供了用于检测AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的存在或检测样品中编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。所述试剂盒可连同执行检测预期因子的方法所需的所有试剂和对照样品以及使用说明一起提供。
所述实施例的组合物和方法可用于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含所述生物体的组合物是农业用途所需的。所述实施例的组合物也可用于产生具有杀虫活性的改变或改善的蛋白质，或可用于检测产物或生物体中AfIP-1A和AfIP-1B多肽或核酸的存在。
本发明涵盖以下实施例：
1.一种编码AfIP-1A多肽的重组核酸分子。
2.实施例1的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽来自粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)菌株。
3.实施例2的重组核酸分子，其中所述粪产碱菌菌株是以登录号NRRL B-50625保藏的DDMC P4G7。
4.实施例1、2或3的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序。
5.实施例4的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽还包含如由SEQ ID NO：257的第15-26位、SEQ ID NO：257的第33-53位和SEQ ID NO：257的第71-84位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
6.实施例1、2、3、4或5的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性。
7.实施例1、2、3、4、5或6的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性并且包含如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序。
8.实施例7的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽还包含如由SEQ ID NO：257的第15-26位、SEQ ID NO：257的第33-53位、SEQ ID NO：257的第71-84位以及SEQ ID NO：257的第100-107位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
9.实施例1、2、3、4、5、6、7或8的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ IDNO：255的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala或Val；第9位处的Xaa是Glu或Gly；第13位处的Xaa是Ile或Val；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第30位处的Xaa是Asn或Ser；第33位处的Xaa是Val或Ile；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp； 第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第67位处的Xaa是Asp或Glu；第68位处的Xaa是Ser或Thr；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第96位处的Xaa是Val或Ile；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第111位处的Xaa是Asp或Asn；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys或Glu；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是 Ile、Ser、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Leu或Phe；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；并且第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
10.实施例1、2、3、4、5、6、7或8的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ IDNO：256的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala、Met或Val；第8位处的Xaa是Thr或Asp；第9位处的Xaa是Glu、Leu或Gly；第10位处的Xaa是Glu或Asn；第11位处的Xaa是Ser或Val；第12位处的Xaa是Lys或Glu；第13位处的Xaa是Ile或Val；第14位处的Xaa是Arg或Gln；第16位处的Xaa是 Tyr或Gln；第17位处的Xaa是Ala或Ser；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第26位处的Xaa是Val或Ser；第27位处的Xaa是Val或Glu；第29位处的Xaa是Ser或Met；第30位处的Xaa是Asn、Asp或Ser；第31位处的Xaa是Phe或Ile；第32位处的Xaa是Lys或Glu；第33位处的Xaa是Val或Ile；第34位处的Xaa是Glu或Lys；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Leu 或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu或Gly；第67位处的Xaa是Asp、Thr或Glu；第68位处的Xaa是Ser、Lys或Thr；第69位处的Xaa是Tyr或Ser；第70位处的Xaa是Thr或Lys；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu或Ala；第78位处的Xaa是Asn或Asp；第79位处的Xaa是Ala或Thr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly或Lys；第88位处的Xaa是Ser或Glu；第89位处的Xaa是Leu或Ile；第91位处的Xaa是Asp或His；第92位处的Xaa是Gly或Asp；第95位处的Xaa是Leu或Trp；第96位处的Xaa是Val、Leu或Ile；第97位处的Xaa是Phe或Ala；第98位处的Xaa是Glu或Thr；第100位处的Xaa是Tyr或Lys；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser或Ala；第111位处的Xaa是Asp、His或Asn；第112位处的Xaa是Glu或Ser；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys、Thr或Glu；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys或Asp；第119位处的 Xaa是Glu或Asn；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Leu或Phe；第131位处的Xaa是Pro或Ser；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val或Cys；第143位处的Xaa是Val或Ile；第145位处的Xaa是Lys或Val；并且第146位处的Xaa是Ser或Gly；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
11.实施例1、2、3、4、5、6、7或8的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ IDNO：257的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Met、Val或Ser；第7位处的Xaa是Ala、Met、Val、Leu、Ile或Gly；第8位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；第9位处的Xaa是Glu、Leu、Gly、Asp、Ala、Ile、Val或Met；第10位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第11位处的Xaa是Ser、Val、Thr、Ile、Leu或Met；第12位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第13位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第14位处的Xaa是Arg、Gln、Lys或Asn；第16位处的Xaa是Tyr、Gln、Trp、Phe或Asn；第17位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu、Ala、Ser、Asp或Gly；第24位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Met；第26位处的Xaa是Val、Ser、Ile、Leu、Met或Thr；第27位处的Xaa是Val、Glu、Ile、Leu、Met或Asp；第29位处的Xaa是Ser、Met、Thr、Ile、Leu或Val；第30位处的Xaa是Asn、Asp、Ser、Glu、Gln或Thr；第31位处的Xaa是Phe、Ile、Leu、Val或Met；第32位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第33位处的Xaa是Val、Ile、Leu或Met；第34位处的Xaa是Glu、Lys、Asp或Arg；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、 Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Glu、Gln、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Arg、Gln、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Thr、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp、Thr、Glu或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Asn、Ser、Asp、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu、Met或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu、Met、Arg或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Arg、Thr、Asp、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第67位处的Xaa是Asp、Thr、Glu或Ser；第68位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg；第69位处的Xaa是Tyr、Ser、Trp、Phe或Thr；第70位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第73位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa 是Glu、Ala、Asp或Gly；第78位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu；第79位处的Xaa是Ala、Thr、Gly或Ser；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第88位处的Xaa是Ser、Glu、Thr或Asp；第89位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第91位处的Xaa是Asp、His或Glu；第92位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu；第95位处的Xaa是Leu、Trp、Ile、Val、Met、Phe或Tyr；第96位处的Xaa是Val、Leu、Ile或Met；第97位处的Xaa是Phe、Ala或Gly；第98位处的Xaa是Glu、Thr、Asp或Ser；第100位处的Xaa是Tyr、Lys、Trp或Arg；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第111位处的Xaa是Asp、His、Asn、Glu或Gln；第112位处的Xaa是Glu、Ser、Asp或Thr；第113位处的Xaa是Leu、Ser、Ile、Val、Met或Thr；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val、Ile、Val或Met；第116位处的Xaa是Lys、Thr、Glu、Arg、Ser或Asp；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys、Asp、Arg或Glu；第119位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第120位处的Xaa是Asn、Lys、Asp或Arg；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Ser、Arg、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Met、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu、Val、Met、Thr、Glu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Arg、Asp、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Ala、Gln、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Thr、Leu、Val、Met或Phe；第131位处的Xaa是Pro、Ser或Thr；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第 133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val、Cys、Ile、Leu或Met；第143位处的Xaa是Val、Ile；Leu或Met；第145位处的Xaa是Lys、Val、Arg、Ile、Leu或Met；并且第146位处的Xaa是Ser、Gly、Thr或Ala；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
12.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：93的多核苷酸、其片段或其互补序列。
13.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的重组核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：94的氨基酸序列或其片段。
14.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子在严格条件下杂交至SEQ ID NO：1的多核苷酸。
15.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：93的多核苷酸。
16.一种转基因植物或其子代，包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子。
17.一种用实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子稳定转化的转基因植物或其子代。
18.实施例16或17的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
19.实施例16或17的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
20.实施例16、17、18或19的转基因植物，还包括一种或多种另外的转基因性状。
21.实施例20的转基因植物，其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性或胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量以及耐旱性。
22.一种表达盒，包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子；以及一个或多个调控序列，所述一个或多个调控序列有效连接至AfIP-1A多肽并引导AfIP-1A多肽的表达。
23.一种转基因植物，包含实施例22的表达盒。
24.一种转基因植物细胞，包含实施例22的表达盒。
25.实施例23的转基因植物或其子代的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含重组核酸分子。
26.实施例25的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
27.实施例26的种子，其中所述一种或多种种子处理剂选自除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂、萌发增强剂、植物生长调节剂、杀细菌剂和杀线虫剂。
28.一种用于在植物中表达编码AfIP-1A多肽的核酸分子的方法，所述方法包括从包含根据权利要求22所述的表达盒的转化植物细胞产生能够表达编码AfIP-1A多肽的核酸分子的植物。
29.一种通过实施例28的方法产生的转基因植物。
30.实施例29的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品。
31.实施例29的转基因植物，其中所述转基因植物还包括一种或多种另外的转基因性状。
32.实施例31的转基因植物，其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
33.实施例31或32的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
34.实施例31或32的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
35.一种重组AfIP-1A多肽。
36.实施例35的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽来自粪产碱菌菌株。
37.实施例36的重组AfIP-1A多肽，其中所述粪产碱菌菌株是以登录号NRRL B-50625保藏的DDMC P4G7。
38.实施例35、36或37的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含如由SEQ IDNO：257的第100-107位表示的氨基酸基序。
39.实施例38的重组AfIP-1A多肽，还包含如由SEQ ID NO：257的第15-26位、SEQID NO：257的第33-53位和SEQ ID NO：257的第71-84位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
40.实施例35、36、37、38或39的重组AfIP-1A多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性。
41.实施例35、36、37、38或39的重组AfIP-1A多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性，并且包含如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序。
42.实施例41的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽还包含如由SEQ ID NO：257的第15-26位、SEQ ID NO：257的第33-53位和SEQ ID NO：257的第71-84位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
43.实施例35、36、37、38、39、40、41或42的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：255的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala或Val；第9位处的Xaa是Glu或Gly；第13位处的Xaa是Ile或Val；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第30位处的Xaa是Asn或Ser；第33位处的Xaa是Val或Ile；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、 Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第67位处的Xaa是Asp或Glu；第68位处的Xaa是Ser或Thr；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第96位处的Xaa是Val或Ile；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第111位处的Xaa是Asp或Asn；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys或Glu；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Leu 或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Leu或Phe；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；并且第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
44.实施例35、36、37、38、39、40、41或42的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：256的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala、Met或Val；第8位处的Xaa是Thr或Asp；第9位处的Xaa是Glu、Leu或Gly；第10位处的Xaa是Glu或Asn；第11位处的Xaa是Ser或Val；第12位处的Xaa是Lys或Glu；第13位处的Xaa是Ile或Val；第14位处的Xaa是Arg或Gln；第16位处的Xaa是Tyr或Gln；第17位处的Xaa是Ala或Ser；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa 是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第26位处的Xaa是Val或Ser；第27位处的Xaa是Val或Glu；第29位处的Xaa是Ser或Met；第30位处的Xaa是Asn、Asp或Ser；第31位处的Xaa是Phe或Ile；第32位处的Xaa是Lys或Glu；第33位处的Xaa是Val或Ile；第34位处的Xaa是Glu或Lys；第35位处的Xaa是Gly、Lys或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、 Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu或Gly；第67位处的Xaa是Asp、Thr或Glu；第68位处的Xaa是Ser、Lys或Thr；第69位处的Xaa是Tyr或Ser；第70位处的Xaa是Thr或Lys；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu或Ala；第78位处的Xaa是Asn或Asp；第79位处的Xaa是Ala或Thr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly或Lys；第88位处的Xaa是Ser或Glu；第89位处的Xaa是Leu或Ile；第91位处的Xaa是Asp或His；第92位处的Xaa是Gly或Asp；第95位处的Xaa是Leu或Trp；第96位处的Xaa是Val、Leu或Ile；第97位处的Xaa是Phe或Ala；第98位处的Xaa是Glu或Thr；第100位处的Xaa是Tyr或Lys；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser或Ala；第111位处的Xaa是Asp、His或Asn；第112位处的Xaa是Glu或Ser；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys、Thr或Glu；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys或Asp；第119位处的Xaa是Glu或Asn；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa 是Thr、Lys、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Leu或Phe；第131位处的Xaa是Pro或Ser；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、yal或Tyr；第142位处的Xaa是Val或Cys；第143位处的Xaa是Val或Ile；第145位处的Xaa是Lys或Val；并且第146位处的Xaa是Ser或Gly；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
45.实施例35、36、37、38、39、40、41或42的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：257的氨基酸序 列，其中第6位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Met、Val或Ser；第7位处的Xaa是Ala、Met、Val、Leu、Ile或Gly；第8位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；第9位处的Xaa是Glu、Leu、Gly、Asp、Ala、Ile、Val或Met；第10位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第11位处的Xaa是Ser、Val、Thr、Ile、Leu或Met；第12位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第13位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第14位处的Xaa是Arg、Gln、Lys或Asn；第16位处的Xaa是Tyr、Gln、Trp、Phe或Asn；第17位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu、Ala、Ser、Asp或Gly；第24位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Met；第26位处的Xaa是Val、Ser、Ile、Leu、Met或Thr；第27位处的Xaa是Val、Glu、Ile、Leu、Met或Asp；第29位处的Xaa是Ser、Met、Thr、Ile、Leu或Val；第30位处的Xaa是Asn、Asp、Ser、Glu、Gln或Thr；第31位处的Xaa是Phe、Ile、Leu、Val或Met；第32位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第33位处的Xaa是Val、Ile、Leu或Met；第34位处的Xaa是Glu、Lys、Asp或Arg；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、 Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Glu、Gln、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Arg、Gln、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Thr、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp、Thr、Glu、Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Asn、Ser、Asp、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu、Met或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu、Met、Arg或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Arg、Thr、Asp、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第67位处的Xaa是Asp、Thr、Glu或Ser；第68位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg；第69位处的Xaa是Tyr、Ser、Trp、Phe或Thr；第70位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第73位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu、Ala、Asp或Gly；第78位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu；第79位处的Xaa是Ala、Thr、Gly或Ser；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第88位处的Xaa是Ser、Glu、Thr或Asp；第89位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第91位处的Xaa是Asp、His或Glu；第92位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu；第95位处的Xaa是Leu、Trp、Ile、Val、Met、Phe或Tyr；第96位处的Xaa是Val、Leu、Ile或Met；第97位处的Xaa是Phe、Ala或Gly；第98位处的Xaa是Glu、Thr、Asp或Ser；第100位处的Xaa是Tyr、Lys、Trp或Arg；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第111位处的Xaa是Asp、His、Asn、Glu或Gln；第112位处的Xaa是Glu、Ser、Asp或Thr；第113位处的Xaa是Leu、Ser、Ile、Val、Met或Thr；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val、Ile、Val或Met；第116位处的Xaa是Lys、Thr、Glu、Arg、Ser或Asp；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys、Asp、Arg或Glu；第119位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第120位处的Xaa是Asn、Lys、Asp或Arg；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Ser、Arg、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Met、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu、Val、Met、Thr、Glu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Arg、Asp、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Ala、Gln、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Thr、Leu、Val、Met或Phe；第131位处的Xaa是Pro、Ser或Thr；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp； 第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val、Cys、Ile、Leu或Met；第143位处的Xaa是Val、Ile；Leu或Met；第145位处的Xaa是Lys、Val、Arg、Ile、Leu或Met；并且第146位处的Xaa是Ser、Gly、Thr或Ala；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
46.实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：94的氨基酸序列或其片段。
47.重组AfIP-1A多肽，包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：94的氨基酸序列。
48.实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：93的多核苷酸编码。
49.实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49的重组AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包括选自如下的一个或多个特性：
a)如由SEQ ID NO：257的第15-26位表示的氨基酸基序；
b)如由SEQ ID NO：257的第33-53位表示的氨基酸基序；
c)如由SEQ ID NO：257的第71-84位表示的氨基酸基序；
d)如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序；
e)杀真菌活性；
f)杀昆虫活性；
g)约12kD至约18kD之间的计算分子量。
50.一种能够表达编码实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽的重组多核苷酸的转基因植物。
51.实施例50的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
52.实施例50的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
53.实施例50的转基因植物，其中所述转基因植物表达一种或多种另外的转基因性状。
54.一种组合物，包含杀虫有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的重组AfIP-1A多肽。
55.实施例54的组合物，还包含农业上适用的载体。
56.实施例55的组合物，其中所述载体选自散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。
57.实施例56的组合物，还包含一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。
58.实施例57的组合物，其中所述一种或多种杀昆虫剂是杀虫蛋白。
59.实施例58的组合物，其中所述一种或多种杀虫蛋白选自Cry1蛋白、Cry2蛋白、Cry3蛋白、Cry4蛋白、Cry5蛋白、Cry6蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry9蛋白、Cry15蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry32蛋白、Cry34蛋白、Cry35蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry43蛋白、Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry55蛋白、Cry二元毒素、Cyt蛋白、VIP毒素、SIP蛋白、杀昆虫脂肪酶、杀昆虫几丁质酶以及蛇毒蛋白。
60.一种用于防治真菌害虫种群的方法，包括使所述真菌害虫种群与杀真菌有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的重组AfIP-1A多肽接触。
61.一种用于保护植物免受真菌害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码杀虫有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的重组AfIP-1A多肽的多核苷酸。
62.一种编码AfIP-1B多肽的重组核酸分子。
63.实施例62的重组核酸分子，其中所述核酸分子来自粪产碱菌菌株。
64.实施例63的重组核酸分子，其中所述粪产碱菌菌株是以登录号NRRL B-50625保藏的DDMC P4G7。
65.实施例62、63或64的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽包含如由SEQ IDNO：259的第358-365位表示的氨基酸基序。
66.实施例65的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽还包含如由SEQ ID NO：259的第105-115位、SEQ ID NO：259的第133-144位、SEQ ID NO：259的第177-184位和SEQ IDNO：259的第511-520位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
67.实施例62、63、64、65或66的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽与SEQ IDNO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性。
68.实施例62、63、64、65或66的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽与SEQ IDNO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性，并且包含如由SEQ ID NO：259的第358-365位表示的氨基酸基序。
69.实施例68的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽还包含如由SEQ ID NO：259的第105-115位、SEQ ID NO：259的第133-144位、SEQ ID NO：259的第177-184位和SEQ IDNO：259的第511-520位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
70.实施例62、63、64、65、66、67、68或69的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：258的氨基酸序列，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met或Leu；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly或Cys；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val或Ala；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala或Val；第148位处的Xaa是Ser、Phe或Thr；第152位处的Xaa是Ile或Thr；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys或Phe；第202位处的Xaa是Lys或Asn；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是 Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile或Val；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala或Glu；第299位处的Xaa是Glu或Gly；第300位处的Xaa是Ile或Val；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala或Ser；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile或Val；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn或Lys；第377位处的Xaa是Leu或Ile；第384位处的Xaa是Thr或Ala；第385位处的Xaa是Ile或Ser；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr或Phe；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser或Asn；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、 Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr或Phe；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr或Phe；第552位处的Xaa是Asn或Ser；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met或Ile；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr或Lys；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr或Phe；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr或Ala；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
71.实施例62、63、64、65、66、67、68或69的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：4的第1至35位处的天然氨基酸在SEQ IDNO：4的相应位置处被SEQ ID NO：20的天然氨基酸置换。
72.实施例62、63、64、65、66、67、68或69的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：259的氨基酸序列，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met、Leu、Ile或Val；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly、Cys或Ala；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处 的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val、Ala、Ile或Leu；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；第148位处的Xaa是Ser、Phe、Thr或Trp；第152位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val、Met或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys、Tyr或Phe；第202位处的Xaa是Lys、Asn或Arg；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala、Glu、Gly或Asp；第299位处的Xaa 是Glu、Gly、Asp或Ala；第300位处的Xaa是Ile、Val、Ile或Met；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn、Lys、Gln或Arg；第377位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第384位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第385位处的Xaa是Ile、Ser、Leu、Val、Met或Thr；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、 Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第552位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met、Ile、Leu或Val；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
73.实施例70的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽还包含在SEQ ID NO：4的相应位置处的SEQ ID NO：20的天然氨基酸的一个或多个氨基酸置换。
74.实施例72的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽还包含在SEQ ID NO：4的相应位置处的SEQ ID NO：20的天然氨基酸的一个或多个氨基酸置换。
75.实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73的重组核酸分子，包含SEQID NO：3或SEQ ID NO：75的多核苷酸、其片段或其互补序列。
76.实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73的重组核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：76的氨基酸序列或其片段。
77.实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子在严格条件下杂交至SEQ ID NO：3的多核苷酸。
78.实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：75的多核苷酸。
79.一种转基因植物或其子代，包含实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的重组核酸分子。
80.一种用实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的重组核酸分子稳定转化的转基因植物或其子代。
81.实施例79或80的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
82.实施例79或80的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
83.实施例79或80的转基因植物，还包括一种或多种另外的转基因性状。
84.实施例83的转基因植物，其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性或胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量以及耐旱性。
85.一种表达盒，包含实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的重组核酸分子，其中所述核酸有效连接至引导AfIP-1B多肽的表达的一个或多个调控序列。
86.一种转基因植物，包含实施例85的表达盒。
87.一种植物细胞，包含实施例85的表达盒。
88.实施例86的转基因植物或其子代的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含重组核酸分子。
89.实施例88的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
90.实施例89的种子，其中所述一种或多种种子处理剂选自除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂、萌发增强剂、植物生长调节剂、杀细菌剂和杀线虫剂。
91.一种用于在植物中表达编码AfIP-1B多肽的多核苷酸的方法，包括从包含根据权利要求85所述的表达盒的转化植物细胞产生能够表达编码AfIP-1B多肽的核酸分子的植物。
92.一种通过实施例91的方法产生的转基因植物。
93.实施例92的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品。
94.实施例92的转基因植物，其中所述转基因植物还包括一种或多种另外的转基因性状。
95.实施例94的转基因植物，其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
96.实施例94或95的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
97.实施例94或95的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
98.一种重组AfIP-1B多肽。
99.实施例98的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽来自粪产碱菌菌株。
100.实施例99的重组AfIP-1B多肽，其中所述粪产碱菌菌株是以登录号NRRL B-50625保藏的DDMC P4G7。
101.实施例98、99或100的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含如由SEQID NO：259的第358-365位表示的氨基酸基序。
102.实施例101的重组AfIP-1B多肽，还包含如由SEQ ID NO：259的第105-115位、SEQ ID NO：259的第133-144位、SEQ ID NO：259的第177-184位和SEQ ID NO：259的第511-520位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
103.实施例98、99、100、101或102的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性。
104.实施例98、99、100、101或102的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性，并且包含如由SEQ ID NO：259的第358-365位表示的氨基酸基序。
105.实施例104的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽还包含如由SEQ IDNO：259的第105-115位、SEQ ID NO：259的第133-144位、SEQ ID NO：259的第177-184位和SEQ ID NO：259的第511-520位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
106.实施例98、99、100、101、102或103的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：258的氨基酸序列，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met或Leu；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly或Cys；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的 Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val或Ala；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser或Cys；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala或Val；第148位处的Xaa是Ser、Phe或Thr；第152位处的Xaa是Ile或Thr；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys或Phe；第202位处的Xaa是Lys或Asn；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile或Val；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala或Glu；第299位处的Xaa是Glu或Gly；第300位处的Xaa是Ile或Val；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala或Ser；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Ser、Thr、Lys或ATg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、AsD、Lys或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、 Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Gln、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile或Val；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn或Lys；第377位处的Xaa是Leu或Ile；第384位处的Xaa是Thr或Ala；第385位处的Xaa是Ile或Ser；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr或Phe；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser或Asn；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp或Lys；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr或Phe；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr或Phe；第552位处的Xaa是Asn或Ser；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met或Ile；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr或Lys；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr或Phe；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处 的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr或Ala；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
107.实施例98、99、100、101、102、103、104、105或106的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：4的第1至35位处的天然氨基酸在SEQ ID NO：20的相应位置处被SEQ ID NO：20的天然氨基酸置换。
108.实施例98、99、100、101、102或103的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：259的氨基酸序列，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met、Leu、Ile或Val；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly、Cys或Ala；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val、Ala、Ile或Leu；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第 137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser或Cys；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；第148位处的Xaa是Ser、Phe、Thr或Trp；第152位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val、Met或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys、Tyr或Phe；第202位处的Xaa是Lys、Asn或Arg；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala、Glu、Gly或Asp；第299位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第300位处的Xaa是Ile、Val、Ile或Met；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Ser、Thr、Lys或Arg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Gln、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的 Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn、Lys、Gln或Arg；第377位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第384位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第385位处的Xaa是Ile、Ser、Leu、Val、Met或Thr；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp或Lys；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第552位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met、Ile、Leu或Val；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处的Xaa是Gln 或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；
并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
109.实施例106的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽还包含在SEQ ID NO：4的相应位置处的SEQ ID NO：20的天然氨基酸的一个或多个氨基酸置换。
110.实施例108的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽还包含在SEQ ID NO：4的相应位置处的SEQ ID NO：20的天然氨基酸的一个或多个氨基酸置换。
111.实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108或109的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：76的氨基酸序列或其片段。
112.实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108或109的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
113.实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108或109的重组AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽由SEQID NO：3或SEQ ID NO：75的多核苷酸编码。
114.实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或113的重组AfIP-1B多肽，具有选自如下的一个或多个特性：
a)如由SEQ ID NO：259的第101-105位表示的氨基酸基序；
b)如由SEQ ID NO：259的第133-144位表示的氨基酸基序；
c)如由SEQ ID NO：259的第177-184位表示的氨基酸基序；
d)如由SEQ ID NO：259的第358-365位表示的氨基酸基序；
e)如由SEQ ID NO：259的第511-520位表示的氨基酸基序；
f)杀真菌活性；
g)杀昆虫活性；以及
h)约72.5kD与约80kD之间的计算分子量。
115.一种能够表达编码实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽的重组多核苷酸的转基因植物。
116.实施例115的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
117.实施例115的转基因植物，其中所述转基因植物是双子叶植物。
118.实施例115的转基因植物，其中所述转基因植物表达一种或多种另外的转基因性状。
119.一种组合物，包含杀虫有效量的实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽。
120.实施例119的组合物，还包含农业上适用的载体。
121.实施例120的组合物，其中所述载体选自散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。
122.实施例119的组合物，还包含一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。
123.实施例122的组合物，其中所述一种或多种杀昆虫剂是杀虫蛋白。
124.实施例123的组合物，其中所述一种或多种杀虫蛋白选自Cry1蛋白、Cry2蛋白、Cry3蛋白、Cry4蛋白、Cry5蛋白、Cry6蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry9蛋白、Cry15蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry32蛋白、Cry34蛋白、Cry35蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry43蛋白、Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry55蛋白、Cry二元毒素、Cyt蛋白、VIP毒素、SIP蛋白、杀昆虫脂肪酶、杀昆虫几丁质酶以及蛇毒蛋白。
125.一种用于防治真菌害虫种群的方法，包括使所述真菌害虫种群与杀真菌有效量的实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽接触。
126.一种用于保护植物免受真菌害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码杀虫有效量的实施例98、99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽的多核苷酸。
127.一种组合物，包含杀昆虫有效量的如下物质：
a)实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的重组AfIP-1A多肽或SEQ ID NO：18的多肽；以及
b)实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽或SEQ ID NO：20的多肽。
128.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与实施例127的组合物接触。
129.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述抗性昆虫害虫种群与实施例127的组合物接触。
130.实施例129的防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，其中所述杀虫蛋白选自Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、Cry9c、eCry3.1Ab和CBI-Bt。
131.一种以登录号NRRL B-50625保藏的粪产碱菌菌株DDMC P4G7的生物纯培养物。
132.一种从粪产碱菌菌株分离具有杀虫活性的AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽的方法，包括：
a)从细菌分离株获得蛋白细胞裂解物；
b)筛查蛋白细胞裂解物的杀虫活性；以及
c)从蛋白细胞裂解物分离杀虫蛋白。
133.一种SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的多肽的重组受体。
134.一种鉴定生物样品中的AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽的方法，包括使所述生物样品与实施例133的受体接触。
135.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体特异性地结合实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽。
136.一种检测生物样品中的AfIP-1A多肽的方法，包括使所述蛋白与实施例135的抗体接触。
137.一种分离生物样品中的AfIP-1A多肽的方法，包括使所述蛋白与实施例135的抗体接触。
138.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体特异性地结合实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽。
139.一种检测生物样品中的AfIP-1B多肽的方法，包括使所述蛋白与实施例138的抗体接触。
140.一种分离生物样品中的AfIP-1B多肽的方法，包括使所述蛋白与实施例138的抗体接触。
141.一种转基因植物或其子代，包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子或编码SEQ ID NO：18的多肽的重组核酸分子；以及实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或76的重组核酸分子或编码SEQ ID NO：20的多肽的重组核酸分子。
142.一种转基因植物或其子代，其已用实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子或编码SEQ ID NO：18的多肽的重组核酸分子；以及实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的重组核酸分子或编码SEQ ID NO：20的多肽的重组核酸分子稳定转化。
143.实施例141或142的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物是单子叶植物。
144.实施例141或142的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物是双子叶植物。
145.实施例141或142的转基因植物或其子代，其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜 蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
146.实施例141或142的转基因植物或其子代，还包括一种或多种另外的转基因性状。
147.实施例146的转基因植物，其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
148.一种DNA构建体，包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子或SEQ ID NO：17的重组核酸分子，其中所述核酸有效连接至引导AfIP-1A多肽或SEQ ID NO：18的多肽的表达的一个或多个调控序列；以及实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的重组核酸分子或SEQ ID NO：19的重组核酸分子，其中所述核酸有效连接至引导AfIP-1B多肽或SEQ ID NO：20的多肽的表达的一个或多个调控序列。
149.一种转基因植物，包含实施例148的DNA构建体。
150.一种植物细胞，包含实施例148的DNA构建体。
151.实施例149的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的重组核酸分子或SEQID NO：17的重组核酸分子以及实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的重组核酸分子或SEQ ID NO：19的重组核酸分子。
152.实施例151的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
153.一种用于在植物中表达编码杀昆虫蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括从包含根据权利要求22所述的表达盒和根据权利要求85所述的表达盒的转化植物细胞产生能够表达编码AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽的核酸分子的植物。
154.一种通过实施例153的方法产生的转基因植物。
155.实施例154的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品。
156.实施例154的转基因植物，其中所述转基因植物还包括一种或多种另外的转基因性状。
157.一种转基因植物，其能够表达编码实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽和实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽的至少一个多核苷酸。
158.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达杀昆虫有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽；以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽。
159.一种用于防治昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽；以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽接触。
160.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与组合物接触，所述组合物包含杀昆虫有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽；以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽。
161.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽；以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽接触。
162.一种防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并提供昆虫抗性治理的方法，包括在植物中表达杀昆虫有效量的如下物质：
a)实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的AfIP-1A多肽；以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽；以及
b)与AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽相比具有不同作用模式的至少一种杀昆虫蛋白。
163.实施例162的方法，其中所述步骤b)中的杀昆虫蛋白包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
164.一种降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法，包括：
a)表达编码实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的AfIP-1A多肽；以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的AfIP-1B多肽的多核苷酸；以及
b)表达编码与a)的AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽相比具有不同作用模式的至少一种杀昆虫蛋白的多核苷酸。
165.实施例164的方法，其中所述步骤b)中的杀昆虫蛋白是Cry蛋白。
166.一种用于防治昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重组多肽接触。
167.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与组合物接触，所述组合物包含杀昆虫有效量的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组多肽以及包含SEQID NO：20的氨基酸序列的重组多肽。
168.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组多肽以及包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的重组多肽接触。
169.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重组多肽的多核苷酸。
170.一种转基因植物或其子代，含有包含SEQ ID NO：17的核酸序列的重组核酸分子以及包含SEQ ID NO：19的核酸序列的重组核酸分子。
171.一种转基因植物或其子代，其已用包含SEQ ID NO：17的核酸序列的重组核酸分子以及包含SEQ ID NO：19的核酸序列的重组核酸分子稳定转化。
172.实施例170或171的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物是单子叶植物。
173.实施例170或171的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物是双子叶植物。
174.实施例170或171的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
175.实施例170或171的转基因植物或其子代，还包括一种或多种另外的转基因性状。
176.一种表达盒，包含
a)编码包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽的重组核酸分子，其中所述核酸有效连接至引导SEQ ID NO：18的多肽的表达的一个或多个调控序列；以及
b)编码包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽的重组核酸分子，其中所述核酸有效连接至引导SEQ ID NO：20的多肽的表达的一个或多个调控序列。
177.一种转基因植物，包含实施例176的表达盒。
178.一种植物细胞，包含实施例176的表达盒。
179.实施例177的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或加工产品包含重组核酸分子。
180.实施例179的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
181.一种用于在植物中表达杀昆虫蛋白的方法，包括
(a)在植物细胞中插入编码SEQ ID NO：18的杀昆虫蛋白的核酸分子以及编码SEQID NO：20的杀昆虫蛋白的核酸分子；
(b)获得包含步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞；以及
(c)从转化植物细胞产生能够表达编码杀昆虫蛋白的核酸分子的植物。
182.一种通过实施例181的方法产生的转基因植物。
183.实施例182的转基因植物的种子或谷粒。
184.实施例182的转基因植物，其中所述转基因植物还包括一种或多种另外的转基因性状。
185.一种转基因植物，其能够表达编码包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的杀昆虫多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的杀昆虫多肽的至少一个多核苷酸。
186.一种用于防治昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽接触。
187.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组杀昆虫多 肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽接触。
188.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀虫有效量的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重组多肽以及包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽接触。
189.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的杀昆虫多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的杀昆虫多肽的至少一个多核苷酸。
190.一种防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并提供昆虫抗性治理的方法，包括在所述植物中表达编码具有不同作用模式的至少两种不同杀昆虫蛋白的至少一个多核苷酸，其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的杀昆虫多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽，该蛋白对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性。
191.实施例190的方法，其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
192.一种降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫物种出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法，包括表达编码对昆虫物种具有杀昆虫性、包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的第一杀昆虫多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的杀昆虫多肽的至少一个多核苷酸，同时联合表达与第一杀昆虫蛋白相比具有不同作用模式的第二杀昆虫蛋白。
193.一种有效的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性治理的方式，包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白，其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列的杀昆虫多肽以及包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽，并且所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括Cry蛋白。
194.一种融合蛋白，包含实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的重组AfIP-1A多肽。
195.一种融合蛋白，包含实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽。
196.一种融合蛋白，包含实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的重组AfIP-1A多肽，以及实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽。
197.一种由选自如下的通式表示的融合蛋白：
R1-L-R2、R2-L-R1、R1-R2或R2-R1，
其中
R1是实施例35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的重组AfIP-1A多肽或包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽；
R2是实施例98、99、100、101、102、103、104、105、106、
107、108、109、110、111、112、113或114的重组AfIP-1B多肽或包含
SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽并且
L是连接片断。
198.实施例197的融合蛋白，其中L是多肽接头。
199.实施例197的融合蛋白，其中L是多肽EEKKN(SEQ ID NO：153)。
200.根据实施例197、198或199中任一项或多项的融合蛋白，其中R1是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：94的重组AfIP-1A多肽，并且R2是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：76的重组AfIP-1B多肽。
201.根据实施例16-21、23、24、29、31-34、79-84、86、92、94-97、115-118、141-147、149、154、156、157、170-175、177、 182、184或185中任一项或多项的转基因植物用于得到食物或饲料产品的用途。
202.一种获得食物或饲料产品的方法，包括从根据实施例16-21、23、24、29、31-34、79-84、86、92、94-97、115-118、141-147、149、154、156、157、170-175、177、182、184或185中一项或多项的转基因植物或其种子或谷粒或其子代得到所述食物或所述饲料产品。
203.一种杀虫剂组合物，包含选自如下至少一者的微生物或物质：杀虫活性产碱菌属；
微生物，已知占据所关注的一种或多种植物的植物圈，已用根据权利要求1-15所述的编码AfIP-1A多肽的多核苷酸和根据权利要求62-78所述的编码AFIP-1B多肽的多核苷酸转化；
杀虫活性产碱菌属的一部分或加工产品；以及
微生物的一部分或加工产品，所述微生物已用根据权利要求1-15所述的编码AfIP-1A多肽的多核苷酸和根据权利要求62-78所述的编码AFIP-1B多肽的多核苷酸转化。
204.根据权利要求203所述的组合物，还包含农业上适用的载体。
205.根据权利要求202或203所述的组合物，其中所述杀虫活性产碱菌属是粪产碱菌菌株。
206.根据权利要求205所述的组合物，其中所述粪产碱菌菌株是以登录号NRRL B-50625保藏的DDMC P4G7。
207.根据权利要求203或204所述的组合物，其中已知占据所关注的一种或多种植物的植物圈的所述微生物是假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属 (Alcaligenes)、酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。
208.一种用于防治害虫种群的方法，包括使所述害虫种群与根据权利要求203、204、205或206所述的组合物接触。
209.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与根据权利要求203、204、205或206所述的组合物接触。
210.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述抗性昆虫害虫种群与根据权利要求203、204、205或206所述的组合物接触。
211.一种用于保护植物免受害虫影响的方法，包括施加预防有效量的根据权利要求203、204、205或206所述的组合物。
212.根据权利要求208、209、210或211所述的方法，其中所述组合物作为微生物喷雾剂施加。
213.根据权利要求212所述的方法，其中所述微生物喷雾剂是叶面喷雾剂。
214.根据权利要求208、209、210或211所述的方法，其中所述组合物作为种子处理剂施加。
215.根据权利要求214所述的方法，其中所述组合物还包含选自除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂、萌发增强剂、植物生长调节剂、杀细菌剂和杀线虫剂的一种或多种种子处理剂。
216.根据权利要求215所述的方法，其中将所述组合物施加于作物区域、植物和/或土壤。
217.一种用于鉴定对杀昆虫蛋白的Cry3A交叉抗性的方法，包括对mCry3A抗性WCRW集群筛查杀昆虫蛋白的Cry3A交叉抗性。
附图说明
图1示出了AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)与Slin6118(SEQ ID NO：14)、FGTW-51(SEQID NO：18)、AfIP-1A-49677(SEQ ID NO：786)、AfIP-1A-27066(SEQ ID NO：32)、AfIP-1A_19209(SEQ ID NO：778)和AfIP-1A-33585 (SEQ ID NO：36)的氨基酸序列比对。AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)与近亲同源物AfIP-1A-49677(SEQ ID NO：786)、AfIP-1A-27066(SEQ IDNO：32)、AfIP-1A_19209(SEQ ID NO：778)和AfIP-1A-33585(SEQ ID NO：36)之间的氨基酸差异用阴影指示。AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和Slin6118(SEQ ID NO：14)和/或FGTW-51(SEQ ID NO：18)之间的氨基酸同一性用下划线指示。
图2A-2C示出了AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)与Slin6117(SEQ ID NO：16)和FGTW-52(SEQ ID NO：20)、AfIP-1B-27066(SEQ ID NO：34)、AfIP-1B-33585(SEQ ID NO：38)、AfIP-1B-19209(SEQ ID NO：780)、AfIP-1B-49677(SEQ ID NO：788)和AfIP-1B-43161(SEQ IDNO：784)的氨基酸序列比对。AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)与Slin6117(SEQ ID NO：16)和/或FGTW-52(SEQ ID NO：20)之间的氨基酸同一性用下划线指示。
图3A-3C示出了如下序列的氨基酸序列比对：AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)；近源相关的粪产碱菌活性直系同源物；AfIP-1A-15554(SEQ ID NO：22)、AfIP-1A-27066(SEQ IDNO：26)；和AfIP-1A-33585(SEQ ID NO：30)；远源相关的活性同源物FGTW-51(SEQ ID NO：18)；以及远源相关的杨树菇溶血素样蛋白：Slin6118_GI_284040949_Aegerolysin_S_linguale(SEQ ID NO：14)、GI_115390458_A_terreus(SEQ ID NO：124)、GI_119487614_N_fischeri(SEQ ID NO：125)、GI_121709507_A_clavatus(SEQ ID NO：126)、GI_145230219_A_niger(SEQ ID NO：127)、GI_145256342_A_niger(SEQ ID NO：128)、GI_152985646_P_aeruginosa_aegerolysin(SEQ ID NO：130)、GI_15595320_P_aeruginosa(SEQ ID NO：131)、GI_158524422_R_australe(SEQ ID NO：132)、GI_169772307_A_oryzae(SEQ ID NO：133)、GI_169777319_A_oryzae(SEQ ID NO：134)、GI_169785219_A_oryzae(SEQ ID NO：135)、GI_186897694_H_annosum(SEQ ID NO：136)、GI_2292820_C_bifermentans(SEQ IDNO：137)、GI_2292821_C_bifermentans(SEQ ID NO：138)、GI_24636240_A_aegerita_Aegerolysin(SEQ ID NO：139)、GI_26112720_B_vulgaris(SEQ ID NO：140)、GI_46507636_L_multiflorum(SEQ ID NO：141)、GI_54312022_P_ostreatus_pleurotolysin(SEQ ID NO：142)、 GI_60461919_P_ostretus_ostreolysin(SEQ ID NO：143)、GI_67522192_A_nidulans(SEQ ID NO：144)、GI_70985747_A_fumigatus_hemolysin(SEQ ID NO：145)、GI_90639437_T_versicolor(SEQ ID NO：146)和GI_238581050_M_perniciosa(SEQ ID NO：147。SEQ ID NO：2的基序1(第15-26位氨基酸)、基序2(第33-53位氨基酸)、基序3(第71-84位氨基酸)以及基序4(第100-107位氨基酸)带有下划线。
图4示出了AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)和FGTW-52(SEQ ID NO：20)的氨基酸序列比对以及SEQ ID NO：20的氨基酸与SEQ ID NO：4的氨基酸的对应。
图5示出了AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)、FGTW-51(SEQ ID NO：18)、Slin6118_GI_284040949_Aegerolysin_S_linguale(SEQ ID NO：14)；和Cry34样蛋白：Cry34Aa2_AAK64560(SEQ ID NO：119)、Cry34Ab1_AAG41671(SEQ ID NO：120)、Cry34Ac1_AAG50118(SEQ ID NO：121)、Cry34Ac2_AAK64562(SEQ ID NO：122)、Cry34Ba1_AAK64566(SEQ ID NO：123)、GI_49175503_Bt_Cry34A_like(SEQ ID NO：148)的氨基酸序列比对。
图6示出了AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)、FGTW-51(SEQ ID NO：18)、Slin6118_GI_284040949_Aegerolysin_S_linguale(SEQ ID NO：14)和SEQ ID NO：276的Cry3A蛋白的氨基酸序列比对。
图7示出了AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)和SEQ ID NO：276的Cry3A蛋白的氨基酸序列比对。
图8示出了AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)单独和一起对于真菌病原体北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)(FVR)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(FOS)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)(FGR)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)(CGR)和大斑突脐孢菌(Exserohilum turcicum)(ETC)的抗真菌活性。
图9示出了PHP51688T0植物的温室功效测试结果。Y轴“评分”代表玉米根虫结节损伤评分(CRWNIS)，其中0是无损伤，2是两个结节受损。
图10示出了PHP51688 T1事件结果。Y轴“评分”代表玉米根虫结节损伤评分(CRWNIS)，其中0是无损伤，2是两个结节受损。
图11示出了PHP53521 T0植物的温室功效测试结果。Y轴“评分”代表玉米根虫结节损伤评分(CRWNIS)，其中0是无损伤，2是两个结节受损。
图12示出了PCR诱变策略，其用于产生在基序2中具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体(实例25)、在基序5中具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体(实例26)以及在基序2和基序5中具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体(实例27)。
图13示出了PCR诱变策略，其用于产生在基序5中具有多个氨基酸置换的AfIP-1B-32的变体(实例28)。
具体实施方式
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、属和试剂，因为这些可有所变化。还应当理解，本文所用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在限制本发明的范围。
除非上下文另外明确规定，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该蛋白”包括提及一种或多种蛋白以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另外明确指明，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
本发明涉及用于防治害虫的组合物和方法。所述方法涉及用编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的核酸序列转化生物体。具体地讲，所述实施例的核酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。所述组合物是细菌物种的杀虫核酸和蛋白。所述核酸序列可用于构建表达载体以供后续转化进入所关注的生物体，用作分离其他同源(或部分同源)基因的探针，以及用于通过本领域已知的方法(比如定点诱变、结构域交换或DNA改组)产生改变的AfIP-1A和AfIP-1B多肽。AfIP-1A和AfIP-1B多肽可用于防治或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫害虫种群，以及用于产生具有杀虫活性的组合物。所关注的昆虫害虫包括但不限于鳞翅目物种，其包括 但不限于：小菜蛾，例如谷实夜蛾(Helicoverpa zea Boddie)；大豆尺蠖，例如大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)；以及黎豆毛虫，例如黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)，以及鞘翅目物种，其包括但不限于西方玉米根虫(Diabrotica virgfera)-WCRW、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)-SCRW和北方玉米根虫(Diabrotica barberi)-NCRW。
本文中所用的所谓“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”指对于一种或多种害虫(包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目或线虫门的成员)具有毒杀活性的毒素，或与此类蛋白同源的蛋白。杀虫蛋白已从生物体分离，所述生物体包括例如芽孢杆菌属物种、假单胞菌属物种、发光杆菌属物种(Photorhabdus sp.)、致病杆菌属物种(Xenorhabdus sp.)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)以及日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀虫蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，比如PSEEN3174(Monalysin；(2011)PLoS Pathogens 7：1-13(Monalysin，2011年，《公共科学图书馆病原学》，第7卷，第1-13页))；来自生防假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前的荧光假单胞菌)的杀昆虫蛋白(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology 10：2368-2386(Pechy-Tarr，2008年，《环境微生物学》，第10卷，第2368-2386页)；GenBank登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas Taiwanensis)的杀昆虫蛋白(Liu，et al.，(2010)J.Agric.Food Chem.，58：12343-12349(Liu等人，2010年，《农业与食品化学杂志》，第58卷，第12343-12349页))以及来自类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcligenes)的杀昆虫蛋白(Zhang，et al.，(2009)Annals of Microbiology59：45-50(Zhang等人，2009年，《微生物学年报》，第59卷，第45-50页)和Li，et al.，(2007)Plant Cell Tiss.OrganCult.89：159-168(Li等人，2007年，《植物细胞、组织和器官培养》，第89卷，第159-168页))；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe，et al.，(2010)TheOpen Toxinology Journal，3：101-118(Hinchliffe等人，2010年，《开放毒素学杂志》，第3卷，第101-118页)和Morgan，et al.，(2001)Applied and Envir.Micro.67：2062-2069(Morgan等人，2001年，《应用与环境微生物学》，第67卷，第2062-2069页))；美国专利No.6,048,838 和美国专利No.6,379,946；美国专利序列号13792861的PIP-1多肽；美国专利序列号13/800233的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利序列号13/839702的PHI-4多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry 28、Cry 29、Cry 30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry 51和Cry55类别以及苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号AAA22353)；Cry1Aa2(登录号AAA22552)；Cry1Aa3(登录号BAA00257)；Cry1Aa4(登录号CAA31886)；Cry1Aa5(登录号BAA04468)；Cry1Aa6(登录号AAA86265)；Cry1Aa7(登录号AAD46139)；Cry1Aa8(登录号I26149)；Cry1Aa9(登录号BAA77213)；Cry1Aa10(登录号AAD55382)；Cry1Aa11(登录号CAA70856)；Cry1Aa12(登录号AAP80146)；Cry1Aa13(登录号AAM44305)；Cry1Aa14(登录号AAP40639)；Cry1Aa15(登录号AAY66993)；Cry1Aa16(登录号HQ439776)；Cry1Aa17(登录号HQ439788)；Cry1Aa18(登录号HQ439790)；Cry1Aa19(登录号HQ685121)；Cry1Aa20(登录号JF340156)；Cry1Aa21(登录号JN651496)；Cry1Aa22(登录号KC158223)；Cry1Ab1(登录号AAA22330)；Cry1Ab2(登录号AAA22613)；Cry1Ab3(登录号AAA22561)；Cry1Ab4(登录号BAA00071)；Cry1Ab5(登录号CAA28405)；Cry1Ab6(登录号AAA22420)；Cry1Ab7(登录号CAA31620)；Cry1Ab8(登录号AAA22551)；Cry1Ab9(登录号CAA38701)；Cry1Ab10(登录号A29125)；Cry1Ab11(登录号I12419)；Cry1Ab12(登录号AAC64003)；Cry1Ab13(登录号AAN76494)；Cry1Ab14(登录号AAG16877)；Cry1Ab15(登录号AAO13302)；Cry1Ab16(登录号AAK55546)；Cry1Ab17(登录号AAT46415)；Cry1Ab18(登录号AAQ88259)；Cry1Ab19(登录号AAW31761)；Cry1Ab20(登录号ABB72460)；Cry1Ab21(登录号 ABS18384)；Cry1Ab22(登录号ABW87320)；Cry1Ab23(登录号HQ439777)；Cry1Ab24(登录号HQ439778)；Cry1Ab25(登录号HQ685122)；Cry1Ab26(登录号HQ847729)；Cry1Ab27(登录号JN135249)；Cry1Ab28(登录号JN135250)；Cry1Ab29(登录号JN135251)；Cry1Ab30(登录号JN135252)；Cry1Ab31(登录号JN135253)；Cry1Ab32(登录号JN135254)；Cry1Ab33(登录号AAS93798)；Cry1Ab34(登录号KC156668)；Cry1Ab样(登录号AAK14336)；Cry1Ab样(登录号AAK14337)；Cry1Ab样(登录号AAK14338)；Cry1Ab样(登录号ABG88858)；Cry1Ac1(登录号AAA22331)；Cry1Ac2(登录号AAA22338)；Cry1Ac3(登录号CAA38098)；Cry1Ac4(登录号AAA73077)；Cry1Ac5(登录号AAA22339)；Cry1Ac6(登录号AAA86266)；Cry1Ac7(登录号AAB46989)；Cry1Ac8(登录号AAC44841)；Cry1Ac9(登录号AAB49768)；Cry1Ac10(登录号CAA05505)；Cry1Ac11(登录号CAA10270)；Cry1Ac12(登录号I12418)；Cry1Ac13(登录号AAD38701)；Cry1Ac14(登录号AAQ06607)；Cry1Ac15(登录号AAN07788)；Cry1Ac16(登录号AAU87037)；Cry1Ac17(登录号AAX18704)；Cry1Ac18(登录号AAY88347)；Cry1Ac19(登录号ABD37053)；Cry1Ac20(登录号ABB89046)；Cry1Ac21(登录号AAY66992)；Cry1Ac22(登录号ABZ01836)；Cry1Ac23(登录号CAQ30431)；Cry1Ac24(登录号ABL01535)；Cry1Ac25(登录号FJ513324)；Cry1Ac26(登录号FJ617446)；Cry1Ac27(登录号FJ617447)；Cry1Ac28(登录号ACM90319)；Cry1Ac29(登录号DQ438941)；Cry1Ac30(登录号GQ227507)；Cry1Ac31(登录号GU446674)；Cry1Ac32(登录号HM061081)；Cry1Ac33(登录号GQ866913)；Cry1Ac34(登录号HQ230364)；Cry1Ac35(登录号JF340157)；Cry1Ac36(登录号JN387137)；Cry1Ac37(登录号JQ317685)；Cry1Ad1(登录号AAA22340)；Cry1Ad2(登录号CAA01880)；Cry1Ae1(登录号AAA22410)；Cry1Af1(登录号AAB82749)；Cry1Ag1(登录号AAD46137)；Cry1Ah1(登录号AAQ14326)；Cry1Ah2(登录号ABB76664)；Cry1Ah3(登录号 HQ439779)；Cry1Ai1(登录号AAO39719)；Cry1Ai2(登录号HQ439780)；Cry1A样(登录号AAK14339)；Cry1Ba1(登录号CAA29898)；Cry1Ba2(登录号CAA65003)；Cry1Ba3(登录号AAK63251)；Cry1Ba4(登录号AAK51084)；Cry1Ba5(登录号ABO20894)；Cry1Ba6(登录号ABL60921)；Cry1Ba7(登录号HQ439781)；Cry1Bb1(登录号AAA22344)；Cry1Bb2(登录号HQ439782)；Cry1Bc1(登录号CAA86568)；Cry1Bd1(登录号AAD10292)；Cry1Bd2(登录号AAM93496)；Cry1Be1(登录号AAC32850)；Cry1Be2(登录号AAQ52387)；Cry1Be3(登录号ACV96720)；Cry1Be4(登录号HM070026)；Cry1Bf1(登录号CAC50778)；Cry1Bf2(登录号AAQ52380)；Cry1Bg1(登录号AAO39720)；Cry1Bh1(登录号HQ589331)；Cry1Bi1(登录号KC156700)；Cry1Ca1(登录号CAA30396)；Cry1Ca2(登录号CAA31951)；Cry1Ca3(登录号AAA22343)；Cry1Ca4(登录号CAA01886)；Cry1Ca5(登录号CAA65457)；Cry1Ca6[1](登录号AAF37224)；Cry1Ca7(登录号AAG50438)；Cry1Ca8(登录号AAM00264)；Cry1Ca9(登录号AAL79362)；Cry1Ca10(登录号AAN16462)；Cry1Ca11(登录号AAX53094)；Cry1Ca12(登录号HM070027)；Cry1Ca13(登录号HQ412621)；Cry1Ca14(登录号JN651493)；Cry1Cb1(登录号M97880)；Cry1Cb2(登录号AAG35409)；Cry1Cb3(登录号ACD50894)；Cry1Cb样(登录号AAX63901)；Cry1Da1(登录号CAA38099)；Cry1Da2(登录号I76415)；Cry1Da3(登录号HQ439784)；Cry1Db1(登录号CAA80234)；Cry1Db2(登录号AAK48937)；Cry1Dc1(登录号ABK35074)；Cry1Ea1(登录号CAA37933)；Cry1Ea2(登录号CAA39609)；Cry1Ea3(登录号AAA22345)；Cry1Ea4(登录号AAD04732)；Cry1Ea5(登录号A15535)；Cry1Ea6(登录号AAL50330)；Cry1Ea7(登录号AAW72936)；Cry1Ea8(登录号ABX11258)；Cry1Ea9(登录号HQ439785)；Cry1Ea10(登录号ADR00398)；Cry1Ea11(登录号JQ652456)；Cry1Eb1(登录号AAA22346)；Cry1Fa1(登录号AAA22348)；Cry1Fa2(登录号AAA22347)；Cry1Fa3(登录号HM070028)；Cry1Fa4(登录号HM439638)；Cry1Fb1(登录号CAA80235)；Cry1Fb2(登录号BAA25298)；Cry1Fb3(登录号AAF21767)；Cry1Fb4(登录号AAC10641)；Cry1Fb5(登录号AAO13295)；Cry1Fb6(登录号ACD50892)；Cry1Fb7(登录号ACD50893)；Cry1Ga1(登录号CAA80233)；Cry1Ga2(登录号CAA70506)；Cry1Gb1(登录号AAD10291)；Cry1Gb2(登录号AAO13756)；Cry1Gc1(登录号AAQ52381)；Cry1Ha1(登录号CAA80236)；Cry1Hb1(登录号AAA79694)；Cry1Hb2(登录号HQ439786)；Cry1H样(登录号AAF01213)；Cry1Ia1(登录号CAA44633)；Cry1Ia2(登录号AAA22354)；Cry1Ia3(登录号AAC36999)；Cry1Ia4(登录号AAB00958)；Cry1Ia5(登录号CAA70124)；Cry1Ia6(登录号AAC26910)；Cry1Ia7(登录号AAM73516)；Cry1Ia8(登录号AAK66742)；Cry1Ia9(登录号AAQ08616)；Cry1Ia10(登录号AAP86782)；Cry1Ia11(登录号CAC85964)；Cry1Ia12(登录号AAV53390)；Cry1Ia13(登录号ABF83202)；Cry1Ia14(登录号ACG63871)；Cry1Ia15(登录号FJ617445)；Cry1Ia16(登录号FJ617448)；Cry1Ia17(登录号GU989199)；Cry1Ia18(登录号ADK23801)；Cry1Ia19(登录号HQ439787)；Cry1Ia20(登录号JQ228426)；Cry1Ia21(登录号JQ228424)；Cry1Ia22(登录号JQ228427)；Cry1Ia23(登录号JQ228428)；Cry1Ia24(登录号JQ228429)；Cry1Ia25(登录号JQ228430)；Cry1Ia26(登录号JQ228431)；Cry1Ia27(登录号JQ228432)；Cry1Ia28(登录号JQ228433)；Cry1Ia29(登录号JQ228434)；Cry1Ia30(登录号JQ317686)；Cry1Ia31(登录号JX944038)；Cry1Ia32(登录号JX944039)；Cry1Ia33(登录号JX944040)；Cry1Ib1(登录号AAA82114)；Cry1Ib2(登录号ABW88019)；Cry1Ib3(登录号ACD75515)；Cry1Ib4(登录号HM051227)；Cry1Ib5(登录号HM070028)；Cry1Ib6(登录号ADK38579)；Cry1Ib7(登录号JN571740)；Cry1Ib8(登录号JN675714)；Cry1Ib9(登录号JN675715)；Cry1Ib10(登录号JN675716)；Cry1Ib11(登录号 JQ228423)；Cry1Ic1(登录号AAC62933)；Cry1Ic2(登录号AAE71691)；Cry1Id1(登录号AAD44366)；Cry1Id2(登录号JQ228422)；Cry1Ie1(登录号AAG43526)；Cry1Ie2(登录号HM439636)；Cry1Ie3(登录号KC156647)；Cry1Ie4(登录号KC156681)；Cry1If1(登录号AAQ52382)；Cry1Ig1(登录号KC156701)；Cry1I样(登录号AAC31094)；Cry1I样(登录号ABG88859)；Cry1Ja1(登录号AAA22341)；Cry1Ja2(登录号HM070030)；Cry1Ja3(登录号JQ228425)；Cry1Jb1(登录号AAA98959)；Cry1Jc1(登录号AAC31092)；Cry1Jc2(登录号AAQ52372)；Cry1Jd1(登录号CAC50779)；Cry1Ka1(登录号AAB00376)；Cry1Ka2(登录号HQ439783)；Cry1La1(登录号AAS60191)；Cry1La2(登录号HM070031)；Cry1Ma1(登录号FJ884067)；Cry1Ma2(登录号KC156659)；Cry1Na1(登录号KC156648)；Cry1Nb1(登录号KC156678)；Cry1样(登录号AAC31091)；Cry2Aa1(登录号AAA22335)；Cry2Aa2(登录号AAA83516)；Cry2Aa3(登录号D86064)；Cry2Aa4(登录号AAC04867)；Cry2Aa5(登录号CAA10671)；Cry2Aa6(登录号CAA10672)；Cry2Aa7(登录号CAA10670)；Cry2Aa8(登录号AAO13734)；Cry2Aa9(登录号AAO13750)；Cry2Aa10(登录号AAQ04263)；Cry2Aa11(登录号AAQ52384)；Cry2Aa12(登录号ABI83671)；Cry2Aa13(登录号ABL01536)；Cry2Aa14(登录号ACF04939)；Cry2Aa15(登录号JN426947)；Cry2Ab1(登录号AAA22342)；Cry2Ab2(登录号CAA39075)；Cry2Ab3(登录号AAG36762)；Cry2Ab4(登录号AAO13296)；Cry2Ab5(登录号AAQ04609)；Cry2Ab6(登录号AAP59457)；Cry2Ab7(登录号AAZ66347)；Cry2Ab8(登录号ABC95996)；Cry2Ab9(登录号ABC74968)；Cry2Ab10(登录号EF157306)；Cry2Ab11(登录号CAM84575)；Cry2Ab12(登录号ABM21764)；Cry2Ab13(登录号ACG76120)；Cry2Ab14(登录号ACG76121)；Cry2Ab15(登录号HM037126)；Cry2Ab16(登录号GQ866914)；Cry2Ab17(登录号HQ439789)；Cry2Ab18(登录号JN135255)；Cry2Ab19(登录号 JN135256)；Cry2Ab20(登录号JN135257)；Cry2Ab21(登录号JN135258)；Cry2Ab22(登录号JN135259)；Cry2Ab23(登录号JN135260)；Cry2Ab24(登录号JN135261)；Cry2Ab25(登录号JN415485)；Cry2Ab26(登录号JN426946)；Cry2Ab27(登录号JN415764)；Cry2Ab28(登录号JN651494)；Cry2Ac1(登录号CAA40536)；Cry2Ac2(登录号AAG35410)；Cry2Ac3(登录号AAQ52385)；Cry2Ac4(登录号ABC95997)；Cry2Ac5(登录号ABC74969)；Cry2Ac6(登录号ABC74793)；Cry2Ac7(登录号CAL18690)；Cry2Ac8(登录号CAM09325)；Cry2Ac9(登录号CAM09326)；Cry2Ac10(登录号ABN15104)；Cry2Ac11(登录号CAM83895)；Cry2Ac12(登录号CAM83896)；Cry2Ad1(登录号AAF09583)；Cry2Ad2(登录号ABC86927)；Cry2Ad3(登录号CAK29504)；Cry2Ad4(登录号CAM32331)；Cry2Ad5(登录号CAO78739)；Cry2Ae1(登录号AAQ52362)；Cry2Af1(登录号ABO30519)；Cry2Af2(登录号GQ866915)；Cry2Ag1(登录号ACH91610)；Cry2Ah1(登录号EU939453)；Cry2Ah2(登录号ACL80665)；Cry2Ah3(登录号GU073380)；Cry2Ah4(登录号KC156702)；Cry2Ai1(登录号FJ788388)；Cry2Aj(登录号)；Cry2Ak1(登录号KC156660)；Cry2Ba1(登录号KC156658)；Cry3Aa1(登录号AAA22336)；Cry3Aa2(登录号AAA22541)；Cry3Aa3(登录号CAA68482)；Cry3Aa4(登录号AAA22542)；Cry3Aa5(登录号AAA50255)；Cry3Aa6(登录号AAC43266)；Cry3Aa7(登录号CAB41411)；Cry3Aa8(登录号AAS79487)；Cry3Aa9(登录号AAW05659)；Cry3Aa10(登录号AAU29411)；Cry3Aa11(登录号AAW82872)；Cry3Aa12(登录号ABY49136)；Cry3Ba1(登录号CAA34983)；Cry3Ba2(登录号CAA00645)；Cry3Ba3(登录号JQ397327)；Cry3Bb1(登录号AAA22334)；Cry3Bb2(登录号AAA74198)；Cry3Bb3(登录号I15475)；Cry3Ca1(登录号CAA42469)；Cry4Aa1(登录号CAA68485)；Cry4Aa2(登录号BAA00179)；Cry4Aa3(登录号CAD30148)；Cry4Aa4(登录号AFB18317)；Cry4A样(登录号AAY96321)；Cry4Ba1(登录号CAA30312)；Cry4Ba2(登录号CAA30114)；Cry4Ba3(登录号AAA22337)；Cry4Ba4(登录号BAA00178)；Cry4Ba5(登录号CAD30095)；Cry4Ba样(登录号ABC47686)；Cry4Ca1(登录号EU646202)；Cry4Cb1(登录号FJ403208)；Cry4Cb2(登录号FJ597622)；Cry4Cc1(登录号FJ403207)；Cry5Aa1(登录号AAA67694)；Cry5Ab1(登录号AAA67693)；Cry5Ac1(登录号I34543)；Cry5Ad1(登录号ABQ82087)；Cry5Ba1(登录号AAA68598)；Cry5Ba2(登录号ABW88931)；Cry5Ba3(登录号AFJ04417)；Cry5Ca1(登录号HM461869)；Cry5Ca2(登录号ZP_04123426)；Cry5Da1(登录号HM461870)；Cry5Da2(登录号ZP_04123980)；Cry5Ea1(登录号HM485580)；Cry5Ea2(登录号ZP_04124038)；Cry6Aa1(登录号AAA22357)；Cry6Aa2(登录号AAM46849)；Cry6Aa3(登录号ABH03377)；Cry6Ba1(登录号AAA22358)；Cry7Aa1(登录号AAA22351)；Cry7Ab1(登录号AAA21120)；Cry7Ab2(登录号AAA21121)；Cry7Ab3(登录号ABX24522)；Cry7Ab4(登录号EU380678)；Cry7Ab5(登录号ABX79555)；Cry7Ab6(登录号ACI44005)；Cry7Ab7(登录号ADB89216)；Cry7Ab8(登录号GU145299)；Cry7Ab9(登录号ADD92572)；Cry7Ba1(登录号ABB70817)；Cry7Bb1(登录号KC156653)；Cry7Ca1(登录号ABR67863)；Cry7Cb1(登录号KC156698)；Cry7Da1(登录号ACQ99547)；Cry7Da2(登录号HM572236)；Cry7Da3(登录号KC156679)；Cry7Ea1(登录号HM035086)；Cry7Ea2(登录号HM132124)；Cry7Ea3(登录号EEM19403)；Cry7Fa1(登录号HM035088)；Cry7Fa2(登录号EEM19090)；Cry7Fb1(登录号HM572235)；Cry7Fb2(登录号KC156682)；Cry7Ga1(登录号HM572237)；Cry7Ga2(登录号KC156669)；Cry7Gb1(登录号KC156650)；Cry7Gc1(登录号KC156654)；Cry7Gd1(登录号KC156697)；Cry7Ha1(登录号KC156651)；Cry7Ia1(登录号KC156665)；Cry7Ja1(登录号KC156671)；Cry7Ka1(登录号KC156680)；Cry7Kb1(登录号BAM99306)；Cry7La1(登录号BAM99307)；Cry8Aa1(登录号 AAA21117)；Cry8Ab1(登录号EU044830)；Cry8Ac1(登录号KC156662)；Cry8Ad1(登录号KC156684)；Cry8Ba1(登录号AAA21118)；Cry8Bb1(登录号CAD57542)；Cry8Bc1(登录号CAD57543)；Cry8Ca1(登录号AAA21119)；Cry8Ca2(登录号AAR98783)；Cry8Ca3(登录号EU625349)；Cry8Ca4(登录号ADB54826)；Cry8Da1(登录号BAC07226)；Cry8Da2(登录号BD133574)；Cry8Da3(登录号BD133575)；Cry8Db1(登录号BAF93483)；Cry8Ea1(登录号AAQ73470)；Cry8Ea2(登录号EU047597)；Cry8Ea3(登录号KC855216)；Cry8Fa1(登录号AAT48690)；Cry8Fa2(登录号HQ174208)；Cry8Fa3(登录号AFH78109)；Cry8Ga1(登录号AAT46073)；Cry8Ga2(登录号ABC42043)；Cry8Ga3(登录号FJ198072)；Cry8Ha1(登录号AAW81032)；Cry8Ia1(登录号EU381044)；Cry8Ia2(登录号GU073381)；Cry8Ia3(登录号HM044664)；Cry8Ia4(登录号KC156674)；Cry8Ib1(登录号GU325772)；Cry8Ib2(登录号KC156677)；Cry8Ja1(登录号EU625348)；Cry8Ka1(登录号FJ422558)；Cry8Ka2(登录号ACN87262)；Cry8Kb1(登录号HM123758)；Cry8Kb2(登录号KC156675)；Cry8La1(登录号GU325771)；Cry8Ma1(登录号HM044665)；Cry8Ma2(登录号EEM86551)；Cry8Ma3(登录号HM210574)；Cry8Na1(登录号HM640939)；Cry8Pa1(登录号HQ388415)；Cry8Qa1(登录号HQ441166)；Cry8Qa2(登录号KC152468)；Cry8Ra1(登录号AFP87548)；Cry8Sa1(登录号JQ740599)；Cry8Ta1(登录号KC156673)；Cry8样(登录号FJ770571)；Cry8样(登录号ABS53003)；Cry9Aa1(登录号CAA41122)；Cry9Aa2(登录号CAA41425)；Cry9Aa3(登录号GQ249293)；Cry9Aa4(登录号GQ249294)；Cry9Aa5(登录号JX174110)；Cry9Aa样(登录号AAQ52376)；Cry9Ba1(登录号CAA52927)；Cry9Ba2(登录号GU299522)；Cry9Bb1(登录号AAV28716)；Cry9Ca1(登录号CAA85764)；Cry9Ca2(登录号AAQ52375)；Cry9Da1(登录号BAA19948)；Cry9Da2(登录号AAB97923)；Cry9Da3(登录号 GQ249293)；Cry9Da4(登录号GQ249297)；Cry9Db1(登录号AAX78439)；Cry9Dc1(登录号KC156683)；Cry9Ea1(登录号BAA34908)；Cry9Ea2(登录号AAO12908)；Cry9Ea3(登录号ABM21765)；Cry9Ea4(登录号ACE88267)；Cry9Ea5(登录号ACF04743)；Cry9Ea6(登录号ACG63872)；Cry9Ea7(登录号FJ380927)；Cry9Ea8(登录号GQ249292)；Cry9Ea9(登录号JN651495)；Cry9Eb1(登录号CAC50780)；Cry9Eb2(登录号GQ249298)；Cry9Eb3(登录号KC156646)；Cry9Ec1(登录号AAC63366)；Cry9Ed1(登录号AAX78440)；Cry9Ee1(登录号GQ249296)；Cry9Ee2(登录号KC156664)；Cry9Fa1(登录号KC156692)；Cry9Ga1(登录号KC156699)；Cry9样(登录号AAC63366)；Cry10Aa1(登录号AAA22614)；Cry10Aa2(登录号E00614)；Cry10Aa3(登录号CAD30098)；Cry10Aa4(登录号AFB18318)；Cry10A样(登录号DQ167578)；Cry11Aa1(登录号AAA22352)；Cry11Aa2(登录号AAA22611)；Cry11Aa3(登录号CAD30081)；Cry11Aa4(登录号AFB18319)；Cry11Aa样(登录号DQ166531)；Cry11Ba1(登录号CAA60504)；Cry11Bb1(登录号AAC97162)；Cry11Bb2(登录号HM068615)；Cry12Aa1(登录号AAA22355)；Cry13Aa1(登录号AAA22356)；Cry14Aa1(登录号AAA21516)；Cry14Ab1(登录号KC156652)；Cry15Aa1(登录号AAA22333)；Cry16Aa1(登录号CAA63860)；Cry17Aa1(登录号CAA67841)；Cry18Aa1(登录号CAA67506)；Cry18Ba1(登录号AAF89667)；Cry18Ca1(登录号AAF89668)；Cry19Aa1(登录号CAA68875)；Cry19Ba1(登录号BAA32397)；Cry19Ca1(登录号AFM37572)；Cry20Aa1(登录号AAB93476)；Cry20Ba1(登录号ACS93601)；Cry20Ba2(登录号KC156694)；Cry20样(登录号GQ144333)；Cry21Aa1(登录号I32932)；Cry21Aa2(登录号I66477)；Cry21Ba1(登录号BAC06484)；Cry21Ca1(登录号JF521577)；Cry21Ca2(登录号KC156687)；Cry21Da1(登录号JF521578)；Cry22Aa1(登录号I34547)；Cry22Aa2(登录号CAD43579)；Cry22Aa3(登录号ACD93211)；Cry22Ab1(登录号AAK50456)；Cry22Ab2(登录号CAD43577)；Cry22Ba1(登录号CAD43578)；Cry22Bb1(登录号KC156672)；Cry23Aa1(登录号AAF76375)；Cry24Aa1(登录号AAC61891)；Cry24Ba1(登录号BAD32657)；Cry24Ca1(登录号CAJ43600)；Cry25Aa1(登录号AAC61892)；Cry26Aa1(登录号AAD25075)；Cry27Aa1(登录号BAA82796)；Cry28Aa1(登录号AAD24189)；Cry28Aa2(登录号AAG00235)；Cry29Aa1(登录号CAC80985)；Cry30Aa1(登录号CAC80986)；Cry30Ba1(登录号BAD00052)；Cry30Ca1(登录号BAD67157)；Cry30Ca2(登录号ACU24781)；Cry30Da1(登录号EF095955)；Cry30Db1(登录号BAE80088)；Cry30Ea1(登录号ACC95445)；Cry30Ea2(登录号FJ499389)；Cry30Fa1(登录号ACI22625)；Cry30Ga1(登录号ACG60020)；Cry30Ga2(登录号HQ638217)；Cry31Aa1(登录号BAB11757)；Cry31Aa2(登录号AAL87458)；Cry31Aa3(登录号BAE79808)；Cry31Aa4(登录号BAF32571)；Cry31Aa5(登录号BAF32572)；Cry31Aa6(登录号BAI44026)；Cry31Ab1(登录号BAE79809)；Cry31Ab2(登录号BAF32570)；Cry31Ac1(登录号BAF34368)；Cry31Ac2(登录号AB731600)；Cry31Ad1(登录号BAI44022)；Cry32Aa1(登录号AAG36711)；Cry32Aa2(登录号GU063849)；Cry32Ab1(登录号GU063850)；Cry32Ba1(登录号BAB78601)；Cry32Ca1(登录号BAB78602)；Cry32Cb1(登录号KC156708)；Cry32Da1(登录号BAB78603)；Cry32Ea1(登录号GU324274)；Cry32Ea2(登录号KC156686)；Cry32Eb1(登录号KC156663)；Cry32Fa1(登录号KC156656)；Cry32Ga1(登录号KC156657)；Cry32Ha1(登录号KC156661)；Cry32Hb1(登录号KC156666)；Cry32Ia1(登录号KC156667)；Cry32Ja1(登录号KC156685)；Cry32Ka1(登录号KC156688)；Cry32La1(登录号KC156689)；Cry32Ma1(登录号KC156690)；Cry32Mb1(登录号KC156704)；Cry32Na1(登录号KC156691)；Cry32Oa1(登录号KC156703)；Cry32Pa1(登录号KC156705)；Cry32Qa1(登录号KC156706)；Cry32Ra1(登录号KC156707)；Cry32Sa1(登录号KC156709)；Cry32Ta1(登录号 KC156710)；Cry32Ua1(登录号KC156655)；Cry33Aa1(登录号AAL26871)；Cry34Aa1(登录号AAG50341)；Cry34Aa2(登录号AAK64560)；Cry34Aa3(登录号AAT29032)；Cry34Aa4(登录号AAT29030)；Cry34Ab1(登录号AAG41671)；Cry34Ac1(登录号AAG50118)；Cry34Ac2(登录号AAK64562)；Cry34Ac3(登录号AAT29029)；Cry34Ba1(登录号AAK64565)；Cry34Ba2(登录号AAT29033)；Cry34Ba3(登录号AAT29031)；Cry35Aa1(登录号AAG50342)；Cry35Aa2(登录号AAK64561)；Cry35Aa3(登录号AAT29028)；Cry35Aa4(登录号AAT29025)；Cry35Ab1(登录号AAG41672)；Cry35Ab2(登录号AAK64563)；Cry35Ab3(登录号AY536891)；Cry35Ac1(登录号AAG50117)；Cry35Ba1(登录号AAK64566)；Cry35Ba2(登录号AAT29027)；Cry35Ba3(登录号AAT29026)；Cry36Aa1(登录号AAK64558)；Cry37Aa1(登录号AAF76376)；Cry38Aa1(登录号AAK64559)；Cry39Aa1(登录号BAB72016)；Cry40Aa1(登录号BAB72018)；Cry40Ba1(登录号BAC77648)；Cry40Ca1(登录号EU381045)；Cry40Da1(登录号ACF15199)；Cry41Aa1(登录号BAD35157)；Cry41Ab1(登录号BAD35163)；Cry41Ba1(登录号HM461871)；Cry41Ba2(登录号ZP_04099652)；Cry42Aa1(登录号BAD35166)；Cry43Aa1(登录号BAD15301)；Cry43Aa2(登录号BAD95474)；Cry43Ba1(登录号BAD15303)；Cry43Ca1(登录号KC156676)；Cry43Cb1(登录号KC156695)；Cry43Cc1(登录号KC156696)；Cry43样(登录号BAD15305)；Cry44Aa(登录号BAD08532)；Cry45Aa(登录号BAD22577)；Cry46Aa(登录号BAC79010)；Cry46Aa2(登录号BAG68906)；Cry46Ab(登录号BAD35170)；Cry47Aa(登录号AAY24695)；Cry48Aa(登录号CAJ18351)；Cry48Aa2(登录号CAJ86545)；Cry48Aa3(登录号CAJ86546)；Cry48Ab(登录号CAJ86548)；Cry48Ab2(登录号CAJ86549)；Cry49Aa(登录号CAH56541)；Cry49Aa2(登录号CAJ86541)；Cry49Aa3(登录号CAJ86543)；Cry49Aa4(登录号CAJ86544)；Cry49Ab1(登录号CAJ86542)；Cry50Aa1(登录号BAE86999)；Cry50Ba1(登录号 GU446675)；Cry50Ba2(登录号GU446676)；Cry51Aa1(登录号ABI14444)；Cry51Aa2(登录号GU570697)；Cry52Aa1(登录号EF613489)；Cry52Ba1(登录号FJ361760)；Cry53Aa1(登录号EF633476)；Cry53Ab1(登录号FJ361759)；Cry54Aa1(登录号ACA52194)；Cry54Aa2(登录号GQ140349)；Cry54Ba1(登录号GU446677)；Cry55Aa1(登录号ABW88932)；Cry54Ab1(登录号JQ916908)；Cry55Aa2(登录号AAE33526)；Cry56Aa1(登录号ACU57499)；Cry56Aa2(登录号GQ483512)；Cry56Aa3(登录号JX025567)；Cry57Aa1(登录号ANC87261)；Cry58Aa1(登录号ANC87260)；Cry59Ba1(登录号JN790647)；Cry59Aa1(登录号ACR43758)；Cry60Aa1(登录号ACU24782)；Cry60Aa2(登录号EAO57254)；Cry60Aa3(登录号EEM99278)；Cry60Ba1(登录号GU810818)；Cry60Ba2(登录号EAO57253)；Cry60Ba3(登录号EEM99279)；Cry61Aa1(登录号HM035087)；Cry61Aa2(登录号HM132125)；Cry61Aa3(登录号EEM19308)；Cry62Aa1(登录号HM054509)；Cry63Aa1(登录号BA144028)；Cry64Aa1(登录号BAJ05397)；Cry65Aa1(登录号HM461868)；Cry65Aa2(登录号ZP_04123838)；Cry66Aa1(登录号HM485581)；Cry66Aa2(登录号ZP_04099945)；Cry67Aa1(登录号HM485582)；Cry67Aa2(登录号ZP_04148882)；Cry68Aa1(登录号HQ113114)；Cry69Aa1(登录号HQ401006)；Cry69Aa2(登录号JQ821388)；Cry69Ab1(登录号JN209957)；Cry70Aa1(登录号JN646781)；Cry70Ba1(登录号ADO51070)；Cry70Bb1(登录号EEL67276)；Cry71Aa1(登录号JX025568)；Cry72Aa1(登录号JX025569)；Cyt1Aa(GenBank登录号X03182)；Cyt1Ab(GenBank登录号X98793)；Cyt1B(GenBank登录号U37196)；Cyt2A(GenBank登录号Z14147)；以及Cyt2B(GenBank登录号U52043)。
δ-内毒素的例子还包括但不限于美国专利No.5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利No.8,304,604、8,304,605和8,476,226的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白比如Cry1A、Cry3A的α-螺旋1和/或α-螺旋2变体的N端缺失)；美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利No. 6,033,874的Cry1C；美国专利No.5,188,960和6,218,188的Cry1F；美国专利No.7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；Cry2蛋白，比如美国专利No.7,064,249的Cry2Ab蛋白)；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公布No.2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利No.7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，比如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Naimov，et al.，(2008)Appliedand Environmental Microbiology，74：7145-7151(Naimov等人，2008年，《应用与环境微生物学》，第74卷，第7145-7151页)的Cry15蛋白；美国专利No.6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利No.6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利公布No.2006/0191034、2012/0278954和PCT公布No.WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利No.6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利申请公布No.2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利No.8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利No.7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利申请公布No.2004/0250311的AXMI-008；美国专利申请公布No.2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公布No.2004/0210965的AXMI-007；美国专利申请No.2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公布No.2004/0197917的AXMI-014；美国专利申请公布No.2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利No.8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公布No.201I/0023184的AXMI-205；美国专利申请公布No.201I/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、 AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利申请公布No.2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO2011/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利No.8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公布No.2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公布No.2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利No.8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利申请公布No.2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137，美国专利No.8,319,019的cry蛋白，比如具有经修饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A；美国专利申请公布No.201I/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的Crickmore，et al.，“Bacillus thuringiensis toxinnomenclature”(2011)(Crickmore等人，“苏云金芽孢杆菌毒素命名”，2011年))。 Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述，参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.101：1-16(van Frannkenhuyzen，2009年，《无脊椎动物病理学杂志》，第101卷，第1-16页))。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于表达Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的植物)已取得监管批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal 9：283-300(Sanahuja，2011年，《植物生物技术杂志》，第9卷，第283-300页)和cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database(可使用“www”前缀在万维网上访问)的CERA.(2010)GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment(CERA)，ILSIResearch Foundation，Washington D.C.(CERA.(2010)转基因作物数据库，环境风险评估中心(CERA)，国际生命科学学院研究基金，华盛顿))。不止一种本领域技术人员熟知的杀虫蛋白也可在植物中表达，比如Vip3Ab&Cry1Fa(US2012/0317682)；Cry1BE&Cry1F(US2012/0311746)；Cry1CA&Cry1AB(US2012/0311745)；Cry1F&CryCa(US2012/0317681)；Cry1DA&Cry1BE(US2012/0331590)；Cry1DA&Cry1Fa(US2012/0331589)；Cry1AB&Cry1BE(US2012/0324606)；Cry1Fa&Cry2Aa和Cry1I&Cry1E(US2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab和Cry6Aa(US20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab&Cry3Aa(US20130167268)；以及Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US20130116170)。杀虫蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，其包括美国专利No.7,491,869的脂酰基水解酶和比如来自链霉菌属(Streptomyces)的胆固醇氧化酶(Purcell et al.(1993)Biochem Biophys Res Commun 15：1406-1413(Purcell等人，1993年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第15卷，第1406-1413页))。杀虫蛋白还包括美国专利No5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020的VIP(植物性杀昆虫蛋白)毒素等等。其他VIP蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html(可使用“www”前缀在万维网上访问))。杀虫蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，可得自比如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的生物体(参见，美国专利No.7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有 “独立”杀昆虫活性，而其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。“独立”TC蛋白(来自例如发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性可通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强A类蛋白的毒性。A类蛋白的例子是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的例子是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的例子是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀虫蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利No.8,334,366)。
在一些实施例中，AfIP-1A和AfIP-1B多肽包含从本文所公开的全长核酸序列推导出的氨基酸序列以及因使用替代的下游起始位点或因产生具有杀虫活性的较短蛋白的加工而短于全长序列的氨基酸序列。加工可在蛋白表达的生物体中进行或在蛋白摄食后在害虫体内进行。
因此，本文提供了赋予杀虫活性的新型的分离的或重组的核酸序列。还提供了AfIP-1A和AfIP-1B多肽的氨基酸序列。由这些AfIP-1A和AfIP-1B多肽基因翻译所得的蛋白允许细胞防治或杀灭对其摄食的害虫。
细菌菌株
一个方面涉及表达AfIP-1A多肽和/或AfIP-1B多肽的细菌菌株。在一些实施例中，所述细菌菌株是粪产碱菌菌株。在一些实施例中，所述细菌菌株是粪产碱菌菌株SS44C4的生物纯培养物，其以登录号NRRLB-50613于2011年12月1日保藏于农业研究菌种保藏中心(NRRL)，1815North University Street，Peoria，Illinois 61604(伊利诺州皮奥里亚北方大学街道1815号，邮编61604)(nrrl.ncaur.usda.gov，可使用“www”前缀在万维网上访问)。该保藏物将按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款保持。这些保藏物仅为便利于本领域技术人员而保存，并非承认保藏物是在35U.S.C.§112下所要求的。在本申请待决期间，专利商标局专员及其授权人可依请求取得此保藏物。在本申请的任何权利要求被授权后，申请人将依照37 C.F.R.§1.808使农业研究菌种保藏中心(NRRL)，1815North University Street，Peoria，Illinois 61604(伊利诺州皮奥里亚北方大学街道1815号，邮编61604)的保藏物的样品可供公众获取。该保藏物将 在作为一家公共保藏单位的NRRL保藏单位维持30年时间，或在最近请求后5年，或持续至本专利的有效期限，选其长者，并且如果其在此期间失活将予以更换。一旦专利授权，该保藏物将不可撤回地和无限制或者无条件地可供公众获取。另外，申请人已经满足37 C.F.R.§§1,801-1,809的全部要求，包括提供该样品在保藏时有活力的指征。申请人无权豁免法律对生物材料转移或其商业运输所规定的任何限制。申请人不豁免对他们在本专利下被授予的权利的任何侵犯。但是，应当理解，保藏物的可获取性不构成许可在损害政府法令所授予的专利权的情况下实施本发明。
核酸分子及其变体和片段
一个方面涉及包含编码AfIP-1A和AfIP-1B多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离的或重组的核酸分子，以及足以用作识别编码具有序列同源性区域的蛋白的核酸分子的杂交探针的核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质体DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选的是双链DNA。
“分离的”核酸分子(或DNA)在本文用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的核酸序列(或DNA)。“重组的”核酸分子(或DNA)在本文用来指处于重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(优选蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，“分离的”或“重组的”在用来指核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在各种实施例中，编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的重组核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子的旁侧的核酸序列。
在一些实施例中，与天然或基因组核酸序列相比，编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的分离的核酸分子在核酸序列中具有一个或多个改变。在一些实施例中，天然或基因组核酸序列中的改变包括但不限于：因遗传密码简并而导致的核酸序列的改变；与天然或基因组序列相比，因氨基酸置换、插入、缺失和/或添加而导致的核酸序列中的改变；一个或多个内含子的移 除；一个或多个上游或下游调控区的缺失；以及与基因组核酸序列相关联的5′和/或3′非翻译区的缺失。在一些实施例中，编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的核酸分子是非基因组序列。
设想了编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。此类多核苷酸在有效连接至合适的启动子、转录终止序列和/或多聚腺苷酸化序列时可用于在宿主细胞中产生AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽。此类多核苷酸也可用作分离编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。
编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽或相关蛋白的多核苷酸的一个来源是粪产碱菌菌株，该菌株含有编码SEQ ID NO：2的AfIP-1A多肽的SEQ ID NO：1的AfIP-1A多核苷酸和/或编码SEQ ID NO：4的AfIP-1B多肽的SEQ ID NO：3的AfIP-1B多核苷酸。这些多核苷酸序列分离自粪产碱菌宿主并且因此适用于在其他细菌宿主中表达编码的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽。例如，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3可用来在包括但不限于如下的细菌宿主中表达AfIP-1A和AfIP-1B蛋白：农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属和根瘤菌属细菌宿主细胞。所述多核苷酸也可用作分离编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。此类探针可用来辨识来源于产碱菌属或其他相关细菌的同源或基本上同源的多核苷酸。
编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的多核苷酸也可根据AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽序列从头合成。可通过使用遗传密码从AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽序列推导出多核苷酸基因的序列。计算机程序比如“BackTranslate”(GCGTM软件包，加利福尼亚州圣地亚哥的阿赛乐德公司(Acclerys，Inc.San Diego，Calif.))可用来将肽序列转换为编码该肽的相应核苷酸序列。可用来获得相应核苷酸编码序列的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽序列的例子包括但不限于序列SEQ ID NO：2的AfIP-1A多肽和序列SEQ ID NO：4的AfIP-1B多肽。此外，本发明的合成AfIP-1A和/或AfIP-1B多核苷酸序列可被设计成使得它们将在植物中表达。美国专利No.5,500,365描述了用于合成植物基因以改善由该合成基因编码的蛋白的表达水平的方法。该方法涉及对外源转基因的结构基因序列进行修饰，使其被植物更有效地转录、加工、翻译和表达。在植物中充分表达的基因的特征包括消除可引起基因转录物的 编码区中非期望的内含子剪接或多聚腺苷酸化的序列，同时基本上保留杀昆虫蛋白的毒性部分的氨基酸序列。用于获得单子叶植物中转基因的增强表达的类似方法在美国专利No.5,689,052中有所公开。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽的核酸分子是具有以SEQ ID NO：1示出的序列的多核苷酸以及其变体、片段和互补序列。“互补序列”在本文中用来指与给定的核酸序列充分地互补使得其可杂交至该给定的核酸序列从而形成稳定双链体的核酸序列。“多核苷酸序列变体”在本文中用来指除了遗传密码简并之外编码相同多肽的核酸序列。在一些实施例中，编码AfIP-1B多肽的核酸分子是具有以SEQ ID NO：3示出的序列的核酸分子。由这些核酸序列编码的AfIP-1A或AfIP-1B多肽的相应氨基酸序列分别以SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4示出。
在一些实施例中，编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”是指与天然或基因组核酸序列相比在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：因遗传密码简并而导致的核酸序列的改变；为在植物中表达而对核酸序列进行的密码子优化；与天然或基因组序列相比，为了引入至少一个氨基酸置换、插入、缺失和/或添加而发生的核酸序列中的改变；一个或多个与基因组核酸序列相关联的内含子的移除；一个或多个异源内含子的插入；一个或多个与基因组核酸序列相关联的上游或下游调控区的缺失；一个或多个异源上游或下游调控区的插入；与基因组核酸序列相关联的5′和/或3′非翻译区的缺失；异源5′和/或3′非翻译区的插入；以及多聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成核酸序列。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽的核酸分子是具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：2相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：28相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：32相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：36相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：778的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：778相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：782的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：782相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：784的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：784相比，所述AfIP-1A多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1A多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的相应位置处的天然氨基酸相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含SEQID NO：255的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由Xaa表示的位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含SEQID NO：256的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由Xaa表示的位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含SEQID NO：257的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由Xaa表示的位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQID NO：784相比，具有任何组合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽与SEQ IDNO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：257中的Xaa表示的残基处，具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO：255的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala或Val；第9位处的Xaa是Glu或Gly；第13位处的Xaa是Ile或Val；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第30位处的Xaa是Asn或 Ser；第33位处的Xaa是Val或Ile；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、ArpSer、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第67位处的Xaa是Asp或Glu；第68位处的Xaa是Ser或Thr；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第82位处 的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第96位处的Xaa是Val或Ile；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第111位处的Xaa是Asp或Asn；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys或Glu；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Leu或Phe；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；并且第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO：256的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala、Met或Val；第8位处的Xaa 是Thr或Asp；第9位处的Xaa是Glu、Leu或Gly；第10位处的Xaa是Glu或Asn；第11位处的Xaa是Ser或Val；第12位处的Xaa是Lys或Glu；第13位处的Xaa是Ile或Val；第14位处的Xaa是Arg或Gln；第16位处的Xaa是Tyr或Gln；第17位处的Xaa是Ala或Ser；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第26位处的Xaa是Val或Ser；第27位处的Xaa是Val或Glu；第29位处的Xaa是Ser或Met；第30位处的Xaa是Asn、Asp或Ser；第31位处的Xaa是Phe或Ile；第32位处的Xaa是Lys或Glu；第33位处的Xaa是Val或Ile；第34位处的Xaa是Glu或Lys；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处 的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu或Gly；第67位处的Xaa是Asp、Thr或Glu；第68位处的Xaa是Ser、Lys或Thr；第69位处的Xaa是Tyr或Ser；第70位处的Xaa是Thr或Lys；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu或Ala；第78位处的Xaa是Asn或Asp；第79位处的Xaa是Ala或Thr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly或Lys；第88位处的Xaa是Ser或Glu；第89位处的Xaa是Leu或Ile；第91位处的Xaa是Asp或His；第92位处的Xaa是Gly或Asp；第95位处的Xaa是Leu或Trp；第96位处的Xaa是Val、Leu或Ile；第97位处的Xaa是Phe或Ala；第98位处的Xaa是Glu或Thr；第100位处的Xaa是Tyr或Lys；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser或Ala；第111位处的Xaa是Asp、His或Asn；第112位处的Xaa是Glu或Ser；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys、Thr或Glu；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys或Asp；第119位处的Xaa是Glu或Asn；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Leu或Phe；第130位 处的Xaa是Ser、Ile、Leu或Phe；第131位处的Xaa是Pro或Ser；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val或Cys；第143位处的Xaa是Val或Ile；第145位处的Xaa是Lys或Val；并且第146位处的Xaa是Ser或Gly；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO：257的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中第6位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Met、Val或Ser；第7位处的Xaa是Ala、Met、Val、Leu、Ile或Gly；第8位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；第9位处的Xaa是Glu、Leu、Gly、Asp、Ala、Ile、Val或Met；第10位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第11位处的Xaa是Ser、Val、Thr、Ile、Leu或Met；第12位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第13位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第14位处的Xaa是Arg、Gln、Lys或Asn；第16位处的Xaa是Tyr、Gln、Trp、Phe或Asn；第17位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、 Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu、Ala、Ser、Asp或Gly；第24位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Met；第26位处的Xaa是Val、Ser、Ile、Leu、Met或Thr；第27位处的Xaa是Val、Glu、Ile、Leu、Met或Asp；第29位处的Xaa是Ser、Met、Thr、Ile、Leu或Val；第30位处的Xaa是Asn、Asp、Ser、Glu、Gln或Thr；第31位处的Xaa是Phe、Ile、Leu、Val或Met；第32位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第33位处的Xaa是Val、Ile、Leu或Met；第34位处的Xaa是Glu、Lys、Asp或Arg；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Glu、Gln、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Arg、Gln、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Thr、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp、Thr、Glu或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Asn、Ser、Asp、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu、Met或Phe； 第60位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu、Met、Arg或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Arg、Thr、Asp、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第67位处的Xaa是Asp、Thr、Glu或Ser；第68位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg；第69位处的Xaa是Tyr、Ser、Trp、Phe或Thr；第70位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第73位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu、Ala、Asp或Gly；第78位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu；第79位处的Xaa是Ala、Thr、Gly或Ser；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第88位处的Xaa是Ser、Glu、Thr或Asp；第89位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第91位处的Xaa是Asp、His或Glu；第92位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu；第95位处的Xaa是Leu、Trp、Ile、Val、Met、Phe或Tyr；第96位处的Xaa是Val、Leu、Ile或Met；第97位处的Xaa是Phe、Ala或Gly；第98位处的Xaa是Glu、Thr、Asp或Ser；第100位处的Xaa是Tyr、Lys、Trp或Arg；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第111位处的Xaa是Asp、His、Asn、Glu或Gln；第112位处的Xaa是Glu、Ser、Asp或Thr；第113位处的Xaa是Leu、Ser、Ile、Val、Met或Thr；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val、Ile、Val或Met；第116位处的Xaa是Lys、Thr、Glu、Arg、Ser或Asp；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys、Asp、Arg或Glu；第119位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第120位处的Xaa是Asn、Lys、Asp或Arg；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Ser、Arg、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Met、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu、Val、 Met、Thr、Glu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Arg、Asp、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Ala、Gln、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Thr、Leu、Val、Met或Phe；第131位处的Xaa是Pro、Ser或Thr；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val、Cys、Ile、Leu或Met；第143位处的Xaa是Val、Ile；Leu或Met；第145位处的Xaa是Lys、Val、Arg、Ile、Leu或Met；并且第146位处的Xaa是Ser、Gly、Thr或Ala；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽具有编码包含选自如下的一个或多个氨基酸基序的多肽的核苷酸序列：i)SEQ ID NO：2的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：255的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：256的第15-26位氨基酸、或SEQ IDNO：257的第15-26位氨基酸，ii)SEQ ID NO：2的第33-53位氨基酸、SEQ ID NO：255的第33-53位氨基酸、SEQ ID NO：256的第33-53位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第33-53位氨基酸，iii)SEQ ID NO：2的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：255 的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：256的第71-84位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第71-84位氨基酸，以及iv)SEQ ID NO：2的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：255的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：256的第100-107位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第100-107位氨基酸。在一些实施例中，所述氨基酸基序可任选地具有基序内的一个或多个氨基酸的缺失、基序内的一个或多个氨基酸的插入、或它们的组合。在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽具有编码包含如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序的多肽的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：257的第100-107位处的至少一个氨基酸不与SEQ ID NO：18的第100-107位处的氨基酸相同。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，该AfIP-1A多肽具有具有编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，该AfIP-1A多肽具有编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ ID NO：2的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：255的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：256的第15-26位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第15-26位氨基酸，ii)SEQ ID NO：2的第33-53位氨基酸、SEQ IDNO：255的第33-53位氨基酸、SEQ ID NO：256的第33-53位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第33-53位氨基酸，iii)SEQ ID NO：2的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：255的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：256的第71-84位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第71-84位氨基酸，以及iv)SEQ IDNO：2的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：255的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：256的第100-107位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第100-107位氨基酸。
在一些实施例中，示例性核酸分子编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、 SEQ ID NO：68、SEQID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQID NO：100、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQID NO：310、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782和SEQ ID NO：786的AfIP-1A多肽以及其氨基酸置换、缺失、插入和片段以及它们的组合。
在一些实施例中，所述核酸分子编码表13、表14、表18、表19、表20、表31、表35、表37和/或表38的AfIP-1A多肽、其氨基酸置换以及其缺失和/或插入的组合。
在一些实施例中，编码AfIP-1B多肽的核酸分子是具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO784和SEQ ID NO：788的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQ IDNO：788相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：4相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：30相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：34相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：38相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：780的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：780相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：784的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：784相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：788的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：788相比，所述AfIP-1B多肽具有至少一个氨基酸改变，并且所述AfIP-1B多肽具有杀虫活性。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含SEQID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQ ID NO：788的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQ ID NO：788的相应位置处的天然氨基酸相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含SEQID NO：4的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含SEQID NO：258的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由Xaa表示的位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，非基因组核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含SEQID NO：259的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由Xaa表示的位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQID NO：788相比，具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽与SEQ IDNO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在SEQ ID NO：259中的Xaa表示的残基处，具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，编码AfIP-1B多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO：258的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met或Leu；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly或Cys；第82位处的 Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val或Ala；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala或Val；第148位处的Xaa是Ser、Phe或Thr；第152位处的Xaa是Ile或Thr；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第182位处的Xaa是TrpGly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys或Phe；第202位处的Xaa是Lys或Asn；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile或Val；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala或Glu；第299位处的Xaa是Glu或Gly；第300位处的Xaa是Ile或Val；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala或Ser；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；第360 位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile或Val；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn或Lys；第377位处的Xaa是Leu或Ile；第384位处的Xaa是Thr或Ala；第385位处的Xaa是Ile或Ser；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr或Phe；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser或Asn；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr或Phe；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr或Phe；第552位处的Xaa是Asn或Ser；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met或Ile；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr或Lys；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr或Phe；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位 处的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr或Ala；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
在一些实施例中，编码AfIP-1B多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO：259的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met、Leu、Ile或Val；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly、Cys或Ala；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、yal、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val、Ala、Ile或Leu；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；第148位处的Xaa是Ser、Phe、Thr或Trp；第152位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val、Met或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是 Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys、Tyr或Phe；第202位处的Xaa是Lys、Asn或Arg；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala、Glu、Gly或Asp；第299位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第300位处的Xaa是Ile、Val、Ile或Met；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn、Lys、Gln或Arg；第377位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第384位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第385位处的Xaa是Ile、Ser、Leu、Val、Met或Thr；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或 Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第552位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met、Ile、Leu或Val；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1B多肽，该AfIP-1B多肽具有编码包含选自如下的一个或多个氨基酸基序的多肽的核苷酸序列：i)SEQ ID NO：4的第105-115位氨基酸、SEQ ID NO：258的第105-115位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第105-115位氨基酸，ii)SEQ ID NO：4的第133-141位氨基酸、SEQ ID NO：258的第133-141位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第133-141位氨基酸，iii)SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸、SEQ ID NO：258的第177-184位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第177-184位氨基酸，iv)SEQ ID NO：4的第358-365位氨基酸、SEQ ID NO：258的第358-365位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸，以及v)SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸、SEQ ID NO：258的第511-520位氨基酸、或SEQID NO：259的第511-520位氨基酸。在一些实施例中，所述氨基酸基序可任选地具有基序内的一个或多个氨基酸的缺失、基序内的一个或多个氨基酸的插入、或它们的组合。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1B多肽，该AfIP-1B多肽具有编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述核酸分子编码AfIP-1B多肽，该AfIP-1B多肽具有编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ ID NO：4的第105-115位氨基酸、SEQ ID NO：258的第105-115位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第105-115位氨基酸，ii)SEQ ID NO：4的第133-141位氨基酸、SEQ ID NO：258的第133-141位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第133-141位氨基酸，iii)SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸、SEQ IDNO：258的第177-184位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第177-184位氨基酸，iv)SEQ ID NO：4的第358-365位氨基酸、SEQ ID NO：258的第358-365位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸，以及v)SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸、SEQ ID NO：258的第511-520位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第511-520位氨基酸。
在一些实施例中，示例性核酸分子编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：323、SEQID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：334、SEQID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345、SEQID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：352、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：354、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：356、SEQID NO：357、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：360、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：364、SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：366、SEQ ID NO：367、SEQID NO：368、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：370、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：376、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：378、SEQID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：389、SEQID NO：390、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQID NO：708、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQ ID NO：788的AfIP-1B多肽以及其氨基酸置换、缺失、插入和片段。
在一些实施例中，所述核酸分子编码表22、表24、表33和/或表39的AfIP-1B多肽、其氨基酸置换以及其缺失和/或插入的组合。
还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接而最终产生功能性AfIP-1A或AfIP-1B多肽。剪接可在体外或体内完成，并且可涉及顺式或反式剪接。供剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸顺式剪接的例子是将插入编码序列中的内含子移除并且将两个旁侧外显子区剪接而产生AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽编码序列的情形。反式剪接的例子将是通过如下方式加密多核苷酸的情形：将编码序列分成两个或更多个片段，所述两个或更多个片段可单独地转录，然后剪接而形成全长杀虫编码序列。可引入构建体中的剪接增强子序列的使用可有利于多肽顺式或反式剪接方式的剪接(美国专利No.6,365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，所述多核苷酸不直接编码全长AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽，而是编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达功能性AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽，其中剪接可在多核苷酸(例如，内含子/外显子)和/或多肽(例如，内含肽/外显肽)层面发生。这可用于例如控制杀虫活性的表达，因为功能性杀虫多肽将仅在如下情况下表达：所有必需的片段在容许剪接过程的环境中表达从而产生功能性产物。又如，在多核苷酸中引入一个或多个插入序列可有利于与低同源性多核苷酸的重组；插入 序列使用内含子或内含肽有利于移除间插序列，从而恢复所编码变体的功能。
作为这些编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的核酸序列的片段的核酸分子也被所述实施例涵盖。如本文所用，“片段”是指编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的生物活性部分，或可以是在使用下文所公开的方法时可用作杂交探针或PCR引物的片段。作为编码AfIP-1A多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、240、270、300、330或360个连续核苷酸或最多至存在于编码本文所公开的AfIP-1A多肽的全长核酸序列中的核苷酸的数量，具体取决于预期应用。“连续核苷酸”在本文中用来指彼此紧邻的核苷酸残基。所述实施例的核酸序列的片段将编码蛋白片段，该蛋白片断保留了AfIP-1A多肽的生物活性并从而保留了杀昆虫活性。“保留AfIP-lA活性”在本文中用来指多肽具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的SEQ ID NO：2的全长AfIP-1A多肽单独或与SEQ IDNO：4的AfIP-1B多肽一起的杀昆虫活性。在一个实施例中，杀昆虫活性是鳞翅目活性。作为编码AfIP-1B多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约225、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500、1650、1800、1950或2100个连续核苷酸或最多至存在于编码本文所公开的AfIP-1B多肽的全长核酸序列中的核苷酸的数量，具体取决于预期应用。所述实施例的核酸序列的片段将编码蛋白片段，该蛋白片断保留了AfIP-1B多肽的生物活性并从而保留了杀昆虫活性。“保留AfIP-1B活性”在本文中用来指多肽具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的SEQ ID NO：4的全长AfIP-1B多肽单独或与SEQID NO：2的AfIP-1A多肽一起的杀昆虫活性。在一个实施例中，杀昆虫活性是对于鳞翅目物种而言的。在一个实施例中，杀昆虫活性是对于半翅目物种而言的。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽的核酸序列的编码蛋白生物活性部分的片段将编码至少约15、20、30、50、75、100、125个连续氨基酸或最多至存在于所述实施例的全长AfIP-1A多肽中的氨基酸的总数。在一些实施例中，所述片段是例如通过蛋白水解、起始密码子的插入、编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随终止密码子的插入或通过编码序列中终止 密码子的插入，相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784或其变体从N端和/或C端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或更多个氨基酸的N端或C端截短。在一些实施例中，本文所涵盖的片段是例如通过蛋白水解或者通过编码序列中起始密码子的插入，相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784或其变体从N端移除N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸所产生的。在一些实施例中，本文所涵盖的片段是例如通过蛋白水解或者通过编码序列中起始密码子的插入，相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784或其变体移除N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个氨基酸所产生的。
在一些实施例中，编码AfIP-1B多肽的核酸序列的编码蛋白生物活性部分的片段将编码至少约75、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700个连续氨基酸或最多至存在于所述实施例的全长AfIP-1B多肽中的氨基酸的总数。在一些实施例中，所述片段是例如通过蛋白水解、起始密码子的插入、编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随终止密码子的插入或通过编码序列中终止密码子的插入，相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQ ID NO：788或其变体从N端和/或C端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或更多个氨基酸的N端或C端截短。在一些实施例中，本文所涵盖的片段是例如通过蛋白水解或者通过编码序列中起始密码子的插入，相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ IDNO 784和SEQ ID NO：788或其变体从N端移除N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸所产生的。在一些实施例中，本文 所涵盖的片段是例如通过蛋白水解或通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随终止密码子的插入或通过编码序列中终止密码子的插入，相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO 784和SEQ ID NO：788或其变体从C端移除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸所产生的。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽是由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：35的核酸序列充分同源的核酸序列编码的。“充分同源”在本文中用来指使用本文所述的比对程序之一并采用标准参数与参考序列进行比较时氨基酸或核酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核酸序列所编码的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性是针对编码AfIP-1A多肽的多核苷酸的全长序列或针对AfIP-1A多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，AfIP-1A多肽具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO 778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：786相比至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。在一些实施例中，序列同一性是针对编码AfIP-1A多肽的多核苷酸的全长序列或针对AfIP-1A多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法来计算的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector NTI程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的ALIGNX模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽是由与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：37的核酸序列充分同源的核酸序列编码 的。“充分同源”在本文中用来指使用本文所述的比对程序之一并采用标准参数与参考序列进行比较时氨基酸或核酸序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。在一些实施例中，序列同源性是针对编码AfIP-1B多肽的多核苷酸的全长序列或针对AfIP-1B多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，AfIP-1B多肽具有与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788相比至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。在一些实施例中，序列同一性是针对编码AfIP-1B多肽的多核苷酸的全长序列或针对AfIP-1B多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法来计算的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector NTI程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(InvitrogenCorporation，Carlsbad，Calif.))的ALIGNX模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比，对序列进行了最佳比较目的的比对。这两条序列之间的同一性百分比是序列所共有的相同位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数量/位置(例如，重叠的位置)的总数×100)。在一个实施例中，这两条序列长度相同。在另一个实施例中，所述比较跨越参考序列整体(例如，跨越SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：35之一的整体、跨越SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784之一的整体、跨越SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33或SEQID NO：37之一的整体、跨越SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788之一的整体)。两条序列之间的同一性百分比可使用类似于下文所述的那些的技术在允许或不允许空位的情况下确定。在计算同一性百分比中，通常对准确的匹配进行计数。
可以使用数学算法完成两条序列之间同一性百分比的确定。用于比较两条序列的数学算法的非限制性例子是Karlin and Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第2264页)的算法，其在Karlin and Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。此类算法并入了Altschul，et al.，(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与所述实施例的杀虫核酸分子同源的核酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与所述实施例的杀虫蛋白分子同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：，3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所描述采用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，可使用PSI-Blast来进行迭代搜索，该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul等人，(1997)(出处同上)。当采用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。还可以以人工方式通过检查来进行比对。
用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是ClustalW算法(Higgins，etal.，(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680(Higgins等人，1994年，《核酸研究》，第22卷，第4673-4680页))。ClustalW对序列进行比较并对氨基酸或DNA序列整体进行比对，从而可提供有关整条氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于若干商品化的DNA/氨基酸分析 软件包，比如Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块。在用ClustalW对氨基酸序列进行比对之后，可评估氨基酸同一性百分比。可用于ClustalW比对的分析的软件程序的非限制性例子是GENEDOCTM。GENEDOCTM(Karl Nicholas)允许评估多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Myersand Miller，(1988)CABIOS 4：11-17(Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法。此类算法并入了ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG WisconsinGenetics软件包版本10(得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys公司(Accelrys，Inc.，9685 Scranton Rd.，San Diego，Calif.，USA))的一部分。当采用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。
用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第3期，第443-453页)的算法，其使用GAP版本10软件利用下列默认参数确定序列同一性或相似性：核酸序列的同一性％和相似性％使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmpii打分矩阵；氨基酸序列的同一性％或相似性％使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62打分程序。也可使用等同程序。“等同程序”在本文中用来指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。
所述实施例还涵盖编码AfIP-1A和AfIP-1B多肽的变体的核酸分子。AfIP-1A和AfIP-1B多肽编码核酸序列的“变体”包括编码本文公开的AfIP-1A和AfIP-1B多肽但由于遗传密码的简并性而保守地差异的那些序列以及与上文所讨论充分相同的那些序列。天然存在的等位基因变体可用公知的分子生物学技术进行鉴定，比如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来识别。变体核酸序列也包括合成而得的核酸序列，其例如通过使用定点诱变而产生，但仍然编码所公开的AfIP-1A和AfIP-1B多肽，如下文所讨论。
本发明提供编码任何本文所公开的AfIP-1A和AfIP-1B多肽的分离的或重组的多核苷酸。本领域普通技术人员将易于理解，由于遗传密码的简并性，存在大量编码本发明的AfIP-1A和AfIP-1B多肽的核苷酸序列。表1是提供每个氨基酸的同义密码子的密码子表。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU全部都编码氨基酸精氨酸。因此，在本发明核酸中由某密码子指定为精氨酸的每个位置处，该密码子可更改为上述任何相应的密码子，而不改变所编码的多肽。应当理解，RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。
表1
技术人员还将理解，可通过核酸序列的突变引入变化，从而引起所编码的AfIP-1A和AfIP-1B多肽的氨基酸序列的变化，而不改变蛋白的生物活性。因此，可通过将一个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失引入本文所公开的相应核酸序列中来形成变体核酸分子，使得一个或多个氨基酸置 换、添加或缺失被引入所编码的蛋白中。可通过标准技术，比如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。此类变体核酸序列也被本发明涵盖。
或者，可通过沿着全部或部分的编码序列随机地引入突变，比如通过饱和诱变来制得变体核酸序列，并且可筛查所得突变体赋予杀虫活性的能力以辨识保留活性的突变体。诱变后，可以重组方式表达所编码的蛋白，并且可使用标准测定法技术确定该蛋白的活性。
除如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法以外，本发明的多核苷酸及其片段任选地用作多种重组和递归重组反应的底物，即，为了产生具有所需特性的额外杀虫多肽同源物及其片段。多种此类反应是已知的，包括发明人及其同事开发的那些。用于产生本文所列任何核酸的变体的方法包括将此类多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸的文库，所述方法也是本发明的实施例，所产生的文库、包含所述文库的细胞以及由此类方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外，此类方法任选地包括当此类递归重组在体外或体内完成时，基于杀虫活性从此类文库选择变体多核苷酸。
多种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)可供使用并且已在本领域中充分描述。这些程序可单独和/或组合使用以产生核酸或核酸组的一个或多个变体，以及所编码的蛋白的变体。这些程序单独地和共同地提供产生多样化的核酸和核酸组(包括例如核酸文库)的稳固、广泛适用的方法，可用于例如核酸、蛋白、通路、细胞和/或生物体的工程改造或快速进化而具有新的和/或改善的特性。
虽然为清楚起见在后续讨论过程中进行了区分和分类，但应当理解，这些技术通常不是互相排斥的。事实上，所述各种方法可单独或组合使用、并行或连续使用，以获得多样的序列变体。
任何本文所述的多样性产生程序的结果可以是产生一条或多条核酸，可对所述一条或多条核酸进行选择或筛选而得到具有或赋予所需特性的核酸或者编码具有或赋予所需特性的蛋白的核酸。在通过本文的一种或多种方法或者可供技术人员使用的其他方法进行多样化后，可针对所需活性或特性例如杀虫活性或在所需pH下的此类活性等等，来选择产生的任何核酸。这可包括鉴定任何活性，所述活性可通过本领域的任何测定法以例如自动化或可自动化的格式进行检测，参见例如下文杀昆虫活性的筛查的讨 论。多种相关(或甚至不相关)特性可由操作人员自行决定是连续地还是并行地评价。
用于产生经修饰的核酸序列(例如编码具有杀虫活性的多肽或其片段的核酸序列)的多种多样性产生程序的描述可见于下列出版物及其中引用的参考文献：Soong，etal.，(2000)Nat Genet 25(4)：436-439(Soong等人，2000年，《自然-遗传学》，第25卷，第4期，第436-439页)；Stemmer，et al.，(1999)Tumor Targeting 4：1-4(Stemmer等人，1999年，《肿瘤靶向》，第4卷，第1-4页)；Ness，et al.，(1999)Nat Biotechnol 17：893-896(Ness等人，1999年，《自然-生物技术》，第17卷，第893-896页)；Chang，et al.，(1999)NatBiotechnol 17：793-797(Chang等人，1999年，《自然-生物技术》，第17卷，第793-797页)；Minshull and Stemmer，(1999)Curr Opin Chem Biol 3：284-290(Minshull和Stemmer，1999年，《化学生物学新见》，第3卷，第284-290页)；Christians，et al.，(1999)NatBiotechnol 17：259-264(Christians等人，1999年，《自然-生物技术》，第17卷，第259-264页)；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)；Crameri，et al.，(1997)Nat Biotechnol 15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然-生物技术》，第15卷，第436-438页)；Zhang，et al.，(1997)PNAS USA 94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Patten，et al.，(1997)Curr Opin Biotechnol 8：724-733(Patten等人，1997年，《生物技术新见》，第8卷，第724-733页)；Crameri，et al.，(1996)Nat Med 2：100-103(Crameri等人，1996年，《自然-医学》，第2卷，第100-103页)；Crameri，et al.，(1996)Nat Biotechnol 14：315-319(Crameri等人，1996年，《自然-生物技术》，第14卷，第315-319页)；Gates，et al.，(1996)JMol Biol 255：373-386(Gates等人，1996年，《分子生物学杂志》，第255卷，第373-386页)；Stemmer，(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”In：The Encyclopedia of MolecularBiology.VCH Publishers，New York.pp.447-457(Stemmer，1996年，“有性PCR和装配PCR”，载于：《分子生物学百科全书》，纽约VCH出版社，第447-457页)；Crameri and Stemmer，(1995)Bio Techniques 18：194-195(Crameri和Stemmer，1995年，《生物技术》，第18卷，第194-195页)； Stemmer，et al.，(1995)Gene，164：49-53(Stemmer等人，1995年，《基因》，第164卷，第49-53页)；Stemmer，(1995)Science 270：1510(Stemmer，1995年，《科学》，第270卷，第1510页)；Stemmer，(1995)Bio/Technology 13：549-553(Stemmer，1995年，《生物/技术》，第13卷，第549-553页)；Stemmer，(1994)Nature 370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)以及Stemmer，(1994)PNAS USA 91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)。
产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(Ling，et al.，(1997)Anal Biochem254(2)：157-178(Ling等人，1997年，《分析生物化学》，第254卷，第2期，第157-178页)；Dale，et al.，(1996)Methods Mol Biol 57：369-374(Dale等人，1996年，《分子生物学方法》，第57卷，第369-374页)；Smith，(1985)Ann Rev Genet 19：423-462(Smith，1985年，《遗传学年评》，第19卷，第423-462页)；Botstein and Shortle，(1985)Science 229：1193-1201(Botstein和Shortle，1985年，《科学》，第229卷，第1193-1201页)；Carter，(1986)Biochem J 237：1-7(Carter，1986年，《生物化学杂志》，第237卷，第1-7页)以及Kunkel，(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”in NucleicAcids&Molecular Biology (Eckstein and Lilley，eds.，Springer Verlag，Berlin)(Kunkel，1987年，“寡核苷酸定点诱变的效率”，载于《核酸与分子生物学》，Eckstein和Lilley编辑，柏林施普林格出版社))；使用含尿嘧啶的模板进行的诱变(Kunkel，(1985)PNAS USA 82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel，et al.，(1987)Methods Enzymol 154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)以及Bass，et al.，(1988)Science 242：240-245(Bass等人，1988年，《科学》，第242卷，第240-245页))；寡核苷酸定点诱变(Zoller and Smith，(1983)Methods Enzymol100：468-500(Zoller和Smith，1983年，《酶学方法》，第100卷，第468-500页)；Zoller and Smith，(1987)Methods Enzymol154：329-350(1987)(Zoller和Smith，1987年，《酶学方法》，第154卷，第329-350页(1987))；Zoller and Smith，(1982)NucleicAcids Res 10：6487-6500(Zoller和Smith，1982年，《核酸研究》，第10卷，第 6487-6500页))；硫代磷酸修饰的DNA诱变(Taylor，et al.，(1985)Nucl Acids Res 13：8749-8764(Taylor等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第8749-8764页)；Taylor，et al.，(1985)NuclAcids Res 13：8765-8787(1985)(Taylor等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第8765-8787页(1985))；Nakamaye and Eckstein，(1986)Nucl Acids Res 14：9679-9698(Nakamaye和Eckstein，1986年，《核酸研究》，第14卷，第9679-9698页)；Sayers，et al.，(1988)NuclAcids Res 16：791-802(Sayers等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第791-802页)以及Sayers，et al.，(1988)Nucl Acids Res 16：803-814(Sayers等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第803-814页))；使用带空位的双螺旋DNA进行的诱变(Kramer，et al.，(1984)NuclAcids Res 12：9441-9456(Kramer等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第9441-9456页)；Kramer and Fritz，(1987)Methods Enzymol 154：350-367(Kramer和Fritz，1987年，《酶学方法》，第154卷，第350-367页)；Kramer，et al.，(1988)Nucl AcidsRes 16：7207(Kramer等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第7207页)以及Fritz，et al.，(1988)Nucl Acids Res16：6987-6999(Fritz等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第6987-6999页))。
另外的合适方法包括点错配修复(Kramer，et al.，(1984)Cell 38：879-887(Kramer等人，1984年，《细胞》，第38卷，第879-887页))、使用修复缺陷型宿主菌株进行的诱变(Carter，et al.，(1985)Nucl Acids Res 13：4431-4443(Carter等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第4431-4443页)以及Carter，(1987)Methods in Enzymol 154：382-403(Carter，1987年，《酶学方法》，第154卷，第382-403页))、缺失诱变(Eghtedarzadeh andHenikoff，(1986)Nucl Acids Res 14：5115(Eghtedarzadeh和Henikoff，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5115页))、限制选择和限制纯化(Wells，et al.，(1986)Phil Trans R SocLond A 317：415-423(Wells等人，1986年，《伦敦皇家学会哲学汇刊A辑》，第317卷，第415-423页))、通过全基因合成进行的诱变(Nambiar，et al.，(1984)Science 223：1299-1301(Nambiar等人，1984年，《科学》，第223卷，第1299-1301页)；Sakamar and Khorana，(1988)Nucl Acids Res 14：6361-6372(Sakamar和Khorana，1988年，《核酸研究》，第14卷，第6361-6372 页)；Wells，et al.，(1985)Gene 34：315-323(Wells等人，1985年，《基因》，第34卷，第315-323页)以及et al.，(1985)Nucl Acids Res 13：3305-3316(等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第3305-3316页))、双链断裂修复(Mandecki，(1986)PNAS USA，83：7177-7181(Mandecki，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第7177-7181页)以及Arnold，(1993)Curr Opin Biotech 4：450-455(Arnold，1993年，《生物技术新见》，第4卷，第450-455页))。关于上述方法中许多方法的另外细节可见于Methods Enzymol Volume 154(《酶学方法》，第154卷)，该文献也描述了各种诱变方法故障排除问题的有用对照。
有关各种多样性产生方法的另外细节可见于下列美国专利、PCT公布和申请以及EPO公布：美国专利No.5,723,323、美国专利No.5,763,192、美国专利No.5,814,476、美国专利No.5,817,483、美国专利No.5,824,514、美国专利No.5,976,862、美国专利No.5,605,793、美国专利No.5,811,238、美国专利No.5,830,721、美国专利No.5,834,252、美国专利No.5,837,458、WO 1995/22625、WO 1996/33207、WO 1997/20078、WO 1997/35966、WO 1999/41402、WO 1999/41383、WO 1999/41369、WO 1999/41368、EP 752008、EP 0932670、WO 1999/23107、WO 1999/21979、WO 1998/31837、WO 1998/27230、WO 1998/27230、WO 2000/00632、WO 2000/09679、WO 1998/42832、WO 1999/29902、WO 1998/41653、WO 1998/41622、WO1998/42727、WO 2000/18906、WO 2000/04190、WO 2000/42561、WO 2000/42559、WO 2000/42560、WO 2001/23401和PCT/US01/06775。
所述实施例的核苷酸序列也可用于从其他生物体，尤其是其他细菌，尤其是产碱菌属物种且更尤其是粪产碱菌菌株分离相应的序列。以此方式，诸如PCR、杂交等之类的方法可以基于这类序列与本文所述序列的序列同源性用来鉴别这类序列。所述实施例涵盖基于序列与本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而选择的序列。这类序列包括为所公开的序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而存在于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和/或其所编码的蛋白质序列如本文其他地方所定义的那样具有实质性的同一性时，存在于 不同物种中的基因被认为是直系同源物。直系同源物的功能在各种物种中常常是高度保守的。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从提取自任何所关注生物体的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，在以下文献中有公开：Sambrook，et al.，(1989)Molecular Clonmg：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)，下文称“Sambrook”。还可参见Innis，et al.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications(Academic Press，New York)(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法和应用指导》，学术出版社，纽约)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)(Innis和Gelfand编辑，1995年，《PCR策略》，学术出版社，纽约)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，NewYork)(Innis和Gelfand编辑，1999年，《PCR方法手册》，学术出版社，纽约)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
为了从细菌保藏物中识别潜在的AfIP-1A和AfIP-1B多肽，可使用用AfIP-1A或AfIP-1B多肽作为抗原生成的抗体，利用蛋白质印迹和/或ELISA方法筛选细菌细胞裂解物。该类型的测定法可以高通量方式进行。可通过各种技术比如基于抗体的蛋白纯化和识别，进一步分析阳性样品。生成抗体的方法是本领域熟知的，如下文所讨论。
或者，可使用基于质谱的蛋白识别方法，用文献(Scott Patterson，(1998)，10.22，1-24，Current Protocol in Molecular Biology published by John Wiley&SonInc(Scott Patterson，1998年，第10卷，第22期，第1-24页，《现代分子生物学实验手册》，由约翰·威利父子出版公司出版))中的方案辨识AfIP-1A和AfIP-1B多肽的同源物。具体而言，使用基于LC-MS/MS的蛋白识别方法将给定细胞裂解物或富含所需分子量的样品(从AfIP-1A和AfIP-1B多肽的相关分子量条带的SDS-PAGE凝胶切离)的MS数据与AfIP-1A和AfIP-1B(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4)及其同 源物的序列信息相关联。肽序列中的任何匹配均指示样品中有可能含有同源蛋白。可使用另外的技术(蛋白纯化和分子生物学)分离蛋白并识别同源物的序列。
在杂交方法中，可使用全部或部分的杀虫核酸序列筛选cDNA或基因组文库。此类cDNA和基因组文库的构建方法是本领域公知的并且公开于Sambrook和Russell，(2001)(出处同上)。所谓的杂交探针可为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可由可检测的基团比如32P或任何其他可检测的标记物，比如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子进行标记。可通过标记基于本文所公开的已知AfIP-1A或AfIP-1B多肽编码核酸序列的合成寡核苷酸，来制备用于杂交的探针。另外还可使用在核酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基的基础上设计的简并引物。该探针通常包含这样的核酸序列区域：该区域在严格条件下杂交于编码本发明AfIP-1A或AfIP-1B多肽的核酸序列或其片段或变体的至少约12、至少约25、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核苷酸。制备用于杂交的探针的方法是本领域公知的并且公开于Sambrook和Russell，(2001)(出处同上)，该文献以引用方式并入本文。
例如，编码本文所公开的AfIP-1A或AfIP-1B多肽的整个核酸序列或者其一个或多个部分可用作能够特异性杂交于编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽样序列的相应核酸序列和信使RNA的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括独特的序列，并且优选地长为至少约10个核苷酸或长为至少约20个核苷酸。这种探针可用于通过PCR从选定的生物体扩增相应的杀虫序列。这项技术可用于从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬斑或菌落；参见例如Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)。
这类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”在本文中用来指探针与其靶标序列杂交的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列 依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以识别与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.5×至1×SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.1×SSC中在60℃至65℃下洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，一般约4至约12小时。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据Meinkoth and Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的公式估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员应当理解，其从本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化形式。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导可见于Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，N.Y.)(Tijssen，1993年，《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔出版社，纽约)；以及Ausubel，et al.，eds.(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)(Ausubel等人编辑，1995年，《现代分子生物学实验手册》，第2章，格林出版与威立国际科学，纽约)。参见Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)。
蛋白及其变体和片段
AfIP-1A和AfIP-1B多肽也被本发明涵盖。如本文可互换使用的“产碱菌属杀昆虫蛋白-1A”、“AfIP-1A多肽”或“AfIP-1A蛋白”是指这样的多肽，其具有杀虫活性，包括但不限于杀真菌活性、以及单独或联合AfIP-1B多肽对于鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫害虫的杀昆虫活性，并且其与SEQ ID NO：2的蛋白充分同源。设想了多种AfIP-1A多肽。编码AfIP-1A多肽或相关蛋白的多核苷酸的来源之一是粪产碱菌菌株，该菌株含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：781或SEQ IDNO 785的多核苷酸，其分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的AfIP-1A多肽。如本文可互换使用的“产碱菌属杀昆虫蛋白-1B”、“AfIP-1B多肽”或“AfIP-1B蛋白”是指这样的多肽，其具有杀虫活性，包括但不限于杀真菌活性、以及单独或联合AfIP-1A多肽对于鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫害虫的杀昆虫活性，并且其与SEQ ID NO：4的蛋白充分同源。设想了多种AfIP- 1B多肽。编码AfIP-1B多肽或相关蛋白的多核苷酸的来源之一是粪产碱菌菌株，该菌株含有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：779、SEQ IDNO：783或SEQ ID NO：787的多核苷酸，其分别编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的AfIP-1B多肽。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列充分同源。“充分同源”在本文中用来指使用本文所述的比对程序之一并采用标准参数与参考序列进行比较时氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑氨基酸相似性等等适当调整这些值以确定蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性是针对AfIP-1A多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，AfIP-1A多肽具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784相比至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。在一些实施例中，序列同一性是针对AfIP-1A多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector 程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法来计算的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的氨基酸序列充分同源。“充分同源”在本文中用来指使用本文所述的比对程序之一并采用标准参数与参考序列进行比较时氨基酸 序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑氨基酸相似性等等适当调整这些值以确定蛋白质的相应同一性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽具有与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788相比至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。在一些实施例中，序列同一性是针对AfIP-1B多肽的全长序列而言的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法来计算的。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的 模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
如本文所用，术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括包含五个或更多个氨基酸的任何分子。本领域熟知的是，蛋白、肽或多肽分子可进行修饰，包括翻译后修饰，比如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，如本文所用，术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物或非生物过程修饰的任何蛋白。术语“氨基酸”是指所有天然存在的L-氨基酸。
“重组蛋白”在本文中用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外或者处于重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白。基本上不含细胞物质的AfIP-1A或AfIP-1B多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％或更少(以干重计)的非杀虫蛋白(本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白制备物。
“片段”或“生物活性部分”包括包含与AfIP-1A或AfIP-1B多肽充分相同的氨基酸序列并且表现出杀昆虫活性的多肽片段。AfIP-1A多肽的“片段”或“生物活性部分”包括包含与分别以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784(包括但不限于SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：152) 示出的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列并且表现出杀昆虫活性的片段。AfIP-1A多肽的生物活性部分可以是长为例如10、25、50、75、100、125、132个或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术制备并且可评价其杀昆虫活性。如此处所用，片段包含AfIP-1A多肽的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中，AfIP-1A多肽片段包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中，片段包含SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中，片段包含SEQ ID NO：18的至少8个连续氨基酸。AfIP-1B多肽的“片段”或“生物活性部分”包括包含与分别以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788(包括但不限于SEQ ID NO：4的第1至380位氨基酸以及SEQ ID NO：4的第381至703位氨基酸)示出的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列并且表现出杀昆虫活性的片段。AfIP-1B多肽的生物活性部分可以是长为例如10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650个或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术制备并且可评价其杀昆虫活性。如此处所用，片段包含AfIP-1B多肽的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中，片段包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中，片段包含SEQ ID NO：4的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中，片段包含SEQ ID NO：20的至少8个连续氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽片段是例如通过蛋白水解、通过起始密码子的插入、通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随起始密码子的插入和/或终止密码子的插入，相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784或其变体(包括但不限于SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、 SEQID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：310、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663和SEQ ID NO：664)从N端和/或C端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或更多个氨基酸的N端和/或C端截短。
在一些实施例中，本文所涵盖的AfIP-1A多肽片段是例如通过蛋白水解或通过起始密码子的插入，通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴 随起始密码子的插入，相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784及其变体(包括但不限于SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ IDNO：309、SEQ ID NO：310、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ IDNO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ IDNO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ IDNO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ IDNO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ IDNO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ IDNO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：648、SEQ IDNO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、 SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ IDNO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663和SEQ ID NO：664)的N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的移除所产生的。
在一些实施例中，本文所涵盖的AfIP-1A多肽片段是相对于SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784及其变体(包括但不限于SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：310、SEQID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、 SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ IDNO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ IDNO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663和SEQ ID NO：664)的N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸的移除所产生的。在一些实施例中，截短发生于SEQ ID NO：2的头4个氨基酸，从而由SEQ ID NO：2的第5-146位氨基酸产生AfIP-1A多肽。在一些实施例中，截短发生于SEQ ID NO：2的头14个氨基酸，从而由SEQ ID NO：2的第15-146位氨基酸产生AfIP-1A多肽。在一些实施例中，截短的AfIP-1A多肽是SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：152的多肽。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽片段是例如通过蛋白水解、通过起始密码子的插入、通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随起始密码子的插入和/或终止密码子的插入，相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788或其变体(包括但不限于SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：337、SEQID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：348、SEQID NO：349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：352、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：354、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQID NO：360、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：364、 SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：366、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：370、SEQID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：376、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：381、SEQID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707和SEQ ID NO：708)从N端和/或C端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个氨基酸的N端和/或C端截短。
在一些实施例中，本文所涵盖的AfIP-1B多肽片段是例如通过蛋白水解或通过起始密码子的插入，通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随起始密码子的插入，相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788及其变体(包括但不限于SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ IDNO：92、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ IDNO：333、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：343、SEQ IDNO：344、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：352、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：354、SEQ IDNO：355、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：360、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：364、SEQ ID NO：365、SEQ IDNO：366、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：370、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：376、SEQ IDNO：377、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：387、SEQ IDNO：388、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ IDNO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ IDNO：706、SEQ ID NO：707和SEQ ID NO：708)从C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或更多个氨基酸的移除所产生的。
在一些实施例中，本文所涵盖的AfIP-1B多肽片段是相对于SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788及其变体(包括但不限于SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：323、SEQID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：334、SEQID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345、SEQID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：352、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：354、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：356、SEQID NO：357、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：360、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：362、 SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：364、SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：366、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：370、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ IDNO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：376、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ IDNO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ IDNO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ IDNO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707和SEQ ID NO：708)从C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的移除所产生的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽片段是SEQ ID NO：4的第1至380位氨基酸。在一些实施例中，AfIP-1B多肽片段是SEQ ID NO：4的第381至703位氨基酸。本领域熟知的是，可对编码截短多肽的多核苷酸进行工程改造以在N端添加起始密码子，比如ATG，其编码甲硫氨酸或甲硫氨酸接着是丙氨酸。本领域还熟知的是，根据多肽在何种宿主中表达，甲硫氨酸可被部分或完全加工去除。
在一些实施例中，还提供了SEQ ID NO：18和/或SEQ ID NO：20的片段、生物活性部分以及其氨基酸置换、缺失和/或插入，并且其可用于操作本发明的方法。
如本文所用，“变体”是指与亲本氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白或多肽。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列的全长上具有至少约50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，杀昆虫多肽在SEQ ID NO：18的氨基酸序列的全长上具有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：2的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：255的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：256的第15-26位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第15-26位氨基酸，ii)SEQ ID NO：2的第33-53位氨基酸、SEQID NO：255的第33-53位氨基酸、SEQ ID NO：256的第33-53位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第33-53位氨基酸，iii)SEQ ID NO：2的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO： 255的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：256的第71-84位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第71-84位氨基酸，以及iv)SEQID NO：2的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：255的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：256的第100-107位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第100-107位氨基酸。在一些实施例中，所述氨基酸基序可任选地具有基序内的一个或多个氨基酸的缺失、基序内的一个或多个氨基酸的插入、或它们的组合。在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO：257的第100-107位处的至少一个氨基酸不与SEQ IDNO：18的第100-107位处的氨基酸相同。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784示出的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784示出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784示出的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序 包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784示出的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列，并且包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：2的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：255的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：256的第15-26位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第15-26位氨基酸，ii)SEQ ID NO：2的第33-53位氨基酸、SEQID NO：255的第33-53位氨基酸、SEQ ID NO：256的第33-53位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第33-53位氨基酸，iii)SEQ ID NO：2的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：255的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：256的第71-84位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第71-84位氨基酸，以及iv)SEQID NO：2的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：255的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：256的第100-107位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第100-107位氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含如由SEQ ID NO：256的第100-107位表示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO：256的第100-107位处的至少一个氨基酸不与SEQ ID NO：18的第101-107位处的氨基酸相同。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782或SEQ ID NO：784示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：2的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：255的第15-26位氨基酸、SEQ ID NO：256的第15-26位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第15-26位氨基酸，ii)SEQ ID NO：2的第33-53位氨基酸、SEQID NO：255的第33-53位氨基酸、SEQ ID NO：256的第33-53位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第33-53位氨基酸，iii)SEQ ID NO：2的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：255的第71-84位氨基酸、SEQ ID NO：256的第71-84位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第71-84位氨基酸，以及iv)SEQID NO：2的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：255的第100-107位氨基酸、SEQ ID NO：256的第100-107位氨基酸、或SEQ ID NO：257的第100-107位氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO：257的第100-107位处的至少一个氨基酸不与SEQ ID NO：18的第100-107位处的氨基酸相同。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：255的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala或Val；第9位处的Xaa是Glu或Gly；第13位处的Xaa是Ile或Val；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第30位处的Xaa是Asn或Ser；第33位处的Xaa是Val或Ile；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Leu或 Phe；第56位处的Xaa是Ser或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Leu或Phe；第67位处的Xaa是Asp或Glu；第68位处的Xaa是Ser或Thr；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第96位处的Xaa是Val或Ile；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第111位处的Xaa是Asp或Asn；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys或Glu；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Leu或Phe；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的 Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；并且第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：255的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：255中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：255的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：255中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：256的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile或Thr；第7位处的Xaa是Ala、Met或Val；第8位处的Xaa是Thr或Asp；第9位处的Xaa是Glu、Leu或Gly；第10位处的Xaa是Glu或Asn；第11位处的Xaa是Ser或Val；第12位处的Xaa是Lys或Glu；第13位处的Xaa是Ile或Val；第14位处的Xaa是Arg或Gln；第16位处的Xaa是Tyr或Gln；第17位处的Xaa是Ala或Ser；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu或Ala；第24位处的Xaa是Ile或Leu；第26位处的Xaa是Val或Ser；第27位处的Xaa是Val或Glu；第29位处的Xaa是Ser或Met；第30位处的Xaa是Asn、Asp或Ser；第31位处的Xaa是Phe或Ile；第32位处的Xaa是Lys或Glu；第33位处的Xaa是Val或Ile；第34位处的Xaa是Glu或Lys；第35位处的Xaa是Gly 或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Leu或Phe；第49位处的Xaa是Lys、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Leu或Phe；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu或Gly；第67位处的Xaa是Asp、Thr或Glu；第68位处的Xaa是Ser、Lys或Thr；第69位处的Xaa是Tyr或Ser；第70位处的Xaa是Thr或Lys；第73位处的Xaa是Ser或Ala；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、 Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu或Ala；第78位处的Xaa是Asn或Asp；第79位处的Xaa是Ala或Thr；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly或Lys；第88位处的Xaa是Ser或Glu；第89位处的Xaa是Leu或Ile；第91位处的Xaa是Asp或His；第92位处的Xaa是Gly或Asp；第95位处的Xaa是Leu或Trp；第96位处的Xaa是Val、Leu或Ile；第97位处的Xaa是Phe或Ala；第98位处的Xaa是Glu或Thr；第100位处的Xaa是Tyr或Lys；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser或Ala；第111位处的Xaa是Asp、His或Asn；第112位处的Xaa是Glu或Ser；第113位处的Xaa是Leu或Ser；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val或Ile；第116位处的Xaa是Lys、Thr或Glu；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys或Asp；第119位处的Xaa是Glu或Asn；第120位处的Xaa是Asn或Lys；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Leu或Phe；第131位处的Xaa是Pro或Ser；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、 Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val或Cys；第143位处的Xaa是Val或Ile；第145位处的Xaa是Lys或Val；并且第146位处的Xaa是Ser或Gly；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：256的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：256中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：256的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：256中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：257的氨基酸序列，其中第6位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Met、Val或Ser；第7位处的Xaa是Ala、Met、Val、Leu、Ile或Gly；第8位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；第9位处的Xaa是Glu、Leu、Gly、Asp、Ala、Ile、Val或Met；第10位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第11位处的Xaa是Ser、Val、Thr、Ile、Leu或Met；第12位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第13位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第14位处的Xaa是Arg、Gln、Lys或Asn；第16位处的Xaa是Tyr、Gln、Trp、Phe或Asn；第17位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、 Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；第23位处的Xaa是Thr、Glu、Ala、Ser、Asp或Gly；第24位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Met；第26位处的Xaa是Val、Ser、Ile、Leu、Met或Thr；第27位处的Xaa是Val、Glu、Ile、Leu、Met或Asp；第29位处的Xaa是Ser、Met、Thr、Ile、Leu或Val；第30位处的Xaa是Asn、Asp、Ser、Glu、Gln或Thr；第31位处的Xaa是Phe、Ile、Leu、Val或Met；第32位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；第33位处的Xaa是Val、Ile、Leu或Met；第34位处的Xaa是Glu、Lys、Asp或Arg；第35位处的Xaa是Gly或Asn；第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第48位处的Xaa是Asp、Asn、Glu、Gln、Leu或Phe；第50位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第51位处的Xaa是Lys、Asn、Arg、Gln、Leu或Phe；第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；第55位处的Xaa是Pro、Ser、Thr、Leu或Phe；第56位处的Xaa是Ser、Asp、Thr、Glu或Leu；第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Asn、Ser、Asp、Leu或Phe；第58位处的Xaa是Ile、 Val、Leu、Met或Phe；第60位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu、Met、Arg或Phe；第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Arg、Thr、Asp、Leu或Phe；第65位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；第66位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第67位处的Xaa是Asp、Thr、Glu或Ser；第68位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg；第69位处的Xaa是Tyr、Ser、Trp、Phe或Thr；第70位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第73位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第77位处的Xaa是Glu、Ala、Asp或Gly；第78位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu；第79位处的Xaa是Ala、Thr、Gly或Ser；第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；第86位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；第88位处的Xaa是Ser、Glu、Thr或Asp；第89位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第91位处的Xaa是Asp、His或Glu；第92位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu；第95位处的Xaa是Leu、Trp、Ile、Val、Met、Phe或Tyr；第96位处的Xaa是Val、Leu、Ile或Met；第97位处的Xaa是Phe、Ala或Gly；第98位处的Xaa是Glu、Thr、Asp或Ser；第100位处的Xaa是Tyr、Lys、Trp或Arg；第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；第106位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；第111位处的Xaa是Asp、His、Asn、Glu或Gln；第112位处的Xaa是Glu、Ser、Asp或Thr；第113位处的Xaa是Leu、Ser、Ile、Val、Met或Thr；第114位处的Xaa是Thr或Ser；第115位处的Xaa是Val、Ile、Val或Met；第116位处的Xaa是Lys、Thr、Glu、Arg、Ser或Asp；第117位处的Xaa是Asp或Glu；第118位处的Xaa是Lys、Asp、Arg或Glu；第119位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；第120位处的Xaa是Asn、Lys、Asp或Arg；第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；第122位处的Xaa是Thr、Lys、Ser、Arg、Leu或Phe；第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Met、Phe或Asn；第124位处的Xaa是Ile、 Ser、Asp、Leu、Val、Met、Thr、Glu或Phe；第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；第126位处的Xaa是Lys、Glu、Arg、Asp、Leu或Phe；第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；第129位处的Xaa是Gly、Asn、Ala、Gln、Leu或Phe；第130位处的Xaa是Ser、Ile、Thr、Leu、Val、Met或Phe；第131位处的Xaa是Pro、Ser或Thr；第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；第142位处的Xaa是Val、Cys、Ile、Leu或Met；第143位处的Xaa是Val、Ile；Leu或Met；第145位处的Xaa是Lys、Val、Arg、Ile、Leu或Met；并且第146位处的Xaa是Ser、Gly、Thr或Ala；并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：257的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：257中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：257的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：257中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸置换。
在一些实施例中，示例性AfIP-1A多肽由以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：312、SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：314、SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：320、SEQ IDNO：321、SEQ ID NO：322、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ IDNO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ IDNO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572、SEQ ID NO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ IDNO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583、SEQ ID NO：584、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ IDNO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ IDNO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ IDNO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ IDNO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ IDNO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：781、SEQ ID 785和SEQ ID NO：789示出的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO 316、SEQ ID NO：321、SEQ ID NO；322或SEQ ID NO：789的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，示例性AfIP-1A多肽以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ IDNO：310、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ IDNO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ IDNO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ IDNO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ IDNO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ IDNO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ IDNO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ IDNO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ IDNO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782和SEQ ID NO：784示出。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO；2、SEQ ID NO；305、SEQ ID NO；310或SEQ ID NO：311的氨基酸序列。
在一些实施例中，示例性AfIP-1A多肽是表13、表14、表18、表19、表20、表31、表35、表37和/或表38中所示的多肽以及其氨基酸置换及其缺失和/或插入和片段的任何组合。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽不具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽的计算分子量在约8kD与约18kD之间、约10kD与约18kD之间、约12.kD与约18kD之间、约14kD与约18kD之间、约15kD与约17kD或约15.5kD与约16.5kD之间。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽具有改变的物理性质。如本文所用，术语“物理性质”是指适用于描述蛋白的物理化学特性的任何参数。如本文所用，“所关注的物理性质”和“所关注的性质”可互换使用，是指正研究和/或修饰的蛋白的物理性质。物理性质的例子包括但不限于蛋白表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可电离基团的总数、表面张力、蛋白 大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容和第二维里系数。物理性质的例子还包括但不限于溶解度、折叠性、稳定性和消化性。在一些实施例中，AfIP-1A多肽增强了蛋白水解片段在昆虫肠道中的消化性。由模拟胃液来消化的模型是本领域技术人员已知的(Fuchs，R.L.andJ.D.Astwood.Food Technology 50：83-88，1996(Fuchs，R.L.和J.D.Astwood，《食品技术》，第50卷，第83-88页，1996年)；Astwood，J.D.，et al Nature Biotechnology 14：1269-1273，1996(Astwood，J.D.等人，《自然-生物技术》，第14卷，第1269-1273页，1996年)；Fu TJ et al J.Agric Food Chem.50：7154-7160，2002(Fu TJ等人，《农业与食品化学杂志》，第50卷，第7154-7160页，2002年))。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的氨基酸序列的全长上具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸 序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性和/或杀虫活性。在一些实施例中，杀昆虫多肽在SEQ ID NO：20的氨基酸序列的全长上具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：4的第105-115位氨基酸、SEQ ID NO：258的第105-115位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第105-115位氨基酸，ii)SEQ ID NO：4的第133-144位氨基酸、SEQ ID NO：258的第133-144位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第133-144位氨基酸，iii)SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸、SEQ ID NO：258的第177-184位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第177-184位氨基酸，iv)SEQ IDNO：4的第358-365位氨基酸、SEQ ID NO：258的第358-365位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸，以及v)SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸、SEQ ID NO：258的第511-520位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第511-520位氨基酸。在一些实施例中，所述氨基酸基序可任选地具有基序内的一个或多个氨基酸的缺失、基序内的一个或多个氨基酸的插入、或它们的组合。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含如由SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸表示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO：259的第358-365位处的至少一个氨基酸不与SEQ ID NO：20的第358-365位处的氨基酸相同。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。 在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，序列同一性是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法跨越多肽的整个长度计算的。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列，并且包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：4的第105-115位氨基酸、SEQ ID NO：258的第105-115位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第105-115位氨基酸，ii)SEQ ID NO：4的第133-144位氨基酸、SEQ ID NO：258的第133-144位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第133-144位氨基酸，iii)SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸、SEQ ID NO：258的第177-184位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第177-184位氨基酸，iv)SEQ IDNO：4的第358-365位氨基酸、SEQ ID NO：258的第358-365位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸，以及v)SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸、SEQ ID NO：258的第511-520位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第511-520位氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列， 并且包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：4的第105-115位氨基酸、SEQ ID NO：258的第105-115位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第105-115位氨基酸，ii)SEQ ID NO：4的第133-144位氨基酸、SEQ ID NO：258的第133-144位氨基酸、或SEQ ID NQ：259的第133-144位氨基酸，iii)SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸、SEQ ID NO：258的第177-184位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第177-184位氨基酸，iv)SEQ IDNO：4的第358-365位氨基酸、或SEQ ID NO：258的第358-365位氨基酸、SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸，以及v)SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸、SEQ ID NO：258的第511-520位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第511-520位氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含与以SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788示出的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且包含选自如下的一个或多个氨基酸基序：i)SEQ IDNO：4的第105-115位氨基酸、SEQ ID NO：258的第105-115位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第105-115位氨基酸，ii)SEQ ID NO：4的第133-144位氨基酸、SEQ ID NO：258的第133-144位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第133-144位氨基酸，iii)SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸、SEQ ID NO：258的第177-184位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第177-184位氨基酸，iv)SEQ IDNO：4的第358-365位氨基酸、SEQ ID NO：258的第358-365位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第358-365位氨基酸，以及v)SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸、SEQ ID NO：258的第511-520位氨基酸、或SEQ ID NO：259的第511-520位氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：258的氨基酸序列，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met或Leu；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly或Cys；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、 Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val或Ala；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala或Val；第148位处的Xaa是Ser、Phe或Thr；第152位处的Xaa是Ile或Thr；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys或Phe；第202位处的Xaa是Lys或Asn；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile或Val；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala或Glu；第299位处的Xaa是Glu或Gly；第300位处的Xaa是Ile或Val；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala或Ser；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；第364 位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile或Val；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn或Lys；第377位处的Xaa是Leu或Ile；第384位处的Xaa是Thr或Ala；第385位处的Xaa是Ile或Ser；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr或Phe；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser或Asn；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr或Phe；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr或Phe；第552位处的Xaa是Asn或Ser；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met或Ile；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr或Lys；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr或Phe；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val或Leu；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr或Ala；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln； 第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：258的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：258中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：258的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：258中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：259的氨基酸序列，其中第2位处的Xaa是Asp或Gly；第12位处的Xaa是Met、Leu、Ile或Val；第34位处的Xaa是Ile或Leu；第38位处的Xaa是Ile或Leu；第42位处的Xaa是Glu或Asp；第43位处的Xaa是Ile或Leu；第53位处的Xaa是Tyr或Phe；第55位处的Xaa是Tyr或Phe；第71位处的Xaa是Gly、Cys或Ala；第82位处的Xaa是Val或Met；第86位处的Xaa是Val或Leu；第94位处的Xaa是Tyr或Phe；第97位处的Xaa是Ile或Leu；第101位处的Xaa是Tyr或Phe；第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；第106位处的Xaa是Ile或Leu；第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Asp、Lys或His；第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；第115位处的Xaa是Asp或Glu；第119位处的Xaa是Val、Ala、Ile或 Leu；第134位处的Xaa是Ser或Leu；第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；第144位处的Xaa是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；第148位处的Xaa是Ser、Phe、Thr或Trp；第152位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；第155位处的Xaa是Asp或Glu；第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；第181位处的Xaa是Ile、Val、Met或Leu；第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；第188位处的Xaa是Val或Leu；第196位处的Xaa是Lys或Glu；第197位处的Xaa是Thr或Ser；第201位处的Xaa是Trp、Cys、Tyr或Phe；第202位处的Xaa是Lys、Asn或Arg；第203位处的Xaa是Tyr或Phe；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第214位处的Xaa是Ile或Leu；第220位处的Xaa是Ile或Leu；第224位处的Xaa是Tyr或Phe；第234位处的Xaa是Glu或Asp；第235位处的Xaa是Val或Leu；第270位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第296位处的Xaa是Lys或Glu；第298位处的Xaa是Ala、Glu、Gly或Asp；第299位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；第300位处的Xaa是Ile、Val、Ile或Met；第305位处的Xaa是Asp或Glu；第308位处的Xaa是Lys或Asn；第317位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第335位处的Xaa是Glu或Asp；第343位处的Xaa是Asp或Glu；第352位处的Xaa是Glu或Asp；第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；第367位处的Xaa是Glu或Lys；第368位处的Xaa是Gly或Asp；第370位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第373位处的Xaa是Arg或Ser；第374位处的Xaa是Asn、Lys、Gln或Arg；第377位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；第384位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第385位处的Xaa是Ile、Ser、Leu、Val、Met 或Thr；第388位处的Xaa是Asp或Glu；第393位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第398位处的Xaa是Ala或Val；第414位处的Xaa是Tyr或Phe；第418位处的Xaa是Ile或Leu；第419位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln；第423位处的Xaa是Val或Leu；第425位处的Xaa是Glu或Val；第427位处的Xaa是Ile或Val；第434位处的Xaa是Met或Thr；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第495位处的Xaa是Asp或Glu；第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或Arg；第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；第526位处的Xaa是Val或Leu；第530位处的Xaa是Ile或Leu；第533位处的Xaa是Val或Ala；第536位处的Xaa是Ile或Leu；第538位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第543位处的Xaa是Tyr或Phe；第544位处的Xaa是Lys或Arg；第547位处的Xaa是Tyr或Phe；第550位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第552位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；第558位处的Xaa是Phe或Leu；第600位处的Xaa是Met或Val；第602位处的Xaa是Met、Ile、Leu或Val；第607位处的Xaa是Asp或Gly；第610位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；第612位处的Xaa是Ile或Thr；第613位处的Xaa是Leu或Pro；第615位处的Xaa是Asn或Asp；第619位处的Xaa是Lys或Arg；第625位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；第629位处的Xaa是Lys或Asn；第631位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；第633位处的Xaa是Trp或Phe；第646位处的Xaa是Gln或Arg；第661位处的Xaa是Asn或Ser；第683位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；第700位处的Xaa是Ser或Gly；并且第702位处的Xaa是Phe或Ser；并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：259的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：259中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：259的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：259中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：277的氨基酸序列，其中第8位处的Xaa是Ile或Val；第14位处的Xaa是Ile或Val；第16位处的Xaa是Val或Ile；第30位处的Xaa是Leu或Ile；第43位处的Xaa是Ile或Val；第47位处的Xaa是Met或Ile；第50位处的Xaa是Lys或Arg；第52位处的Xaa是Gln或Asn；第56位处的Xaa是Thr或Ser；第62位处的Xaa是Gly或Ala；第63位处的Xaa是Thr或Ser；第64位处的Xaa是Ile或Leu；第73位处的Xaa是Ser或Thr；第75位处的Xaa是Ile或Val；第76位处的Xaa是Ala或Ser；第81位处的Xaa是Ala或Ser；第83位处的Xaa是Ala或Ser；第99位处的Xaa是Val或Leu；第122位处的Xaa是Val或Ile；第135位处的Xaa是Leu或Val；第139位处的Xaa是Glu或Asp；第158位处的Xaa是Met或Val；第160位处的Xaa是Glu或Asp；第162位处的Xaa是Val或Leu；第164位处的Xaa是Ser或Ala；第166位处的Xaa是Gln或Asn；第171位处的Xaa是Ser或Thr；第173位处的Xaa是Gly或Ala；第176位处的Xaa是Leu或Met；第185位处的Xaa是Met或Ile；第191位处的Xaa是Glu或Asp；第192位处的Xaa是Met或Ile；第208位处的Xaa是Glu或Asp；第210位处的Xaa是Ser或Thr；第216位处的Xaa是Ser或Ala；第217位处的Xaa是Ser或Ala；第220位处的Xaa是Ile或Val；第233位处的Xaa是Ser或Thr；第236位处的Xaa是Glu或Asp；第241位处的Xaa是Ala或Ser；第243位处的Xaa是Ala或Ser；第263位处的Xaa是Ser或Ala；第264位处的Xaa是Phe或Tyr；第265位处的Xaa是Ala或Ser；第268位处的Xaa是Ser或Thr；第270位处的Xaa是Ile或Leu；第288位处的Xaa是Ile或Leu；第292位处的Xaa是Leu或Val；第309位处的Xaa是Lys或Arg； 第313位处的Xaa是Ser或Thr；第317位处的Xaa是Ala或Ser；第318位处的Xaa是Leu或Ile；第323位处的Xaa是Glu或Asp；第332位处的Xaa是Leu或Met；第344位处的Xaa是Lys或Arg；第347位处的Xaa是Ile或Leu；第357位处的Xaa是Val或Leu；第367位处的Xaa是Glu或Asp；第393位处的Xaa是Tyr或Phe；第404位处的Xaa是Ser或Ala；第410位处的Xaa是Met或Leu；第415位处的Xaa是Met或Leu；第417位处的Xaa是Glu或Asp；第442位处的Xaa是Thr或Ser；第449位处的Xaa是Ala或Ser；第454位处的Xaa是Leu或Met；第455位处的Xaa是Asp或Glu；第461位处的Xaa是Ser或Ala；第465位处的Xaa是Val或Ile；第468位处的Xaa是Ser或Ala；第475位处的Xaa是Val或Ile；第481位处的Xaa是Glu或Asp；第486位处的Xaa是Val或Ile；第490位处的Xaa是Phe或Tyr；第496位处的Xaa是Glu或Asp；第520位处的Xaa是Leu或Met；第526位处的Xaa是Ile或Val；第530位处的Xaa是Ile或Val；第536位处的Xaa是Ile或Val；第538位处的Xaa是Tyr或His；第545位处的Xaa是Ala或Ser；第550位处的Xaa是Tyr或Phe；第559位处的Xaa是Ser或Ala；第562位处的Xaa是Ile或Met；第564位处的Xaa是Met或Val；第574位处的Xaa是Ile或Val；第585位处的Xaa是Arg或Lys；第588位处的Xaa是Leu或Ile；第592位处的Xaa是Met或Val；第603位处的Xaa是Lys或Arg；第617位处的Xaa是Ser或Thr；第634位处的Xaa是Arg或Lys；第643位处的Xaa是Ala或Ser；第666位处的Xaa是Thr或Ser；第667位处的Xaa是Leu或Val；第685位处的Xaa是Arg或Lys；第687位处的Xaa是Ile或Met；以及第690位处的Xaa是Thr或Ser。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：277的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：277中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：277的氨基酸序列，与SEQ ID NO：4的相应位置处的天然氨基酸相比，在由SEQ ID NO：277中的Xaa表示的残基处具有任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中在第8位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第12位处氨基酸是Met、Leu、Ile或Val；在第14位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第16位处氨基酸是Val、Ile、Leu或Met；在第30位处氨基酸是Leu、Ile、Val或Met；在第42位处氨基酸是Glu或Asp；在第43位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第47位处氨基酸是Met、Ile、Leu或Val；在第50位处氨基酸是Lys或Arg；在第52位处氨基酸是Gln或Asn；在第56位处氨基酸是Thr或Ser；在第62位处氨基酸是Gly或Ala；在第63位处氨基酸是Thr或Ser；在第64位处氨基酸是Ile、Leu、Val或Met；在第71位处氨基酸是Gly、Cys或Ala；在第73位处氨基酸是Ser或Thr；在第75位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第76位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第81位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第83位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第99位处氨基酸是Val、Leu、Ile或Met；在第115位处氨基酸是Asp或Glu；在第119位处氨基酸是Val、Ala、Ile或Leu；在第122位处氨基酸是Val、Ile、Leu或Met；在第135位处氨基酸是Leu、Val、Ile或Met；在第139位处氨基酸是Glu或Asp；在第144位处氨基酸是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；在第148位处氨基酸是Ser、Phe、Thr或Trp；在第152位处氨基酸是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；在第155位处氨基酸是Asp或Glu；在第158位处氨基酸是Met、Val、Ile或Leu；在第160位处氨基酸是Glu或Asp；在第162位处氨基酸是Val、Leu、Ile或Met；在第164位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第166位处氨基酸是Gln或Asn；在第171位处氨基酸是Ser或Thr；在第173位处氨基酸是Gly或Ala；在第176位处氨基酸是Leu、Met、Ile或Val；在第181位处氨基酸是Ile、Val、Ile或Met；在第185位处氨基酸是Met、Ile、Leu或Val；在第191位处氨基酸是Glu或Asp；在第192位处氨基酸是Met、Ile、Leu或Val；在第197位处氨基酸是Thr或Ser；在第201位处氨基酸 是Trp、Cys或Tyr；在第202位处氨基酸是Lys、Asn或Arg；在第208位处氨基酸是Glu或Asp；在第210位处氨基酸是Ser或Thr；在第216位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第217位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第220位处氨基酸是Ile、Val、Leu、Met、Ile或Val；在第233位处氨基酸是Ser或Thr；在第234位处氨基酸是Glu或Asp；在第236位处氨基酸是Glu或Asp；在第241位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第243位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第263位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第264位处氨基酸是Phe、Tyr或Trp；在第265位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第268位处氨基酸是Ser或Thr；在第270位处氨基酸是Ile、Leu、Val或Met；在第288位处氨基酸是Ile、Leu、Val或Met；在第292位处氨基酸是Leu、Val、Ile或Met；在第298位处氨基酸是Ala、Glu、Gly或Asp；在第299位处氨基酸是Glu、Gly、Asp或Ala；在第300位处氨基酸是Ile、Val、Ile或Met；在第305位处氨基酸是Asp或Glu；在第309位处氨基酸是Lys或Arg；在第313位处氨基酸是Ser或Thr；在第317位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第318位处氨基酸是Leu、Ile、Val或Met；在第323位处氨基酸是Glu或Asp；在第332位处氨基酸是Leu、Met、Ile或Val；在第335位处氨基酸是Glu或Asp；在第344位处氨基酸是Lys或Arg；在第347位处氨基酸是Ile、Leu、Val或Met；在第352位处氨基酸是Glu或Asp；在第357位处氨基酸是Val、Leu、Ile或Met；在第367位处氨基酸是Glu或Asp；在第370位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第374位处氨基酸是Asn、Lys、Gln或Arg；在第377位处氨基酸是Leu、Ile、Val或Met；在第384位处氨基酸是Thr、Ala、Ser或Gly；在第385位处氨基酸是Ile、Ser、Leu、Val、Met或Thr；在第388位处氨基酸是Asp或Glu；在第393位处氨基酸是Tyr或Phe；在第404位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第410位处氨基酸是Met或Leu；在第415位处氨基酸是Met或Leu；在第417位处氨基酸是Glu或Asp；在第419位处氨基酸是Ser、Asn、Thr或Gln；在第442位处氨基酸是Thr或Ser；在第449位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第454位处氨基酸是Leu、Met、Ile或Val；在第455位处氨基酸是Asp或Glu；在第461位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第465位处氨基酸是Val、Ile、Leu或Met；在第468位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly； 在第475位处氨基酸是Val、Ile、Leu或Met；在第481位处氨基酸是Glu或Asp；在第486位处氨基酸是Val、Ile、Leu或Met；在第490位处氨基酸是Phe、Tyr或Trp；在第495位处氨基酸是Asp或Glu；在第496位处氨基酸是Glu或Asp；在第520位处氨基酸是Leu、Met、Ile或Val；在第526位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第530位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第536位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第538位处氨基酸是Tyr或Phe；在第545位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第550位处氨基酸是Tyr或Phe；在第552位处氨基酸是Asn、Ser、Gln或Thr；在第559位处氨基酸是Ser、Ala、Thr或Gly；在第562位处氨基酸是Ile或Met；在第564位处氨基酸是Met、Val、Ile或Leu；在第574位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第585位处氨基酸是Arg或Lys；在第588位处氨基酸是Leu、Ile、Val或Met；在第592位处氨基酸是Met、Val、Ile或Leu；在第602位处氨基酸是Met、Ile、Leu或Val；在第603位处氨基酸是Lys或Arg；在第610位处氨基酸是Thr、Lys、Ser或Arg；在第617位处氨基酸是Ser或Thr；在第619位处氨基酸是Lys或Arg；在第625位处氨基酸是Tyr、Phe或Trp；在第631位处氨基酸是Ile、Val、Leu或Met；在第634位处氨基酸是Arg或Lys；在第643位处氨基酸是Ala、Ser、Gly或Thr；在第666位处氨基酸是Thr或Ser；在第667位处氨基酸是Leu、Val、Ile或Met；在第683位处氨基酸是Thr、Ala、Ser或Gly；在第685位处氨基酸是Arg或Lys；在第687位处氨基酸是Ile或Met；在第690位处氨基酸是Thr或Ser；以及在第696位处氨基酸是Glu或Asp。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：4的第1至70位氨基酸被SEQ ID NO：20的相应位置处的氨基酸置换，如图4中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：20的氨基酸序列比对所示。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：4的第1至35位氨基酸被SEQ ID NO：20的相应位置处的氨基酸置换，如图4中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：20的氨基酸序列比对所示。
在一些实施例中，示例性AfIP-1B多肽由以SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：33或SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO： 77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：391、SEQ ID NO：392、SEQ ID NO：393、SEQ ID NO：394、SEQ ID NO：395、SEQ ID NO：396、SEQ IDNO：397、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：401、SEQ ID NO：402、SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：404、SEQ ID NO：405、SEQ ID NO：406、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：408、SEQ IDNO：409、SEQ ID NO：410、SEQ ID NO：411、SEQ ID NO：412、SEQ ID NO：413、SEQ ID NO：414、SEQ ID NO：415、SEQ ID NO：416、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：419、SEQ IDNO：420、SEQ ID NO：421、SEQ ID NO：422、SEQ ID NO：423、SEQ ID NO：424、SEQ ID NO：425、SEQ ID NO：426、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：430、SEQ IDNO：431、SEQ ID NO：432、SEQ ID NO：433、SEQ ID NO：434、SEQ ID NO：435、SEQ ID NO：436、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：440、SEQ ID NO：441、SEQ IDNO：442、SEQ ID NO：443、SEQ ID NO：444、SEQ ID NO：445、SEQ ID NO：446、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：450、SEQ ID NO：451、SEQ ID NO：452、SEQ IDNO：453、SEQ ID NO：454、SEQ ID NO：455、SEQ ID NO：456、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ IDNO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ IDNO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：779、SEQ ID NO：783、SEQ ID NO：785和SEQ ID NO：790示出的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：392、SEQ ID NO；433、SEQ ID NO：446或SEQ ID NO：790的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：365或SEQ ID NO：446的氨基酸序列。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包括这样的变体，其中作为蛋白水解裂解位点一部分的氨基酸变为另一种氨基酸以消除或改变该位点处的蛋白水解裂解。在一些实施例中，蛋白水解裂解通过昆虫肠道中的蛋白酶进行。在其他实施例中，蛋白水解裂解通过转基因植物中的植物蛋白酶进行。
在一些实施例中，示例性AfIP-1B多肽是表22、表24、表33和/或表39中所示的多肽以及其氨基酸置换及其缺失和/或插入和片段的任何组合。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽不具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽的计算分子量在约65kD与约85kD之间、约67.5kD与约82.5kD之间、约72.5kD与约80kD之间、约75kD与约77.5kD之间或约75.5kD与约76.5kD之间。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽具有改变的物理性质。如本文所用，术语“物理性质”是指适用于描述蛋白的物理化学特性的任何参数。如本文所用，“所关注的物理性质”和“所关注的性质”可互换使用，是指正研究和/或修饰的蛋白的物理性质。物理性质的例子包括但不限于蛋白表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可电离基团的总数、表面张力、蛋白大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容和第二维里系数。物理性质的例子还包括但不限于溶解度、折叠性、稳定性和消化性。在一些实施例中，AfIP-1B多肽增强了蛋白水解片段在昆虫肠道中的消化性。由模拟胃液来消化的模型是本领域技术人员已知的(Fuchs，R.L.andJ.D.Astwood.Food Technology 50：83-88，1996(Fuchs，R.L.和J.D.Astwood，《食品技术》，第50卷，第83-88页，1996年)；Astwood，J.D.，et al Nature Biotechnology 14：1269-1273，1996(Astwood，J.D.等人，《自然-生物技术》，第14卷，第1269-1273页，1996年)；Fu TJet al.J.Agric Food Chem.50：7154-7160，2002(Fu TJ等人，《农业与食品化学杂志》，第50卷，第7154-7160页，2002年))。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽由在严格条件下杂交于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：779、SEQ ID NO：783、SEQ ID NO：787或SEQID NO：790的核酸分子的核酸分子编码。
在一些实施例中，变体包括因诱变而氨基酸序列有差异的多肽。本发明所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性(即杀虫活性)。在某个实施例中，变体将具有天然蛋白的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％或更多的杀昆虫活性。在一些实施例中，变体可具有相比于天然蛋白改善的活性。
细菌基因常常在开放阅读框起点附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致功能蛋白的产生。这些起始密码子可包括ATG密码子。然而，细菌比如芽孢杆菌物种也将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白在第一位氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可在TTG密码子处起始，尽管在此情形下TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不能先验确定这些密码子中的哪些是细菌中天然使用的。因此，应当理解，使用替代甲硫氨酸密码子之一也可导致杀虫蛋白的产生。这些杀虫蛋白涵盖于本发明中并且可应用于本发明的方法中。应当理解，当在植物中表达时，为实现正确翻译，有必要将替代起始密码子更改为ATG。
在另一个方面，AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽可被表达为具有间插序列的前体蛋白，所述间插序列催化多步的翻译后蛋白剪接。蛋白剪接涉及从多肽切除间插序列，同时伴随旁侧序列的连接，从而产生新的多肽(Chong，et al.，(1996)J.Biol.Chem.，271：22159-22168(Chong等人，1996年，《生物化学杂志》，第271卷，第22159-22168页))。该间插序列或蛋白剪接元件称为内含肽，其通过如下三个协调一致的反应在N端和C端剪接连接点处催化其自身的切除：N端半胱氨酸或丝氨酸的酰基重排；两个末端之间的酯交换反应以形成支链酯或硫酯中间体，以及肽键断裂同时伴随内含肽C端天冬酰胺的环化，使内含肽得以释放(Evans，et al.，(2000)J.Biol.Chem.，275：9091-9094(Evans等人，2000年，《生物化学杂志》，第275卷，第9091-9094页)。蛋白剪接机制的阐明产生了多种基于内含肽的应用(Comb等人，美国专利No.5,496,714；Comb等人，美国专利No.5,834,247；Camarero and Muir，(1999)J.Amer.Chem.Soc.121：5597-5598(Camarero和Muir，1999年，《美国化学会志》，第121卷，第5597-5598页)；Chong，et al.，(1997)Gene 192：271-281(Chong等人，1997年，《基因》，第192卷，第271-281页)；Chong，et al.，(1998)Nucleic Acids Res.26：5109-5115(Chong等人，1998年，《核酸研究》，第26卷，第5109-5115页)；Chong，et al.，(1998)J.Biol.Chem.273：10567-10577(Chong等人，1998年，《生物化学杂志》，第273卷，第10567-10577页)；Cotton，et al.，(1999)J.Am.Chem.Soc.121：1100-1101(Cotton等人，1999年，《美国化学会志》，第121卷，第1100-1101页)；Evans，et al.，(1999)J.Biol.Chem.274：18359-18363(Evans等人，1999年，《生物化学杂志》，第274卷，第18359-18363页)；Evans，etal.，(1999)J.Biol.Chem.274：3923-3926(Evans等人，1999年，《生物化学杂志》，第274卷，第3923-3926页)；Evans，et al.，(1998)Protein Sci.7：2256-2264(Evans等人，1998年，《蛋白质科学》，第7卷，第2256-2264页)；Evans，et al.，(2000)J.Biol.Chem.275：9091-9094(Evans等人，2000年，《生物化学杂志》，第275卷，第9091-9094页)；Iwai andPluckthun，(1999)FEBS Lett.459：166-172(Iwai和Pluckthun，1999年，《欧洲生化学会联合会快报》，第459卷，第166-172页)；Mathys，et al.，(1999)Gene 231：1-13(Mathys等人，1999年，《基因》，第231卷，第1-13页)；Mills，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3543-3548(Mills等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第3543-3548页)；Muir，etal.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6705-6710(Muir等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第6705-6710页)；Otomo，et al.，(1999)Biochemistry38：16040-16044(Otomo等人，1999年，《生物化学》，第38卷，第16040-16044页)；Otomo，et al.，(1999)J.Biolmol.NMR 14：105-114(Otomo等人，1999年，《生物分子核磁共振杂志》，第14卷，第105-114页)；Scott，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：13638-13643(Scott等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第13638-13643页)；Severinov and Muir，(1998)J.Biol.Chem.273：16205-16209(Severinov和Muir，1998年，《生物化学杂志》，第273卷，第16205-16209页)；Shingledecker，et al.，(1998)Gene 207：187-195(Shingledecker等人，1998年，《基因》，第207卷，第187-195页)；Southworth，et al.，(1998)EMBO J.17：918-926(Southworth等人，1998年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第17卷，第918-926页)；Southworth，et al.，(1999)Biotechniques27：110-120(Southworth等人，1999年，《生物技术》，第27卷，第110- 120页)；Wood，et al.，(1999)Nat.Biotechnol.17：889-892(Wood等人，1999年，《自然-生物技术》，第17卷，第889-892页)；Wu，et al.，(1998a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9226-9231(Wu等人，1998a，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第9226-9231页)；Wu，et al.，(1998b)Biochim Biophys Acta 1387：422-432(Wu等人，1998b，《生物化学与生物物理学报》，第1387卷，第422-432页)；Xu，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：388-393(Xu等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第388-393页)；Yamazaki，et al.，(1998)J.Am.Chem.Soc.，120：5591-5592(Yamazaki等人，1998年，《美国化学会志》，第120卷，第5591-5592页))。有关内含肽在植物转基因中的应用，参见Yang，et al.，(Transgene Res 15：583-593(2006))(Yang等人，《转基因研究》，第15卷，第583-593页，2006年))和Evans，et al.，(Annu.Rev.Plant Biol.56：375-392(2005))(Evans等人，《植物生物学年评》，第56卷，第375-392页，2005年))。
在另一个方面，AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽可由两个单独的基因编码，其中前体蛋白的内含肽来自这两个基因，称为断裂型内含肽，并且前体的这两个部分通过肽键形成而连接在一起。该肽键形成通过内含肽介导的反式剪接而实现。为此，包含这两个单独基因的第一和第二表达盒还编码能够介导蛋白反式剪接的内含肽。通过反式剪接，由第一和第二片段编码的蛋白和多肽可通过肽键形成而连接在一起。反式剪接内含肽可选自包括真核生物、古细菌和真细菌的不同生物体的核仁和细胞器基因组。可使用的内含肽在neb.com/neb/inteins.html(可使用“www”前缀在万维网上访问)处列出。编码内含肽的核苷酸序列可分裂成分别编码内含肽5′和3′部分的5′和3′部分。内含肽剪接不需要的序列部分(例如，归巢核酸内切酶域)可以缺失。内含肽编码序列断裂以使得5′和3′部分能够反式剪接。为了选择内含肽编码序列的合适断裂位点，可遵循Southworth，et al.，(1998)EMBO J.17：918-926(Southworth等人，1998年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第17卷，第918-926页)公布的考虑因素。在构建第一和第二表达盒中，将5′内含肽编码序列连接至编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的N端部分的第一片段的3′端，并且将3′内含肽编码序列连接至编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的C端部分的第二片段的5′端。
一般来讲，可使用任何断裂型内含肽(包括任何天然存在的或人工断裂的断裂型内含肽)来设计反式剪接伴侣。若干天然存在的断裂型内含肽是已知的，例如：集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803的DnaE基因的断裂型内含肽(参见Wu，et al.，(1998)ProcNatl Acad Sci USA.95(16)：9226-31(Wu等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第16期，第9226-9231页)和Evans，et al.，(2000)J Biol Chem.275(13)：9091-4(Evans等人，2000年，《生物化学杂志》，第275卷，第13期，第9091-9094页))和来自点形念珠藻(Nostocpunctiforme)的DnaE基因的断裂型内含肽(参见Iwai，et al.，(2006)FEBS Lett.580(7)：1853-8(Iwai等人，2006年，《欧洲生化学会联合会快报》，第580卷，第7期，第1853-1858页))。已在实验室中将非断裂型内含肽人工断裂而形成新的断裂型内含肽，例如：人工断裂型Ssp DnaB内含肽(参见，Wu，et al.，(1998)Biochim Biophys Acta.1387：422-32(Wu等人，1998年，《生物化学与生物物理学报》，第1387卷，第422-432页))和断裂型Sce VMA内含肽(参见，Brenzel，et al.，(2006)Biochemistry.45(6)：1571-8(Brenzel等人，2006年，《生物化学》，第45卷，第6期，第1571-1578页))以及人工断裂型真菌微型内含肽(参见，Elleuche，et al.，(2007)Biochem Biophys Res Commun.355(3)：830-4(Elleuche等人，2007年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第355卷，第3期，第830-834页))。还有可供使用的收录已知内含肽的内含肽数据库(参见，例如可在如下找到的在线数据库：bioinformatics.weizmann.ac.il/～pietro/inteins/Inteinstable.html(可使用“www”前缀在万维网上访问))。
天然存在的非断裂型内含肽可具有核酸内切酶或其他酶活性，这些酶活性通常可在设计人工断裂的断裂型内含肽时被移除。此类微型内含肽或最小化的断裂型内含肽是本领域熟知的，并且长度通常少于200个氨基酸残基(参见，Wu，et al.，(1998)BiochimBiophys Acta.1387：422-32(Wu等人，1998年，《生物化学与生物物理学报》，第1387卷，第422-432页))。合适的断裂型内含肽可具有添加至其结构上的其他实现纯化的多肽元件，前提条件是此类元件不会抑制断裂型内含肽的剪接或者以允许其在剪接之前被移除的方式添加。已报道了使用包含如下域的蛋白进行的蛋白剪接：细菌内含肽样(BIL)域(参见，Amitai，et al.，(2003)Mol Microbiol. 47：61-73(Amitai等人，2003年，《分子微生物学》，第47卷，第61-73页))和刺猬蛋白(Hog)自动加工域(后者与内含肽组合，此时称为Hog/内含肽超家族或HINT家族(参见，Dassa，et al.，(2004)J Biol Chem.279：32001-7(Dassa等人，2004年，《生物化学杂志》，第279卷，第32001-32007页))，并且诸如这些的域也可用来制备人工断裂型内含肽。具体地讲，可通过分子生物学方法修饰此类家族的非剪接成员以在此类相关物质中引入或恢复剪接活性。最近的研究表明，当使N端断裂型内含肽组分与自然界中并非作为其“伴侣”存在的C端断裂型内含肽组分反应时，可观察到剪接。例如，采用与“天然”剪接伴侣具有少至30％至50％同源性的伴侣时，观察到了剪接(参见，Dassa，et al.，(2007)Biochemistry.46(1)：322-30(Dassa等人，2007年，《生物化学》，第46卷，第1期，第322-330页))。已表明，相异的断裂型内含肽伴侣的其他此类混合物彼此无反应(参见，Brenzel，et al.，(2006)Biochemistry.45(6)：1571-8(Brenzel等人，2006年，《生物化学》，第45卷，第6期，第1571-1578页))。然而，在相关领域技术人员能力范围内的是，使用常规方法且不必运用独创性技术就可确定具体的一对多肽是否能够彼此相连而提供功能性内含肽。
在另一个方面，AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽是环状排列的变体。在某些实施例中，AfIP-1A多肽是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782、SEQ ID NO：784、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ IDNO：309、SEQ ID NO：310、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ IDNO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO： 516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ IDNO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ IDNO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ IDNO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ IDNO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ IDNO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：648、SEQ IDNO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ IDNO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782和SEQ ID NO：786的多肽的环状排列的变体。
在某些实施例中，AfIP-1B多肽是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ IDNO：332、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ IDNO：343、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO： 349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：352、SEQ ID NO：353、SEQ IDNO：354、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：360、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：364、SEQ IDNO：365、SEQ ID NO：366、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：370、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQ IDNO：376、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ IDNO：387、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ IDNO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ IDNO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707和SEQ ID NO：708的多肽的环状排列的变体。
重组DNA方法的开发使得可以研究序列转座对蛋白折叠、结构和功能的影响。用于形成新序列的方法类似于天然存在的蛋白对的与其氨基酸序列的线性重构相关的方法(Cunningham，et al.，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：3218-3222(Cunningham等人，1979年，《美国国家科学院院刊》，第76卷，第3218-3222页)；Teather and Erfle，(1990)J.Bacteriol.172：3837-3841(Teather和Erfle，1990年，《细菌学杂志》，第172卷，第3837-3841页)；Schimming，et al.，(1992)Eur.J.Biochem.204：13-19(Schimming等人，1992年，《欧洲生物化学杂志》，第204卷，第13-19页)；Yamiuchi and Minamikawa，(1991)FEBSLett.260：127-130(Yamiuchi和Minamikawa，1991年，《欧洲生化学会联合会快报》，第260卷，第127-130页)；MacGregor，et al.，(1996)FEBS Lett.378：263-266(MacGregor等人，1996年，《欧洲生化学会联合会快报》，第378卷，第263-266页))。该类型重排首次体外应用于蛋白由Goldenberg and Creighton(J.Mol.Biol.165：407-413，1983(Goldenberg和Creighton，《分子生物学杂 志》，第165卷，第407-413页，1983年))描述。在形成环状排列的变体中，在初始序列的内部位点(断点)处选择新的N端，从该断点开始，该新序列具有与初始序列相同顺序的氨基酸，直到其到达处于或接近初始C端的氨基酸。此时，该新序列直接地或通过序列的另外部分(连接基)连接至处于或接近初始N端的氨基酸，并且该新序列继续采用与初始序列相同的序列，直到其到达处于或接近初始序列断点位点N端的氨基酸的点，该残基形成该链的新C端。连接基的氨基酸序列长度可根据经验选择或在结构信息指导下选择或通过使用这两种方法的组合选择。当没有可供使用的结构信息时，可使用如下设计来制备小系列的连接基以用于测试，该设计的长度是变化的以跨越0至的范围并且该设计的序列被选择为符合表面暴露(亲水性，Hopp and Woods，(1983)Mol.Immunol.20：483-489(Hopp和Woods，1983年，《分子免疫学》，第20卷，第483-489页)；Kyte andDoolittle，(1982)J.Mol.Biol.157：105-132(Kyte和Doolittle，1982年，《分子生物学》，第157卷，第105-132页)；溶剂暴露表面区，Lee and Richards，(1971)J.Mol.Biol.55：379-400(Lee和Richards，1971年，《分子生物学》，第55卷，第379-400页))和采取所需构象而不扰乱杀虫多肽的构型的能力(构象柔性；Karplus and Schulz，(1985)Naturwissenschaften72：212-213(Karplus和Schulz，1985年，《自然科学》，第72卷，第212-213页))。假定每个残基平均平移2.0至 这意味着要测试的长度将在0至30个残基之间，其中0至15个残基是优选的范围。此类经验系列的示例将是使用盒序列比如重复n次(其中n为1、2、3或4)的Gly-Gly-Gly-Ser来构建连接基。本领域技术人员将认识到，存在长度或组成有所差别且可用作连接基的许多此类序列，首要考虑因素是它们既不能过长也不能太短(参阅Sandhu，(1992)Critical Rev.Biotech.12：437-462(Sandhu，1992年，《生物技术评论》，第12卷，第437-462页))；如果它们太长，熵效应可能会破坏三维折叠的稳定性，并且也可能使折叠在动力学上不切实际，并且如果它们太短，它们可能会因为扭转或空间应变而破坏分子的稳定性。蛋白结构信息分析方面的技术人员将认识到，使用链末端之间的距离(限定为c-α碳之间的距离)可用来限定要使用的序列的长度，或至少用来限制必须在连接基的经验选择中测试的可能性数量。他们还将认识到，有时情况是这样的：多肽链的末端的位 置在源自X射线衍射或核磁共振波谱数据的结构模型中不明确，并且当事实如此时，该情况将因此需要加以考虑以便正确估计所需连接基的长度。从位置明确的那些残基中选择序列中邻近链末端的两个残基，并且使用其c-α碳之间的距离计算它们之间的连接基的近似长度。然后使用计算的长度作为指导，选择具有一定范围残基数量(使用每个残基2至来计算)的连接基。这些连接基可由初始序列组成，可视需要缩短或延长，并且当延长时，可如上所述将另外的残基选择为柔性和亲水的；或任选地可使用一系列连接基替代初始序列，一个例子是上述的Gly-Gly-Gly-Ser盒方法；或任选地可使用初始序列和具有适当总长度的新序列的组合。能够折叠成生物活性状态的杀虫多肽的序列可在使用如上所述的连接基序列的同时，通过从初始多肽链内适当选择开始(氨基端)和结束(羧基端)位置来制备。使用下述指南从序列的共同链段(称为断点区)内选择氨基端和羧基端。因此，通过从相同断点区内选择氨基端和羧基端，产生了新型氨基酸序列。在许多情况下，新末端的选择将使得羧基端的初始位置紧跟在氨基端的初始位置之前。然而，本领域技术人员将认识到，在该区域内任何位置处选择末端都可起作用，并且这些将有效地引起新序列的氨基或羧基部分的缺失或添加。分子生物学的核心原则是，蛋白的一级氨基酸序列决定了折叠成表达其生物功能所需的三维结构。使用单一蛋白晶体的X射线衍射或蛋白溶液的核磁共振波谱获得并解读三维结构信息的方法是本领域技术人员已知的。与断点区识别相关的结构信息的例子包括蛋白二级结构的定位和类型(α螺旋和3-10螺旋、平行和反平行β折叠、链反转和转角以及环；Kabsch and Sander，(1983)Biopolymers 22：2577-2637(Kabsch和Sander，1983年，《生物聚合物》，第22卷，第2577-2637页)；氨基酸残基的溶剂暴露程度、残基彼此相互作用的程度和类型(Chothia，(1984)Ann.Rev.Biochem.53：537-572(Chothia，1984年，《生物化学年评》，第53卷，第537-572页))以及沿着多肽链的构象静态和动态分布(Alber andMathews，(1987)Methods Enzymol.154：511-533(Alber和Mathews，1987年，《酶学方法》，第154卷，第511-533页))。在一些情况下，已知关于残基溶剂暴露的另外信息；一个例子是有必要位于蛋白表面上的糖类的翻译后连接位点。当实验结构信息不可用或不可能获得时，也可利用多种方法分析一级氨基酸序列以预测蛋白三级和二级结构、溶剂可及性 以及转角和环的出现。当直接结构方法不可行时，生物化学方法有时也可适用于经验地确定表面暴露。例如，在限制性蛋白水解后利用断链位点的辨识以推断表面暴露(Gentile andSalvatore，(1993)Eur.J.Biochem.218：603-621(Gentile和Salvatore，1993年，《欧洲生物化学杂志》，第218卷，第603-621页))。因此，使用实验得出的结构信息或预测方法(例如，Srinivisan and Rose，(1995)Proteins：Struct.，Funct.&Genetics 22：81-99(Srinivisan和Rose，1995年，《蛋白质：结构、功能和遗传学》，第22卷，第81-99页))检查亲本氨基酸序列以根据它们对于二级和三级结构的维持是否不可或缺而将区域分类。在已知涉及周期性二级结构(α螺旋和3-10螺旋、平行和反平行β折叠)的区域内出现的序列是应当避开的区域。类似地，观察或预测到具有较低程度溶剂暴露的氨基酸序列的区域更可能是蛋白的所谓疏水核的部分，在选择氨基端和羧基端时也应当避开。相比之下，已知或经预测在表面转角或环中的那些区域，特别是已知并非生物活性所需的那些区域，是多肽链末端定位的优选位点。基于上述标准所优选的氨基酸序列的连续链段被称为断点区。可基本上按照如下文献中所述的方法制备编码环状排列的AfIP-1A或AfIP-1B多肽的多核苷酸，所述AfIP-1A或AfIP-1B多肽具有包含将初始C端和N端分隔开的接头区的新N端/C端：Mullins，et al.，(1994)J.Am.Chem.Soc.116：5529-5533(Mullins等人，1994年，《美国化学会志》，第116卷，第5529-5533页)。使用聚合酶链反应(PCR)扩增的多个步骤来重排编码蛋白一级氨基酸序列的DNA序列。可基于如下文献中所述的串联重复方法制备编码环状排列的AfIP-1A或AfIP-1B多肽的多核苷酸，所述AfIP-1A或AfIP-1B多肽具有包含将初始C端和N端分隔开的接头区的新N端/C端：Horlick，et al.，(1992)Protein Eng.5：427-431(Horlick等人，1992年，《蛋白质工程》，第5卷，第427-431页)。使用串联重复的模板DNA进行新N端/C端基因的聚合酶链反应(PCR)扩增。
在另一个方面，提供了融合蛋白，所述融合蛋白在其氨基酸序列内包含构成AfIP-1A多肽的氨基酸序列，所述AfIP-1A多肽包括但不限于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：302、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ IDNO：310、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ IDNO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ IDNO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ IDNO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ IDNO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ IDNO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ IDNO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ IDNO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ IDNO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782、SEQ ID NO：784的多肽及其活性片段。
在另一个方面，提供了融合蛋白，所述融合蛋白在其氨基酸序列内包含构成AfIP-1B多肽的氨基酸序列，所述AfIP-1B多肽包括但不限于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784或SEQ ID NO：788、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ IDNO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：336、SEQ IDNO：337、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：347、SEQ IDNO：348、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：352、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：354、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：358、SEQ IDNO：359、SEQ ID NO：360、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：364、SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：366、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：369、SEQ IDNO：370、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：372、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：374、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：376、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：380、SEQ IDNO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：687、SEQ IDNO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ IDNO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707和SEQ ID NO：708的多肽及其活性片段。
用于设计和构建融合蛋白(和对其编码的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的。编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的多核苷酸可融合到信 号序列，所述信号序列将引导AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽定位于原核或真核细胞的特定区室和/或引导所述实施例的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽从原核或真核细胞分泌。例如，在大肠杆菌中，可能希望引导蛋白表达于细胞周质间隙。AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽可融合到其上以引导多肽表达于细菌细胞周质间隙的信号序列或蛋白(或其片段)的例子包括但不限于pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基的信号序列以及碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将引导蛋白的定位的融合蛋白的若干载体可商购获得，比如可购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的pMAL系列载体(特别是pMAL-p系列)。在特定实施例中，AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽可融合到pelB果胶酸裂解酶信号序列以增加此类多肽在革兰氏阴性细菌中表达和纯化的效率(参见，美国专利No.5,576,195和No.5,846,818)。植物质体转运肽/多肽融合体是本领域熟知的(参见，美国专利No.7,193,133)。质外体转运肽比如水稻或大麦α-淀粉酶分泌信号也是本领域熟知的。质体转运肽通常N端融合到要靶向的多肽(例如，融合伴侣)。在一个实施例中，融合蛋白基本上由质体转运肽和要靶向的AfIP-1A或AfIP-1B多肽组成。在另一个实施例中，融合蛋白包含质体转运肽和要靶向的多肽。在此类实施例中，质体转运肽优选地位于融合蛋白的N端。然而，另外的氨基酸残基可为质体转运肽的N端，前提条件是融合蛋白至少部分地靶向质体。在特定实施例中，质体转运肽处于融合蛋白的N端一半处、N端三分之一处或N端四分之一处。大多数或所有质体转运肽通常在插入质体后从融合蛋白裂解。由于特定的细胞间状况或所使用的转运肽/融合伴侣的具体组合，裂解的位置在植物物种之间、在不同植物发育期可略有差别。在一个实施例中，质体转运肽裂解是同源的，使得裂解位点在融合蛋白群中是相同的。在另一个实施例中，质体转运肽是非同源的，使得裂解位点在融合蛋白群中相差1-10个氨基酸。质体转运肽可以若干方法之一重组地融合到第二蛋白。例如，可将限制性内切核酸酶识别位点引入转运肽的核苷酸序列中对应于其C末端的位置处，并且可将该位点或相容位点设计在要靶向的蛋白的核苷酸序列中其N末端处。必须小心设计这些位点以确保转运肽和第二蛋白的编码序列保持处于“框内”，从而允许所需融合蛋白的合成。在一些情况下，当引入新限制位点时，可能优选的是将第二蛋白的起始子 甲硫氨酸密码子移除。两个亲本分子上限制性内切核酸酶识别位点的引入及其后续通过重组DNA技术进行的连接可导致转运肽与第二蛋白之间添加一个或多个额外的氨基酸。只要转运肽裂解位点保持可触及并且第二蛋白的功能不会受到在其N端处这些额外氨基酸的添加的影响，这通常不会影响靶向活性。或者，本领域技术人员可使用基因合成(Stemmer，et al.，(1995)Gene 164：49-53(Stemmer等人，1995年，《基因》，第164卷，第49-53页))或类似方法在转运肽与第二蛋白(具有或不具有其起始子甲硫氨酸)之间形成精确裂解位点。此外，转运肽融合体可有意识地包含裂解位点下游的氨基酸。成熟蛋白N端的氨基酸可影响转运肽将蛋白靶向质体的能力和/或蛋白输入后裂解的效率。这可取决于要靶向的蛋白。参见例如Comai，et al.，(1988)J.Biol.Chem.263(29)：15104-9(Comai等人，1988年，《生物化学杂志》，第263卷，第29期，第15104-15109页))。
在一些实施例中，提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含通过氨基酸连接基连接在一起的AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽。
在一些实施例中，提供了由选自如下的通式表示的融合蛋白：
R1-L-R2、R2-L-R1、R1-R2或R2-R1
其中R1是AfIP-1A多肽或SEQ ID NO：18的多肽，R2是AfIP-1B多肽或SEQ ID NO：20的多肽。R1多肽直接地或通过接头(L)区段融合到R2多肽。术语“直接地”限定了多肽在无连接肽的情况下进行连接的融合。因此，“L”表示R1和R2两者均框内融合到其上的化学键或多肽区段，最常见的是，L为R1和R2通过酰胺键结合到其上的线性肽，所述酰胺键将R1的羧基端连接到L的氨基端并将L的羧基端连接到R2的氨基端。所谓“框内融合”意指R1与R2的阅读框之间没有翻译终止或中断。连接基团(L)通常为长度介于1与500个氨基酸之间的多肽。连接两个分子的连接基优选地被设计为(1)允许这两个分子独立于彼此折叠和发挥作用，(2)没有倾向形成可干扰这两个蛋白的功能域的有序二级结构，(3)具有极少可与功能蛋白域相互作用的疏水或带电特性，以及(4)提供R1与R2的位阻分离，使得R1和R2可同时与其在单个细胞上的相应受体相互作用。通常，柔性蛋白区中的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。事实上，包含Gly、Asn和Ser的氨基 酸序列的任何排列预计都将满足连接基序列的以上标准。其他中性氨基酸比如Thr和Ala也可在连接基序列中使用。为了在连接基序列中添加独特的限制性位点以有利于构建融合体，另外的氨基酸也可包含在连接基中。
在一些实施例中，连接基包含选自下式的序列：(Gly3Ser)n、(Gly4Ser)n、(Gly5Ser)n、(GlynSer)n或(AlaGlySer)n，其中n为整数。高度柔性的接头的一个例子是存在于丝状噬菌体例如噬菌体M13或fd的pIII蛋白内的富含(GlySer)的间隔区(Schaller等人，1975年)。该区域提供了pIII表面蛋白两个域之间较长的柔性间隔区。还包括其中包含内切肽酶识别序列的连接基。对于分离融合体的各个组分以确定它们在体外是否正确折叠并具有活性而言，此类裂解位点可能是有价值的。各种内切肽酶的例子包括但不限于纤溶酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活物、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、圆斑蝰蛇毒蛋白酶、脯氨酸后裂解酶、V8蛋白酶、凝血酶和因子Xa。在一些实施例中，连接基包含来自多基因表达载体(MGEV)的氨基酸EEKKN(SEQ ID NO：153)，该载体由如美国专利申请公布No.US 2007/0277263中所公开的液泡蛋白酶裂解。在其他实施例中，来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区的连接肽区段提供所连接的多肽之间的角度关系。尤其有用的是半胱氨酸被替换为丝氨酸的那些铰链区。本发明的连接基包含源自半胱氨酸已更换为丝氨酸的鼠IgGγ2b铰链区的序列。融合蛋白不受到所采用的连接基序列的形态、大小或数量的限制，并且连接基的唯一要求是在功能上其不会不利地干扰融合体的各个分子的折叠和功能。
在另一个方面，提供了嵌合多肽，所述嵌合多肽通过连接最初编码来自不同物种的单独杀昆虫蛋白的基因的两个或更多个部分形成嵌合基因来产生。嵌合基因的翻译得到了具有源自每个初始多肽的区域、基序或域的单个嵌合杀虫多肽。在某些实施例中，嵌合蛋白包含任何组合的AfIP-1A多肽和FGTW-51(SEQ ID NO：18)的部分、基序或域。在某些实施例中，嵌合蛋白包含任何组合的AfIP-1B多肽和FGTW-52(SEQ ID NO：20)的部分、基序或域。在某些实施例中，嵌合蛋白包含任何组合的SEQ ID NO：2的AfIP-1A多肽和FGTW-51(SEQ IDNO：18)的部分、基序或域。在某些实施例中，嵌合蛋白包含任何组合的SEQ ID NO：4的AfIP-1B多肽和FGTW-52(SEQ ID NO：20)的部分、基序或域。
公认的是，可通过各种方法改变DNA序列，并且这些改变可导致DNA序列编码的蛋白具有与野生型(或天然)杀虫蛋白所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施例中，AfIP-1A多肽可以各种方式进行改变，所述方式包括一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和插入，包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQID NO：778、SEQ ID NO：782、SEQ ID NO：786、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256或SEQ ID NO：257相比，最多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、约55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145个或更多个氨基酸置换、缺失和/或插入或其组合。在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：782、SEQ ID NO：786、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256或SEQ ID NO：257(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：149)的氨基酸位置从AfIP-1A多肽N端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸的缺失。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽可以各种方式进行改变，所述方式包括一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和插入，包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784、SEQ ID NO：788、SEQ ID NO：258或SEQID NO：259相比，最多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、约55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145个或更多个氨基酸置换、缺失和/或插入或其组合。在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：780、SEQ ID NO：784、SEQ ID NO：788、SEQ IDNO：258或SEQ ID NO：259的氨基酸位置从AfIP-1B多肽的C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或更多个氨基酸的缺失。
这类操纵的方法是本领域公知的。例如，AfIP-1A或AfIP-1B多肽的氨基酸序列变体可通过在DNA中突变来制备。这也可通过若干形式之一的诱变和/或在定向进化中完成。在一些方面，氨基酸序列中编码的变化基本上 不会影响蛋白的功能。这种变体将具有所需的杀虫活性。然而，应当理解，可通过对本发明组合物使用此类技术，使AfIP-1A和AfIP-1B多肽赋予杀虫活性的能力提高。
例如，可在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可从AfIP-1A或AfIP-1B多肽的野生型序列改变而不改变生物活性的残基。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基的氨基酸置换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；极性、带负电的残基及其酰胺(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；较小脂族、非极性或弱极性的残基(例如，丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；较大脂族、非极性的侧链(例如，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸)；β-支化的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；较大芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。
氨基酸置换可在保留功能的非保守区中进行。一般来讲，此类置换不会对保守氨基酸残基或对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白活性必需的。保守的且可能是蛋白活性必需的残基的例子包括例如在相似或相关毒素与所述实施例的序列的比对中所含的所有蛋白之间相同的残基(例如，在同源蛋白的比对中相同的残基)。保守的但可允许保守氨基酸置换且仍然保留活性的残基的例子包括例如在相似或相关毒素与所述实施例的序列的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守置换的残基(例如，在同源蛋白的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守置换的残基)。然而，本领域技术人员应当理解，功能性变体在保守残基中可具有较少保守或非保守的改变。有关不会影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到：Dayhoff，etal.，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington， D.C.(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)的模型，将该文献以引用方式并入本文。
在进行此类改变时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在为蛋白赋予相互作用的生物功能方面的重要性是本领域中普遍理解的(Kyte and Doolittle，(1982)J Mol Biol.157(1)：105-32(Kyte和Doolittle，1982年，《分子生物学》，第157卷，第1期，第105-132页))。公认的是，氨基酸的相对亲水性特征促成了所得蛋白的二级结构，这继而限定了蛋白与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。
本领域已知的是，某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或评分的其他氨基酸置换，并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白，即仍然获得生物功能方面等效的蛋白。基于其疏水性和带电特性为每个氨基酸指定了亲水性指数(Kyte和Doolittle，同前)。这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行此类改变时，亲水性指数在+2内的氨基酸的置换是优选的，亲水性指数在+1内的那些是尤其优选的，并且亲水性指数在+0.5内的那些甚至更是尤其优选的。
本领域中还应当理解，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利No.4,554,101陈述了蛋白的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性决定)与蛋白的生物性质相关联。
如美国专利No.4,554,101中详述，已为氨基酸残基指定下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+0.1)；谷氨酸(+3.0.+0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
或者，可对许多蛋白的蛋白序列在氨基端或羧基端进行改变，而基本上不影响活性。这可包括通过现代分子方法引入的插入、缺失或改变，所 述现代分子方法比如PCR，包括通过使PCR扩增中采用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白编码序列的PCR扩增。或者，所添加的蛋白序列可包括全部蛋白编码序列，比如本领域通常用于产生蛋白融合体的那些。此类融合蛋白通常用于(1)增加所关注蛋白的表达，(2)引入结合域、酶活性或表位以有利于蛋白纯化、蛋白检测或本领域已知的其他实验用途，(3)使蛋白的分泌或翻译靶向亚细胞细胞器，比如革兰氏阴性细菌的细胞周质间隙、植物的线粒体或叶绿体或者真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白的糖基化。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：2的天然氨基酸相比，在选自SEQ ID NO：2的第6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、48、50、51、54、55、56、57、58、60、62、66、65、66、67、68、69、70、73、74、76、77、78、79、82、86、88、89、91、92、95、96、97、98、100、101、104、105、106、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、122、12、124、126、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、145和146位的一个或多个残基处具有氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：2的天然氨基酸相比，在选自SEQ ID NO：2的第6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、19、20、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、50、51、54、55、56、57、58、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、73、74、76、77、78、79、82、86、88、89、91、92、95、96、97、98、100、101、104、105、106、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、122、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、145和146位的1至29个残基处具有一个或多个氨基酸置换。
在一些实施例中，AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：4的天然氨基酸相比，在选自SEQ ID NO：4的第2、12、42、71、82、115、119、139、144、148、152、155、181、197、201、 202、208、234、270、298、299、300、305、308、317、323、335、343、352、370、374、377、384、385、388、393、419、481、495、538、550、552、602、610、619、625、629、631、683和696位的一个或多个残基处具有一个或多个氨基酸置换。
在具体的实施例中，置换表现为丙氨酸在所列举的位置处置换天然氨基酸。还涵盖的是编码变体蛋白或多肽的核酸序列。
本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖源自诱变和引起重组的程序(比如DNA改组)的序列。采用此类程序时，一个或多个不同AfIP-1A或AfIP-1B多肽编码区可用于形成具有所需性质的新AfIP-1A或AfIP-1B多肽。这样，从一组相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，该相关的序列多核苷酸包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内发生同源重组的序列区。例如，使用该方法，可将编码所关注结构域的序列基序在杀虫基因和其他已知的杀虫基因之间进行改组，以获得编码具有改进的所关注性质(比如提高的杀昆虫活性)的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer，(1994)Nature 370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)；以及美国专利No.5,605,793和5,837,458。
结构域交换或改组是用于产生改变的AfIP-1A或AfIP-1B多肽的另一种机制。结构域可在AfIP-1A或AfIP-1B多肽之间进行交换，从而产生具有提高的杀虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒素。用于产生重组蛋白并测试其杀虫活性的方法是本领域熟知的(参见，例如Naimov，et al.，(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330(Naimov等人，2001年，《应用与环境微 生物学》，第67卷，第5328-5330页)；de Maagd，et al.，(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543(de Maagd等人，1996年，《应用与环境微生物学》，第62卷，第1537-1543页)；Ge，et al.，(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958(Ge等人，1991年，《生物化学杂志》，第266卷，第17954-17958页)；Schnepf，et al.，(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930(Schnepf等人，1990年，《生物化学杂志》，第265卷，第20923-20930页)；Rang，et al.，91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925(Rang等人，1999年，《应用与环境微生物学》，第65卷，第2918-2925页)。
DNA改组和定点诱变两者均用于限定具有杀虫活性的多肽序列。在实例8和11中，DNA改组用于通过分别存在于AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)中的多样性的重组来产生活性变体的文库。本领域技术人员将能够使用与其他蛋白或功能测定法的比较来进一步限定基序。可使用高通量筛选来测试这些基序的变异以确定具体残基的作用。若已知若干基序，则可以限定功能蛋白的要求。对基序的了解允许技术人员设计不会影响功能的序列变异。
AfIP-1A同源物与AfIP-1B同源物的同源物比对(分别为图1和图3，和图2)允许对该家族的天然同源物间高度保守的残基进行识别(图1)。在实例9和12中，使用饱和诱变在保守残基处基序中的所选氨基酸位置处进行置换，并测试这些置换。测试了这些突变体的活性，并且识别出了同源物间不存在的多种活性置换，从而提供了对这些残基处的功能限制的理解。
组合物
还涵盖包含AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含AfIP-1A多肽。在一些实施例中，所述组合物包含AfIP-1B多肽。在一些实施例中，所述组合物包含AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽。在一些实施例中，所述组合物包含AfIP-1A/AfIP-1B融合蛋白。
抗体
还涵盖对于所述实施例的AfIP-1A或AfIP-1B多肽或对于其变体或片段的抗体。本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体以及它们的片断，所述片断保留了其与存在于昆虫肠道中的AfIP-1A或AfIP-1B蛋白结合的能力。抗体、单克隆抗体或其片段如果能够与分子发生特异性反应从而使该 分子结合于该抗体、单克隆抗体或其片段，则被认为能够结合该分子。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子以及其片段或结合区或域(比如，Fab和F(ab).sub.2片段)。此类片段通常由蛋白水解裂解(比如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)产生。或者，半抗原结合片段可通过应用重组DNA技术或通过合成化学产生。用于制备本发明抗体的方法是本领域公知的。例如参见Antibodies，A LaboratoryManual，Ed Harlow and David Lane(eds.)Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1988)(《抗体：实验室手册》，Ed Harlow和David Lane编辑，纽约冷泉港实验室，1988年)以及其中引用的参考文献。说明免疫学一般原理的标准参考著作包括：Klein，J.Immunology：TheScience of Cell-Noncell Discrimination，John Wiley&Sons，N.Y.(1982)(Klein，J.，免疫学：细胞-非细胞区分的科学，约翰·威利父子出版公司，纽约，1982年)；Dennett，etal.，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，N.Y.(1980)(Dennett等人，单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新尺度，Plenum出版社，纽约，1980年)以及Campbell，“Monoclonal Antibody Technology，”InLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Burdon，etal.，(eds.)，Elsevier，Amsterdam(1984)(Campbell，“单克隆抗体技术”，载于《生物化学和分子生物学实验技术》，第13卷，Burdon等人编辑，爱思唯尔，阿姆斯特丹，1984年)。还可参见美国专利No.4,196,265、4,609,893、4,713,325、4,714,681、4,716,111、4,716,117和4,720,459。AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽抗体或其抗原结合部分可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler and Milstein，(1975)Nature 256：495(Kohler和Milstein，1975年，《自然》，第256卷，第495页)的标准体细胞杂交技术。也可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，比如B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。用于分离供融合用的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。本发明的抗体和单克隆抗体可通过将AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽用作抗原来制备。
提供了用于检测AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽的存在或检测样品中编码AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实 施例中，该试剂盒提供了基于抗体的试剂以用于检测组织样品中AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽的存在。在另一个实施例中，该试剂盒提供了可用于检测编码AfIP-1A多肽或AfIP-1B多肽的一个或多个多核苷酸的存在的标记核酸探针。该试剂盒连同执行检测方法的适当试剂和对照以及试剂盒使用说明一起提供。
受体识别和分离
还涵盖对于所述实施例的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽或对于其变体或片段的受体。用于识别受体的方法是本领域熟知的(参见，Hofmann，et.al.，(1988)Eur.J.Biochem.173：85-91(Hofmann等人，1988年，《欧洲生物化学杂志》，第173卷，第85-91页)；Gill，et al.，(1995)J.Biol.Chem.27277-27282(Gill等人，1995年，《生物化学杂志》，第27277-27282页))，可用于利用来自易感昆虫的刷状缘膜囊鉴定并分离识别AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的受体。除了所引用的文献中列出的放射性标记方法以外，AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽还可用荧光染料和其他常见标签比如链霉抗生物素蛋白进行标记。易感昆虫比如大豆尺蠖和椿象的刷状缘膜囊(BBMV)可根据参考文献中列出的方案制备，并且在SDS-PAGE凝胶上分离，并印迹在合适的膜上。可将标记的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽与BBMV的印迹膜一起温育，并用标记的受体识别标记的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽。可通过N端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白鉴定方法检测与AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽相互作用的蛋白条带的身份(Patterson，(1998)10.22，1-24，Current Protocol in Molecular Biologypublished by John Wiley&Son Inc(Patterson，1998年，第10卷，第22期，第1-24页，《现代分子生物学实验手册》，由约翰·威利父子出版公司出版))。一旦蛋白被识别出，就可从易感昆虫的基因组DNA或cDNA文库克隆相应基因，并且可直接用AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽测量结合亲和力。对于由AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽表现的杀昆虫活性的受体功能可通过RNAi类型的基因敲除方法完成验证(Rajagopal，et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：46849-46851(Rajagopal等人，2002年，《生物化学杂志》，第277卷，第46849-46851页))。
核苷酸构建体、表达盒和载体
本文中术语“核苷酸构建体”的使用无意于将所述实施例局限于包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸，也可应用于本文公开的方法中。所述实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这类构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，所述实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖可在本发明实施例的方法中采用以转化植物的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于那些由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它们的组合所构成的核苷酸构建体、分子和序列。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。所述实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖所有形式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
又一个实施例涉及转化的生物体，如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。转化的生物体包含所述实施例的DNA分子、含所述DNA分子的表达盒或者含所述表达盒的载体，它们可稳定掺入到转化的生物体的基因组中。
所述实施例的序列在DNA构建体中提供以用于在所关注生物体中表达。该构建体将包括有效连接至所述实施例的序列的5’和3’调节序列。本文所用的术语“有效连接”指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并有必要在相同的阅读框内连接两个蛋白质编码区。该构建体可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，所述额外基因可在多个DNA构建体上提供。
这种DNA构建体提供有多个限制位点，以使AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽基因序列的插入处于调控区的转录调控之下。该DNA构建体可另外含有选择性标记基因。
DNA构建体一般将在5’至3’转录方向上包含：转录和翻译起始区(即启动子)、所述实施例的DNA序列和在充当宿主的生物体中具有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。转录起始区(即启动子)相对于宿主生物体和/或相对于所述实施例的序列可以是天然的、类似的、外来的或者异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。本文所用的术语 “外来的”表示启动子在引入启动子的天然生物体中不存在。如果启动子相对于所述实施例的序列是“外来的”或者“异源的”，则意指启动子不是其有效连接的所述实施例的序列的天然或自然存在的启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。如果启动子是天然或自然的序列，则其有效连接的序列的表达较野生型的表达有所变更，这造成了表型的变更。
在一些实施例中，DNA构建体还可包含转录增强子序列。如本文所用，术语“增强子”是指这样的DNA序列，所述DNA序列可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。各种增强子是本领域已知的，包括例如，植物中具有基因表达增强性质的内含子(美国专利申请公布No.2009/0144863，泛素内含子(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见例如，NCBI序列S94464))、omega增强子或omegaprime增强子(Gallie，et al.，(1989)Molecular Biology of RNA ed.Cech(Liss，NewYork)237-256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物学》，Cech编辑(纽约Liss))和Gallie，et al.，(1987)Gene60：217-25(Galiie等人，1987年，《基因》，第60卷，第217-225页))、CaMV35S增强子(参见例如，Benfey，et al.，(1990)EMBO J.9：1685-96(Benfey等人，1990年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第9卷，第1685-1696页))并且也可使用美国专利No.7,803,992的增强子，所述文献各自以引用方式并入。上面关于转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何适当的转录增强子都可用于所述实施例。
终止区可以是对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的所关注DNA序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一来源(即对于该启动子、所关注序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。
便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot，(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发 育》，第5卷，第141-149页)；Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas，et al.，(1989)Nucleic AcidsRes.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)以及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
如适当，可将核酸进行优化以提高在宿主生物体中的表达。因此，如果宿主生物体是植物，则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主优选的密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。例如，尽管所述实施例的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以体现单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实是不同的(Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页))。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子的用法在Murray等人(出处同上)的表4中列出。用于合成植物偏好基因的方法在本领域是现成的。参见例如美国专利No.5,380,831和5,436,391以及Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)以及Liu H et al.Mol BioRep 37：677-684，2010(Liu H等人，《分子生物学报道》，第37卷，第677-684页，2010年)，所述文献以引用方式并入本文。玉蜀黍(Zea maize)密码子用法表也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4577(可使用www前缀访问)。表2示出了玉蜀黍最佳密码子分析(修改自Liu H et al.Mol Bio Rep 37：677-684，2010(Liu H等人，《分子生物学报道》，第37卷，第677-684页，2010年))。
表2
| 氨基 | 密码子 | 高 | RSCU | 低 | RSCU | 氨基 | 密码子 | 高 | RSCU | 低 | RSCU |
| 酸 | 计数 | 计数 | 酸 | 计数 | 计数 | ||||||
| Phe | UUU | 115 | 0.04 | 2,301 | 1.22 | Ala | GCU | 629 | 0.17 | 3,063 | 1.59 |
| UUC* | 5,269 | 1.96 | 1,485 | 0.78 | GCC* | 8,057 | 2.16 | 1,136 | 0.59 | ||
| Ser | UCU | 176 | 0.13 | 2,498 | 1.48 | GCA | 369 | 0.1 | 2,872 | 1.49 | |
| UCC* | 3,489 | 2.48 | 1,074 | 0.63 | GCG* | 5,835 | 1.57 | 630 | 0.33 | ||
| UCA | 104 | 0.07 | 2,610 | 1.54 | Tyr | UAU | 71 | 0.04 | 1,632 | 1.22 | |
| UCG* | 1,975 | 1.4 | 670 | 0.4 | UAC* | 3,841 | 1.96 | 1,041 | 0.78 | ||
| AGU | 77 | 0.05 | 1,788 | 1.06 | His | CAU | 131 | 0.09 | 1,902 | 1.36 | |
| AGC* | 2,617 | 1.86 | 1,514 | 0.89 | CAC* | 2,800 | 1.91 | 897 | 0.64 | ||
| Leu | UUA | 10 | 0.01 | 1,326 | 0.79 | Cys | UGU | 52 | 0.04 | 1,233 | 1.12 |
| UUG | 174 | 0.09 | 2,306 | 1.37 | UGC* | 2,291 | 1.96 | 963 | 0.88 | ||
| CUU | 223 | 0.11 | 2,396 | 1.43 | Gln | CAA | 99 | 0.05 | 2,312 | 1.04 | |
| CUC* | 5,979 | 3.08 | 1,109 | 0.66 | CAG* | 3,557 | 1.95 | 2,130 | 0.96 | ||
| CUA | 106 | 0.05 | 1,280 | 0.76 | Arg | CGU | 153 | 0.12 | 751 | 0.74 | |
| CUG* | 5,161 | 2.66 | 1,646 | 0.98 | CGC* | 4,278 | 3.25 | 466 | 0.46 | ||
| Pro | CCU | 427 | 0.22 | 1,900 | 1.47 | CGA | 92 | 0.07 | 659 | 0.65 | |
| CCC* | 3,035 | 1.59 | 601 | 0.47 | CGG* | 1,793 | 1.36 | 631 | 0.62 | ||
| CCA | 311 | 0.16 | 2,140 | 1.66 | AGA | 83 | 0.06 | 1,948 | 1.91 | ||
| CCG* | 3,846 | 2.02 | 513 | 0.4 | AGG* | 1,493 | 1.14 | 1,652 | 1.62 | ||
| Ile | AUU | 138 | 0.09 | 2,388 | 1.3 | Asn | AAU | 131 | 0.07 | 3,074 | 1.26 |
| AUC* | 4,380 | 2.85 | 1,353 | 0.74 | AAC* | 3,814 | 1.93 | 1,807 | 0.74 | ||
| AUA | 88 | 0.06 | 1,756 | 0.96 | Lvs | AAA | 130 | 0.05 | 3,215 | 0.98 | |
| Thr | ACU | 136 | 0.09 | 1,990 | 1.43 | AAG* | 5,047 | 1.95 | 3,340 | 1.02 | |
| ACC* | 3,398 | 2.25 | 991 | 0.71 | Asp | GAU | 312 | 0.09 | 4,217 | 1.38 | |
| ACA | 133 | 0.09 | 2,075 | 1.5 | GAC* | 6,729 | 1.91 | 1,891 | 0.62 | ||
| ACG* | 2,378 | 1.57 | 495 | 0.36 | Gly | GGU | 363 | 0.13 | 2,301 | 1.35 | |
| Val | GUU | 182 | 0.07 | 2,595 | 1.51 | GGC* | 7,842 | 2.91 | 1,282 | 0.75 | |
| GUC* | 4,584 | 1.82 | 1,096 | 0.64 | GGA | 397 | 0.15 | 2,044 | 1.19 | ||
| GUA | 74 | 0.03 | 1,325 | 0.77 | GGG* | 2,186 | 0.81 | 1,215 | 0.71 | ||
| GUG* | 5,257 | 2.08 | 1,842 | 1.07 | Glu | GAA | 193 | 0.06 | 4,080 | 1.1 | |
| GAG* | 6,010 | 1.94 | 3,307 | 0.9 |
使用卡方列联检验来比较密码子用法以甄别最佳密码子。出现明显更频繁(P\0.01)的密码子用星号指示。
大豆(Glycine max)密码子用法表在表3中示出并且也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N(可使用www前缀访问)。
表3
| TTT | F | 21.2 | (10493) | TCT | S | 18.4 | (9107) |
| TTC | F | 21.2 | (10487) | TCC | S | 12.9 | (6409) |
| TTA | L | 9.2 | (4545) | TCA | S | 15.6 | (7712) |
| TTG | L | 22.9 | (11340) | TCG | S | 4.8 | (2397) |
| CTT | L | 23.9 | (11829) | CCT | P | 18.9 | (9358) |
| CTC | L | 17.1 | (8479) | CCC | P | 10.1 | (5010) |
| CTA | L | 8.5 | (4216) | CCA | P | 19.1 | (9461) |
| CTG | L | 12.7 | (6304) | CCG | P | 4.7 | (2312) |
| ATT | I | 25.1 | (12411) | ACT | T | 17.1 | (8490) |
| ATC | I | 16.3 | (8071) | ACC | T | 14.3 | (7100) |
| ATA | I | 12.9 | (6386) | ACA | T | 14.9 | (7391) |
| ATG | M | 22.7 | (11218) | ACG | T | 4.3 | (2147) |
| GTT | V | 26.1 | (12911) | GCT | A | 26.7 | (13201) |
| GTC | V | 11.9 | (5894) | GCC | A | 16.2 | (8026) |
| GTA | V | 7.7 | (3803) | GCA | A | 21.4 | (10577) |
| GTG | V | 21.4 | (10610) | GCG | A | 6.3 | (3123) |
| TAT | Y | 15.7 | (7779) | TGT | C | 8.1 | (3995) |
| TAC | Y | 14.9 | (7367) | TGC | C | 8.0 | (3980) |
| TAA | * | 0.9 | (463) | TGA | * | 1.0 | (480) |
| TAG | * | 0.5 | (263) | TGG | W | 13.0 | (6412) |
| CAT | H | 14.0 | (6930) | CGT | R | 6.6 | (3291) |
| CAC | H | 11.6 | (5759) | CGC | R | 6.2 | (3093) |
| CAA | Q | 20.5 | (10162) | CGA | R | 4.1 | (2018) |
| CAG | Q | 16.2 | (8038) | CGG | R | 3.1 | (1510) |
| AAT | N | 22.4 | (11088) | AGT | S | 12.6 | (6237) |
| AAC | N | 22.8 | (11284) | AGC | S | 11.3 | (5594) |
| AAA | K | 26.9 | (13334) | AGA | R | 14.8 | (7337) |
| AAG | K | 35.9 | (17797) | AGG | R | 13.3 | (6574) |
| GAT | D | 32.4 | (16040) | GGT | G | 20.9 | (10353) |
| GAC | D | 20.4 | (10097) | GGC | G | 13.4 | (6650) |
| GAA | E | 33.2 | (16438) | GGA | G | 22.3 | (11022) |
| GAG | E | 33.2 | (16426) | GGG | G | 13.0 | (6431) |
在一些实施例中，编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的重组核酸分子具有玉蜀黍优化密码子。在一些实施例中，编码AfIP-1A或AfIP-1B多肽的玉蜀黍优化重组核酸分子选自但不限于SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：282、SEQID NO：283、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：290、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：293、SEQID NO：294、SEQ ID NO：295、 SEQ ID NO：296、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：299和SEQ ID NO：300。
已知另外的序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除那些编码伪多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列以及其他得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。本文所用的术语“宿主细胞”指含有载体并支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞，或者单子叶或者双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个例子是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie，et al.，(1995)Gene 165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，et al.，(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling，et al.，(1987)Nature 325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，et al.，(1989)in Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑(Liss，纽约)，第237-256页))以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，et al.，(1991)Virology 81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。另参见Della-Cioppa，etal.，(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。此类构建体也可包含“信号序列”或“前导序列”以有利于 肽的共翻译转运或翻译后转运到特定细胞内结构，比如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。
如本文所用的“信号序列”是指已知或疑似引起跨越细胞膜的共翻译肽转运或翻译后肽转运的序列。在真核生物中，这通常涉及分泌到高尔基体中，伴随着一定程度的糖基化。细菌的杀昆虫毒素通常被合成为原毒素，其在靶标害虫的肠道中被质子传递(protolytically)激活(Chang，(1987)Methods Enzymol.153：507-516(Chang，1987年，《酶学方法》，第153卷，第507-516页))。在一些实施例中，信号序列位于天然序列内，或者可以来源于所述实施例的序列。如本文所用的“前导序列”是指任意序列，当该序列被翻译时，其产生的氨基酸序列足以触发肽链共翻译转运到亚细胞细胞器。因此，这包括通过进入内质网、穿过液泡、质体(包括叶绿体)、线粒体等而靶向转运和/或糖基化的前导序列。靶向叶绿体类囊体内腔区室的细胞核编码蛋白质具有特征性的二连转运肽(bipartite transitpeptide)，其由基质靶向信号肽和内腔靶向信号肽构成。基质靶向信息位于该转运肽的近氨基端部分。内腔靶向信号肽位于该转运肽的近羧基端部分，其含有靶向内腔的所有信息。近年来高等植物叶绿体的蛋白质组学研究成功鉴别了许多细胞核编码的内腔蛋白质(Kieselbach et al.FEBS LETT480：271-276，2000(Kieselbach等人，《欧洲生化学会联合会快报》，第480卷，第271-276页，2000年)；Peltier et al.Plant Cell 12：319-341，2000(Peltier等人，《植物细胞》，第12卷，第319-341页，2000年)；Bricker etal.Biochim.Biophys Acta 1503：350-356，2001(Bricker等人，《生物化学与生物物理学报》，第1503卷，第350-356页，2001年))，其内腔靶向信号肽存在依本发明使用的潜能。Kieselbach et al.，Photosynthesis Research，78：249-264，2003(Kieselbach等人，《光合作用研究》，第78卷，第249-264页，2003年)报道了来自拟南芥(Arabidopsis)的约80种蛋白质以及菠菜和豌豆的同源蛋白质。具体地讲，在此以引用方式并入本说明书的该出版物的表2公开了以其登录号标识的85种叶绿体内腔蛋白质(还可参见美国专利申请公布2009/09044298)。此外，近来发表的水稻基因组草图(Goff et al，Science 296：92-100，2002(Goff等人，《科学》，第296卷，第92-100页，2002年))是可根据本发明使用的内腔靶向信号肽的合适来源。
合适的叶绿体转运肽(CTP)是本领域技术人员熟知的，也包括嵌合CTP，所述嵌合CTP包含但不限于来自如下酶的CTP的N端结构域、中央结构域或C端结构域：水稻(Oryzasatlva)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻可溶性淀粉合酶、水稻NADP依赖型苹果酸酶、水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5或水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米(Zea Mays)ssRUBISCO、玉米β-葡萄糖苷酶、玉米苹果酸脱氢酶、玉米M型硫氧还蛋白(美国专利申请公布2012/0304336)。
在一些实施例中，AfIP-1A和AfIP-1B多肽由单独的基因表达，技术人员应当理解，这两个组分可与上文所述类型的不同细胞内靶向信号在功能上连锁，使得AfIP-1A和AfIP-1B多肽表达和/或储存在不同细胞内区室中。在一些实施例中，AfIP-1A或AfIP-1B多肽可能由嵌合基因表达，其中编码序列与质体转运肽在功能上连锁，使得多肽定位在质体[例如，在绿色组织中为叶绿体]，而另一多肽使用靶向信号表达，使得多肽定位在液泡、质外体或细胞质。AfIP-1A和AfIP-1B因而得以在完整细胞中分隔开，但在细胞膜被破坏(例如由于昆虫、真菌或其他病原体的作用)时，又可聚集在一起。
要靶向叶绿体的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽基因可优化用于在叶绿体中表达以体现植物细胞核与该细胞器之间的密码子用法的差异。以此方式，可使用叶绿体偏好的密码子合成所关注的核酸。参见例如，美国专利No.5,380,831，其以引用方式并入本文。
在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或连接基将DNA片段连接在一起，或者可引入其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可引入体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(例如转换和颠换)。
有多种启动子可用于所述实施例的实施。启动子可基于所需的结果来选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏好型启动子、诱导型启动子或其他启动子进行组合，以在宿主生物体中表达。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO 1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的 Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1989)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等等。其他的组成型启动子包括例如以下专利讨论的那些：美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
取决于所需的结果，从诱导型启动子表达基因可能带来有益效果。损伤诱导启动子对于调节所述实施例的核苷酸序列在植物中的表达值得特别关注。这种损伤诱导启动子可响应昆虫取食所引起的损害，它包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan，(1990)Ann.Rev.Phytopath.)，28：425-449(Ryan，1990年，《植物病理学年鉴》，第28卷，第425-449页)；Duan，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：494-498(Duan等人，1996年，《自然-生物技术》，第14卷，第494-498页))；wun1和wun2(美国专利No.5,428,148)；win1和win2(Stanford，et al.，(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208(Stanford等人，1989年，《分子遗传学与普通遗传学》，第215卷，第200-208页))；系统素(McGurl，et al.，(1992)Science225：1570-1573(McGurl等人，1992年，《科学》，第225卷，第1570-1573页))；WIP1(Rohmeier，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792(Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页)；Eckelkamp，et al.，(1993)FEBS Letters 323：73-76(Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生化学会联合会快报》，第323卷，第73-76页))；MPI基因(Corderok，et al.，(1994)Plant J.6(2)：141-150(Corderok等人，1994 年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第141-150页))等等，这些文献以引用方式并入本文。
另外，病原体诱导启动子可在所述实施例的方法和核苷酸构建体中使用。这种病原体诱导型启动子包括那些来自致病相关蛋白(PR蛋白)的在病原体感染后被诱导的启动子；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如，Redolfi，et al.，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254(Redolfi等人，1983年，《荷兰植物病理学杂志》，第89卷，第245-254页)；Uknes，et al.，(1992)Plant Cell 4：645-656(Uknes等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第645-656页)以及Van Loon，(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116(VanLoon，1985年，《植物分子病毒学》，第4卷，第111-116页)。还可参见WO 1999/43819，该专利以引用的方式并入本文。
在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如，Marineau，etal.，(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342(Marineau等人，1987年，《植物分子生物学》，第9卷，第335-342页)；Matton，et al.，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331(Matton等人，1989年，《分子植物-微生物相互作用》，第2卷，第325-331页)；Somsisch，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430(Somsisch等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第2427-2430页)；Somsisch，et al.，(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98(Somsisch等人，1988年，《分子遗传学与普通遗传学》，第2卷，第93-98页)以及Yang，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977(Yang，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第14972-14977页)。还可参见Chen，et al.，(1996)PlantJ.10：955-966(Chen等人，1996年，《植物杂志》，第10卷，第955-966页)；Zhang，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511(Zhang等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2507-2511页)；Warner，et al.，(1993)Plant J.3：191-201(Warner等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第191-201页)；Siebertz，et al.，(1989)Plant Cell 1：961-968(Siebertz等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第961-968页)；美国专利No.5,750,386(线虫诱导型)以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如，Cordero，et al.，(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200(Cordero等人，1992年，《生理与分子植物病理学》，第41卷，第189-200页))。
可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作前突生(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他所关注的化学调控启动子包括类固醇响应启动子(参见，例如，糖皮质素诱导型启动子，Schena，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad Sci.USA 88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)和McNellis，et al.，(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页))和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见，例如，Gatz，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)以及美国专利No.5,814,618和5,789,156)，上述文献以引用的方式并入本文。
组织偏好启动子可用来将增强型AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽表达靶向特定的植物组织内。组织偏好启动子包括以下文献中讨论的那些启动子：Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen，et al.，(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学和基因组学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart，et al.，(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Camp，et al.，(1996)PlantPhysiol. 112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini，et al.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam，(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka，et al.，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)和Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto，et al.，(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kwon，et al.，(1994)Plant Physiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页)；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Gotor，et al.，(1993)Plant J.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)以及Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)。
根偏好启动子或者根特异性启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从各种相容的物种从头分离。参见例如，Hire，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(Hire等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第2期，第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller and Baumgartner，(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(Keller 和Baumgartner，1991年，《植物细胞》，第3卷，第10期，第1051-1061页)(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第3期，第433-443页)(根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao，et al.，(1991)Plant Cell3(1)：11-22(Miao等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第1期，第11-22页)(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达)。还可参见，Bogusz，et al.，(1990)Plant Cell 2(7)：633-641(Bogusz等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第7期，第633-641页)，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入进非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76(《植物科学》，Limerick，第79卷，第1期，第69-76页))。他们得出结论认为，增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合表明，编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的特别理想的特性组合(参见EMBO J.8(2)：343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第2期，第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster，et al.，(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772(Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》，第29卷，第4期，第759-772页))和rolB启动子(Capana，et al.，(1994)PlantMol.Biol.25(4)：681-691(Capana等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第4期，第681-691页))。另参见美国专利No.5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和 5,023,179。拟南芥(Arabidopsis thaliana)根偏好调控序列公开于US20130117883中。
“种子偏好的”启动子包括“种子特异性”启动子(那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompson，et al.，(1989)BioEssays 10：108(Thompson等人，1989年，《生物测定法》，第10卷，第108页)，该文献以引用方式并入本文。这类种子偏好启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；以及milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见美国专利No.6,225,529，其以引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白和Gib-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于Kunitz胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku and Goldberg，(1989)Plant Cell 1：1079-1093(Jofuku和Goldberg，1989年，《植物细胞》，第1卷，第1079-1093页))、菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。还可参见WO 2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好启动子；将这些专利和文献以引用方式并入本文。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于来自拟南芥的种皮启动子pBAN；以及来自拟南芥的早期种子启动子p26、p63和p63tr(美国专利No.7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中表达的程度高于在至少一种其他植物组织中表达的程度。一些组织偏好启动子几乎专门在特定组织中表达。
如果需要低水平表达，则要使用弱启动子。一般而言，本文所用的术语“弱启动子”指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。所谓“低水平表达”意指处于约1/1000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。还应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中而不在其他细胞中驱动表达从而造成总表达水平较低的启动子。如启动子以不可接受的高水平驱动表达，则可缺失或者修饰启动子序列的一些部分以降低表达水平。
这种弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO1999/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他的组成型启动子包括例如以下专利中公开的那些：美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6，177,611，所述专利以引用方式并入本文。
上面关于启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于所述实施例。
一般而言，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因被应用于转化细胞或组织的选择。选择性标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。合适的选择性标记基因的另外例子包括但不限于：编码对氯霉素的抗性的基因(Herrera Estrella，et al.，(1983)EMBO J.2：987-992(Herrera Estrella等人，1983年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第2卷，第987-992页))；甲氨蝶呤(Herrera Estrella，etal.，(1983)Nature 303：209-213(Herrera Estrella等人，1983年，《自然》，第303卷，第209-213页)和Meijer，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820(Meijer等人，1991年，《植物分子生物学》，第16卷，第807-820页))；链霉素(Jones，et al.，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91(Jones等人，1987年，《分子遗传学与普通遗传学》，第210卷，第86-91页))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard，et al.，(1996)Transgenic Res.5：131-137(Bretagne-Sagnard等人，1996年，《转基因研究》，第5卷，第131-137页))；博来霉素(Hille，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176(Hille等人，1990年，《植物分子生物学》，第7卷，第171-176页))；磺酰胺(Guerineau，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136(Guerineau等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第127-136页))；溴苯腈(Stalker，etal.，(1988)Science 242：419-423(Stalker等人，1988年，《科学》，第242卷，第419-423页))；草甘膦(Shaw，et al.，(1986)Science 233：478-481(Shaw等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页)和美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草胺膦(DeBlock，et al.，(1987)EMBO J.6：2513-2518(DeBlock等人，1987年， 《欧洲分子生物学组织杂志》，第6卷，第2513-2518页))。主要参见：Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao，et al.，(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley，et al.，(1980)The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，《操纵子》，第177-220页)；Hu，et al.，(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown，et al.，(1987)Cell 49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge，etal.，(1988)Cell 52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle，et al.，(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，(1993)博士论文，海德堡大学(University of Heidelberg)；Reines，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591- 1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin，(1993)博士论文，海德堡大学；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)以及Gill，et al.，(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。
上面关于选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因都可用于所述实施例。
植物转化
所述实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入到植物中。如本文所用，“引入”意指将多核苷酸或多肽给予植物，使得该序列能够进入植物细胞的内部。所述实施例的方法不依赖于特定方法将多核苷酸或多肽引入植物中，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
如本文所用，“稳定转化”意指被引入到植物中的核苷酸构建体整合到了植物的基因组中，并能够被其后代继承。如本文所用，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所用，“植物”是指整株植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可为分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据转化所指向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)变动。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括微注射 (Crossway，et al.，(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔(Riggs，etal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、农杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))以及弹道粒子加速法(参见例如美国专利No.4,945,050、5,879,918、5,886,244和5,932,782；Tomes，et al.，(1995)inPlant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg andPhillips，(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格，柏林)以及McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))和Lecl转化(WO 00/28058)。对于马铃薯转化，参见Tu，et al.，(1998)Plant MolecularBiology 37：829-838(Tu等人，1998年，《植物分子生物学》，第37卷，第829-838页)以及Chong，et al.，(2000)Transgenic Research9：71-78(Chong等人，2000年，《转基因研究》，第9卷，第71-78页)。另外的转化程序可见于Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《颗粒科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen，(1991)InVitro CellDev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh，et al.，(1998)Theot.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein，et al.，(1988)PlantPhysiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，(朗文出版社，纽约)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然-生物技术》，第14卷，第745-750页)(玉蜀黍，经由根瘤农杆菌)；所有这些文献均以引用方式并入本文。
在具体的实施例中，所述实施例的序列可用多种瞬时转化方法提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽或其变体和片段，或者向植物中引入AfIP-1A和/或AfIP-1B多 肽转录物。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway，et al.，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页)；Nomura，et al.，(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler，etal.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush，et al.，(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有这些文献都以引用方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽多核苷酸瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，从粒子结合的DNA可发生转录，但其释放出来而整合进基因组中的频率则大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)涂覆的粒子。
用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见例如WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，这些专利均以引用方式并入本文。简而言之，可将所述实施例的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧是两个不相同的重组位点。将转移盒引入其基因组中稳定掺入靶位点的植物中，其中所述靶位点旁侧是两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。
植物转化载体可由实现植物转化所需的一个或多个DNA载体构成。例如，本领域通常的做法是采用由不止一个连续DNA区段构成的植物转化载体。这些载体在本领域中常常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性是相当大的，并且将功能分摊到单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，该质粒载体含有T-DNA转移所必需的顺式作用序列(比如左边界和右边界)，经工程改造能在植物细胞中表达的选择性标记，以及“所关注基因”(经工程改造能在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。还存在于这种质粒载体上的是细菌复制所 需的序列。顺式作用序列以允许有效转移入植物细胞中并在其中表达的方式排列。例如，选择性标记基因和杀虫基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。按照本领域中所理解的，该质粒通常包含允许植物细胞被农杆菌感染并通过在边界序列处的切割以及vir介导的DNA转移来转移DNA的毒力功能(Vir基因)(Hellens and Mullineaux，(2000)Trends inPlant Science5：446-451(Hellens和Mullineaux，2000年，《植物科学趋势》，第5卷，第446-451页))。数种类型的农杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。在使用其他方法(比如微喷射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等等)时，该第二质粒载体不是转化植物所必需的。
一般而言，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等等)中，随后应用最大阈值水平的合适选择物(取决于选择性标记基因)来从未转化细胞团块群中回收转化的植物细胞。在将异源外来DNA整合入植物细胞中后，然后在培养基中应用最大阈值水平的合适选择物以杀死未转化的细胞，并通过定期转移至新鲜培养基来分离和增殖从该选择处理中存活的据推测已转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择物进行测试，可甄别和增殖用所述质粒载体转化的细胞。然后，分子和生物化学方法可用于证实整合到转基因植物的基因组中的所关注异源基因的存在。
通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在放置于补充了最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后，已转化的细胞被分化成苗。然后将所述苗转移到选择性生根培养基中，以回收生根的苗或小植株。然后将转基因小植株生长成成熟的植株并产生可育种子(例如，Hiei，et al.，(1994)The Plant Journal 6：271-282(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271-282页)；Ishida，et al.，(1996)NatureBiotechnology 14：745-750(Ishida等人，1996年，《自然-生物技术》，第14卷，第745-750页))。通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。产生转基因植物的技术和方法的一般描述可见于Ayres and Park，(1994)Critical Reviews in PlantScience 13：219-239(Ayres和Park，1994年，《植物科学评论》，第13卷，第219-239页)和Bommineni and Jauhar，(1997)Maydica 42：107-120(Bommineni和Jauhar，1997年，《Maydica》，第42卷，第107-120页)。由于被转化的材料包含许多细胞；在任何一片目标愈伤组织或组织或细胞群中都存在转化的和未转化的细胞。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生了经转化的植物培养物。通常，去除未转化细胞的能力限制了快速回收经转化的植物细胞并成功产生转基因植物。
转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可培育这些植株并用同一转化株或不同的株进行授粉，并甄别出具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。
所述实施例的核苷酸序列可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而提供给植物。通常，这种方法涉及将所关注的核苷酸构建体掺入于病毒DNA或RNA分子内。已经认识到，所述实施例的重组蛋白可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽。还认识到，这种包含所述实施例的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的氨基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的杀虫活性。这种病毒聚蛋白及其编码核苷酸序列为所述实施例所涵盖。给植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码的蛋白质的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；这些专利和文献以引用方式并入本文。
转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab，et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530(Svab等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第8526-8530页)；Svab and Maliga，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917(Svab和Maliga，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第913-917页)；Svab andMaliga，(1993)EMBO J.12：601-606(Svab和Maliga，1993年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第12卷，第601-606页)。该方法依赖于粒子枪输送含选择性标记的DNA以及通过同源重组将DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过细胞核编码和 质体介导的RNA聚合酶的组织偏好表达来反式激活沉默的质体携带的转基因而完成。这种系统已经在McBride，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA91：7301-7305(McBride等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第7301-7305页)中进行了报道。
所述实施例还涉及所述实施例的转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶、以及根和苗的插条。
所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica)物种(例如，欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可应用于实施所述实 施例的针叶树包括例如松树，如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和蒙特利松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树，如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松，如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。所述实施例的植物包括作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)，例如玉米和大豆植物。
草坪草包括但不限于：一年生蓝草(Poa annua)；一年生黑麦草(Loliummultiflorum)；加拿大蓝草(Poa compressa)；邱氏紫羊茅(Festuca rubra)；细弱剪股颖(Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(Agrostis palustris)；光穗冰草(Agropyrondesertorum)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；肯塔基蓝草(Poa pratensis)；果园草(Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；紫羊茅(Festuca rubra)；红顶草(Agrostis alba)；粗茎蓝草(Poa trivialis)；羊茅(Festuca ovina)；无芒雀麦草(Bromus inermis)；高羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；绒毛剪股颖(Agrostis canina)；碱茅(Puccinellia distans)；西方冰草(Agropyron smithii)；百慕达草(Cynodon spp.)；圣奥古斯丁草(Stenotaphrumsecundatum)；结缕草(Zoysia spp.)；美洲雀稗(Paspalum notatum)；地毯草(Axonopusaffinis)；百足草(Eremochloa ophiuroides)；狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(Paspalum vaginatum)；蓝格兰马草(Bouteloua gracilis)；野牛草(Buchloedactyloids)；垂穗草(Bouteloua curtipendula)。
所关注的植物包括谷物植物(提供所关注的种子)、油籽植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦、粟等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
植物转化的评估
在将异源外来DNA引入到植物细胞中以后，异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法如与整合基因有关的核酸、蛋白质和代谢物的分析来证实。
PCR分析是在移种到土壤之前筛选早期转化细胞、组织或苗中掺入基因存在的快速方法(Sambrook and Russell，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(Sambrook和Russell，2001年，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港))。使用对所关注基因或农杆菌属载体背景等特异的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来确定(Sambrook和Russell，(2001)(出处同上))。一般而言，从转化体提取总DNA，用适当的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分级分离并且转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell，(2001)(出处同上))，可以用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测所述膜或“印迹”，以确认被引入的基因在植物基因组中的整合。
在RNA印迹分析中，根据本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell，(2001)(出处同上))，从转化体的特定组织分离RNA，所述RNA在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级分离，并且印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域内已知的方法(Sambrook和Russell，(2001)(出处同上))，使所述滤膜与源自杀虫基因的放射性探针杂交，来检测由杀虫基因编码的RNA的表达。
根据标准程序(Sambrook和Russell，(2001)(出处同上))，使用与存在于AfIP-1A或AfIP-1B多肽上的一个或多个表位结合的抗体，可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生化分析等，以确认由杀虫基因编码的蛋白质的存在。
转基因植物中性状的堆叠
转基因植物可包含本文所公开的一个或多个杀昆虫多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列的堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含所关注多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本文所公开的基因的转基因植 物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(即，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。本文所用的性状是指衍生自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化规程将性状与所关注的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况下，可能需要引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，这些专利均以引用方式并入本文。
在一些实施例中，编码单独的或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的本文所公开的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的多核苷酸可与一种或多种另外的投入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度等等)或产出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、抗旱性等等)堆叠。因此，可以使用多核苷酸实施例来提供具有灵活地且成本有效地防治许多农艺学害虫的能力的改善的作物质量的完整农艺学方案。
可用于堆叠的转基因包括但不限于：
1.赋予对昆虫或病害的抗性并编码以下各方面的转基因：
(A)植物抗病基因。植物防御往往由该植物中抗病基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用激活。可用克隆的抗性基因转化植物品种，以工程构建出对特定的病原体株系有抗性的植物。参见例如Jones，et al.，(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)(抵抗番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)的番茄Cf-9基因的克隆)；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)(抵抗丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的番茄Pto基因编码蛋白激酶)；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页)(抵抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的拟南芥RSP2基因)、McDowell and Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.21(4)：178-83(McDowell和Woffenden，2003年，《生物技术趋势》，第21卷，第4期，第178-183页)以及Toyoda，et al.，(2002)Transgenic Res.11(6)：567-82(Toyoda等人，2002年，《转基因研究》，第11卷，第6期，第567-582页)。抗病植物是与野生型植物相比更能抵抗病原体的植物。
(B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或模拟其的合成多肽的基因。参见例如Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自马里兰州罗克维尔市(Rockville，Md.)的美国模式培养物保藏所，例如登录号40098、67136、31995和31998。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性例子在以下专利和专利申请中给出，并出于此目的据此以引用方式并入：美国专利No.5,188,960、5,689,052、5,880,275、5,986,177、6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7，105,332、7，179,965、7,208,474、7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849以及WO 1991/14778、WO 1999/31248、WO 2001/12731、WO 1999/24581和WO 1997/40162。
编码杀虫蛋白的基因也可堆叠，包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，诸如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS Pathogens，7：1-13(Monalysin，2011年，《公共科学图书馆病原学》，第7卷，第1-13页))；来自生防假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前的荧光假单胞菌)的杀昆虫蛋白(Pechy-Tarr，(2008)EnvironmentalMicrobiology 10：2368-2386(Pechy-Tarr，2008年，《环境微生物学》，第10卷，第2368-2386页)；GenBank登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas Taiwanensis)的杀昆虫蛋白(Liu，et al.，(2010)J.Agric.Food Chem.58：12343-12349(Liu等人，2010年，《农业与食品化学杂志》，第58卷，第12343-12349页))以及来自类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcligenes)的杀昆虫蛋白(Zhang，et al.，(2009)Annals of Microbiology59：45-50(Zhang等人，2009年，《微生物学年报》，第59卷，第45-50页)和Li，et al.，(2007)PlantCell Tiss.Organ Cult.89：159-168(Li等人，2007年，《植物细胞、组织和器官培养》，第89卷，第159-168页))；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe，etal.，(2010)The Open Toxinology Journal 3：101-118(Hinchliffe等人，2010年，《开放毒素学杂志》，第3卷，第101-118页)和Morgan，et al.，(2001)Applied and Envir.Micro.67：2062-2069(Morgan等人，2001年，《应用与环境微生物学》，第67卷，第2062-2069页))、美国专利No.6,048,838和美国专利No.6,379,946；美国专利序列号13792861的PIP-1多肽；美国专利序列号13/800233的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利序列号13/839702的PHI-4多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51和Cry55类别以及苏云金芽孢杆菌溶细胞Cyt1和Cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号AAA22353)；Cry1Aa2(登录号AAA22552)；Cry1Aa3(登录号BAA00257)；Cry1Aa4(登录号CAA31886)；Cry1Aa5 (登录号BAA04468)；Cry1Aa6(登录号AAA86265)；Cry1Aa7(登录号AAD46139)；Cry1Aa8(登录号I26149)；Cry1Aa9(登录号BAA77213)；Cry1Aa10(登录号AAD55382)；Cry1Aa11(登录号CAA70856)；Cry1Aa12(登录号AAP80146)；Cry1Aa13(登录号AAM44305)；Cry1Aa14(登录号AAP40639)；Cry1Aa15(登录号AAY66993)；Cry1Aa16(登录号HQ439776)；Cry1Aa17(登录号HQ439788)；Cry1Aa18(登录号HQ439790)；Cry1Aa19(登录号HQ685121)；Cry1Aa20(登录号JF340156)；Cry1Aa21(登录号JN651496)；Cry1Aa22(登录号KC158223)；Cry1Ab1(登录号AAA22330)；Cry1Ab2(登录号AAA22613)；Cry1Ab3(登录号AAA22561)；Cry1Ab4(登录号BAA00071)；Cry1Ab5(登录号CAA28405)；Cry1Ab6(登录号AAA22420)；Cry1Ab7(登录号CAA31620)；Cry1Ab8(登录号AAA22551)；Cry1Ab9(登录号CAA38701)；Cry1Ab10(登录号A29125)；Cry1Ab11(登录号I12419)；Cry1Ab12(登录号AAC64003)；Cry1Ab13(登录号AAN76494)；Cry1Ab14(登录号AAG16877)；Cry1Ab15(登录号AAO13302)；Cry1Ab16(登录号AAK55546)；Cry1Ab17(登录号AAT46415)；Cry1Ab18(登录号AAQ88259)；Cry1Ab19(登录号AAW31761)；Cry1Ab20(登录号ABB72460)；Cry1Ab21(登录号ABS18384)；Cry1Ab22(登录号ABW87320)；Cry1Ab23(登录号HQ439777)；Cry1Ab24(登录号HQ439778)；Cry1Ab25(登录号HQ685122)；Cry1Ab26(登录号HQ847729)；Cry1Ab27(登录号JN135249)；Cry1Ab28(登录号JN135250)；Cry1Ab29(登录号JN135251)；Cry1Ab30(登录号JN135252)；Cry1Ab31(登录号JN135253)；Cry1Ab32(登录号JN135254)；Cry1Ab33(登录号AAS93798)；Cry1Ab34(登录号KC156668)；Cry1Ab样(登录号AAK14336)；Cry1Ab样(登录号AAK14337)；Cry1Ab样(登录号AAK14338)；Cry1Ab样(登录号ABG88858)；Cry1Ac1(登录号AAA22331)；Cry1Ac2(登录号AAA22338)；Cry1Ac3(登录号CAA38098)；Cry1Ac4(登录号AAA73077)；Cry1Ac5(登录号AAA22339)；Cry1Ac6(登录号AAA86266)；Cry1Ac7(登录号AAB46989)；Cry1Ac8(登录号AAC44841)；Cry1Ac9(登录号AAB49768)；Cry1Ac10(登录号CAA05505)；Cry1Ac11(登录号CAA10270)；Cry1Ac12(登录号I12418)；Cry1Ac13(登录号AAD38701)；Cry1Ac14(登录号AAQ06607)；Cry1Ac15(登录号AAN07788)；Cry1Ac16(登录号AAU87037)；Cry1Ac17(登录号AAX18704)；Cry1Ac18(登录号AAY88347)；Cry1Ac19(登录号ABD37053)；Cry1Ac20(登录号ABB89046)；Cry1Ac21(登录号AAY66992)；Cry1Ac22(登录号ABZ01836)；Cry1Ac23(登录号CAQ30431)；Cry1Ac24(登录号ABL01535)；Cry1Ac25(登录号FJ513324)；Cry1Ac26(登录号FJ617446)；Cry1Ac27(登录号FJ617447)；Cry1Ac28(登录号ACM90319)；Cry1Ac29(登录号DQ438941)；Cry1Ac30(登录号GQ227507)；Cry1Ac31(登录号GU446674)；Cry1Ac32(登录号HM061081)；Cry1Ac33(登录号GQ866913)；Cry1Ac34(登录号HQ230364)；Cry1Ac35(登录号JF340157)；Cry1Ac36(登录号JN387137)；Cry1Ac37(登录号JQ317685)；Cry1Ad1(登录号AAA22340)；Cry1Ad2(登录号CAA01880)；Cry1Ae1(登录号AAA22410)；Cry1Af1(登录号AAB82749)；Cry1Ag1(登录号AAD46137)；Cry1Ah1(登录号AAQ14326)；Cry1Ah2(登录号ABB76664)；Cry1Ah3(登录号HQ439779)；Cry1Ai1(登录号AAO39719)；Cry1Ai2(登录号HQ439780)；Cry1A样(登录号AAK14339)；Cry1Ba1(登录号CAA29898)；Cry1Ba2(登录号CAA65003)；Cry1Ba3(登录号AAK63251)；Cry1Ba4(登录号AAK51084)；Cry1Ba5(登录号ABO20894)；Cry1Ba6(登录号ABL60921)；Cry1Ba7(登录号HQ439781)；Cry1Bb1(登录号AAA22344)；Cry1Bb2(登录号HQ439782)；Cry1Bc1(登录号CAA86568)；Cry1Bd1(登录号AAD10292)；Cry1Bd2(登录号AAM93496)；Cry1Be1(登录号AAC32850)；Cry1Be2(登录号AAQ52387)；Cry1Be3(登录号ACV96720)；Cry1Be4(登录号HM070026)；Cry1Bf1(登录号CAC50778)；Cry1Bf2(登录号AAQ52380)；Cry1Bg1(登录号AAO39720)；Cry1Bh1(登录号HQ589331)；Cry1Bi1(登录号 KC156700)；Cry1Ca1(登录号CAA30396)；Cry1Ca2(登录号CAA31951)；Cry1Ca3(登录号AAA22343)；Cry1Ca4(登录号CAA01886)；Cry1Ca5(登录号CAA65457)；Cry1Ca6[1](登录号AAF37224)；Cry1Ca7(登录号AAG50438)；Cry1Ca8(登录号AAM00264)；Cry1Ca9(登录号AAL79362)；Cry1Ca10(登录号AAN16462)；Cry1Ca11(登录号AAX53094)；Cry1Ca12(登录号HM070027)；Cry1Ca13(登录号HQ412621)；Cry1Ca14(登录号JN651493)；Cry1Cb1(登录号M97880)；Cry1Cb2(登录号AAG35409)；Cry1Cb3(登录号ACD50894)；Cry1Cb样(登录号AAX63901)；Cry1Da1(登录号CAA38099)；Cry1Da2(登录号I76415)；Cry1Da3(登录号HQ439784)；Cry1Db1(登录号CAA80234)；Cry1Db2(登录号AAK48937)；Cry1Dc1(登录号ABK35074)；Cry1Ea1(登录号CAA37933)；Cry1Ea2(登录号CAA39609)；Cry1Ea3(登录号AAA22345)；Cry1Ea4(登录号AAD04732)；Cry1Ea5(登录号A15535)；Cry1Ea6(登录号AAL50330)；Cry1Ea7(登录号AAW72936)；Cry1Ea8(登录号ABX11258)；Cry1Ea9(登录号HQ439785)；Cry1Ea10(登录号ADR00398)；Cry1Ea11(登录号JQ652456)；Cry1Eb1(登录号AAA22346)；Cry1Fa1(登录号AAA22348)；Cry1Fa2(登录号AAA22347)；Cry1Fa3(登录号HM070028)；Cry1Fa4(登录号HM439638)；Cry1Fb1(登录号CAA80235)；Cry1Fb2(登录号BAA25298)；Cry1Fb3(登录号AAF21767)；Cry1Fb4(登录号AAC10641)；Cry1Fb5(登录号AAO13295)；Cry1Fb6(登录号ACD50892)；Cry1Fb7(登录号ACD50893)；Cry1Ga1(登录号CAA80233)；Cry1Ga2(登录号CAA70506)；Cry1Gb1(登录号AAD10291)；Cry1Gb2(登录号AAO13756)；Cry1Gc1(登录号AAQ52381)；Cry1Ha1(登录号CAA80236)；Cry1Hb1(登录号AAA79694)；Cry1Hb2(登录号HQ439786)；Cry1H样(登录号AAF01213)；Cry1Ia1(登录号CAA44633)；Cry1Ia2(登录号AAA22354)；Cry1Ia3(登录号AAC36999)；Cry1Ia4(登录号AAB00958)；Cry1Ia5(登录号CAA70124)；Cry1Ia6(登录号 AAC26910)；Cry1Ia7(登录号AAM73516)；Cry1Ia8(登录号AAK66742)；Cry1Ia9(登录号AAQ08616)；Cry1Ia10(登录号AAP86782)；Cry1Ia11(登录号CAC85964)；Cry1Ia12(登录号AAV53390)；Cry1Ia13(登录号ABF83202)；Cry1Ia14(登录号ACG63871)；Cry1Ia15(登录号FJ617445)；Cry1Ia16(登录号FJ617448)；Cry1Ia17(登录号GU989199)；Cry1Ia18(登录号ADK23801)；Cry1Ia19(登录号HQ439787)；Cry1Ia20(登录号JQ228426)；Cry1Ia21(登录号JQ228424)；Cry1Ia22(登录号JQ228427)；Cry1Ia23(登录号JQ228428)；Cry1Ia24(登录号JQ228429)；Cry1Ia25(登录号JQ228430)；Cry1Ia26(登录号JQ228431)；Cry1Ia27(登录号JQ228432)；Cry1Ia28(登录号JQ228433)；Cry1Ia29(登录号JQ228434)；Cry1Ia30(登录号JQ317686)；Cry1Ia31(登录号JX944038)；Cry1Ia32(登录号JX944039)；Cry1Ia33(登录号JX944040)；Cry1Ib1(登录号AAA82114)；Cry1Ib2(登录号ABW88019)；Cry1Ib3(登录号ACD75515)；Cry1Ib4(登录号HM051227)；Cry1Ib5(登录号HM070028)；Cry1Ib6(登录号ADK38579)；Cry1Ib7(登录号JN571740)；Cry1Ib8(登录号JN675714)；Cry1Ib9(登录号JN675715)；Cry1Ib10(登录号JN675716)；Cry1Ib11(登录号JQ228423)；Cry1Ic1(登录号AAC62933)；Cry1Ic2(登录号AAE71691)；Cry1Id1(登录号AAD44366)；Cry1Id2(登录号JQ228422)；Cry1Ie1(登录号AAG43526)；Cry1Ie2(登录号HM439636)；Cry1Ie3(登录号KC156647)；Cry1Ie4(登录号KC156681)；Cry1If1(登录号AAQ52382)；Cry1Ig1(登录号KC156701)；Cry1I样(登录号AAC31094)；Cry1I样(登录号ABG88859)；Cry1Ja1(登录号AAA22341)；Cry1Ja2(登录号HM070030)；Cry1Ja3(登录号JQ228425)；Cry1Jb1(登录号AAA98959)；Cry1Jc1(登录号AAC31092)；Cry1Jc2(登录号AAQ52372)；Cry1Jd1(登录号CAC50779)；Cry1Ka1(登录号AAB00376)；Cry1Ka2(登录号HQ439783)；Cry1La1(登录号AAS60191)；Cry1La2(登录号HM070031)；Cry1Ma1(登录号FJ884067)；Cry1Ma2(登录号KC156659)；Cry1Na1(登录号KC156648)；Cry1Nb1(登录号KC156678)；Cry1样(登录号AAC31091)；Cry2Aa1(登录号AAA22335)；Cry2Aa2(登录号AAA83516)；Cry2Aa3(登录号D86064)；Cry2Aa4(登录号AAC04867)；Cry2Aa5(登录号CAA10671)；Cry2Aa6(登录号CAA10672)；Cry2Aa7(登录号CAA10670)；Cry2Aa8(登录号AAO13734)；Cry2Aa9(登录号AAO13750)；Cry2Aa10(登录号AAQ04263)；Cry2Aa11(登录号AAQ52384)；Cry2Aa12(登录号ABI83671)；Cry2Aa13(登录号ABL01536)；Cry2Aa14(登录号ACF04939)；Cry2Aa15(登录号JN426947)；Cry2Ab1(登录号AAA22342)；Cry2Ab2(登录号CAA39075)；Cry2Ab3(登录号AAG36762)；Cry2Ab4(登录号AAO13296)；Cry2Ab5(登录号AAQ04609)；Cry2Ab6(登录号AAP59457)；Cry2Ab7(登录号AAZ66347)；Cry2Ab8(登录号ABC95996)；Cry2Ab9(登录号ABC74968)；Cry2Ab10(登录号EF157306)；Cry2Ab11(登录号CAM84575)；Cry2Ab12(登录号ABM21764)；Cry2Ab13(登录号ACG76120)；Cry2Ab14(登录号ACG76121)；Cry2Ab15(登录号HM037126)；Cry2Ab16(登录号GQ866914)；Cry2Ab17(登录号HQ439789)；Cry2Ab18(登录号JN135255)；Cry2Ab19(登录号JN135256)；Cry2Ab20(登录号JN135257)；Cry2Ab21(登录号JN135258)；Cry2Ab22(登录号JN135259)；Cry2Ab23(登录号JN135260)；Cry2Ab24(登录号JN135261)；Cry2Ab25(登录号JN415485)；Cry2Ab26(登录号JN426946)；Cry2Ab27(登录号JN415764)；Cry2Ab28(登录号JN651494)；Cry2Ac1(登录号CAA40536)；Cry2Ac2(登录号AAG35410)；Cry2Ac3(登录号AAQ52385)；Cry2Ac4(登录号ABC95997)；Cry2Ac5(登录号ABC74969)；Cry2Ac6(登录号ABC74793)；Cry2Ac7(登录号CAL18690)；Cry2Ac8(登录号CAM09325)；Cry2Ac9(登录号CAM09326)；Cry2Ac10(登录号ABN15104)；Cry2Ac11(登录号CAM83895)；Cry2Ac12(登录号CAM83896)；Cry2Ad1(登录号AAF09583)；Cry2Ad2(登录号ABC86927)；Cry2Ad3(登录号 CAK29504)；Cry2Ad4(登录号CAM32331)；Cry2Ad5(登录号CAO78739)；Cry2Ae1(登录号AAQ52362)；Cry2Af1(登录号ABO30519)；Cry2Af2(登录号GQ866915)；Cry2Ag1(登录号ACH91610)；Cry2Ah1(登录号EU939453)；Cry2Ah2(登录号ACL80665)；Cry2Ah3(登录号GU073380)；Cry2Ah4(登录号KC156702)；Cry2Ai1(登录号FJ788388)；Cry2Aj(登录号)；Cry2Ak1(登录号KC156660)；Cry2Ba1(登录号KC156658)；Cry3Aa1(登录号AAA22336)；Cry3Aa2(登录号AAA22541)；Cry3Aa3(登录号CAA68482)；Cry3Aa4(登录号AAA22542)；Cry3Aa5(登录号AAA50255)；Cry3Aa6(登录号AAC43266)；Cry3Aa7(登录号CAB41411)；Cry3Aa8(登录号AAS79487)；Cry3Aa9(登录号AAW05659)；Cry3Aa10(登录号AAU29411)；Cry3Aa11(登录号AAW82872)；Cry3Aa12(登录号ABY49136)；Cry3Ba1(登录号CAA34983)；Cry3Ba2(登录号CAA00645)；Cry3Ba3(登录号JQ397327)；Cry3Bb1(登录号AAA22334)；Cry3Bb2(登录号AAA74198)；Cry3Bb3(登录号I15475)；Cry3Ca1(登录号CAA42469)；Cry4Aa1(登录号CAA68485)；Cry4Aa2(登录号BAA00179)；Cry4Aa3(登录号CAD30148)；Cry4Aa4(登录号AFB18317)；Cry4A样(登录号AAY96321)；Cry4Ba1(登录号CAA30312)；Cry4Ba2(登录号CAA30114)；Cry4Ba3(登录号AAA22337)；Cry4Ba4(登录号BAA00178)；Cry4Ba5(登录号CAD30095)；Cry4Ba样(登录号ABC47686)；Cry4Ca1(登录号EU646202)；Cry4Cb1(登录号FJ403208)；Cry4Cb2(登录号FJ597622)；Cry4Cc1(登录号FJ403207)；Cry5Aa1(登录号AAA67694)；Cry5Ab1(登录号AAA67693)；Cry5Ac1(登录号I34543)；Cry5Ad1(登录号ABQ82087)；Cry5Ba1(登录号AAA68598)；Cry5Ba2(登录号ABW88931)；Cry5Ba3(登录号AFJ04417)；Cry5Ca1(登录号HM461869)；Cry5Ca2(登录号ZP_04123426)；Cry5Da1(登录号HM461870)；Cry5Da2(登录号ZP_04123980)；Cry5Ea1(登录号HM485580)；Cry5Ea2(登录号ZP_04124038)；Cry6Aa1(登录号AAA22357)；Cry6Aa2(登录号 AAM46849)；Cry6Aa3(登录号ABH03377)；Cry6Ba1(登录号AAA22358)；Cry7Aa1(登录号AAA22351)；Cry7Ab1(登录号AAA21120)；Cry7Ab2(登录号AAA21121)；Cry7Ab3(登录号ABX24522)；Cry7Ab4(登录号EU380678)；Cry7Ab5(登录号ABX79555)；Cry7Ab6(登录号ACI44005)；Cry7Ab7(登录号ADB89216)；Cry7Ab8(登录号GU145299)；Cry7Ab9(登录号ADD92572)；Cry7Ba1(登录号ABB70817)；Cry7Bb1(登录号KC156653)；Cry7Ca1(登录号ABR67863)；Cry7Cb1(登录号KC156698)；Cry7Da1(登录号ACQ99547)；Cry7Da2(登录号HM572236)；Cry7Da3(登录号KC156679)；Cry7Ea1(登录号HM035086)；Cry7Ea2(登录号HM132124)；Cry7Ea3(登录号EEM19403)；Cry7Fa1(登录号HM035088)；Cry7Fa2(登录号EEM19090)；Cry7Fb1(登录号HM572235)；Cry7Fb2(登录号KC156682)；Cry7Ga1(登录号HM572237)；Cry7Ga2(登录号KC156669)；Cry7Gb1(登录号KC156650)；Cry7Gc1(登录号KC156654)；Cry7Gd1(登录号KC156697)；Cry7Ha1(登录号KC156651)；Cry7Ia1(登录号KC156665)；Cry7Ja1(登录号KC156671)；Cry7Ka1(登录号KC156680)；Cry7Kb1(登录号BAM99306)；Cry7La1(登录号BAM99307)；Cry8Aa1(登录号AAA21117)；Cry8Ab1(登录号EU044830)；Cry8Ac1(登录号KC156662)；Cry8Ad1(登录号KC156684)；Cry8Ba1(登录号AAA21118)；Cry8Bb1(登录号CAD57542)；Cry8Bc1(登录号CAD57543)；Cry8Ca1(登录号AAA21119)；Cry8Ca2(登录号AAR98783)；Cry8Ca3(登录号EU625349)；Cry8Ca4(登录号ADB54826)；Cry8Da1(登录号BAC07226)；Cry8Da2(登录号BD133574)；Cry8Da3(登录号BD133575)；Cry8Db1(登录号BAF93483)；Cry8Ea1(登录号AAQ73470)；Cry8Ea2(登录号EU047597)；Cry8Ea3(登录号KC855216)；Cry8Fa1(登录号AAT48690)；Cry8Fa2(登录号HQ174208)；Cry8Fa3(登录号AFH78109)；Cry8Ga1(登录号AAT46073)；Cry8Ga2(登录号ABC42043)；Cry8Ga3(登录号FJ198072)；Cry8Ha1(登录号AAW81032)；Cry8Ia1(登录号EU381044)；Cry8Ia2(登录号GU073381)；Cry8Ia3(登录号HM044664)；Cry8Ia4(登录号KC156674)；Cry8Ib1(登录号GU325772)；Cry8Ib2(登录号KC156677)；Cry8Ja1(登录号EU625348)；Cry8Ka1(登录号FJ422558)；Cry8Ka2(登录号ACN87262)；Cry8Kb1(登录号HM123758)；Cry8Kb2(登录号KC156675)；Cry8La1(登录号GU325771)；Cry8Ma1(登录号HM044665)；Cry8Ma2(登录号EEM86551)；Cry8Ma3(登录号HM210574)；Cry8Na1(登录号HM640939)；Cry8Pa1(登录号HQ388415)；Cry8Qa1(登录号HQ441166)；Cry8Qa2(登录号KC152468)；Cry8Ra1(登录号AFP87548)；Cry8Sa1(登录号JQ740599)；Cry8Ta1(登录号KC156673)；Cry8样(登录号FJ770571)；Cry8样(登录号ABS53003)；Cry9Aa1(登录号CAA41122)；Cry9Aa2(登录号CAA41425)；Cry9Aa3(登录号GQ249293)；Cry9Aa4(登录号GQ249294)；Cry9Aa5(登录号JX174110)；Cry9Aa样(登录号AAQ52376)；Cry9Ba1(登录号CAA52927)；Cry9Ba2(登录号GU299522)；Cry9Bb1(登录号AAV28716)；Cry9Ca1(登录号CAA85764)；Cry9Ca2(登录号AAQ52375)；Cry9Da1(登录号BAA19948)；Cry9Da2(登录号AAB97923)；Cry9Da3(登录号GQ249293)；Cry9Da4(登录号GQ249297)；Cry9Db1(登录号AAX78439)；Cry9Dc1(登录号KC156683)；Cry9Ea1(登录号BAA34908)；Cry9Ea2(登录号AAO12908)；Cry9Ea3(登录号ABM21765)；Cry9Ea4(登录号ACE88267)；Cry9Ea5(登录号ACF04743)；Cry9Ea6(登录号ACG63872)；Cry9Ea7(登录号FJ380927)；Cry9Ea8(登录号GQ249292)；Cry9Ea9(登录号JN651495)；Cry9Eb1(登录号CAC50780)；Cry9Eb2(登录号GQ249298)；Cry9Eb3(登录号KC156646)；Cry9Ec1(登录号AAC63366)；Cry9Ed1(登录号AAX78440)；Cry9Ee1(登录号GQ249296)；Cry9Ee2(登录号KC156664)；Cry9Fa1(登录号KC156692)；Cry9Ga1(登录号KC156699)；Cry9样(登录号AAC63366)；Cry10Aa1(登录号AAA22614)；Cry10Aa2(登录号 E00614)；Cry10Aa3(登录号CAD30098)；Cry10Aa4(登录号AFB18318)；Cry10A样(登录号DQ167578)；Cry11Aa1(登录号AAA22352)；Cry11Aa2(登录号AAA22611)；Cry11Aa3(登录号CAD30081)；Cry11Aa4(登录号AFB18319)；Cry11Aa样(登录号DQ166531)；Cry11Ba1(登录号CAA60504)；Cry11Bb1(登录号AAC97162)；Cry11Bb2(登录号HM068615)；Cry12Aa1(登录号AAA22355)；Cry13Aa1(登录号AAA22356)；Cry14Aa1(登录号AAA21516)；Cry14Ab1(登录号KC156652)；Cry15Aa1(登录号AAA22333)；Cry16Aa1(登录号CAA63860)；Cry17Aa1(登录号CAA67841)；Cry18Aa1(登录号CAA67506)；Cry18Ba1(登录号AAF89667)；Cry18Ca1(登录号AAF89668)；Cry19Aa1(登录号CAA68875)；Cry19Ba1(登录号BAA32397)；Cry19Ca1(登录号AFM37572)；Cry20Aa1(登录号AAB93476)；Cry20Ba1(登录号ACS93601)；Cry20Ba2(登录号KC156694)；Cry20样(登录号GQ144333)；Cry21Aa1(登录号I32932)；Cry21Aa2(登录号I66477)；Cry21Ba1(登录号BAC06484)；Cry21Ca1(登录号JF521577)；Cry21Ca2(登录号KC156687)；Cry21Da1(登录号JF521578)；Cry22Aa1(登录号I34547)；Cry22Aa2(登录号CAD43579)；Cry22Aa3(登录号ACD93211)；Cry22Ab1(登录号AAK50456)；Cry22Ab2(登录号CAD43577)；Cry22Ba1(登录号CAD43578)；Cry22Bb1(登录号KC156672)；Cry23Aa1(登录号AAF76375)；Cry24Aa1(登录号AAC61891)；Cry24Ba1(登录号BAD32657)；Cry24Ca1(登录号CAJ43600)；Cry25Aa1(登录号AAC61892)；Cry26Aa1(登录号AAD25075)；Cry27Aa1(登录号BAA82796)；Cry28Aa1(登录号AAD24189)；Cry28Aa2(登录号AAG00235)；Cry29Aa1(登录号CAC80985)；Cry30Aa1(登录号CAC80986)；Cry30Ba1(登录号BAD00052)；Cry30Ca1(登录号BAD67157)；Cry30Ca2(登录号ACU24781)；Cry30Da1(登录号EF095955)；Cry30Db1(登录号BAE80088)；Cry30Ea1(登录号ACC95445)；Cry30Ea2(登录号FJ499389)；Cry30Fa1(登录号ACI22625)；Cry30Ga1(登录号ACG60020)；Cry30Ga2(登录号 HQ638217)；Cry31Aa1(登录号BAB11757)；Cry31Aa2(登录号AAL87458)；Cry31Aa3(登录号BAE79808)；Cry31Aa4(登录号BAF32571)；Cry31Aa5(登录号BAF32572)；Cry31Aa6(登录号BAI44026)；Cry31Ab1(登录号BAE79809)；Cry31Ab2(登录号BAF32570)；Cry31Ac1(登录号BAF34368)；Cry31Ac2(登录号AB731600)；Cry31Ad1(登录号BAI44022)；Cry32Aa1(登录号AAG36711)；Cry32Aa2(登录号GU063849)；Cry32Ab1(登录号GU063850)；Cry32Ba1(登录号BAB78601)；Cry32Ca1(登录号BAB78602)；Cry32Cb1(登录号KC156708)；Cry32Da1(登录号BAB78603)；Cry32Ea1(登录号GU324274)；Cry32Ea2(登录号KC156686)；Cry32Eb1(登录号KC156663)；Cry32Fa1(登录号KC156656)；Cry32Ga1(登录号KC156657)；Cry32Ha1(登录号KC156661)；Cry32Hb1(登录号KC156666)；Cry32Ia1(登录号KC156667)；Cry32Ja1(登录号KC156685)；Cry32Ka1(登录号KC156688)；Cry32La1(登录号KC156689)；Cry32Ma1(登录号KC156690)；Cry32Mb1(登录号KC156704)；Cry32Na1(登录号KC156691)；Cry32Oa1(登录号KC156703)；Cry32Pa1(登录号KC156705)；Cry32Qa1(登录号KC156706)；Cry32Ra1(登录号KC156707)；Cry32Sa1(登录号KC156709)；Cry32Ta1(登录号KC156710)；Cry32Ua1(登录号KC156655)；Cry33Aa1(登录号AAL26871)；Cry34Aa1(登录号AAG50341)；Cry34Aa2(登录号AAK64560)；Cry34Aa3(登录号AAT29032)；Cry34Aa4(登录号AAT29030)；Cry34Ab1(登录号AAG41671)；Cry34Ac1(登录号AAG50118)；Cry34Ac2(登录号AAK64562)；Cry34Ac3(登录号AAT29029)；Cry34Ba1(登录号AAK64565)；Cry34Ba2(登录号AAT29033)；Cry34Ba3(登录号AAT29031)；Cry35Aa1(登录号AAG50342)；Cry35Aa2(登录号AAK64561)；Cry35Aa3(登录号AAT29028)；Cry35Aa4(登录号AAT29025)；Cry35Ab1(登录号AAG41672)；Cry35Ab2(登录号AAK64563)；Cry35Ab3(登录号AY536891)；Cry35Ac1(登录号AAG50117)；Cry35Ba1(登录号AAK64566)；Cry35Ba2(登录号AAT29027)；Cry35Ba3(登录号AAT29026)；Cry36Aa1(登录号AAK64558)；Cry37Aa1(登录号AAF76376)；Cry38Aa1(登录号AAK64559)；Cry39Aa1(登录号BAB72016)；Cry40Aa1(登录号BAB72018)；Cry40Ba1(登录号BAC77648)；Cry40Ca1(登录号EU381045)；Cry40Da1(登录号ACF15199)；Cry41Aa1(登录号BAD35157)；Cry41Ab1(登录号BAD35163)；Cry41Ba1(登录号HM461871)；Cry41Ba2(登录号ZP_04099652)；Cry42Aa1(登录号BAD35166)；Cry43Aa1(登录号BAD15301)；Cry43Aa2(登录号BAD95474)；Cry43Ba1(登录号BAD15303)；Cry43Ca1(登录号KC156676)；Cry43Cb1(登录号KC156695)；Cry43Cc1(登录号KC156696)；Cry43样(登录号BAD15305)；Cry44Aa(登录号BAD08532)；Cry45Aa(登录号BAD22577)；Cry46Aa(登录号BAC79010)；Cry46Aa2(登录号BAG68906)；Cry46Ab(登录号BAD35170)；Cry47Aa(登录号AAY24695)；Cry48Aa(登录号CAJ18351)；Cry48Aa2(登录号CAJ86545)；Cry48Aa3(登录号CAJ86546)；Cry48Ab(登录号CAJ86548)；Cry48Ab2(登录号CAJ86549)；Cry49Aa(登录号CAH56541)；Cry49Aa2(登录号CAJ86541)；Cry49Aa3(登录号CAJ86543)；Cry49Aa4(登录号CAJ86544)；Cry49Ab1(登录号CAJ86542)；Cry50Aa1(登录号BAE86999)；Cry50Ba1(登录号GU446675)；Cry50Ba2(登录号GU446676)；Cry51Aa1(登录号ABI14444)；Cry51Aa2(登录号GU570697)；Cry52Aa1(登录号EF613489)；Cry52Ba1(登录号FJ361760)；Cry53Aa1(登录号EF633476)；Cry53Ab1(登录号FJ361759)；Cry54Aa1(登录号ACA52194)；Cry54Aa2(登录号GQ140349)；Cry54Ba1(登录号GU446677)；Cry55Aa1(登录号ABW88932)；Cry54Ab1(登录号JQ916908)；Cry55Aa2(登录号AAE33526)；Cry56Aa1(登录号ACU57499)；Cry56Aa2(登录号GQ483512)；Cry56Aa3(登录号JX025567)；Cry57Aa1(登录号ANC87261)；Cry58Aa1(登录号ANC87260)；Cry59Ba1(登录号JN790647)；Cry59Aa1(登录号ACR43758)；Cry60Aa1(登录号ACU24782)；Cry60Aa2(登录号EAO57254)；Cry60Aa3(登录号EEM99278)；Cry60Ba1(登录号 GU810818)；Cry60Ba2(登录号EAO57253)；Cry60Ba3(登录号EEM99279)；Cry61Aa1(登录号HM035087)；Cry61Aa2(登录号HM132125)；Cry61Aa3(登录号EEM19308)；Cry62Aa1(登录号HM054509)；Cry63Aa1(登录号BAI44028)；Cry64Aa1(登录号BAJ05397)；Cry65Aa1(登录号HM461868)；Cry65Aa2(登录号ZP_04123838)；Cry66Aa1(登录号HM485581)；Cry66Aa2(登录号ZP_04099945)；Cry67Aa1(登录号HM485582)；Cry67Aa2(登录号ZP_04148882)；Cry68Aa1(登录号HQ113114)；Cry69Aa1(登录号HQ401006)；Cry69Aa2(登录号JQ821388)；Cry69Ab1(登录号JN209957)；Cry70Aa1(登录号JN646781)；Cry70Ba1(登录号ADO51070)；Cry70Bb1(登录号EEL67276)；Cry71Aa1(登录号JX025568)；Cry72Aa1(登录号JX025569)。
δ-内毒素的例子还包括但不限于美国专利No.5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利No.8,304,604和8,304,605的DIG-3或DIG-11毒素(Cry蛋白诸如Cry1A的α-螺旋1和/或α-螺旋2变体的N端缺失)；美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利No.6,033,874的Cry1C；美国专利No.5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利No.7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；Cry2蛋白，比如美国专利No.7,064,249的Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公布No.2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利No.7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，比如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Naimov，et al.，(2008)Applied andEnvironmental Microbiology74：7145-7151(Naimov等人，2008年，《应用与环境微生物学》，第74卷，第7145-7151页)的Cry15蛋白；美国专利No.6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利No.6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公布No.2006/0191034、2012/0278954和PCT公布No.WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利No.6,083,499、6,548,291和 6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利No.8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；US7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；US 2004/0250311的AXMI-008；US 2004/0216186的AXMI-006；US 2004/0210965的AXMI-007；US 2004/0210964的AXMI-009；US 2004/0197917的AXMI-014；US 2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利No.8,084,416的AXMI-150；US20110023184的AXMI-205；US 2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利No.8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；US 2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；US20090144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利No.8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；美国专利No.8,319,019的Cry蛋白，比如具有经修饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A；以及美国专利申请公布No.2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的Crickmore，et al.，“Bacillusthuringiensis toxin nomenclature”(2011)(Crickmore等人，“苏云金芽孢杆菌毒素命名”，2011年))。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述，参见vanFrannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.101：1-16(van Frannkenhuyzen，2009年，《无脊椎动物病理学杂志》，第101卷，第1-16页))。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的Cry转基因植物已取得监管批准(参见，Sanahuja，(2011)PlantBiotech Journal 9：283-300(Sanahuja，2011年，《植物生物技术杂志》，第9卷，第283-300页)和cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database(可使用“www”前缀在万维网上访问)的CERA(2010)GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment(CERA)，ILSI Research Foundation，Washington D.C.(CERA(2010)转基因作物数据库，环境风险评估中心(CERA)，国际生命科学学院研究基金，华盛顿))。本领域技术人员熟知的不止一种杀虫蛋白也可在植物中表达，比如Vip3Ab & Cry1Fa(US2012/0317682)、Cry1BE &Cry1F(US2012/0311746)、Cry1CA & Cry1AB(US2012/0311745)、Cry1F & CryCa(US2012/0317681)、Cry1DA & Cry1BE(US2012/0331590)、Cry1DA & Cry1Fa(US2012/0331589)、Cry1AB & Cry1BE(US2012/0324606)、以及Cry1Fa & Cry2Aa、Cry1I或Cry1E (US2012/0324605)。杀虫蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，该脂肪酶包括美国专利No.7,491,869的脂酰基水解酶和比如来自链霉菌属(Streptomyces)的胆固醇氧化酶(Purcell et al.(1993)Biochem Biophys Res Commun 15：1406-1413(Purcell等人，1993年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第15卷，第1406-1413页))。杀虫蛋白还包括美国专利No.5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020的VIP(植物性杀昆虫蛋白)毒素等等。其他VIP蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html(可使用“www”前缀在万维网上访问))。杀虫蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，可得自比如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的生物体(参见，美国专利No.7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性，而其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。“独立”TC蛋白(来自例如发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性可通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强A类蛋白的毒性。A类蛋白的例子是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的例子是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的例子是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀虫蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利No.8,334,366)。
(C)编码昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮甾类和保幼激素，其变体、基于其的模拟物或者其拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见例如Hammock，et al.，(1990)Nature 344：458(Hammock等人，1990年，《自然》，第344卷，第458页)，其公开了以杆状病毒来表达克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)。
(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时会扰乱受影响害虫的生理机能。例如参见以下文献的公开内容：Regan，(1994)J.Biol.Chem.269：9(Regan，1994年，《生物化学杂志》，第269卷，第9页)(表达克隆产生出编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt，et al.，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(Pratt等人，1989年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第163卷，第 1243页)(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin))；Chattopadhyay，et al.，(2004)Critical Reviews inMicrobiology 30(1)：33-54(Chattopadhyay等人，2004年，《微生物学评论》，第30卷，第1期，第33-54页)；Zjawiony，(2004)J Nat Prod 67(2)：300-310(Zjawiony，2004年，《天然产物杂志》，第67卷，第2期，第300-310页)；Carlini and Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon 40(11)：1515-1539(Carlini和Grossi-de-Sa，2002年，《毒素》，第40卷，第11期，第1515-1539页)；Ussuf，et al.，(2001)Curr Sci.80(7)：847-853(Ussuf等人，2001年，《当代科学》，第80卷，第7期，第847-853页)，以及Vasconcelos and Oliveira(2004)Toxicon 44(4)：385-403(Vasconcelos和Oliveira，2004年，《毒素》，第44卷，第4期，第385-403页)。还可参见授予Tomalski等人的美国专利No.5,266,317，其公开了编码昆虫特异性毒素的基因。
(E)编码负责单萜烯、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素(phenylpropanoid)衍生物或者别的具有杀昆虫活性的非蛋白分子的超量积累的酶的多核苷酸。
(F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的。参见以Scott等人的名义的PCT申请WO 1993/02197，其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可例如以登录号39637和67152从获得。还可参见Kramer，et al.，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.23：691(Kramer等人，1993年，《昆虫生物化学与分子生物学》，第23卷，第691页)，其教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，以及Kawalleck，et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：673(Kawalleck等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第673页)，其提供了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列，以及美国专利No.6,563,020、7,145,060和7,087,810。
(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella，et al.，(1994)Plant Molec.Biol.24：757(Botella等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第757页)，其公开了绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess，et al.，(1994)PlantPhysiol.104：1467(Griess等人，1994年，《植物生理学》，第104卷，第1467页)，其提供了玉蜀黍钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。
(H)编码疏水力矩肽的多核苷酸。参见PCT申请WO 1995/16776和美国专利No.5,580,852(公开了鲎抗菌肽的肽衍生物，其抑制真菌植物病原体)，以及PCT申请WO 1995/18855和美国专利No.5,607,914(教导了合成的抗微生物肽，其赋予抗病性)。
(I)编码膜透性酶、通道离子载体或通道阻断剂的多核苷酸。例如参见，Jaynes，etal.，(1993)Plant Sci.89：43(Jaynes等人，1993年，《植物科学》，第89卷，第43页)公开的杀菌肽-β溶胞肽类似物的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。
(J)编码病毒侵入性蛋白或从中衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外被蛋白在转化的植物细胞中的积累，可赋予对由该外被蛋白基因衍生的病毒以及相关病毒所造成的病毒感染和/或病害发展的抗性。参见Beachy，et al.，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28：451(Beachy等人，1990年，《植物病理学年评》，第28卷，第451页)。外被蛋白介导的抗性已被赋予转化植物以抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条斑病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。
(K)编码昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中的关键代谢功能的抗体将会灭活受影响的酶，从而杀死昆虫。Cf.Taylor，et al.，Abstract #497，SEVENTH INT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS(Edinburgh，Scotland，1994)(Cf.Taylor等人，第497号摘要，《第七届分子植物微生物国际交流会论文集》(苏 格兰爱丁堡，1994年))(通过产生单链抗体片段对转基因烟草进行酶促灭活)。
(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见例如，Tavladoraki，et al.，(1993)Nature366：469(Tavladoraki等人，1993年，《自然》，第366卷，第469页)，其显示表达重组抗体基因的转基因植物免于病毒攻击。
(M)编码在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内切α-1，4-D-聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同型-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶而有利于真菌定植和植物营养物释放。参见Lamb，et al.，(1992)Bio/Technology 10：1436(Lamb等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第1436页)。Toubart，et al.，(1992)Plant J.2：367(Toubart等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第367页)描述了编码菜豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。
(N)编码在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。例如，Logemann，etal.，(1992)Bio/Technology 10：305(Logemann等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第305页)已表明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物对真菌病害的抗性提高。
(O)参与系统获得性抗性(SAR)响应的基因和/或发病相关基因。Briggs，(1995)Current Biology 5(2)(Briggs，1995年，《当代生物学》，第5卷，第2期)、Pieterse and VanLoon，(2004)Curr.Opin.Plant Bio.7(4)：456-64(Pieterse和Van Loon，2004年，《植物生物学新见》，第7卷，第4期，第456-464页)以及Somssich，(2003)Cell 113(7)：815-6(Somssich，2003年，《细胞》，第113卷，第7期，第815-816页)。
(P)抗真菌基因(Cornelissen and Melchers，(1993)Pl.Physiol.101：709-712(Cornelissen和Melchers，1993年，《植物生理学》，第101卷，第709-712页)；Parijs，etal.，(1991)Planta 183：258-264(Parijs等人，1991年，《植物学》，第183卷，第258-264页)；以及Bushnell，et al.，(1998)Can.J.of Plant Path.20(2)：137-149(Bushnell等人，1998年，《加拿大植物病理学杂志》，第 20卷，第2期，第137-149页))。还可参见美国专利申请序列号09/950,933、11/619,645、11/657,710、11/748,994、11/774,121以及美国专利No.6,891,085和No.7,306,946。用于作为抵抗真菌病原体的植物防御反应的第一步而感知几丁质片段的LysM受体样激酶(US 2012/0110696)。
(Q)解毒基因，比如串珠镰孢菌毒素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮以及它们的结构相关衍生物的解毒基因。例如，参见美国专利No.5,716,820、5,792,931、5,798,255、5,846,812、6,083,736、6,538,177、6,388,171和6,812,380。
(R)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见美国专利No.7,205,453。
(S)防御素基因。参见WO 2003/000863以及美国专利No.6,911,577、6,855,865、6,777,592和7,238,781。
(T)赋予对线虫的抗性的基因。参见例如PCT申请WO 1996/30517、PCT申请WO1993/19181、WO 2003/033651以及Urwin，et al.，(1998)Planta 204：472-479(Urwin等人，1998年，《植物》，第204卷，第472-479页)；Williamson，(1999)Curr Opin Plant Bio.2(4)：327-31(Williamson，1999年，《植物生物学新见》，第2卷，第4期，第327-331页)；美国专利No.6,284,948和7,301,069及miR164基因(WO 2012/058266)。
(U)赋予对疫霉根腐病的抗性的基因，诸如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见例如，Shoemaker，et al.，Phytophthora Root Rot Resistance GeneMapping in Soybean，Plant Genome IV Conference，San Diego，Calif.(1995)(Shoemaker等人，大豆中的疫霉根腐病抗性基因作图，第四届植物基因组会议，加利福尼亚州圣地亚哥，1995年)。
(V)赋予对褐茎腐病的抗性的基因，比如美国专利No.5,689,035中所述，该专利出于此目的以引用方式并入。
(W)赋予对炭疽菌(Colletotrichum)的抗性的基因，比如美国专利申请公布US2009/0035765中所述，该专利出于此目的以引用方式并入。这包括可用作单基因座转换的Rcg基因座。
2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如以下除草剂：
(A)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂比如咪唑啉酮或磺酰脲的抗性的多核苷酸。这个类别的示例性基因编码突变的ALS酶和AHAS酶，例如分别由Lee，et al.，(1988)EMBO J.7：1241(Lee等人，1988年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第1241页)和Miki，et al.，(1990)Theor.Appl.Genet.80：449(Miki等人，1990年，《理论与应用遗传学》，第80卷，第449页)所述。还可参见美国专利No.5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824；美国专利申请序列号11/683,737以及国际专利公布WO 1996/33270。
(B)编码对如下的抗性的蛋白的多核苷酸：草甘膦(抗性分别由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)草胺膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸(proprionic acid)和环己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见例如授予Shah等人的美国专利No.4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘膦抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利No.5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利No.6,566,587、6,338,961、6,248,876 B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、5,094,945、4,940,835、5,866,775、6,225,114 B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE 37,287 E和5,491,288，以及国际专利公布EP 1173580、WO2001/66704、EP 1173581和EP 1173582，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。草甘膦抗性也被赋予给能表达编码草甘膦氧化还原酶的基因的植物，如美国专利No.5,776,760和5,463,175 中更完全地描述，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。另外，可以通过过量表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因向植物赋予草甘膦抗性。参见例如美国专利No.7,462,481、7,405,074和美国专利申请公布No.US 2008/0234130。编码突变的aroA基因的DNA分子可以以登录号39256获得，该突变基因的核苷酸序列在授予Comai的美国专利No.4,769,061中公开。授予Kumada等人的EP申请No.0 333 033和授予Goodman等人的美国专利No.4,975,374公开了赋予对除草剂(比如L-草胺膦)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。草胺膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列在授予Leemans等人的EP申请No.0 242246和0 242 236，De Greef，et al.，(1989)Bio/Technology 7：61(De Greef等人，1989年，《生物/技术》，第7卷，第61页)中提供，其描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。还可参见美国专利No.5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616 B1和5,879,903，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。赋予对苯氧基丙酸和环己酮(比如稀禾定和氟吡甲禾灵)的抗性的示例基因是Marshall，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.83：435(Marshall等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第83卷，第435页)所述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。
(C)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性的蛋白的多核苷酸，所述除草剂为比如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。Przibilla，et al.，(1991)Plant Cell3：169(Przibilla等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第169页)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在授予Stalker的美国专利No.4,810,648中公开，含有这些基因的DNA分子可以以登录号53435、67441和67442获得。Hayes，et al.，(1992)Biochem.J.285：173(Hayes等人，1992年，《生物化学杂志》，第285卷，第173页)描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
(D)编码对乙酰羟酸合酶的抗性的蛋白的多核苷酸，该乙酰羟酸合酶已被发现能使表达这种酶的植物抵抗多种类型的除草剂，其已被引入到多种植物中(参见例如Hattori，et al.，(1995)Mol Gen Genet.246：419(Hattori等人，1995年，《分子遗传学与普通遗传学》，第246卷，第419页))。赋予对除草剂的抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota et al.，(1994)Plant Physiol 106：17(Shiota等人，1994年，《植物生理学》，第106卷，第17页))，编码谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(Aono，et al.，(1995)Plant Cell Physiol36：1687(Aono等人，1995年，《植物细胞生理学》，第36卷，第1687页))，以及编码各种磷酸转移酶的基因(Datta，et al.，(1992)Plant Mol Biol 20：619(Datta等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第619页))。
(E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，原卟啉原氧化酶是产生叶绿素所需的。所述protox酶充当多种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑制所存在的所有不同植物物种的生长，造成它们全部毁灭。能抵抗这些除草剂的含有改变的protox活性的植物的开发在美国专利No.6,288,306 B1、6,282,837 B1和5,767,373以及国际公开WO 2001/12825中有所描述。
(F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂比如喹禾灵))除草剂的耐受性。在植物中实现除草剂耐受性的aad-1基因自身首次公开于WO 2005/107437(还可参见US 2009/0093366)。aad-12基因，源自代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋白，通过使若干具有芳氧基链烷酸酯部分的除草剂(包括苯氧基生长素(例如，2，4-D、MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如，氟草烟、绿草定))失活而赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。
(G)编码美国专利申请公布2003/0135879中公开的用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸；
(H)编码美国专利No.4,810,648中公开的用于赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；
(I)编码Misawa，et al.，(1993)Plant J.4：833-840(Misawa等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第833-840页)以及Misawa，et al.，(1994)Plant J.6：481-489(Misawa等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第481-489页)中所述的实现达草灭耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子。
3.赋予或促成谷粒特性改变的转基因
所述特性例如：
(A)脂肪酸改变，例如，通过以下方式改变：
(1)下调硬脂酰-ACP以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2624(Knultzon等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第2624页)和WO 1999/64579(改变玉米中脂质特性的基因)。
(2)通过FAD-2基因修饰使油酸升高和/或通过FAD-3基因修饰使亚麻酸减少(参见美国专利No.6,063,947、6,323,392、6,372,965和WO 1993/11245)。
(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，参见WO 2001/12800。
(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1 ps、各种Ipa基因(如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt)。例如，参见WO 2002/42424、WO 1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、WO2003/011015、美国专利No.6,423,886、6,197,561、6,825,397以及美国专利申请公布No.US2003/0079247、US 2003/0204870以及Rivera-Madrid，et al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：5620-5624(Rivera-Madrid等人，1995年，《美国国家科学院院刊》，第92卷，第5620-5624页)。
(5)编码如下的基因：产生长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶(美国专利No.8,058,571和8,338,152)、降低饱和脂肪的 δ-9去饱和酶(美国专利No.8,063,269)、改善ω-3脂肪酸分布的报春花Δ6去饱和酶。
(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和多肽，具体地讲，在产生转基因植物和调节种子贮藏化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮藏蛋白)水平的方法中使用的以及在调节植物种子大小、种子数量、种子重量、根长和叶片大小的方法中使用的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499)。
(7)改变高水平表达糖诱导2(HSI2)蛋白在植物中的表达以提高或降低HSI2在植物中的表达。提高HSI2的表达会增加油含量，而降低HSI2的表达会降低脱落酸敏感性和/或增强抗旱性(美国专利申请公布No.2012/0066794)。
(8)细胞色素b5(Cb5)单独表达或与FAD2一起表达以调节植物种子中的油含量，尤其是增加ω-3脂肪酸的水平并提高ω-6与ω-3脂肪酸的比率(美国专利申请公布No.2011/0191904)。
(9)编码用于调节糖代谢的wrinkled1样多肽的核酸分子(美国专利No.8,217,223)。
(B)磷含量改变，例如，通过以下方式改变：
(1)引入植酸酶编码基因将增强肌醇六磷酸的分解，从而给转化植物增加更多的游离磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt，et al.，(1993)Gene 127：87(VanHartingsveldt等人，1993年，《基因》，第127卷，第87页)，其公开了黑曲霉(Aspergillusniger)植酸酶基因的核苷酸序列。
(2)调节降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉蜀黍中，这例如可通过以下方式来实现：将与一种或多种等位基因如LPA等位基因(在以低水平植酸为特征的玉蜀黍突变株中鉴定到)相关的DNA进行克隆并再引入，如WO 2005/113778所述，和/或改变肌醇激酶活性，如WO 2002/059324、美国专利申请公布No.2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申请公布No.2003/0079247、WO 1999/05298、美国专利No.6,197,561、美国专利No.6,291,224、美国专利No. 6,391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公布No.2003/0079247、WO 1998/45448、WO 1999/55882、WO 2001/04147中所述。
(C)碳水化合物改变，例如通过改变能影响淀粉的分支模式的酶的基因来影响，或者通过改变能改变硫氧还蛋白比如NTR和/或TRX(参见美国专利No.6,531,648，其出于此目的以引用方式并入)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体诸如cs27或TUSC27或en27(参见美国专利No.6,858,778以及美国专利申请公布No.2005/0160488、美国专利申请公布No.2005/0204418，这些专利出于此目的以引用方式并入)的基因来影响。参见Shiroza，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：810(Shiroza等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第810页)(链球菌(Streptococcus)突变型果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz，etal.，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220(Steinmetz等人，1985年，《分子遗传学与普通遗传学》，第200卷，第220页)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen，et al.，(1992)Bio/Technology 10：292(Pen等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第292页)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产)，Elliot，et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：515(Elliot等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第515页)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，et al.，(1993)J.Biol.Chem.268：22480(等人，1993年，《生物化学杂志》，第268卷，第22480页)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)以及Fisher，et al.，(1993)Plant Physiol.102：1045(Fisher等人，1993年，《植物生理学》，第102卷，第1045页)(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶II)，WO1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-表异构酶、Fragile 1和2、Ref1、HCHL、C4H改善消化性和/或淀粉提取)，美国专利No.6,232,529(通过改变淀粉水平(AGP)来生产高油种子的方法)。本文提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。
(D)抗氧化物含量或组成改变，如生育酚或生育三烯醇的改变。例如，参见涉及抗氧化物水平操纵的美国专利No.6,787,683、美国专利申请公布No.2004/0034886和WO2000/68393以及通过改变尿黑酸牻牛儿基牻牛儿基转移酶(hggt)的WO 2003/082899。
(E)必需种子氨基酸改变。例如，参见美国专利No.6,127,600(提高种子中的必需氨基酸的积累的方法)、美国专利No.6,080,913(提高种子中的必需氨基酸的积累的二元方法)、美国专利No.5,990,389(高赖氨酸)、WO 1999/40209(改变种子中的氨基酸组成)、WO1999/29882(改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利No.5,850,016(改变种子中的氨基酸组成)、WO 1998/20133(必需氨基酸的水平提高的蛋白质)、美国专利No.5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利No.5,885,801(高苏氨酸)、美国专利No.6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利No.6,459,019(赖氨酸和苏氨酸提高)、美国专利No.6,441,274(植物色氨酸合酶β亚单位)、美国专利No.6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利No.5,939,599(高硫)、美国专利No.5,912,414(甲硫氨酸提高)、WO 1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO1998/45458(必需氨基酸的百分比更高的工程种子蛋白)、WO 1998/42831(赖氨酸提高)、美国专利No.5,633,436(含硫氨基酸含量提高)、美国专利No.5,559,223(具有确定的结构、含有可编程的必需氨基酸水平的合成贮藏蛋白，用来改进植物的营养价值)、WO 1996/01905(苏氨酸提高)、WO 1995/15392(赖氨酸提高)、美国专利申请公布No.2003/0163838、美国专利申请公布No.2003/0150014、美国专利申请公布No.2004/0068767、美国专利No.6,803,498、WO 2001/79516。
4.控制雄性不育的基因：
有几种方法可用来赋予遗传性雄性不育，比如基因组内单独位置处的多个赋予雄性不育的突变基因，如授予Brar等人的美国专利No.4,654,465和4,727,219中公开，以及染色体易位，如Patterson在美国专利No.3,861,709和3,710,511中所描述。除这些方法以外，Albertsen等人的美国专 利No.5,432,068描述了核雄性不育的系统，其包括：甄别对于雄性能育性关键的基因；沉默这个对于雄性能育性关键的天然基因；从该必要的雄性能育性基因除去天然启动子并将其用诱导型启动子代替；将这个经遗传工程改造的基因插回植物中；从而产生雄性不育的植物，因为该诱导型启动子不“启动”而导致该雄性能育性基因不被转录。通过诱导(或“开启”)启动子，其继而允许赋予雄性能育性的基因被转录，来恢复能育性。
(A)在绒毡层特异性启动子的控制下和在施加化学物质N-Ac-PPT的情况下引入脱乙酰酶基因(WO 2001/29237)。
(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956、WO 1992/13957)。
(C)引入芽孢杆菌RNA酶(barnase)和芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)基因(Paul，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.19：611-622(Paul等人，1992年，《植物分子生物学》，第19卷，第611-622页))。
核雄性和雌性不育系统以及基因的另外的例子，还可参见美国专利No.5,859,341、6,297,426、5,478,369、5,824,524、5,850,014和No.6,265,640，所有这些专利据此以引用方式并入。
5.能产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因。
这包括引入可用于FLP/FRT系统的FRT位点和/或可用于Cre/Loxp系统的Lox位点。例如，参见Lyznik，et al.，(2003)Plant Cell Rep 21：925-932(Lyznik等人，2003年，《植物细胞报道》，第21卷，第925-932页)和WO 1999/25821，所述文献据此以引用方式并入。其他可使用的系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser，et al.，(1991)Vicki Chandler，TheMaize Handbook ch.118(Springer-Verlag 1994)(Maeser等人，1991年，Vicki Chandler，《玉蜀黍手册》，第118章(斯普林格出版社，1994年))、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983年)以及pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992年)。
6.影响非生物胁迫抗性的基因
包括但不限于开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性和抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
(A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸盐而改变水利用效率；美国专利No.5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521。
(B)WO 199938977，其描述了能有效减轻严寒、高盐和干旱对植物的不利作用以及赋予植物表型以其他有利作用的基因，包括CBF基因和转录因子。
(C)美国专利申请公布No.2004/0148654和WO 2001/36596，其中植物中的脱落酸被改变，导致植物表型改善，比如产量提高和/或对非生物胁迫的耐受性提高。
(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利No.7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素表达经修饰，产生具有增强的胁迫耐受性(如耐旱性)和/或增加的产量的植物。还可参见WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利No.6,084,153、WO2001/64898、美国专利No.6,177,275和美国专利No.6,107,547(增强氮利用和改变氮响应度)。
(E)有关乙烯改变，参见美国专利申请公布No.2004/0128719、美国专利申请公布No.2003/0166197和WO 2000/32761。
(F)有关植物转录因子或者非生物胁迫的转录调节剂，参见例如美国专利申请公布No.2004/0098764或美国专利申请公布No.2004/0078852。
(G)增加液泡焦磷酸酶的表达的基因，比如实现产量增加的AVP1(美国专利No.8,058,515)；编码HSFA4或HSFA5(A4或A5类的热休克因子)多肽、寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽的核酸；plastochron2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关的同源盒1 样(WOX1样)多肽(美国专利申请公布No.US2011/0283420)。
(H)编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸的下调以调节程序性细胞死亡(美国专利No.8,058,510)使活力增强。
(I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公布No.US2011/0277181)。
(J)编码用于调节发育、调节对胁迫的响应以及调节胁迫耐受性的ACC合成酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公布No.US 2010/0287669)。
(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予抗旱性的蛋白的多核苷酸(WO 2012/058528)。
(L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公布No.2012/0272352)。
(M)实现胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白(美国专利No.8,338,661)。
(N)SAL1编码基因中的突变增强了胁迫耐受性，包括增强的抗旱性(美国专利申请公布No.2010/0257633)。
(O)编码选自如下的多肽的核酸序列的表达：GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽和YTP多肽，增强了产量相关性状(美国专利申请公布No.2011/0061133)。
(P)调节编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸在植物中的表达，以增强植物中的产量相关性状，尤其是增加种子产量(美国专利申请公布No.2010/0024067)。
可将其他影响植物生长和农艺性状(比如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的基因和转录因子引入或渐渗到植物中，参见如WO 1997/49811(LHY)、WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利NO.6,573,430(TFL)、美国专利No.6,713,663(FT)、WO1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利No.6,794,560、美国专利No.6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)以及WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。
7.赋予增加的产量的基因
(A)由1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶样多肽(ACCDP)编码核酸所转化的转基因作物，其中该核酸序列在作物中的表达导致与植物的野生型品种相比，植物根生长增加和/或产量增加，和/或对环境胁迫的耐受性增强(美国专利No.8,097,769)。
(B)使用种子偏好启动子过表达玉蜀黍锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)已显示出能增强植物生长，增加籽粒数量和单株植物的总籽粒重量(美国专利申请公布No.2012/0079623)。
(C)玉蜀黍侧生器官边界(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDP1)的组成性过表达已显示出能增加籽粒数量和单株植物的总籽粒重量(美国专利申请公布No.2012/0079622)。
(D)通过调节编码VIM1(甲基化变体1)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素响应因子)多肽的核酸在植物中的表达来增强植物中的产量相关性状(WO 2012/038893)。
(E)调节编码Ste20样多肽或其同源物的核酸在植物中的表达得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)。
(F)编码用于改变植物根构型的二磷酸核苷激酶(NDK)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公布No.2009/0064373)。
8.赋予植物消化性的基因。
(A)通过调节木聚糖合酶的表达来改变存在于植物细胞壁中的木聚糖的水平(美国专利No.8,173,866)。
在一些实施例中，堆叠的性状可为已取得监管批准的性状或事件，包括但不限于表4A-表4F中的事件。
表4A Triticum aestivum小麦
表4B Glycine max L.大豆
表4B，续表Glycine max L.大豆
表4C Helianthus annuus向日葵
表4D Medidago sativa苜蓿
表4E Oryza sativa水稻
表4F Zea mays L.玉蜀黍
表4F，续表Zea mays L.玉蜀黍
表4F，续表Zea mays L.玉蜀黍
表4F，续表Zea mays L.玉蜀黍
表4F，续表Zea mays L.玉蜀黍
表4F，续表Zea mays L.玉蜀黍
其他监管批准的事件是本领域技术人员熟知的并且可见于环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，可使用www前缀对其进行访问)和国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用www前缀对其进行访问)。
基因沉默
在一些实施例中，堆叠性状可为所关注的一种或多种多核苷酸的沉默形式，从而造成对一种或多种靶标害虫多肽的抑制。在一些实施例中，所述沉默通过使用抑制DNA构建体而实现。
在一些实施例中，编码AfIP-1A多肽、AfIP-1B多肽、FGTW-51(SEQ ID NO：18)和FGTW-52(SEQ ID NO：20)的多肽的一种或多种多核苷酸或其片段或变体可与如上文所述编码具有杀昆虫活性或农艺性状的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地还可包含使如下文讨论的一种或多种靶多核苷酸发生基因沉默的一种或多种多核苷酸。
“抑制DNA构建体”是这样的重组DNA构建体，其在转化或稳定整合到植物的基因组中时导致植物中靶基因的“沉默”。靶基因对于植物可为内源的或转基因的。如本文相对于靶基因所用的“沉默”一般是指对由 靶基因表达的mRNA或蛋白/酶的水平和/或酶活性或蛋白功能的水平的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下降、减小、抑制、消除和防止。“沉默”或“基因沉默”并无特定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。
抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域，并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。根据将要采用的方法，该区域可与所关注的基因的全部或部分有义链(或反义链)100％相同或少于100％相同(例如，至少50％相同或51％与100％相同之间的任何整数)。
抑制DNA构建体是本领域熟知的，易于在选择所关注的靶基因后进行构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更一般地，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体诸如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”是指产生能够抑制靶蛋白的表达的反义RNA转录物。
“反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并且能阻断靶分离核酸片段的表达的RNA转录物(美国专利No.5,107,065)。反义RNA的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或者编码序列。
“共抑制”是指产生能够抑制靶蛋白的表达的有义RNA转录物。“有义”RNA是指包括该mRNA并且可在细胞内或者在体外被翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，植物中的共抑制构建体的设计是通过聚焦与天然mRNA具有同源性的核酸序列在有义取向上的过表达，使得所有与过表达序列具有同源性的RNA减少(参见Vaucheret，et al.，(1998)Plant J.16：651-659(Vaucheret等人，1998年，《植物杂志》，第16卷，第651-659页)和Gura，(2000)Nature404：804-808(Gura，2000年，《自然》，第404卷，第804-808页))。
另一种变型描述了植物病毒序列用于指导近端mRNA编码序列的抑制的用途(PCT公布WO 1998/36083)。
最近的研究已描述了“发夹”结构的用途，所述“发夹”结构掺入了互补取向的全部或部分mRNA编码序列，从而使所表达的RNA产生可能的“茎-环”结构(PCT公布WO 1999/53050)。在这种情况下，茎由与相对于启动子在有义或反义取向上插入的所关注基因相对应的多核苷酸形成，而环由所关注基因的在构建体中不具有互补序列的一些多核苷酸形成。这增加了在回收的转基因植物中共抑制或沉默的频率。有关发夹抑制的综述，参见Wesley，et al.，(2003)Methods in Molecular Biology，Plant Functional Genomics：Methods and Protocols 236：273-286(Wesley等人，2003年，《分子生物学、植物功能基因组学方面的方法：方法和方案》，第236卷，第273-286页)。
一种构建体也已经有效地用于抑制，该构建体的茎由至少30个来自待抑制的基因的核苷酸形成，而环由随机的核苷酸序列形成的(PCT公布WO 1999/61632)。
多聚T和多聚A序列用于建立茎-环结构中的茎的用途也有所描述(PCT公布WO2002/00894)。
又一种变型包括，使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。已经证实，用这样的重组DNA片段制备的转基因生物体具有降低水平的蛋白，该蛋白由形成环的核苷酸片段编码，如PCT公布WO 2002/00904所述。
RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性的转录后基因沉默的过程(Fire，et al.，(1998)Nature 391：806(Fire等人，1998年，《自然》，第391卷，第806页))。植物中的相应过程通常称作转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，而在真菌中也称作压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因的表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共有(Fire，et al.，(1999)TrendsGenet.15：358(Fire等人，1999年，《遗传学趋势》，第15卷，第358页))。这种防止外来基因表达的保护可响应于双链RNA(dsRNA)的生成而逐渐形成，所述双链RNA源自病毒感染，或源自通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应而将转座子元件随机整合到宿主基因组中。dsRNA在细胞中的存在会通过有待充分表征的机制触发RNAi反应。
长dsRNA在细胞中的存在会刺激称作切丁酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切丁酶参与了将dsRNA加工成为称作短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段的过程(Berstein，et al.，(2001)Nature 409：363(Berstein等人，2001年，《自然》，第409卷，第363页))。由切丁酶的作用得到的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19碱基对的双链体(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188(Elbashir等人，2001年，《基因与发育》，第15卷，第188页))。切丁酶也涉及从参与翻译控制的保守结构的前体RNA中切除21-核苷酸和22-核苷酸的小时序RNA(stRNA)(Hutvagner，et al.，(2001)Science 293：834(Hutvagner等人，2001年，《科学》，第293卷，第834页))。RNAi反应也表征了通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)的内切核酸酶复合物，其介导与siRNA双链体的反义链具有序列互补性的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188(Elbashir等人，2001年，《基因与发育》，第15卷，第188页))。另外，RNA干扰也可以涉及小RNA(例如，miRNA)介导的基因沉默，据推测是通过调节染色质结构的细胞机制，从而阻止靶基因序列的转录(参见例如，Allshire，(2002)Science 297：1818-1819(Allshire，2002年，《科学》，第297卷，第1818-1819页)；Volpe，etal.，(2002)Science297：1833-1837(Volpe等人，2002年，《科学》，第297卷，第1833-1837页)；Jenuwein，(2002)Science 297：2215-2218(Jenuwein，2002年，《科学》，第297卷，第2215-2218页)和Hall，et al.，(2002)Science 297：2232-2237(Hall等人，2002年，《科学》，第297卷，第2232-2237页))。这样，本公开的miRNA分子可用于通过与RNA转录物的相互作用或通过与特定基因序列的相互作用而介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后层面的基因沉默。
还提供了使由沉默元件产生的RNAi增加的方法和组合物。在此类实施例中，所述方法和组合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包含有效连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶标害虫序列沉默元件；所述第二多核苷酸包含有效连接至在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件，所述抑制增强元件包含靶标害虫序列或其活性变体或片段。沉默元件与抑制增强元件的联合表达使得由沉默元件产生的抑制性 RNA的扩增较仅沉默元件单独表达可实现的扩增有所增加。除增强特定RNAi物质本身的扩增之外，所述方法和组合物还允许产生不同种群的RNAi物质，其可增强干扰靶基因表达的效力。因此，当在植物细胞中结合沉默元件表达抑制增强元件时，所述方法和组合物可允许整个植物系统性产生RNAi；与仅由单独的沉默元件构建体观察到的相比产生更大量的RNAi；并且改善RNAi在植物韧皮部的载入，因而通过RNAi方法对进食韧皮部的昆虫提供更好的防治。因而，各种方法和组合物提供了将抑制性RNA递送至靶生物体的改善方法。参见例如美国专利申请公布2009/0188008。
如本文所用，“抑制增强元件”包含多核苷酸，所述多核苷酸包含待抑制的靶序列或其活性片段或变体。已认识到，抑制增强元件无需与靶序列相同，相反，抑制增强元件可以包含靶序列的变体，只要抑制增强元件与靶序列具有足够的序列同一性，从而允许由沉默元件产生的RNAi的水平与仅使用沉默元件表达可获得的相比有所提高。类似地，抑制增强元件可包含靶序列的片段，其中片段具有足够长度从而允许由沉默元件产生的RNAi的水平与仅使用沉默元件表达可获得的相比有所提高。
已认识到，可采用来自相同靶序列或来自不同靶序列或来自相同靶序列的不同区域的多个抑制增强元件。例如，所采用的抑制增强元件可以包含源自靶序列的不同区域的靶序列片段(即，源自3′UTR、编码序列、内含子和/或5′UTR)。此外，如本文别处所述，抑制增强元件可包含在表达盒中，并且在具体实施例中，抑制增强元件是在相同或不同的DNA载体或构建体上作为沉默元件。抑制增强元件可以有效连接至本文公开的启动子。已认识到，抑制增强元件可以组成性表达，或者，它可以通过使用在本文别处讨论的各种诱导型、组织偏好或发育调节型启动子以阶段特异性的方式产生。
在具体实施例中，采用沉默元件和抑制增强元件两者时，RNAi的系统性产生贯穿整个植物体。在其他实施例中，与沉默元件构建体单独表达所观察到的相比，本公开的植物或植物部分改善了RNAi进入植物韧皮部的载入，因而通过RNAi方法对进食韧皮部的昆虫提供更好的防治。在具体的实施例中，本公开的植物、植物部分和植物细胞的特征还可以是，允许能增强干扰靶基因表达效力的多样性的RNAi物质的产生。
在具体实施例中，与沉默元件单独表达时所实现的水平相比，沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部的抑制性RNA的浓度。
如本文所用，“抑制性RNA水平增加”包括，与合适的对照植物相比，在具有联合表达的植物中产生的RNAi的水平的任何统计学上显著的增加。例如，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平增加可包括，与合适的对照物相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平增加至少约1％、约1％-5％、约5％-10％、约10％-20％、约20％-30％、约30％-40％、约40％-50％、约50％-60％、约60-70％、约70％-80％、约80％-90％、约90％-100％或更高。在其他实施例中，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平增加可包括，与合适的对照物相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平增加至少约1倍、约1倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80倍-90倍、约90倍-100倍或更高。用于防治椿象和草盲蝽的沉默元件与抑制增强元件的联合表达的例子可见于美国专利申请公布2011/0301223和美国专利申请公布2009/0192117。
一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子来下调昆虫害虫物种中靶基因的表达。PCT公布WO 2007/074405描述了抑制无脊椎害虫(包括科罗拉多马铃薯甲虫)中的靶基因的表达的方法。PCT公布WO 2005/110068描述了作为防治昆虫侵染的一种方式而抑制无脊椎害虫(尤其包括西方玉米根虫)中的靶基因的表达的方法。此外，PCT公布WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫害虫物种(包括来自草盲蝽属的害虫)的靶基因的组合物和方法。核酸分子，包括用于靶向空泡型ATP酶H亚基的RNAi，可用于防治鞘翅目害虫群体和侵染，如美国专利申请公布2012/0198586中所述。PCT公布WO 2012/055982描述了抑制或下调编码如下蛋白的靶基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)：昆虫核糖体蛋白，比如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，比如Rpn6蛋白、Pros25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体、COPI囊泡的γ-外被体、COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫四次跨膜蛋白2A(Tetraspanine 2A)蛋白，其是推定的跨 膜结构域蛋白；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，比如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与胞内蛋白质转运的GTP酶激活物；昆虫皱缩蛋白(crinkled protein)，其是参与肌动活动(motor activity)的非常规肌球蛋白；昆虫歪脖蛋白，其参与细胞核选择性mRNA剪接的调节；昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白以及昆虫Tbp-1，比如Tat结合蛋白。美国专利申请公布2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫中靶基因的表达的作用，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件为双链RNA区域，所述双链RNA区域包含退火的互补链，其中的一条链包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。美国专利申请公布2012/0164205描述了用于抑制无脊椎害虫的干扰双链核糖核酸的可能靶标，包括：Chd3同源序列、β微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白酶体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物水解酶同源序列、依赖溶胀的氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖基化因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、以及α微管蛋白同源序列。
杀虫防治的用途
将包含所述实施例的核酸序列或其变体的菌株用于杀虫剂控制或用于将其他生物体工程改造为杀虫剂的一般方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,039,523和EP 0480762A2。
可选择已知会占领一种或者多种所关注作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供表达AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的基因的稳定维持和表达，并且理想的是，提供对该杀虫剂的改善保护使其不受环境降解和失活。
这种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别要关注的是微生物例如细菌如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属 (Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Aeuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)，真菌尤其是酵母如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别要关注的是植物圈细菌物种如丁香假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌属(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，以及植物圈酵母物种例如深红类酵母菌(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别要关注的是有色素微生物。特别值得关注的宿主生物体包括酵母如红酵母属(Rhodotorula spp.)、短梗霉属(Aureobasidium spp.)、酵母菌属(Saccharomyces spp.)(如酿酒酵母(S.cerevisiae))、掷孢酵母属(Sporobolomyces spp.)，叶面生物体如假单胞菌属(Pseudomonas spp.)(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis))、欧文氏菌属(Erwinia spp.)和黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、以及其他此类生物体，包括根瘤农杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等等。
可将编码所述实施例的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的基因引入到植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)中，以将AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽递送到潜在的靶标害虫。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
根定殖细菌可通过例如本领域已知的方法从所关注的植物分离。具体而言，定殖于根的蜡状芽孢杆菌菌株可从植物的根分离(参见例如，Handelsman et al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718(Handelsman等人，1991年，《应用和环境微生物学》，第56卷，第713-718页))。可通过本领域已知的标准方法将编码所述实施例的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的基因引入到定殖根的蜡状芽孢杆菌中。
可通过电转化手段将编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的基因引入到例如定殖根的芽孢杆菌中。具体而言，可将编码AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的基因克隆到穿梭载体如pHT3101中(Lerecius，et al.，(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218(Lerecius等人，1989年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第60卷，第211-218页))。含有特定AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽基因的编码序列的穿梭载体pHT3101可例如通过电穿孔手段转化到定殖根的芽孢杆菌中(Lerecius，et al.，(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218(Lerecius等人，1989年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第60卷，第211-218页))。
可设计表达系统，使得AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽被分泌到革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的细胞质之外。分泌AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的优点是：(1)避免所表达的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的潜在细胞毒性效应；和(2)改进AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的纯化效率，包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白质回收和纯化效率和降低每单位蛋白质的回收和纯化时间和/或成本。
可例如通过将适当的大肠杆菌信号肽与AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽的氨基末端融合，使AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽在大肠杆菌中分泌。被大肠杆菌识别的信号肽可存在于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白质，例如OmpA蛋白(Ghrayeb，et al.，(1984)EMBOJ，3：2437-2442(Ghrayeb等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2437-2442页))。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白质，因此它的信号肽被认为在转移过程中有效。另外，在加工前不需要对OmpA信号肽进行修饰，而其他信号肽例如脂蛋白信号肽则需要(Duffaud，et al.，(1987)Meth.Enzymol.153：492(Duffaud等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第492页))。
可在细菌宿主中发酵所述实施例的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽，并且将所得的细菌加工并以与Bt菌株已被用作杀昆虫喷雾剂相同的方式用作微生物喷雾剂。在AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽从芽孢杆菌分泌的情况中，用本领域已知的程序将分泌信号移除或者突变。这种突变和/或缺失能防止AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽在发酵过程中分泌到生长培养基中。AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽保持在细胞内，然后将细胞进行加工以得到包囊的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽。任何合适的微生物都可用于这个目的。已用假单胞菌属将Bt毒素表达为包囊蛋白，并且将所得的细胞进行加工并作为杀昆虫剂喷施(Gaertner，et al.，(1993)，in：Advanced Engineered Pesticides，ed.Kim(Gaertner等人，1993年，载于《高级工程化杀虫剂》，Kim编辑))。
或者，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽。异源基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在当将细胞施用于靶标害虫的环境时能延长该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些天然包囊的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽以便施用于靶标害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如EPA 0192319，以及其中引用的参考文献。
杀虫组合物
在一些实施例中，活性成分可以组合物的形式施用，并且可以同时或相继地与其他化合物一起施用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或定时释放或可生物降解的载体制剂，其允许在单次施用所述制剂后对靶区域进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或几种这些制剂的混合物，如果需要，与其他农业上可接受的载体、表面活性剂或在配制领域中通常使用的促进施用的助剂一起使用。合适的载体和助剂可以是固体或者液体，并对应于通常用于配制技术的物质，例如天然或者再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或者肥料。同样地，可将所述制剂制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”，以允许靶标害虫摄食或摄取所述杀虫制剂。
用于施用活性成分或农业化学组合物(包含至少一种由细菌菌株产生的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽)的方法包括叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应害虫侵染的强度。
可以将组合物配制成散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等，并且可以通过常规方法，例如包含所述多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备所述组合物。在包含至少一种此类杀虫多肽的所有这些组合物中，所述多肽可以约1重量％到约99重量％的浓度存在。
可通过本发明的方法在给定区域内杀死鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目害虫或减少其数目，或者可将本发明的方法预防性地应用于环境区域以防止被易感害虫侵染。优选地，害虫摄取杀虫有效量的多肽，或与杀虫有效量的多肽接触。如本文所用，“杀虫有效量”是指这样的杀虫剂的量，所述量能够引起至少一只害虫死亡，或者明显减少害虫生长、取食或正常的生理发育。该量将随下列因素而变化：例如，待防治的具体的靶标害虫，待处理的特定的环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件，以及施用杀虫有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性和数量。所述制剂还可以随气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或害虫侵染的严重程度而变化。
可通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬液或者分离的蛋白质组分与所需的农业上可接受的载体配制在一起来制备所述的杀虫剂组合物。在施用前，可以合适的方法例如冻干、冷冻干燥、干燥，或者在水性载体、介质或合适稀释剂例如盐水或其他的缓冲液中配制所述组合物。配制的组合物可以为粉尘剂或颗粒材料的形式，或者在油(植物或矿物油)中的悬浮液的形式，或者水或油/水乳剂的形式，或者作为可湿性粉剂，或者与适合于农业应用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域熟知的。术语“农业上可接受的载体”包括通常用于杀虫剂配制技术的所有助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些对于杀虫剂配制领域的技术人员来说是熟知的。所述制剂可以与一种或多种固体或液体助剂相混合，并且可以通过多种方法来制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适的助剂一起均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的制剂和施用方法描述于美国专利No.6,468,523中， 其以引用方式并入本文。还可以用一种或多种化学组合物来处理植物，这些化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性的化学组合物包括：果实/蔬菜类除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆(Gowan公司)、百草枯、炔苯酰草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、三嗪茚草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜类杀昆虫剂：涕灭威、转苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriengiensis)、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、乙基多杀菌素(Spinoteram)、杀铃脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(Cyanopyrafen)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、乙基多杀菌素、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑膦(Forthiazate)、苯线磷、硫线磷、吡丙醚、苯丁锡氧化物、噻螨酮(Hexthiazox)、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；果实/蔬菜类杀真菌剂：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、三乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸恶咪唑、赛座灭、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷类除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酯、禾草灵、氟虫腈、精恶唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘甲磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲基二磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻磺隆、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、三甲苯草酮、吡咯磺隆(Pyroxasulfon)；谷类杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷类杀昆虫剂：乐果、λ-氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、毒死蜱、甲胺磷、乙酰甲胺磷(Oxidemethon-methyl)、抗蚜威、甲硫威；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲吩草胺、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮、嘧啶肟草醚、噻酮磺隆、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉蜀黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀铃脲(Triflumoron)、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉蜀黍杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水 稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草丹、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、恶嗪草酮、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔恶草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特糠酯酮、恶草酮(Oxadiazone)、精恶唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆 虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、氟草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、氟草敏、二甲戊灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氟氯氰菊酯、多杀菌素、硫双威、Y-氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、γ-氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、五氯硝基苯；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊灵、得杀草、草铵膦；大豆 杀昆虫剂：λ-氟氯氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫双威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂：氯草敏、甜菜安、甜菜呋、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜 杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；卡诺拉油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；卡诺拉油 菜杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、咪鲜胺、乙烯菌核利；卡诺拉油菜杀昆虫剂：克百威、有机磷酸酯类、除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯(tau-Fluvaleriate)、乙虫腈、多杀菌素、乙基多杀菌素、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。
在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异恶唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧草硫醚、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆、嗪草酮、喹禾灵、S-异丙甲草胺、环嗪酮(Hexazinne)或它们的组合。
在一些实施例中，杀昆虫剂是高效氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、杀线威或它们的组合。
杀虫和杀昆虫活性
“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、壁虱等等。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鳞翅目和鞘翅目。
本领域技术人员会认识到，并不是所有的化合物都对所有的害虫同等有效。所述实施例的化合物显示出对昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。
鳞翅目的幼虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的行军虫、地蚕、尺蠖和实夜蛾SpodopteraSmith(秋夜蛾)；S.exigua Hübner(甜菜夜蛾)；S.lituraFabricius(烟草地蚕，簇毛虫)；Mamestra configurata Walker(披肩粘虫)；M.brassicaeLinnaeus(甘蓝夜蛾)；Agrotis ipsilon Hufnagel(黑地蚕)；A.orthogonia Morrison(西部地蚕)；A.subterranea Fabricius(粒肤地蚕)；Alabama argillacea Hübner(棉叶虫)；Trichoplusia ni Hübner(卷心菜尺蠖)；Pseudoplusia includens Walker(大豆尺蠖)；Anticarsia gemmatalis Hübner(黎豆毛虫)；Hypena scabra Fabricius(苜蓿绿叶蛾)；Heliothis virescens Fabricius(烟青虫)；Pseudaletia unipuncta Haworth(行军虫)；Athetis mindara Barnes and McDunnough(粗皮地蚕)；Euxoa messoria Harris(暗缘地蚕)；Earias insulana Boisduval(刺棉铃虫)；E.vittella Fabricius(翠纹金刚钻)；Helicoverpa armtgera Hübner(美洲螟蛉)；H.zea Boddie(玉米穗虫或棉铃虫)；Melanchra picta Harris(斑马纹夜蛾)；Egira (Xylomyges)curialis Grote(柑橘地老虎)；螟蛾科(Pyralidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、梢斑螟和斑蛾Ostrinia nubilalis Hübner(欧洲玉米螟)；Amyelois transitella Walker(脐橙螟蛾)；Anagasta kuehniellaZeller(地中海粉蛾)；Cadra cautella Walker(杏仁蛾)；Chilo suppressalis Walker(水稻螟虫)；C.partellus(高粱钻心虫)；Corcyra cephalonica Stainton(米蛾)；Crambuscaliginosellus Clemens(玉米根网虫)；C.teterrellus Zincken(蓝草网虫)；Cnaphalocrocis medinalis Guenée(稻卷叶虫)；Desmia funeralis Hübner(葡萄卷叶虫)；Diaphania hyalinata Linnaeus(甜瓜虫)；D.nitidalis Stoll(泡菜虫)；Diatraeagrandiosella Dyar(西南玉米钻心虫)，D.saccharalis Fabricius(甘蔗钻心虫)；Eoreumaloftini Dyar(墨西哥水稻钻心虫)；Ephestia elutella Hübner(烟草(可可)蛾)；Galleria mellonella Linnaeus(大蜡蛾)；Herpetogramma licarsisalis Walker(草地网虫)；Homoeosoma electellum Hulst(向日葵蛾)；Elasmopalpus lignosellus Zeller(小玉米茎钻心虫)；Achroia grisella Fabricius(小蜡螟)；Loxostege sticticalisLinnaeus(甜菜网虫)；Orthaga thyrisalis Walker(茶树网蛾)；Maruca testulalisGeyer(豆荚钻心虫)；Plodia interpunctella Hübner(印度谷蛾)；Scirpophagaincertulas Walker(黄茎钻心虫)；Udea rubigalis Guenée(芹菜叶虫)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫Acleris gloverana Walsingham(西部黑头蚜虫)；A.variana Fernald(东部黑头蚜虫)；Archips argyrospila Walker(果树卷叶虫)；A.rosana Linnaeus(欧洲卷叶虫)；以及其他黄卷蛾属(Archips)物种：Adoxophyesorana Fischer von(棉褐带卷蛾)；Cochylis hospes Walsingham(条纹向日葵螟)；Cydia latiferreana Walsingham(榛树虫)；C.pomonella Linnaeus(苹果蠹蛾)；Platynota flavedana Clemens(杂色卷叶蛾)；P.stultana Walsingham(杂食卷叶蛾)；Lobesia botrana Denis&Schiffermüller(European grape vine moth)；Spilonotaocellana Denis&Schiffermüller(eyespotted bud moth)；Endopiza viteana Clemens(葡萄浆果蛾)；Eupoecilia ambiguella Hübner(葡萄树蛾)；Bonagota salubricolaMeyrick(巴西苹果卷叶蛾)；Grapholita molesta Busck(东方果实蛾)；Suleimahelianthana Riley(向日葵芽蛾)；条卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；色卷蛾属(Choristoneura spp.)。
鳞翅目中选择的其他农艺学害虫包括但不限于Alsophila pometaria Harris(秋尺蠖)；Anarsia lineatella Zeller(桃树枝钻心虫)；Anisota senatoria J.E.Smit(橙色条纹橡树虫)；Antheraea pernyi Guérin-Méneville (中国橡树柞蚕蛾)；Bombyx moriLinnaeus(蚕)；Bucculatrix thurberiella Busck(棉叶潜蛾)；Colias eurythemeBoisduval(苜蓿毛虫)；Datana integerrima Grote&Robinson)(walnut caterpillar)；Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov(西伯利亚丝蛾)，Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺蠖)；Erannis tiliaria Harris(椴树尺蠖)；Euproctis chrysorrhoea Linnaeus(褐尾蛾)；Harrisina americana Guérin-Méneville(葡萄叶雕叶虫)；Hemileuca oliviaeCockrell(牧场毛虫)；Hyphantria cunea Drury(秋天网虫)；Keiferia lycopersicellaWalsingham(番茄蛲虫)；Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst(东部铁杉尺蠖)；L.fiscellaria lugubrosa Hulst(西部铁杉尺蠖)；Leucoma salicis Linnaeus(缎蛾)；Lymantria dispar Linnaeus(舞毒蛾)；Manduca qumquemaculata Haworth(五点天蛾，番茄天蛾幼虫)；M.sexta Haworth(番茄天蛾幼虫，烟草天蛾幼虫)；Operophtera brumataLinnaeus(冬蛾)；Paleacrita vernata Peck(春尺蠖)；Papilio cresphontes Cramer(巨燕尾蝶，橙狗(orange dog))；Phryganidia californica Packard(加州橡树虫)；Phyllocnistis citrella Stainton(柑橘潜叶虫)；Phyllonorycter blancardellaFabricius(斑点幕形潜叶虫)；Pieris brassicae Linnaeus(大白蝴蝶)；P.rapaeLinnaeus(小白蝴蝶)；P.napi Linnaeus(绿脉纹白蝴蝶)；Platyptilia carduidactylaRiley(朝鲜蓟羽蛾)；Plutella xylostella Linnaeus(菱纹背蛾)；Pectinophoragossypiella Saunders(粉色螟蛉)；Pontia protodice Boisduval and Leconte(南方菜青虫)；Sabulodes aegrotata Guenée(杂食尺蠖)；Schizura concinna J.E.Smith(红驼背毛虫)；Sitotroga cerealella Olivier(安古木瓦谷蛾)；Thaumetopoea pityocampaSchiffermuller(松树列队毛虫)；Tineola bisselliella Hummel(结网衣蛾)；Tutaabsoluta Meyrick(番茄斑潜蝇)；Yponomeuta padella Linnaeus(巢蛾)；Heliothissubflexa Guenée；天幕毛虫属(Malacosoma spp.)和毒蛾属(Orgyia spp)。
值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：Anthonomus grandisBoheman(棉籽象鼻虫)；Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel(稻水象鼻虫)；Sitophilusgranarius Linnaeus(谷象鼻虫)；S.oryzae Linnaeus(米象)；Hypera punctataFabricius(车轴草叶 象)；Cylindrocopturus adspersus LeConte(向日葵茎象鼻虫)；Smicronyx fulvus LeConte(红向日葵籽象鼻虫)；S.sordidus LeConte(灰向日葵籽象鼻虫)；Sphenophorus maidis Chittenden(玉蜀黍喙甲))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲和潜叶虫(包括但不限于：Leptinotarsa decemlineataSay(科罗拉多马铃薯甲虫)；Diabrotica virgifera virgifera LeConte(西方玉米根虫)；D.barberi Smith and Lawrence(北方玉米根虫)；D.undecimpunctata howardi Barber(南方玉米根虫)；Chaetocnema pulicaria Melsheimer(玉米跳甲)；Phyllotretacruciferae Goeze(十字花科跳甲)；Phyllotreta striolata(黄曲条跳甲)；Colaspisbrunnea Fabricius(葡萄肖叶甲)；Oulema melanopus Linnaeus(谷叶甲虫)；Zygogrammaexclamationis Fabricius(向日葵叶甲))；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：Epilachna varivestis Mulsant(墨西哥豆瓢虫))；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫(包括但不限于：Popillia japonica Newman(日本甲虫)；Cyclocephalaborealis Arrow(北方隐金龟子，白蚧螬)；C.immaculata Olivier(南方隐金龟子，白蚧螬)；Rhizotrogus majalis Razoumowsky(欧洲金龟子)；Phyllophaga crinitaBurmeister(白蛴螬)；Ligyrus gibbosus De Geer(胡萝卜金龟)；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自叩头虫科(Elateridae)的铁线虫、伪金针虫属(Eleodes spp.)、金针虫属(Melanotus spp.)；宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)；丘胸叩甲属(Limonius spp.)；细胸叩甲属(Agriotes spp.)；Ctenicera属；Aeolus属；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫以及来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。
双翅目(Diptera)的成体和未成熟体是值得关注的，包括潜叶虫Agromyzaparvicornis Loew(玉米斑潜叶虫)；摇蚊(包括但不限于SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331，Contarinia sorghicolaCoquillett(高粱摇蚊)；Mayetiola destructor Say(黑森蝇)；Sitodiplosis mosellanaGéhin(小麦摇蚊)；Neolasioptera murtfeldtiana Felt(向日葵籽摇蚊))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、Oscinella frit Linnaeus(果蝇)；蛆(包括但不限于SEQ ID NO：90、SEQID NO：92、SEQ ID NO：323、 SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：331，Delia platuraMeigen(玉米种蝇)；D.coarctata Fallen(麦种蝇)以及其他地种蝇属(Delia spp.)：Meromyza americana Fitch(麦秆蝇)；Musca domestica Linnaeus(家蝇类)；Fanniacanicularis Linnaeus，F.femoralis Stein(小家厕蝇)；Stomoxys calcitrans Linnaeus(厩蝇类)；面蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属(Chrysomya spp.)；伏蝇属(Phormia spp.)和其他蝇类(muscoid fly)害虫、马蝇类虻属(Tabanus spp.)；肤蝇类胃蝇属(Gastrophilus spp.)；狂蝇属(Oestrus spp.)；牛蝇类皮蝇属(Hypoderma spp.)；鹿蝇类斑虻属(Chrysops spp.)；Melophagus ovinus Linnaeus(虱蝇类)和其他短角亚目(Brachycera)、蚊类伊蚊属(Aedesspp.)；按蚊属(Anopheles spp.)；库蚊属(Culex spp.)；黑蝇类原蚋属(Prosimuliumspp.)；蚋属(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
作为所关注的昆虫而包括的是半翅目和同翅目的成体和幼虫，例如但不限于来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜；来自盲蝽科(Miridae)的植食蝽；来自蝉科(Cicadidae)的蝉；来自叶蝉科(Cicadellidae)的叶蝉、小绿叶蝉属(Empoasca spp.)；来自菱飞虱科(Cixiidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、圆飞虱科(Issidae)以及稻虱科(Delphacidae)的飞虱；来自角蝉科(Membracidae)的角蝉；来自木虱科(Psyllidae)的木虱；来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱；来自蚜科(Aphididae)的蚜虫；来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤蚜；来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧；来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、软介壳虫科(Coccidae)、洋红蚧科(Dactylopiidae)、盾介壳虫科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)以及硕介壳虫科(Margarodidae)的介壳虫；来自网蝽科(Tingidae)的网蝽；来自蝽科(Pentatomidae)的椿象；麦长蝽；土长蝽属(Blissus spp.)；以及来自长蝽科(Lygaeidae)的其他长蝽(seed bug)；来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉；来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽以及来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的红蝽和棉蝽象。
来自同翅目的在农业上重要的成员还包括但不限于：Acyrthisiphon pisumHarris(豌豆蚜虫)；Aphis craccivora Koch(豇豆蚜虫)；A.fabae Scopoli(黑豆蚜虫)；A.gossypii Glover(棉花蚜虫，甜瓜蚜虫)；A. maidiradicis Forbes(玉米根蚜虫)；A.pomi De Geer(苹果蚜虫)；A.spiraecola Patch(绣线菊蚜虫)；Aulacorthum solaniKaltenbach(茄无网蚜)；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓蚜虫)；Diuraphisnoxia Kurdjumov/Mordvilko(俄罗斯小麦蚜虫)；Dysaphis plantaginea Paaserini(红苹果蚜虫)；Eriosoma lanigerum Hausmann(苹果绵蚜)；Brevicoryne brassicae Linnaeus(卷心菜蚜虫)；Hyalopterus pruni Geoffroy(桃大尾蚜)；Lipaphis erysimi Kaltenbach(萝卜蚜)；Metopolophium dirrhodum Walker(麦长管蚜)；Macrosiphum euphorbiaeThomas(马铃薯长管蚜)；Myzus persicae Sulzer(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；Nasonoviaribisnigri Mosley(莴苣蚜虫)；瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)(根蚜和瘿蚜)；Rhopalosiphum maidis Fitch(玉米叶蚜虫)；R.padi Linnaeus(禾谷缢管蚜)；Schizaphisgraminum Rondani(麦二叉蚜)；Sipha flava Forbes(黄色甘蔗蚜虫)；Sitobion avenaeFabricius(麦长管蚜)；Therioaphis maculata Buckton(斑点苜蓿蚜)；Toxopteraaurantu Boyer de Fonscolombe(黑色柑橘蚜虫)和T.citricida Kirkaldy(褐色柑橘蚜虫)；球蚜属(Adelges spp.)(球蚜类)；Phylloxera devastatrix Pergande(长山核桃根瘤蚜)；Bemisia tabaci Gennadius(烟草粉虱，甘薯粉虱)；B.argentifolii Bellows&Perring)(silverleaf whitefly)；Dialeurodes citri Ashmead(柑桔粉虱)；Trialeurodes abutiloneus(纹翅粉虱)和T.vaporariorum Westwood(温室粉虱)；Empoasca fabae Harris(马铃薯叶蝉)；Laodelphax striatellus Fallen(灰飞虱)；Macrolestes quadrilineatus Forbes(紫莞叶蝉)；Nephotettix cinticeps Uhler(绿叶蝉)；N.nigropictus(水稻叶蝉)；Milaparvata lugens(褐飞虱)；Peregrinusmaidis Ashmead(玉米飞虱)；Sogatella furcifera Horvath(白背飞虱)；Sogatodesorizicola Muir(水稻飞虱)；Typhlocyba pomaria McAtee(苹果白叶蝉)；葡萄斑叶蝉属(Erythroneoura spp.)(葡萄斑叶蝉)；Magicicada septendecim Linnaeus(周期蝉)；Icerya purchasi Maskell(吹绵蚧)；Quadraspidiotus perniciosus Comstock(梨园蚧)；Planococcus citri Risso(柑橘粉蚧)；粉蚧属(Pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；Cacopsylla pyricola Foerster(梨木虱)；Trioza diospyri Ashmead(柿木虱)。
来自半翅目的所关注的在农业上重要的物种包括但不限于：Acrosternum hilareSay(绿蝽象)；Anasa tristis De Geer(南瓜缘蝽)；Blissus leucopterus leucopterusSay(麦长蝽)；Corythuca gossypii Fabriciu(棉花网蝽)；Cyrtopeltis modesta Distant(蝽)；Dysdercus suturellus (棉蝽)；Euschistus servus Say(褐椿象)；E.variolarius Palisot de Beauvois(一斑蝽象)；长蝽属(Graptostethus)物种(长蝽系群(complex of seed bugs))；Leptoglossus corculus Say(松叶根蝽)；Lyguslineolaris Palisot de Beauvois(牧草盲蝽)；L.Hesperus Knight(西方牧草盲蝽)；L.pratensis Linnaeus(牧草盲蝽)；L.rugulipennis Poppius(欧洲牧草盲蝽)；Lygocorispabulinus Linnaeus(长绿盲蝽)；Nezara viridula Linnaeus(南方绿蝽)；Oebaluspugnax Fabricius(稻蝽象)；Oncopeltus fasciatus Dallas(大马利筋蝽)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)。
此外，实施例可有效对抗例如如下半翅目昆虫：Calocoris norvegicus Gmelin(草莓蝽)；Orthops campestris Linnaeus；Plesiocoris rugicollis Fallen(苹盲蝽)；Cyrtopeltis modestus Distant(番茄蝽)；Cyrtopeltis notatus Distant(烟草小盲蝽)；Spanagonicus albofasciatus Reuter(白斑盲蝽)；Diaphnocoris chlorion is Say(皂荚蝽)；Labopidicola allii Knight(洋葱蝽)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)；Adelphocoris rapidus Say(苜蓿褐盲蝽)；Poecilocapsus lineatus Fabricius(四线盲蝽)；拟麦长蝽(Nysius ericae Schilling)(假麦长蝽)；茶黄蓟马(Nysius raphanusHoward)(假麦长蝽)；Nezara viridula Linnaeus(南方绿蝽)；扁盾蝽属(Eurygasterspp.)；缘蝽属(Coreidae spp.)；红蝽属(pyrrhocoridae spp.)；谷蛾属(Tinidae spp.)；负子蝽属(Blostomatidae spp.)；猎蝽属(Reduviidae spp.)以及臭蝽(Cimicidae spp)。
另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如Aceria tosichella Keifer(小麦卷叶螨)Petrobia latens Müller(褐色小麦螨)；叶螨科(Tetranychidae)的蜘蛛螨和红螨，Panonychus ulmi Koch(欧洲红螨)；Tetranychus urticae Koch(二斑蜘蛛螨)；(T.mcdanieli McGregor(迈叶螨)；T.cinnabarinus Boisduval(红蜘蛛螨)；T.turkestaniUgarov&Nikolski(草莓蜘蛛螨)；细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨类、Brevipalpuslewisi McGregor(桔短须螨)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱类。Ixodes scapularis Say(鹿蜱)；I.holocyclus Neumann(澳洲寄生蜱)；Dermacentorvariabilis Say(美洲犬蜱)；Amblyomma americanum Linnaeus(美洲钝眼蜱)以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫是值得关注的，例如Lepisma saccharinaLinnaeus(蠹虫)；Thermobia domestica Packard(小灶衣鱼)。
所涵盖的其他节肢害虫包括：蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如Loxosceles reclusaGertsch and Mulaik(褐色隐士蜘蛛)和Latrodectus mactans Fabricius(黑寡妇蜘蛛)以及蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类例如Scutigera coleoptrata Linnaeus(蚰蜒)。
所关注的昆虫害虫包括椿象和其他相关昆虫的总科，包括但不限于属于蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽、璧蝽(Piezodorus guildini)、褐臭蝽、喜绿蝽、大豆褐椿、Euschistustristigmus、喜绿蝽、Dichelops furcatus、Dichelops melacanthus和Bagrada hilaris(菘蝽))、龟蝽科(筛豆龟蝽-豆圆蝽(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-根椿象)的物种，以及鳞翅目物种，包括但不限于：小菜蛾，例如谷实夜蛾；大豆尺蠖，例如大豆尺夜蛾以及黎豆毛虫，例如黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)。
用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如，Czapla and Lang，(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485(Czapla和Lang，1990年，《经济昆虫学杂志》，第83卷，第2480-2485页)；Andrews，et al.，(1988)Biochem.J.252：199-206(Andrews等人，1988年，《生物化学杂志》，第252卷，第199-206页)；Marrone，et al.，(1985)J.of EconomicEntomology 78：290-293(Marrone等人，1985年，《经济昆虫学杂志》，第78卷，第290-293页)以及美国专利No.5,743,477，所有这些文献全文以引用方式并入本文。一般而言，将蛋白混合并用于摄食测定。参见例如Marrone，et al.，(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293(Marrone等人，1985年，《经济昆虫学杂志》，第78卷，第290-293页)。此类测定法包括将植物与一种或多种害虫接触以及测定植物存活和/或促使害虫死亡的能力。
线虫包括寄生线虫比如根结、孢囊和根腐线虫，包括孢囊线虫属(Heteroderaspp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫属(Globodera spp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于Heterodera glycines(大豆孢囊线虫)；Heterodera schachtii(甜菜孢囊线虫)；Heterodera avenae(禾谷孢囊线虫)以及Globodera rostochiensis和Globodera pailida(马铃薯孢囊线虫)。根腐线虫包括短体线虫属(Pratylenchus spp.)。
种子处理剂
为了保护并提高产率产量和性状技术，种子处理剂的选用可提供额外的作物计划灵活性以及对于昆虫、杂草和病害的经济有效的防治。对种子材料的处理，通常是表面处理，可用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物。这些化合物通常与在配制领域中惯常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的助剂一起配制。包衣可以通过用液体制剂浸渍增殖材料或通过用混合的湿或干制剂涂覆来实施。可用作种子处理剂的各种类型化合物的例子在由英国农作物保护委员会(British Crop Production Council)出版的The Pesticide Manual：A WorldCompendium，C.D.S.Tomlin Ed.(《杀虫剂手册：世界纲要》，C.D.S.Tomlin编辑)中提供，该文献据此以引用方式并入。
可用于作物种子上的一些种子处理剂包括但不限于如下的一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、杀草强、氧环唑、固氮螺菌、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属(包括蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)、慢生根瘤菌属(bradyrhizobium spp.)(包括甜菜慢生根瘤菌、加那利慢生根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、辽宁慢生根瘤菌、地瓜慢生根瘤菌和/或圆明园慢生根瘤菌中的一种或多种)、克菌丹、萎锈灵、壳聚糖、噻虫胺、铜、氰虫酰胺、苯醚甲环唑、土菌灵(etidiazole)、氟虫腈、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮(isoflavenoids)、脂壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、腈菌唑、PCNB、戊苯吡菌胺、青霉属、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧 菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氟虫酰胺、S-异丙甲草胺、皂草苷、环苯吡菌胺、TCMTB、戊唑醇、噻苯哒唑、噻虫嗪、硫双威、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。PCNB种子包衣是指EPA注册号00293500419，含有五氯硝基苯和依得利。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。
可测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪种种子处理剂选项和施用速率可补充此类品种和转基因性状以提高产量。例如，具有良好产量潜力但存在丝黑穗病易感性的品种可受益于提供防丝黑穗病的保护的种子处理剂的使用，具有良好产量潜力但存在胞囊线虫易感性的品种可受益于提供防胞囊线虫的保护的种子处理剂的使用，以此类推。同样地，涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂所赋予的第二作用模式，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可受益于用增强植物对该除草剂的抗性的安全剂进行的种子处理，等等。此外，由种子处理剂的适当使用所引起的良好根系建成和提早出苗可使得在与种子处理剂结合时包含特定性状的一个品种或多个品种更有效地使用氮、抵御干旱的能力更佳、以及产量潜力总体增加。
用于杀灭昆虫害虫并防治昆虫种群的方法
在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫同时地或顺序地与杀昆虫有效量的重组AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽接触。在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的SEQ ID NO：18的重组杀虫蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体接触。
在一些实施例中，提供了用于防治昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群同时地或顺序地与杀昆虫有效量的重组AfIP-1A和AfIP-1B多肽接触。在一些实施例中，提供了用于防治昆虫害虫种群的方法，包括使昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的SEQ ID NO：18的重组杀虫蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体接触。如本文所用，“防治害虫种群”或“防治害虫”是指针对害虫的使其造成的损害受到限制的任何效应。防治害虫包括但不限于以一定方式杀灭害虫、抑制害虫发育、改变害虫繁殖力或生长，使得害虫对植物造成的损害减轻，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的害虫，产生易受捕食者攻击的害虫，或阻止害虫啃食植物。
在一些实施例中，提供了用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群同时地或顺序地与杀昆虫有效量的重组AfIP-1A和AfIP-1B多肽接触。在一些实施例中，提供了用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的SEQ ID NO：18的重组杀虫蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体接触。
在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码AfIP-1A和AfIP-1B多肽的重组多核苷酸。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法，包括在植物或其细胞中表达编码SEQ ID NO：18的杀虫蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体的重组多核苷酸。
Cry3A抗性WCRW集群
还提供了Cry3A抗性的经实验室选择的西方玉米根虫(WCRW)集群，其具有对经修饰的Cry3A(mCry3A)(US 7,030,295)纯化蛋白和表达高水平mCry3A的玉蜀黍事件增强的耐受性。在一些实施例中，根据基于饲料的生物测定中的LC50值，Cry3A抗性WCRW集群对mCry3A的耐受性/抗性水平为RR＞90。从幼虫到成体对表达高水平mCry3A的玉蜀黍事件的存活率相对于等位基因系阴性对照处理为＞60％。已报道了针对玉蜀黍事件(MIR604)选择的Cry3A抗性WCRW集群，其中对于MIR604-B，根中的mCry3A表达水平(μg mCry3A/g干重)为23.55-27.07，并且对于MIR604-C为16.29-21.18(US EPA 2010)(Meihls，L.，et al.，Journal of Economic Entomology 104：1045-1054(2011)(Meihls，L.等人，《经济昆虫学杂志》，第104卷，第1045-1054页，2011年))。MIR604所产生的Cry3A抗性WCRW集群从幼虫到成体的存活率相对于非Bt等位基因系为40％，这导致在10代选择之后对mCry3A的低耐受性/抗性水平(基于LC50，RR＝15.4)。
在一些实施例中，提供了方法，其使用本公开的Cry3A抗性WCRW集群测试Cry3A抗性以及杀昆虫蛋白(包括但不限于Cry蛋白)和dsRNA分子的Cry3A交叉抗性。在一些实施例中，提供了方法，其使用本公开的Cry3A抗性WCRW集群测试Cry3A抗性以及本公开AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽的Cry3A交叉抗性。在一些实施例中，提供了方法，其使用本公开 的Cry3A抗性WCRW集群测试Cry3A抗性作为昆虫抗性治理(IRM)策略的一部分。
在一些实施例中，提供了方法，其使用本公开的Cry3A抗性WCRW集群筛查杀昆虫蛋白的Cry3A交叉抗性。在一些实施例中，提供了方法，其使用本公开的Cry3A抗性WCRW集群筛查AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽的Cry3A交叉抗性。
在一些实施例中，提供了方法，其使用基于转录组分析的分子标记来检测Cry3A抗性昆虫。
昆虫抗性治理(IRM)策略
已证实，苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达是防治农业上重要的昆虫害虫的有效手段(Perlak等人，1990年；1993年)。然而，昆虫已进化成能抵抗在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素。此类抗性如果广泛分布的话将明显限制包含编码此类苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。
增加转基因杀昆虫剂应对靶标害虫的效力并且同时降低具有杀昆虫剂抗性的害虫的发育的一种方法是，提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(非杀昆虫作物/玉米的一部分)以与产生对于靶标害虫有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency)(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，可使用www前缀对其进行访问)公布了与产生对于靶标害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。此外，全国玉米种植者协会(National Corn Growers Association)在其网站上：(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn，可使用www前缀对其进行访问)也提供了有关庇护所要求的类似指南。由于庇护区域内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可能会降低总产量。
增加转基因杀昆虫剂应对靶标害虫的效力并且同时降低具有杀昆虫剂抗性的害虫的发育的另一种方法将是，保有能有效抵抗昆虫害虫种群并通过不同作用模式显示其效应的杀昆虫基因的库。
在植物中表达对相同的昆虫物种具有毒性的两种或更多种杀昆虫组合物(每种杀昆虫剂以有效水平表达)将是实现控制抗性发展的另一种方 法。这是基于这样的原理：相比仅一种作用模式，针对两种单独作用模式更不可能进化出抗性。Roush例如概括了双重毒素策略，也称为“金字塔堆砌”或“堆叠”，以用于管理杀昆虫转基因作物。(The RoyalSociety.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353：1777-1786(皇家学会，《伦敦皇家学会哲学汇刊B辑》，1998年，第353卷，第1777-1786页))。均能有效抵抗靶标害虫且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白的堆叠或金字塔堆砌可允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植的非Bt玉米的结构庇护所(一般5％)显著小于单一性状产品(一般20％)。提供庇护所的IRM效应有多种方法，包括田间的多种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如Roush进一步讨论。
在一些实施例中，本公开的AfIP-1A和AfIP-1B多肽可用作与其他杀虫蛋白组合(即，金字塔堆砌)的昆虫抗性治理策略，所述其他杀虫蛋白包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属或发光杆菌属杀昆虫蛋白等等。
提供了防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染的方法，所述方法促进了昆虫抗性治理，包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。
在一些实施例中，防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法，杀昆虫蛋白中的至少一种包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的AfIP-1A和AfIP-1B多肽。
在一些实施例中，防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法，杀昆虫蛋白中的至少一种包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的SEQ ID NO：18的蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体。
在一些实施例中，防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法，包括在转基因植物中表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性且具有不同作用模式的AfIP-1A和AfIP-1B多肽以及Cry蛋白。
在一些实施例中，防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法，包括在转基因植物中表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性且具有不同作用模式的SEQ ID NO：18的蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体以及Cry蛋白。
还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法，包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的AfIP-1A和AfIP-1B多肽，同时联合表达具有不同作用模式的昆虫物种的第二杀昆虫蛋白。
还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法，包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的SEQ IDNO：18的蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体，同时联合表达具有不同作用模式的昆虫物种的第二杀昆虫蛋白。
还提供了用于转基因植物的有效的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性治理的方式，包括以高水平在植物中共表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白，其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白包括AfIP-1A和AfIP-1B多肽以及Cry蛋白。还提供了用于转基因植物的有效的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性治理的方式，包括以高水平在植物中共表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白，其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白包括SEQ ID NO：18的蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体以及Cry蛋白。
此外，提供了用于获得表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法，包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述昆虫测定结合数据表明，在此类昆虫中，AfIP-1A和AfIP-1B多肽不与Cry蛋白的结合位点竞争。此外，提供了用于获得表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法，包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述昆虫测定结合数据表明，在此类昆虫中，SEQ ID NO：18的蛋白和/或SEQ ID NO：20的蛋白或其变体不与Cry蛋白的结合位点竞争。
用于增加植物产量的方法
提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文所公开的杀虫多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，以及在被害虫侵染的田地使该植物或其种子生长，其中所述多肽对所述害虫具有杀虫活性。在一些实施例中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫害虫 具有杀虫活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫害虫侵染。
如本文所定义，植物的“产量”是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。如本文所用，“生物质”是指任何被测量的植物产品。生物质生产的增加是被测量植物产品的产量上的任何改善。增加植物产量具有若干商业应用。例如，增加植物叶片生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜类的产量。另外，增加叶片生物质可以用于增加植物衍生的药用或工业产品的生产。产量的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量增加至少1％、增加至少3％、增加至少5％、增加至少10％、增加至少20％、增加至少30％、增加至少50％、增加至少70％、增加至少100％或增加更多。
在具体方法中，由于表达本文所公开的AfIP-1A和AfIP-1B多肽的植物对害虫的抗性增强而造成了植物产量的增加。AfIP-1A和AfIP-1B多肽的表达导致害虫侵染或采食植物的能力降低，从而提高植物产量。
加工方法
还提供了加工植物、植物部分或种子以从包含AfIP-1A多肽和/或AfIP-1B多肽的植物、植物部分或种子获得食物或饲料产品的方法。可加工本文提供的植物、植物部分或种子以产生油、蛋白产品和/或副产品，所述油、蛋白产品和/或副产品是通过加工获得的具有商业价值的衍生物。非限制性例子包括包含编码AfIP-1A多肽和/或AfIp-1B多肽的核酸分子的转基因种子，可加工所述转基因种子以产生大豆油、大豆产品和/或大豆副产品。
“加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，并且包括但不限于热调节、压片和研磨、挤出、溶剂提取或水浸以及完整或部分种子的提取。
以下实例是以说明性而非限制性方式提供的。
实验
实例1-从菌株DDMC P4G7甄别对于西方玉米根虫有活性的杀昆虫蛋白
按照如下方式通过蛋白纯化、N端氨基酸测序和PCR克隆从细菌菌株DDMC P4G7甄别杀昆虫蛋白AfIP-1A-31和AfIP-1B-32。从Luria发酵液 (LB)中生长并在28℃下培养过夜的DDMC P4G7的细胞裂解物中观察到对于西方玉米根虫(Diabrotica virgiferavirgifera，WCRW)的杀昆虫活性。
使用与熔融的低熔点WCRW饲料(阿肯色州莱克村的南部产品公司(SouthlandProducts Inc.，Lake Village，Arkansas))在96孔格式中混合的细胞裂解物样品进行西方玉米根虫(WCRW)生物测定。在96孔板的每个孔中放入西方玉米切根虫(Diabroticavirgifera virgifera)新生幼虫。将该测定在25℃下运行四天，然后对昆虫死亡率和昆虫生长迟缓进行评分。评分被记录为死亡、生长极度迟缓(很少或无生长但存活)、生长迟缓(生长到二龄期，但不等同于对照)或无活性。对表现出死亡或生长极度迟缓的样品进行进一步研究。
使用GenEluteTM细菌基因组DNA试剂盒(西格玛公司(Sigma))提取基因组DNA。使用HF advantage PCR试剂盒(科隆达公司(Clontech))和16S保守PCR引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(16SFOR)(SEQ ID NO:7)和ACGGCTACCTTGTTACGACTT(16SREV)(SEQID NO:8)通过聚合酶链反应来产生16S核糖体序列。使用ABI BigDyeTM terminator版本3.1Prism测序试剂盒在96孔板中对该反应的DNA产物进行末端测序。在基于乙醇的清洗后，在Life TechnologiesTM ABI 3730xl自动测序仪上解析并检测循环测序反应产物，并且从该测序仪检索单独的序列。16s rRNA基因序列用作对类似序列的GenBank FastA搜索(Wisconsin软件包版本9.0，威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机小组(Genetics ComputerGroup,Madison,Wis.))的查询序列。基于rRNA基因序列，菌株被鉴定为粪产碱菌。粪产碱菌菌株DDMC P4G7以登录号NRRL B-50625于2011年12月16日保藏于农业研究菌种保藏中心(NRRL)，1815North University Street,Peoria,Illinois 61604(伊利诺州皮奥里亚北方大学街道1815号，邮编61604)(nrrl.ncaur.usda.gov，可使用“www”前缀在万维网上访问)。
使用TS系列细胞粉碎机(恒定系统公司(Constant Systems Inc.))中的两程，将来自DDMC P4G7单菌落的过夜培养物的细胞沉淀物裂解。用40％硫酸铵将澄清的提取物分级分离，并且通过离心移除沉淀的蛋白。将硫酸铵浓度升高至80％饱和度，通过离心移除沉淀的蛋白。将沉淀物级分溶解于20mM Na MOPS pH 7.1、10mM NaCl中，离心并且使用GEHiPrep 26/10脱盐柱将其脱盐到20mM MOPS pH 7.1、10mM NaCl中。将脱盐的提 取物上样于适当尺寸的20mL CeramicQ阴离子交换柱(颇尔公司(Pall))。线性7.5个柱体积的梯度以0至300mM NaCl运行。针对上述杀虫生物测定中的WCRW，来测试CeramicQ阴离子交换柱的级分。将WCRW活性Hyper D合并液浓缩、脱盐并上样于22mL羟基磷灰石柱(1型羟基磷灰石，伯乐公司(Bio-Rad))并且15个床体积的梯度以0至150mM磷酸钠pH 6.8运行。用10kDa旋转过滤器将WCRW活性级分浓缩，并上样于在100mM碳酸氢铵中平衡的200柱。再次测定按照200色谱法获得的级分的WCRW活性。在这一阶段，发现：两种组分或级分的混合对于保持针对WCRW的高水平活性是必需的，这表明可能需要不止一种蛋白。将每种甄别出的WCRW活性组分合并液上样于0.8mLSAX柱(戴安公司(Dionex))，并且60个柱体积的梯度从0开始到220mM NaCl，pH6.2。再一次测定级分在存在或不存在第二组分的情况下对于WCRW的活性。进一步纯化WCRW活性组分，得到LDS电泳凝胶上的单个条带。较大的组分(本文表示为AfIP-1B-32)预计为大约76kDa，并且较小的组分(本文表示为AfIP-1A-31)预计为大约16kDa。当单独地评估时单独的组分仅在较高浓度下才表现出杀昆虫活性，而AfIP-1A-31与AfIP-1B-32的组合在约低100倍的浓度下就能抑制WCRW幼虫的生长。
为了测定AfIP-1A-31和AfIP-1B-32蛋白序列，进行了N端测序和质谱分析。将LDS凝胶的与76KDa和16KDa条带相对应的部分脱色、切割并进行N端测序和MS鉴定。用脱色的切割凝胶条带制备用于MS鉴定的消化蛋白。将切割的凝胶条带用DTT还原，然后用碘乙酰胺进行烷基化。在用胰蛋白酶过夜消化后，对样品进行LCMS分析。
使用与Eksigent NanoLC-1D PlusTM纳升LC系统(加利福尼亚州都伯林的Eksigent公司(Eksigent，Dublin，CA)耦合的LTQ Orbitrap XLTM质谱仪(加利福尼亚州圣何塞的热电科技公司(Thermo Scientific，San Jose，CA))上的电喷雾，进行经胰蛋白酶消化的肽的液相色谱法-串联质谱法(LC-MS/MSMS)分析。
测定AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的N端部分的氨基酸序列。将所关注的蛋白印迹到PVDF膜上，并插入Procise测试盒(cartridge)中以在Applied 494蛋白测序仪(加利福尼亚州的应用生物系统公司 (AppliedCalifornia))上进行向PTH(乙内酰苯硫脲)氨基酸的化学转化。
将所得的N端氨基酸序列针对内部数据库(Bacteria-Plus)进行BLAST搜索，所述内部数据库包括来自NCBI非冗余数据库(nr)的所有细菌蛋白序列和角蛋白序列以及内部蛋白序列。使用由粪产碱菌菌株DDMC P4G7的基因组序列产生的重叠群建立小型核苷酸序列搜索数据库。对于该菌株所产生的重叠群在实例2中有所描述。还使用EMBOSS getorf软件将DDMC P4G7重叠群翻译成开放阅读框蛋白(ORF)。
实例2-AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的基因组测序
根据亿明达公司开发的文库构建方案制备分离的粪产碱菌菌株DDMCP4G7基因组DNA，并使用基因组分析仪IIx进行测序。装配这些核酸重叠群序列，产生开放阅读框。
针对通过重叠群装配的开放阅读框(ORF)所预测的蛋白，搜索通过N端测序和LC-MS/MS/MS测序(实例1中所述)为AfIP-1A-31和AfIP-1B-32鉴定的氨基酸序列链段。多肽与两个相邻ORF完美匹配，这两个相邻ORF称为ORF101和ORF105，分别与AfIP-1A-31和AfIP-1B-32相对应。ORF101和ORF105以相同方向读取并且相隔11个碱基对。在ORF101的上游，下一个ORF(265)以相反方向读取。在ORF105下游，有3个也以相反方向读取的ORF。看起来ORF101和105编码AfIP-1A-31和AfIP-1B-32并形成单个操纵子。
使用编码序列设计下列引物以克隆AfIP-1A-31编码序列：GCTGAGGACTTACATATGACTGC(Orf101FOR)(SEQ ID NO：9)和CTTCTATGTCCAGGATCCTCTCCCTTAGG(Orf101REV)(SEQ ID NO：10)。使用HFPCR试剂盒(科隆达公司(Clontech))并以来自DDMC P4G7的基因组DNA作为模板，通过聚合酶链反应来产生该克隆。使用NdeI/XhoI位点将所产生的DNA连接到pET-14a中。通过测序来确认所克隆的序列。
使用编码序列设计下列引物以克隆AfIP-1B-32基因：GGAGAAACATATGGACATAGAAGCTAAATCC(Orf105FOR)(SEQ ID NO：11)和GGAGGATCCCTGAGTTTCAGGCC(Orf105REV)(SEQ IDNO：12)。降落PCR测定条件(GenomeWalkerTM通用试剂盒(GenomeWalkerTMUniversal Kit)(碧迪生物科学事业部(BD Biosciences)))与PCR试剂盒一起使用。使用NdeI/XhoI位点将所产生的DNA连接到pET-14a 中。通过测序来确认克隆序列。
基于DNA和蛋白测序，AfIP-1A-31多核苷酸序列作为SEQ ID NO：1示出并且多肽序列作为SEQ ID NO：2示出。AfIP-1B-32多核苷酸序列作为SEQ ID NO：3提供并且多肽序列作为SEQ ID NO：4提供。还从粪产碱菌菌株DDMC P4G7识别出了N端截短(4个氨基酸)的AfIP-1A-31多肽，其作为SEQ ID NO：6提供，并且已发现其在与AfIP-1B-32蛋白(SEQ ID NO：4)组合时具有WCRW杀昆虫活性。将编码4个N端氨基酸截短且N端添加有Met的AfIP-1A-31(SEQID NO：6)的具有ATG密码子的多核苷酸序列(SEQ ID NO：5)合成并在大肠杆菌中表达，证实在与AfIP-1B-32蛋白(SEQ ID NO：4)组合时具有WCRW杀昆虫活性。
实例3-AfIP-1A-31和AfIP-1B-32基因组序列及同源性分析
可通过进行默认参数下的BLAST(基本局部比对搜索工具；Altschul，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410(Altschul等人，1993年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页)；还可参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，可使用www前缀访问)搜索，获得与公众可用的BLAST“nr”数据库(包含所有非冗余GenBank CDS翻译序列、源自三维结构布鲁克海文蛋白质数据库、SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新主要发布版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)中所含的序列的相似性，来确定基因身份。分析多核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：3。
AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)显示出与杨树菇溶血素样蛋白的远同源性，所述杨树菇溶血素样蛋白具有Pfam ID#PF06355(参考Pfam数据库：en.wikipedia.org/wiki/Pfam，可使用www前缀访问)。未鉴定到AfIP-1B-32(SEQ ID NO：3)的近同源物。从舌螺状菌(Spirosoma linguale)鉴定出了远同源物，即假定蛋白Slin_6118(NCBI参考序列：YP_003390879.1)和假定蛋白Slin_6117(NCBI参考序列：YP_003390878.1)(本文表示为Slin6118和Slin6117)。舌螺状菌编码序列具有以SEQ ID NO：13示出的DNA序列，并且表示为Slin6118的氨基酸序列以SEQ ID NO：14示出。Slin6118的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)显示出与AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)的43％同一性和61％相似性。Slin6117 DNA序列作为SEQID NO：15示出 并且氨基酸序列作为SEQ ID NO：16示出。Slin6117的氨基酸序列(SEQ IDNO：16)显示出与AfIP-1B-32(SEQ ID NO：2)的36％同一性和60％相似性。
对编码属于Pfam Pf06355的蛋白的核酸序列进行DOE-JGI宏基因组序列数据库(img.jgi.doe.gov/cgi-bin/m/main.cgi，可使用www前缀访问)的搜索，得以从与培菌白蚁工蚁(FGTW)序列相关的序列鉴定出FGTW-51。FGTW_contig30527(SEQ ID NO：17)上的假定基因ID#2066809079编码本文表示为FGTW-51(SEQ ID NO：18)的预测杨树菇溶血素样蛋白。预测的FGTW-51氨基酸序列(SEQ ID NO：18)显示出与AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)的46％同一性和61％相似性。FGTW-51基因下游的152个核苷酸是假定基因ID#2066809078(SEQ IDNO：19)，其编码本文表示为FGTW-52(SEQ ID NO：20)的假定蛋白，所述假定蛋白显示出与AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)的48％同一性和69％相似性。图1示出了AfIP-1A-31(SEQ IDNO：2)与Slin6118(SEQ ID NO：14)和FGTW-51(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列比对。图2示出了AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)与Slin6117(SEQ ID NO：16)和FGTW-52(SEQ OD NO：20)的氨基酸序列比对。此外，汇总了全局同一性的表在表5A和表5B中示出。同一性和相似性百分比的值是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(InvitrogenTMCorporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法来计算的。
表5A
| Slin6118 | FGTW-51 | |
| AfIp-1A-31 | 38.5％(50％) | 43.8％(51.4％) |
| Slin6118 | 40.8％(54.2％) |
表5B
| Slin6117 | FGTW-52 | |
| AfIp-1B-32 | 35％(51.7％) | 47.1％(60.7％) |
| Slin6117 | 37.9％(53.3％) |
实例4-AfIP-1A-31和AfIP-1B-32重组蛋白的大肠杆菌表达
将AfIP-1A-31和AfIP-1B-32编码序列合成并克隆到pET24载体 中，两条序列具有如下两种情形：具有天然终止密码子(TAA)，分别为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，以及为便于6x组氨酸标签添加的C端翻译而移除了终止密码子。带组氨酸标签的AfIP-1A-31的序列作为SEQ ID NO：23示出，并且带组氨酸标签的AfIP-1B-32作为SEQ IDNO：25示出。将这四个载体转化到大肠杆菌细胞中。使大规模培养物生长到O.D.280nm为约0.5，然后用异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导培养物，并让培养物在16℃下生长16小时。使用1/4 B-PER试剂(热电科技公司(ThermoScientific))、50mM Tris pH 8.0以及OmniCleaveTM内切核酸酶和Ready-LyseTM溶菌酶裂解细胞沉淀物。裂解后，将溶液离心并用30％硫酸铵使来自pET24 AfIP-1A-31和pET24 AfIP-1B-32天然终止密码子构建体培养物的上清液沉淀，短暂离心，然后用80％硫酸铵使上清液沉淀。进行WCRW测定的裂解物是有活性的。对具有C端6x组氨酸标签的pET24 AfIP-1A-31和AfIP-1B-32构建体采用相同程序，不同的是将裂解物在TalonTM树脂柱(热电科技公司(ThermoScientific))上进一步纯化。用PBS中的150mM咪唑洗脱带His标签的蛋白。使用在PBS中平衡的PD-10脱盐柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))从样品中移除咪唑。当AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：24(带His标签))和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：26(带His标签))两者均存在时，进行WCRW测定的裂解物是有活性的。
实例5-用纯化蛋白进行的鞘翅目测定
用纯化的重组C端带His标签的AfIP-1A-31(SEQ ID NO：24)和C端带His标签的AfIP-1B-32(SEQ ID NO：26)进行杀昆虫活性生物测定筛查以评估对包括西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)-WCRW、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)-SCRW、北方玉米根虫(Diabrotica barberi)-NCRW的多种鞘翅目的幼虫的杀昆虫蛋白效应，对包含杀昆虫蛋白的人工饲料进行鞘翅目摄食测定。将杀昆虫蛋白掺入鞘翅目特定的人工饲料(阿肯色州莱克村的南部产品公司(Southland Products Inc.，Lake Village，Arkansas))。每孔放入一只新生幼虫，随意饲喂取食4天。对于比如发育迟缓和/或死亡的幼虫反应，结果表示为阳性。如果幼虫与饲喂只加入上述缓冲液的饲料的阴性对照相似，则结果表示为阴性。为了测定AfIP-1A-31 (带His标签的SEQ ID NO：24)和AfIP-1B-32(带His标签的SEQ ID NO：26)杀昆虫多肽对西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)的LC50和IC50，将AfIP-1A-31以250ppm至0.1ppm的稀释系列进行测定，而AfIP-1B-32保持在250ppm，并且相反地，将AfIP-1B-32以250ppm至0.1ppm的稀释系列进行测定，而AfIP-1A-31保持在250ppm。每孔放入一只新生幼虫，随意饲喂取食4天。各生物测定在各剂量下以八个平行样进行，生物测定重复三次。通过称量各蛋白浓度下的存活幼虫将得到的结果表示为LC50(死亡率)和/或IC50。一个组分经稀释而第二组分保持在250ppm的杀昆虫多肽AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)的WCRW测定的结果在表6中示出。
表6-AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的WCRW测定
此外，还使用等质量比且以PBS从240ppm AfIP-1A-31与240ppm AfIP-1B-32连续稀释两倍的AfIP-1A-31和AfIP-1B-32并且使用供西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)-WCRW、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)-SCRW、北方玉米根虫(Diabrotica barberi)-NCRW所用的每种蛋白的昆虫饲料，来测定IC50和LC50。等质量比的杀昆虫多肽AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)的WCRW、NCRW和SCRW测定的结果在表7中示出。
表7
为了进一步评估AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的杀昆虫活性，使用128ppm与0.06ppm之间的每种蛋白(AfIP-1A-31为7951nM至3.7nM，并且AfIP-1B-32为1671nM至0.8nM)的稀释矩阵，以不同浓度比(表8)进行WCRW测定。对每种稀释组合的杀灭或生长迟缓作用进行评分。在每种组分低至约1ppm时观察到生长极度迟缓的活性，并且当第二组分饱和时在低于0.1ppm处观察到生长极度迟缓(表8)。
表8
为了进一步单独地评估AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的杀昆虫活性，使用每种蛋白的稀释矩阵(AfIP-1A-31在10,000ppm与156ppm(通过BCA测定的原液的蛋白浓度)之间并且AfIP-1B-32为6000ppm至94ppm(通过BCA测定的原液的蛋白浓度))以不同浓度进行WCRW测定。对每种稀释液的杀灭或生长迟缓作用进行评分。对于单独的AfIP-1A-31在625ppm或以上始终观察到生长迟缓，并且对于单独的AfIP-1B-32在3000ppm或以上始终观察到生长迟缓(表9)。
表9
实例6-用纯化蛋白进行的鳞翅目测定
用纯化的重组C端带His标签的AfIP-1A-31(SEQ ID NO：24)和C端带His标签的AfIP-1B-32(SEQ ID NO：26)进行杀昆虫活性生物测定筛查以评估对多种鳞翅目的幼虫的杀昆虫蛋白效应。
对包含PBS中的等质量比的AfIP-1A-31(SEQ ID NO：24)和AfIP-1B-32(SEQ IDNO：26)蛋白的人工饲料进行鳞翅目摄食测定。.将蛋白以0、31.25ppm、62.5ppm、125ppm、250ppm、500ppm和1000ppm的比率局部施加于孔中鳞翅目特定的人工饲料(南部产品公司(Southland Products))并使其干燥。测试AfIP-1A-31和AfIP-1B-32杀昆虫多肽对于大豆尺蠖(SBL，Pseudoplusia includens)、黎豆毛虫(VBC，Anticarsia gemmatalis)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、玉米穗虫(CEW，Helicoverpa zea)、草地夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)和黑地老虎(BCW，Agrotis ipsilon)的活性。每孔放入2-3只新生幼虫，随意饲喂取食3天。各个生物测定在各个剂量下以4个平行样进行。结果表示为对于幼虫反应比如生长迟缓和/或死亡呈阳性。如果幼虫与饲喂只加入上述缓冲液的饲料的阴性对照相似，则结果表示为阴性。尺寸类似于对照的幼虫被指定分数0，表现出生长轻微迟缓的幼虫被评分为1，表现出生长极度迟缓的幼虫被评分为2，并且死亡的幼虫被评分为3。类似AfIP-1A-31(带His标签的SEQ ID NO：24)和AfIP-1B-32(带His标签的SEQ ID NO：26)的组合在所测试的浓度下并未表现出对于欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、玉米穗虫(CEW，Helicoverpa zea)、草地夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)和黑地老虎(BCW，Agrotis ipsilon)的杀昆虫活性。组合的AfIP-1A-31(带His标签的SEQ ID NO：24)和AfIP-1B-32(带His标签的SEQ ID NO：26)在大豆尺蠖(SBL，Pseudoplusia includens)和黎豆毛虫(VBC，Anticarsia gemmatalis)中的杀昆虫活性在表10中示出。
表10
实例7-从其他粪产碱菌菌株甄别AfIP-1A-31和AfIP-1B-32同源物
从美国模式培养物保藏所(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110(弗吉尼亚州马纳萨斯的大学大道10801号，邮编20110))获得六个另外的粪产碱菌菌株，即 和 并且以类似于实例1-3中所述的方式甄别AfIP-1A-31和AfIP-1B-32同源物。蛋白同源物分别表示为AfIP-1A-15554(SEQ ID NO： 28)、AfIP-1B-15554(SEQ ID NO：30)、AfIP-1A-27066(SEQ ID NO：32)、AfIP-1B-27066(SEQ ID NO：34)、AfIP-1A-33585(SEQ ID NO：36)、AfIP-1B-33585(SEQ ID NO：38)、AfIP-1A-19209(SEQID NO：778)、AfIP-1B-19209(SEQ ID NO：780)、AfIP-1A-49677(SEQ ID NO：786)、AfIP-1B-49677(SEQ ID NO：788)、AfIP-1A-43161(SEQ ID NO：782)和AfIP-1B-43161(SEQ ID NO：784)。编码同源物的核酸序列分别为SEQ ID NO：27(AfIP-1A-15554)、SEQ ID NO：29(AfIP-1B-15554)、SEQ ID NO：31(AfIP-1A-27066)、SEQ ID NO：33(AfIP-1B-27066)、SEQ ID NO：35(AfIP-1A-33585)、SEQ ID NO：37(AfIP-1B-33585)、SEQ ID NO：777(AfIP-1A-19209)、SEQ ID NO：779(AfIP-1B-19209)、SEQ ID NO：785(AfIP-1A-49677)、SEQ ID NO：787(AfIP-1B-49677)、SEQ ID NO：781(AfIP-1A-43161)和SEQ ID NO：783(AfIP-1B-43161)。AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)与来自 和的AfIP-1A同源物是相同的，不同的是AfIP-1B-15554(SEQ ID NO：29)的C端有缺失。AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)与粪产碱菌菌株同源物AfIP-1A-49677(SEQ ID NO：786)、AfIP-1A-27066(SEQ ID NO：32)、AfIP-1A-19209(SEQ ID NO：778)、AfIP-1A-33585(SEQ ID NO：36)之间的氨基酸差异在图1的序列比对中示出。AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)与粪产碱菌菌株同源物AfIP-1B-27066(SEQID NO：34)、AfIP-1B-33585(SEQ ID NO：38)、AfIP-1B-19209(SEQ ID NO：780)、AfIP-1B-49677(SEQ ID NO：788)和AfIP-1B-43161(SEQ ID NO：784)之间的氨基酸差异在图2的序列比对中示出。汇总了同一性的表在表11A和表11B中示出。同一性和相似性百分比的值是使用采用全部默认参数的Vector程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.))的模块中的ClustalW算法来计算的。
表11A
表11B
实例8-具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体的形成
为了形成具有多个氨基酸变化的AfIP-1A-31的变体，通过如下方式产生两个文库(AfIP-1A-31LE和AfIP-1A-31HE)：使用如文献(Statzman-Engwall，et al.，(2005)Metabolic Engineering 7：27-37(Statzman-Engwall等人，2005年，《代谢工程》，第7卷，第27-37页))中所述的标准方案掺加携带表12中所列的两组氨基酸变化的寡核苷酸。在转化到大肠杆菌细胞中之后，为每个文库挑取96个菌落并在96孔板中培养以进行蛋白表达。通过得自热电科技公司(Thermo Scientific)(3747N Meridian Rd，Rockford，IL USA 61101(美国伊利诺伊州罗克福德子午线北路3747号，邮编61101))的蛋白提取试剂产生细胞裂解物，并且筛查其在与纯化的AfIP-1B-32混合之后的WCRW杀昆虫活性。与此同时，对活性AfIP-1A-31变体进行DNA测序。
表12-AfIP-1A-31LE和HE文库设计
在将生物测定和测序数据合并之后，选择具有如表13中所示掺入的各种程度和组合的突变的一组活性克隆，以便进一步组合。表13示出了诱变位置以及在AfIP-1A-31(SEQID NO：2)的那些位置处的野生型氨基酸和AfIP-1A-31变体中的那些位置处的氨基酸置换。
然后设计AfIP-1A-31的变体，并且合成基因(GenScript，Piscataway，NJ 08854，USA(美国新泽西州皮斯卡特维的金斯瑞公司))以将从表13 的改组文库鉴定的各种突变组合掺入。将变体AfIP-1A-31基因克隆到大肠杆菌细胞中，并使用如之前所述的His标签亲和纯化试剂盒纯化AfIP-1A-31变体多肽。变体AfIP-1A-31多肽在与100ppm纯化的AfIP-1B-32(带His标签的SEQ ID NO：26)(200ppm的AfIP-1A-31变体)组合之后针对WCRW进行测定。表14示出了表现出对于WCRW的杀昆虫活性的AfIP-1A-31变体多肽的序列。表14示出了诱变位置以及在AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)的那些位置处的野生型氨基酸和AfIP-1A-31变体中的那些位置处的氨基酸置换。
实例9-影响AfIP-1A-31的蛋白稳定性和功能的氨基酸位置的甄别
图3中示出了如下蛋白的蛋白序列比对：AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)；近源相关的粪产碱菌活性直系同源物；AfIP-1A-15554(SEQ ID NO：28)、AfIP-1A-27066(SEQ ID NO：32)和AfIP-1A-33585(SEQ ID NO：36)；远源相关的活性同源物FGTW-51(SEQ ID NO：18)；远源相关的非活性同源物Slin6118(SEQ ID NO：14)和若干杨树菇溶血素样蛋白。AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)的二级结构特征使用SeqWeb v3.1.2内的“Peptide Structure”(肽结构)程序获得，并且根据Garnier-Osguthorpe-Robson预测的所选结构特征示于图1的比对上方。从该比对鉴定出五个保守AfIP-1A-31基序，即AfIP-1A-31(SEQ ID NO：1)的SEQ ID NO：2的第15-26位氨基酸(基序1)、SEQ ID NO：2的第33-53位氨基酸(基序2)、SEQ ID NO：2的第71-84位氨基酸(基序3)、SEQ ID NO：2的第100-107位氨基酸(基序4)和SEQ ID NO：2的第132-140位氨基酸(基序5)。
为了进一步限定这五个所选基序内的序列空间及其在杀昆虫活性方面的作用，选择AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)的第19和20位氨基酸(基序1中)、第36、37、38、39、40、41、42、43、44、45和46位氨基酸(基序2)、第74、75、76、82位氨基酸(基序3)、第101、104、105位氨基酸(基序4)、以及第132至140位氨基酸(基序5)以用于饱和诱变。使用诱变寡核苷酸为基序的所选位置设计饱和诱变，所述诱变寡核苷酸如针对基序1、3和4在表15中所示、针对基序2在表16中所示以及针对基序5在表17中所示。使用每个位点的简并寡核苷酸并使用每个位点的N端(无突变)和C端(含突变)的两个重叠片段的拼接和拯救PCR策略，来产生突变体，使用N端(无突变)和C端(含突变)基因的两个重叠片段的拼接和拯救PCR策略。表18示出了在基序1、3和4每个位置处鉴定的被诱变的氨基酸置换、表达细胞裂解物中的可溶蛋白的氨基酸置换，并且甄别出基序内的允许保留杀昆虫活性的序列变异。表19示出了在基序2每个位置处甄别的被诱变的氨基酸置换、表达细胞裂解物中的可溶蛋白的氨基酸置换、以及基序内的允许保留杀昆虫活性(在18的标度上＞10)的序列变异。表20示出了在基序5每个位置处甄别的被诱变的氨基酸置换、表 达细胞裂解物中的可溶蛋白的氨基酸置换、以及基序内的允许保留杀昆虫活性(在18的标度上＞10)的序列变异。
表15
表16
表17
表18
表19
表20
实例10-AfIP-1A-31的另外变体的产生
如之前所述合成编码另外AfIP-1A-31变体的多核苷酸以用于蛋白晶体学和其他研究。
A36G(核酸SEQ ID NO：93)(氨基酸SEQ ID NO：94)
V115I(核酸SEQ ID NO：95)(氨基酸SEQ ID NO：96)
I20M和I138M(核酸SEQ ID NO：97)(氨基酸SEQ ID NO：98)
I20M和T135M(核酸SEQ ID NO：99)(氨基酸SEQ ID NO：100)
如上所述将这些AfIP-1A-31变体在大肠杆菌中表达，并且发现澄清裂解物在与AfIP-1B-32组合时具有杀昆虫活性。
实例11-具有多个氨基酸置换的AfIP-1B-32变体的产生
为了将氨基酸变化掺入AfIP-1B-32中，通过如下方式产生两个文库(AfIP-1B-32LE和AfIP-1B-32HE)：使用如文献(Statzman-Engwall，et al.，(2005)MetabolicEngineering 7：27-37(Statzman-Engwall等人，2005年， 《代谢工程》，第7卷，第27-37页))中所述的标准方案掺加携带表21中所示的两组氨基酸变化的寡核苷酸。将构建体转化到大肠杆菌细胞中，为每个文库挑取96个菌落并在96孔板中培养以进行蛋白表达。通过得自热电科技公司(Thermo Scientific)(3747N Meridian Rd，Rockford，IL USA61101(美国伊利诺伊州罗克福德子午线北路3747号，邮编61101))的 蛋白提取试剂产生细胞裂解物，并且在与纯化的AfIP-1A-31(带His标签的SEQ ID NO：24)混合之后针对WCRW进行测定。与此同时，对这些克隆进行DNA测序。在将生物测定和测序数据合并之后，选择具有如表22中所列掺入的各种数量的突变的一组活性克隆。
表21 AfIP-1B-32LE和HE文库设计
实例12-影响AfIP-1B-32的蛋白稳定性和功能的氨基酸位置的甄别
图3中示出了如下蛋白的蛋白序列比对：AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)；近源相关的粪产碱菌活性直系同源物；AfIP-1B-15554(SEQ ID NO：30)、AfIP-1B-27066(SEQ ID NO：34)和AfIP-1B-33585(SEQ ID NO：38)；远源相关的活性同源物FGTW-52(SEQ ID NO：20)；远源相关的同源物Slin6117(SEQ ID NO：16)。AfIP-1B-32(SEQ ID NO：2)的二级结构特征使用程序Garnier(EMBOSS浏览器)(Garnier，et al.，(1978)J. Mol.Biol.120：97-120(Garnier等人，1978年，《分子生物学杂志》，第120卷，第97-120页))获得。从该比对甄别出五个保守AfIP-1B-32基序，即活性蛋白(AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)的SEQ ID NO：4的第105-115位氨基酸(基序1)、SEQ ID NO：4的第133-141位氨基酸(基序2)、SEQ ID NO：4的第177-184位氨基酸(基序3)、SEQ ID NO：4的第358-365位氨基酸(基序4)和SEQ ID NO：4的第511-520位氨基酸(基序5)(图3中基序加有方框)。
为了进一步限定这五个所选基序内的序列空间及其在杀虫活性方面的作用，选择AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)的基序1的氨基酸I103、M105、G108、I109、E110和Y111、基序2的氨基酸V137、F141、基序3的氨基酸G179、W182、基序4的氨基酸E359、N360、S361、D363、V364和L365、以及基序5的氨基酸F109、N512、F514、G516和L519以用于饱和诱变。使用如表23中所示的诱变寡核苷酸，为基序的每个位置设计饱和诱变。表24示出了在每个位置处甄别的被诱变的氨基酸置换、表达细胞裂解物中的可溶蛋白的氨基酸置换、以及基序内的允许保留杀昆虫活性(在18的标度上＞10)的序列变异。
表23
表23，续表
表24
实例13-AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的胰蛋白酶和WCRW肠液加工
从100只三龄期WCRW幼虫解剖出中肠，放入200μL PBS中并置于冰上。将悬浮液以20,000g离心15分钟，并且将上清液等分并在-80℃冷冻待用。将两微升的肠液与20μL PBS中的15μg AfIP-1A-31或AfIP-1B-32在30℃下一起温育2小时。还通过与胰蛋白酶-琼脂糖凝胶(皮尔斯公司(Pierce))在37℃下一起摇晃2小时，使AfIP-1A-31和AfIP-1B-32胰蛋白酶化。在消化后，通过将树脂+样品溶液放入旋转过滤器中并收集滤液来回 收所消化的蛋白。用SDS PAGE评估所消化的样品，并且通过Edman序列分析来测定消化的消化产物的N端。胰蛋白酶或肠液处理后的主要AfIP-1A-31加工产物在其N端具有氨基酸AYAQWIEI(SEQ IDNO：2的第1-8位氨基酸)。合成了一种多核苷酸(SEQ ID NO：151)，其编码缺失了起始子甲硫氨酸之后的头14个氨基酸的AfIP-1A-31多肽(SEQ ID NO：152)，其在大肠杆菌中表达，并发现在与AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：26)组合时具有杀昆虫活性。还检测到在其N端具有氨基酸序列DIATEESK(SEQ ID NO：2的第5-12位氨基酸)或在其N端具有氨基酸序列EESKI(SEQ ID NO：2的第9-13位氨基酸2)的AfIP-1A-31的次要加工产物。AfIP-1B-32(SEQID NO：4)的胰蛋白酶或肠液消化产生两种主要产物。一种与约42kDa条带相对应的形式代表AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)的N端部分。Edman测序表明N端氨基酸序列为MDIEAKSINPLMG(SEQ ID NO：4的第I-13位氨基酸)。另一产物迁移成约38kDa凝胶条带。其代表在GVRTISLDSSS处开始的AfIP-1B-32的C端部分(SEQ ID NO：4的第381-703位氨基酸)。将胰蛋白酶化或肠液消化的AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)掺入WCRW新生幼虫的饲料中，并发现其抑制性与未消化的AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)一样。
实例14-在WCRW的mCry3A抗性品系中不存在AfIP-1A-31多肽和AfIP-1B-32多肽的
交叉抗性
为了确定抵抗Cry蛋白的昆虫是否对AfIP-1A-31和AfIP-1B-32有交叉抗性，用AfIP-1A-31和AfIP-1B-32处理对mCry3A易感或有抗性的西方玉米根虫(WCRW，Diabroticavirgifera virgifera)幼虫。图6示出了AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)、FGTW-51(SEQ ID NO：18)、Slin6118_GI_284040949_Aegerolysin_S_linguale(SEQ ID NO：14)和SEQ ID NO：276的Cry3A蛋白的氨基酸序列比对。图7示出了AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)和SEQ ID NO：276的Cry3A蛋白的氨基酸序列比对。AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和SEQ ID NO：276的Cry3A蛋白仅有2.5％同一性，而AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)和SEQ ID NO：276的Cry3A蛋白仅有12.3％同一性，表明这些蛋白是无关的。
通过如下方式引起Cry3A抗性集群：在2009年8月和9月从三个州(伊利诺伊州尚佩恩(Champaign，IL)；爱荷华州梅斯维尔(Maysville，IA)；和内布拉斯加州克莱森特(ClayCenter，NE)附近)的田地收集大约9,000只西方玉米根虫成体。将来自每个地点的甲虫在实验室中单独地放入笼中，并从这三个集群的每一个中收集大约30,000-50,000个卵。将卵在10℃下保存6个月，然后在25℃下温育直到观察到初始孵化。在2010年4月使用60目筛网洗去卵上的污垢，然后使卵侵染玉蜀黍幼苗并饲养至成体(来自每个集群的5,000-6,000只甲虫)。使来自每个田地收集集群的1,400-2,000只雄性与来自非滞育(ND)先锋良种公司(Pioneer)昆虫饲养所集群(源于南达科他州布鲁金斯(Brookings，SD))的相似数量雌性进行混合杂交。渐渗非滞育性状消除了专性滞育，使得根虫种群选择的循环更快速。使由每个杂交所产生的F1卵在无滞育期的情况下孵化，并且侵染玉蜀黍幼苗并饲养至F1成体。将来自所有三个杂交的所有F1成体汇集在产卵笼中以便产生组合的F2卵。然后使F2卵侵染玉蜀黍幼苗并饲养至F2成体。该过程起始了Cry3A-Res集群。
首先在2010年11月用来自渐渗非滞育性状后的F3代的卵选择Cry3A-Res集群。使大约346,500个F3卵侵染含有高表达mCry3A事件(＞T0根中总蛋白的10,000ppm mCry3A表达量)的玉蜀黍幼苗，平均孵化率为19％。在通过连续暴露于表达mCry3A的事件的这种初始抗性选择期间，总共210只昆虫存活至成体期。对于该事件从卵到成体的存活率为0.06％。在一次选择后，该过程产生Cry3A-Res集群的F3甲虫，如表25中所示。未经选择的等位基因系(Iso-CK)每一代均在非Bt玉蜀黍幼苗上饲养。在第一次选择后，将所有F3存活者收集在产卵笼中以便交配并产生F4卵。使F4卵和F5卵侵染非Bt玉米幼苗以便饲养并增加种群(population ramping)。使大约72,000个F6卵侵染含有高水平表达mCry3A事件(＞T0根中总蛋白的20,000ppm mCry3A表达量)的玉蜀黍幼苗以进行第二次选择。使用高水平表达mCry3A玉蜀黍事件(＞T0根中总蛋白的10,000ppm mCry3A表达量)对F7、F8、F10、F12和F14重复进行进一步的选择。使用高表达mCry3A玉蜀黍事件(＞根中总蛋白的30,000ppmmCry3A)对F14-H和随后各代进行另外的选择。表25示出在六代选择后，相对于非Bt而言，F14对mCry3A的存活率为64.6％，该存活率＞相似表达水平时第一 次选择中的相对存活率(0.15％)的400倍。在三代选择(对F3、F6、F7)后，基于LC50(使用F8幼虫测试的50％个体的致死浓度)计，Cry3A-Res集群对mCry3A的抗性比(RR)＞90倍，如表25中所示。
表25
*RR，即抗性比＝Cry3A-Res集群的LC50/ND实验室集群的LC50
**使F6-H和F14-H卵侵染mCry3A事件，该事件有着比在其他选择中所用事件更高的mCry3A表达。
使用Cry3A-Res集群的F11甲虫与易感实验室WCRW集群进行正反群体杂交以测试抗性的遗传性。使用来自抗性纯合子(R)、F1杂合子(RS)和易感纯合子(S)的卵，基于相对于非Bt玉米种子而言对高表达mCry3A玉米事件的12天存活率计，来测试抗性的显性(h＝0.20-0.21)。由R与S集群之间的F1正反交得出的12天相对存活结果的分析表明，mCry3A事件对mCry3A的抗性是常染色体遗传并且是不完全隐性(h＜0.5)，如表26中所示。
表26
*h，抗性的显性。
Cry3A-Res相对于其他WCRW集群和个体的转录组分析表明，所分析的两个Cry3A-Res个体(Cry3A-Res-1和Cry3A-Res-2)可与等位基因系易感WCRW(Iso-CK)或其他参考集群分离。基于转录组分析的分子标记可用于检测Cry3A-Res个体。
如Lefko等人((2008)，J.Appl.Entomol.132：189-204(2008年，《应用昆虫学杂志》，第132卷，第189-204页))所述通过对含有事件DAS-59122-7的玉蜀黍进行选择，来形成Cry34/35抗性WCRW集群。基于EC50计的对Cry34/35的抗性比为约500倍(Nowatzki，et al.，(2008)，J.Appl.Entomol.132：177-188(Nowatzki等人，2008年，《应用昆虫学杂志》，第132卷，第177-188页))。在约10次选择后，每2-3代对DAS-59122-7种子进行常规选择，在交叉抗性测定前总共进行大于20次选择。Cry34/35抗性品系(RH39 Sel.F23)的Rochelle-S卵用于交叉抗性测定。
标准化WCRW饲料掺入生物测定用于评估杀昆虫蛋白对WCRW幼虫的效应。将杀昆虫蛋白与WCRW特定的人工饲料(Bioserve Diabrotica)组合，以形成生物测定饲料。基于范围确定测定结果，测试浓度是：AfIP-lA-31多肽、AfIP-1B-32多肽和mCry3A或Cry34/35对易感WCRW品系及AfIP-1A-31多肽、AfIP-1B-32多肽对抗性品系为1-256ppm，并且mCry3A对Cry3A抗性品系为63-2000ppm。将WCRW新生幼虫放在含有生物测定饲料和杀昆虫蛋白的板上，每种浓度处理采用4或5个平行样，在每个生物测定开始后处理3天(对Cry3A-R)或4天(对Cry34/35-R)，对死亡率和生长极度迟缓的计数评分并且合并作为总响应以基于概率元分析来计算50％个体的抑制(IC50)。基于每种蛋白对易感和抗性WCRW品系的IC50来计算抗性比(RR)。
RR＝抗性品系的IC50/易感品系的IC50
表27示出抵抗mCry3A或Cry34/35的WCRW品系对AfIP-1A-31多肽和AfIP-1B-32多肽(分别RR＝0.74或1.7倍)无交叉抗性。
表27
*基于EC50计(Nowatzki等人，2008年)。
实例15-AfIP-1A-31多肽或AfIP-1B-32多肽的杀真菌活性
使用如美国专利No.7,772,370中所述的标准平板测定法评估AfIP-1A-31和AfIP-1B-32单独和一起对于真菌病原体北美大豆猝死综合症病菌(FVR)、尖孢镰刀菌(FOS)、禾谷镰刀菌(FGR)、禾生炭疽菌(CGR)和大斑突脐孢菌(ETC)的抗真菌活性。简而言之，每隔一周制备新的培养物，以保持孢子的持续供应。从2-4周的培养物制备孢子，并使用血球计对孢子进行定量，用测定培养基(1/4×马铃薯葡萄糖肉汤)将孢子稀释到所需浓度。对于标准测定平板，将各种浓度的AfIP-1A-31和AfIP-1B-32多肽以50μL/孔加入平板中，或对于半区平板，以25μL/孔加入平板中。然后，加入上述浓度2倍的含真菌孢子的等体积培养基，以开始测定。使用透气膜(Breathe-EasyTM，目录号BEM-1，马萨诸塞州波士顿的多元生物技术公司(Diversified Biotech，Boston，Mass.))密封平板，使测定在28℃的暗处进行24至48小时。在温育期后，将平板置于倒置显微镜上，检查每个孔并且根据下列参数在0-4的标度上评分：0＝与阴性对照相比真菌生长不受抑制，0.5＝轻微抑制(总体生长小于阴性对照但由单独孢子的生长不明显)，1＝轻微抑制(总体生长小于阴性对照但由单独孢子的生长较明显，尽管并未完全汇合)，2＝适度抑制(由1个孢子的生长可容易地鉴定出并且丰度显著低于阴性对照；由每个孢子的生长趋于呈球形)，3＝强烈抑制(孢子已萌发但生长仅限于短菌丝的一些分支)，4＝完全抑制(孢子未萌发)。参见，例 如，Duvick，et al.，(1992)J.Biol.Chem.267：18814-18820(Duvick等人，1992年，《生物化学杂志》，第267卷，第18814-18820页)。图8示出了AfIP-1A-31和AfIP-1B-32单独和一起的抗真菌活性的水平。AfIP-1A-31和AfIP-1B-32各自独立地表现出抗真菌活性。
实例16-AfIP-1A-31多肽和AfIP-1B-32多肽在矮菜豆Phaseolus vulgaris中的瞬
时表达
将AfIP-1A-31(SEQ ID NO：1)和AfIP-1B-32(SEQ ID NO：3)基因两者通过如(Kapila，et.al.，(1997)Plant Science 122：101-108(Kapila等人，1997年，《植物科学》，第122卷，第101-108页))所述的农杆菌渗入法克隆到各自处于病毒35S启动子和菜豆素终止子控制下的瞬时表达载体中，以将农杆菌细胞悬液引入完整组织植物细胞，从而确认植物来源的转基因表达。简而言之，用测试和对照菌株的正常化细菌细胞培养物对幼小矮菜豆植株(普通菜豆，Phaseolus vulgaris)进行农杆菌渗入。在农杆菌渗入后4天收集叶组织，冻干并粉碎。通过蛋白质印迹分析来确认AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)和AfIP-1B-32(SEQID NO：4)的瞬时蛋白表达。
实例17-酵母中的AfIP-1A-31多肽和AfIP-1B-32多肽表达
将AfIP-1A-31和AfIP-1B-32编码序列插入酵母表达质粒p413GDP中以用于组成型表达并插入p415GAL1中以用于半乳糖诱导型表达。通过用p413GDP：AfIP-1A-31和p413GPD：AfIP-1B-32(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas VA))转化菌株BY4742(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas VA))来产生单独的酵母菌株。将转化的菌落在不含组氨酸的培养基(俄亥俄州索伦的安倍生物医学公司(MP Biochemicals，Solon OH))上选择并且在28℃下生长。然后用p415GAL1：AfIP-1B-32表达构建体转化p413GDP：AfIP-1A-31菌株。用p415GAL1：AfIP-1A-31表达构建体转化p413GPD：AfIP-1B-32菌株。将包含这两种质粒的转化菌落在不含组氨酸和亮氨酸的培养基(俄亥俄州索伦的安倍生物医学公司(MPBiochemicals，Solon OH))上选择。在存在或不存在2％半乳糖的情况下回收的菌落数量相似，表明在酵母中同时表达AfIP-1A-31和AfIP-1B-32不产生毒性。通过限制性酶消化来确认这两种质粒的存在。将培养物在含半乳糖的培养基(俄亥俄州索伦的安倍生物医学公司(MP Biochemicals，Solon OH))中在28℃下生长。通过用Y-PER酵母蛋白提取试剂(伊利诺伊州罗克福德的热电 科技公司(Thermo Scientific，Rockford IL))裂解酵母细胞沉淀物然后离心来产生澄清裂解物。通过蛋白质印迹分析来确认这两种蛋白的存在。澄清裂解物还显示出将AfIP-1A-31-AfIP-1B-32介导的毒性赋予WCRW。
实例18-WCRW测定中AfIP-1A-31多肽和FGTW-52多肽的共施用
将AfIP-1A-31蛋白与FGTW-52蛋白组合以确定是否该二元对可以交换并在WCRW测定中保持杀昆虫活性。将来自表达FGTW-51(总蛋白浓度＝79mg/mL)或FGTW-52(总蛋白浓度＝64mg/mL)的大肠杆菌的粗裂解物用于该实验，并与0.2mg/mL纯化的AfIP-1A-31或AfIP-1B-32组合。表28示出AfIP-1A-31和FGTW-52蛋白一起保持了杀昆虫活性。
表28
实例19-WCRW测定中的AfIP-1A-31多肽/AfIP-1B-32多肽顺序摄食
为了确定这两种蛋白的同时存在是否为WCRW杀昆虫活性所需，将二龄期幼虫放在含有150ppm AfIP-1A-31或150ppm AfIP-1B-32或150ppm AfIP-1A-31加150ppm AfIP-1B-32(阳性对照)或不含杀昆虫蛋白(阴性对照)的根虫饲料上。24小时暴露后将所有幼虫转移到不含毒素的饲料上持 续24小时。然后将之前仅暴露于AfIP-1A-31的幼虫转移到含有150ppm AfIP-1B-32的饲料再持续24小时。在第2天后，将在第1天仅暴露于AfIP-1B-32的幼虫转移到含有150ppm AfIP-1A-31的饲料。将阳性和阴性对照幼虫保持于不含杀昆虫蛋白的饲料上。在实验开始72小时后对幼虫的生长进行评分。汇总于表29中的结果证实AfIP-1B-32与其在WCRW中的靶标存在持久的相互作用。令人惊讶的是，结果表明同时存在这两种蛋白对于WCRW幼虫的毒性并非必需。
表29
实例20-AfIP-1A-31多肽/AfIP-1B-32融合蛋白构建体
构建了基于大肠杆菌pBET24的表达载体，其包含：编码AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)的核酸分子(SEQ ID NO：1)；编码蛋白连接基(表30)的核酸分子以及编码AfIP-1B-32(缺少SEQ ID NO：4的N端甲硫氨酸)的核酸分子(SEQ ID NO：3)或编码具有多聚His标签(缺少SEQID NO：26的N端甲硫氨酸)的AfIP-1B-32的核酸分子(SEQ ID NO：25)；其编码表30中所示的融合蛋白。将表30的融合蛋白在大肠杆菌中表达并且发现澄清裂解物具有杀昆虫活性。
表30
实例21-用于在植物中共表达AfIP-1A-31和AfIP-1B-32的表达载体构建体
构建植物表达载体PHP51886，其包含第一转基因盒和第二转基因盒，所述第一转基因盒包含的核酸分子具有有效连接至编码SEQ ID NO：94的AfIP-1A-31多肽变体的核酸分子的玉蜀黍金属硫蛋白(RM2)启动子(美国专利No.7,214,854)，所述第二转基因盒包含的核酸分子具有有效连接至编码SEQ ID NO：76的AfIP-1B-32多肽变体的核酸分子的玉蜀黍泛素(Ubi-1)基因的启动子、5′非翻译外显子和第一内含子(Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页)和Christensen and Quail，(1996)Transgenic Res.5：213-218(Christensen和Quail，1996年，《转基因研究》，第5卷，第213-218页))。图9示出了PHP51688T0植物的温室功效测试结果。Y轴“评分”代表玉米根虫结节损伤评分(CRWNIS)，其中0是无损伤，2是两个结节受损。图10示出了PHP51688 T1事件结果。
实例22-用于在植物中表达AfIP-1A-31/AfIP-1B-32融合蛋白的表达载体构建
构建植物表达载体PHP53521，其包含转基因盒，所述转基因盒包含的核酸分子(SEQ ID NO：253)具有玉蜀黍泛素(Ubi-1)基因的启动子、5′非翻译外显子和第一内含子(Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页)和Christensen and Quail，(1996)TransgenicRes.5：213-218(Christensen和Quail，1996年，《转基因研究》，第5卷，第213-218页))，它们有 效连接至编码框内融合的SEQ ID NO：76的AfIP-1B-32变体、多基因表达载体(MGEV)连接基(Glu Glu Lys Lys Asn(SEQ ID NO：153))和SEQ ID NO：94的AfIP-1A-31变体(缺少N端Met)的核酸分子，该核酸分子编码SEQ ID NO：254的AfIP-1A-31/AfIP-1B-32融合蛋白。图11示出了PHP53521T0植物的温室功效测试结果。Y轴“评分”代表玉米根虫结节损伤评分(CRWNIS)，其中0是无损伤，2是两个结节受损。
实例23-具有改良物理性质的AfIP-1A-31的变体
为了甄别具有改良物理性质的AfIP-1A-31变体，通过使用高保真PCR试剂盒(High-Fidelity PCR Kit)(新英格兰生物实验室(New England)，目录号E0553S)根据制造商说明进行定点诱变，来形成一系列变体。简而言之，使双链DNA模板在高温下变性，然后使序列特异性引物退火到靶序列旁侧的位点，并通过Thermo 高保真DNA聚合酶进行延伸。该新合成产物进而成为使用分辨引物(resolution primer)扩增的后续循环的额外模板。如上所述产生具有下列单个氨基酸置换的AfIP-1A-31变体：G47L、G47F、D48L、D48F、K49L、K49F、D50L、D50F、K51L、K51F、E52L、E52F、I53L、I53F、S54L、S54F、P55L、P55F、S56L、Q57L、Q57F、I58L、I58F、N59L、N59F、G60L、G60F、T61L、T61F、I62L、I62F、K64L、K64F、D565L、D65F、Y121L、Y121F、Y122L、T122F、V123L、V123F、V123N、I124L、I124F、K125L、K125F、K125M、K126L、K126F、G1271、G127F、G128L、G128F、G129L、G129F、S130L和S130F。将所得AfIP-1A-31变体在大肠杆菌中表达为带His标签的蛋白并作为澄清裂解物筛查其WCRW杀昆虫活性。发现所得AfIP-1A-31变体在18的标度上具有大于10的WCRW杀昆虫活性，但N59L、N59F、G127L和G127P例外。选择表31中识别的AfIP-1A-31变体进一步测试所得AfIP-1A多肽的物理性质。表31示出了氨基酸置换、在第一PCR反应中使用的诱变引物以及编码各自AfIP-1A多肽的多核苷酸序列。
表31
实例24-具有改良物理性质的AfIIP-1B-32的变体
通过如之前在实例9中所述的诱变方法形成具有改良物理性质的一系列AfIP-1B-32变体。简而言之，设计寡核苷酸(表32)以引入下列突变：相比于SEQ ID NO：4(AfIP-1B-32)的I34L、I38L、I43L、Y53F、Y55F、V86L、Y94F、I97L、Y101F、I103L、I106L、I109L、I181L、V188L、W201F、Y203F、I214L、I220L、Y224F、V235L、Y414F、I418L、 V423L、V526L、I530L、I536L、Y538F、Y543F、Y547F、Y550F、Y625F、I631L和W633F。通过将片段化的AfIP-1B-32基因(SEQ ID NO：4)片段以15∶1、10∶1、7.5∶1和3.75∶1的比率与合并的寡核苷酸混合来构建四个单独的文库，并通过PCR反应装配全长基因(Statzman-Engwall，et al.，(2005)Metabolic Engineering 7：27-37(Statzman-Engwall等人，2005年，《代谢工程》，第7卷，第27-37页))。将这四个文库在大肠杆菌中表达并且如之前在实例1中所述将约1500个分离株作为澄清裂解物筛查WCRW杀昆虫活性。对在18的标度上具有大于10的WCRW杀昆虫活性的分离株进行测序以确定氨基酸变化的种类(表33)。除了以上甄别的所设计氨基酸置换以外，在一些变体中还识别出相比于SEQ ID NO：4(AfIP-1B-32)的下列随机氨基酸变化S134L、K196E、I270V、K296E、E367K、G368D、R373S、A398V、E425V、I427V、M434T、N512S、V533A、K544R、F558L、M600V、D607G、I612T、L613P、N615D、Q646R、N661S、S700G和F702S。所测序的活性变体均不含有所设计的氨基酸置换I34L和I43L。
表32
表32，续表
表33
表33，续表
表33，续表
实例25-在基序2中具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体
使用诱变引物Motif 2-Comb-R(ACCTTCTACTTTGAAGTTTGAGTTA SEQ ID NO：382)与诱变引物T7-F(TAATACGACTCACTATAGGG SEQ ID NO：683)配对，以及诱变引物pETR(ATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG SEQ ID NO：684)与简并诱变引物Motif 2-Comb-F(TAACTCAAACTTCAAAGTAGAAGGTDCGTWCVTSARGTGGGGAAAGTTCCATVTSSCCGGAGATAAAGACAAGGAAATAAGTCC SEQ ID NO：685)配对，采用如图12所示N端(无突变)和C端(含突变)的两个重叠片段的拼接和拯救PCR策略，来产生在基序2中具有多个所选氨基酸置换的AfIP-1A-31变体。
诱变引物Motif 2-Comb-F(SEQ ID NO：685)被设计为在与SEQ ID NO：2(AfIP-1A-31)相对应的基序2的第36、37、38、39、45和46位残基处部 分简并，从而在每个残基处产生所选的氨基酸置换。表34示出了在相对于SEQ ID NO：2的第36-46位处每个残基的密码子和可能得到的氨基酸。在表34中，天然氨基酸以粗体和下划线指示。
将拯救的突变文库克隆到大肠杆菌表达载体中，将384个单独的分离株在大肠杆菌中表达，并且如之前所述在WCRW杀昆虫测定中筛查细胞裂解物。对在WCRW筛查中在18中具有10或更大的评分的各个分离株进行DNA测序以测定变体多肽的氨基酸序列。表35示出了对于每个AfIP-1A-31变体而言在基序2(第36-46位氨基酸)中识别的氨基酸置换、以及在WCRW杀昆虫测定中有活性且在18中具有10或更大的最小评分的那些置换。在表35中，与AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)相比在基序2中的氨基酸置换以粗体和下划线指示。
表34
表35
实例26-在基序5中具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体
如图12所示使用诱变引物T7-F(TAATACGACTCACTATAGGG SEQ ID NO：683)和简并诱变引物Motif 5-Comb-F(GTGGTGCTCGAGGGATTTTTTGACAACAGTAATGWASABWTYGCCCGHCGHCSMCGHTGGGCTACCGCCACCTTTTTTAATC SEQ ID NO：686)产生在基序5中具有多个所选氨基酸置换的AfIP-1A-31基序5变体。
诱变引物Motif 5-Comb-F被设计为在与SEQ ID NO：2(AfIP-1A-31)相对应的基序5的第132、133、134、135、137、138和139位残基处部分简并，从而在每个残基处产生所选的氨基酸置换。表36示出了在相对于SEQ ID NO：2的第132-140位处每个残基的密码子和可能得到的氨基酸。在表36中，天然氨基酸以粗体和下划线指示。
将拯救的突变文库克隆到大肠杆菌表达载体中，将480个单独的分离株在大肠杆菌中表达，并且如之前所述在WCRW杀昆虫测定中筛查细胞裂解物。对在WCRW筛查中在18中具有10或更大的评分的各个分离株进行DNA测序以测定变体多肽的氨基酸序列。表37示出了对于每个AfIP-1A-31变体而言在基序5(第132-140位氨基酸)中识别的氨基酸置换，这些氨基酸置换在WCRW杀昆虫测定中有活性且在18中具有10或更大的最小评分。在表37中，与AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)相比在基序5中的氨基酸置换以粗体和下划线指示。
表36
表37
表37，续表
实例27-在基序2和基序5中具有多个氨基酸置换的AfIP-1A-31的变体
如图12所示使用简并诱变引物Motif 5-Comb-F(SEQ ID NO：686)与简并诱变引物Motif 2-Comb-F(SEQ ID NO：685)配对，产生在基序2和基序5中具有多个所选氨基酸置换的AfIP-1A-31变体。
将拯救的突变文库克隆到大肠杆菌表达载体中，将672个单独的分离株在大肠杆菌中表达，并且如之前所述在WCRW杀昆虫测定中筛查细胞裂解物。对在WCRW筛查中在18中具有10或更大的评分的各个分离株进行DNA测序以测定变体多肽的氨基酸序列。表38示出了对于每个AfIP-1A-31变体而言在基序2(第36-46位氨基酸)和基序5(第132-140位氨基酸)中识别的氨基酸置换，这些氨基酸置换在WCRW杀昆虫测定中有活性且在18中具有10或更大的最小评分。在表38中，与AfIP-1A-31(SEQ ID NO：2)相比在基序2和基序5中的氨基酸置换以粗体和下划线指示。
表38
表38，续表
实例28-在基序5中具有多个氨基酸置换的AfIP-1B-32变体
使用简并诱变引物032-combo5-FACCGCCTGGAACGAAATTGGTBNSTTGCGCNKCGCGSRGCTTVHSCTGGGCNDSCTCATTGGGGATCAGTCAGTAAGCAG(SEQ ID NO：749)和引物pET3’(SEQ ID NO：750)通过PCR来产生在基序5中具有多个所选氨基酸置换的AfIP-1B-32变体。然后如图13所示将诱变PCR反应的产物与来自引物032-Nco-F(SEQ ID NO：747)和032-combo-R(SEQ IDNO：748)的延伸的PCR产物混合，通过PCR装配和拯救，并且克隆到表达载体中。
诱变引物032-combo5-F(SEQ ID NO：749)被设计为在与SEQ ID NO：4(AfIP-1B-32)相对应的基序5的第509、512、514、516和519位残基处部分简并，从而在每个残基处产生所选的氨基酸置换。表39示出了在相对于SEQ ID NO：4的第509、512、514、516和519位处每个残基的密码子和可能得到的氨基酸。在表39中，天然氨基酸以粗体和下划线指示。
将拯救的突变文库克隆到大肠杆菌表达载体中，将1900个单独的分离株在大肠杆菌中表达，并且如之前所述在WCRW杀昆虫测定中筛查细胞裂解物。对在WCRW筛查中在18中具有10或更大的评分的各个分离株进行DNA测序以测定变体多肽的氨基酸序列。表40示出了对于每个AfIP-1B-32变体而言在基序5(第509-519位氨基酸)中识别的氨基酸置换，这些氨基酸置换在WCRW杀昆虫测定中有活性且在18中具有10或更大的最小评分。在表40中，与AfIP-1B-32(SEQ ID NO：4)相比在基序5中的氨基酸置换以粗体和下划线指示。
表39
表40
表40，续表
实例29-农杆菌介导的玉蜀黍转化
对于用AfIP-1A-31和AfIP-1B-32进行的农杆菌介导的玉蜀黍转化，采用了Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和国际专利公布No.WO 1998/32326，据此将它们的内容以引用方式并入)。简而言之，从玉蜀黍分离出未成熟胚，并使胚与农杆菌悬液接触，其中该细菌能够将AfIP-1A-31和AfIP-1B-32转移到至少一个所述未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬液中以启动接种。使胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在这个共培养期之后，可以有一个任选的静息步骤。在这个静息步骤中，在不添加植物转化体选择剂的情况 下将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行温育(步骤3：静息步骤)。为了消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息期，将未成熟胚在含有抗生素但不含选择剂的固体培养基上培养。接着，将接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚，从而导致转化细胞的选择性生长。然后使愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并且将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以便再生植株。
为了检测叶组织中的AfIP-1A-31和AfIP-1B-32蛋白，将4个冻干叶圆片/样品粉碎并重悬于含有0.1％吐温20的100μL PBS(PBST)、含有1片/7mL小量完全性蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)1183615301)的1％β-巯基乙醇。将悬液超声处理2分钟，然后在4℃、20,000g下离心15分钟。向上清液等分试样中加入1/3体积的3XLDS样品缓冲液(美国加利福尼亚州的英杰公司(InvitrogenTM(CA，USA))、含有1片/7mL小量完全性蛋白酶抑制剂的1％B-ME。将反应液在80℃下加热10分钟，然后离心。按照制造商(英杰公司(InvitrogenTM))说明将上清液样品上样于含MES电泳缓冲液的4-12％Bis-Tris Midi凝胶上，并使用设备(英杰公司(InvitrogenTM))转移到硝化纤维膜上。将硝化纤维膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中温育2小时，然后在以1∶20,000混于PBST中的亲和纯化的兔抗AfIP-1A-31和亲和纯化的兔抗AfIP-1B-32中过夜温育。将膜用PBST冲洗三次再在PBST中温育15分钟，接着冲洗两次并温育5分钟，然后与以1∶20,000混于PBST中的山羊抗兔HRP一起温育2小时。使用ECL蛋白质印迹试剂(通用电气医疗集团(GE Healthcare)目录号RPN2106)和 MR胶片，使检测到的蛋白显影。为了检测根中的AfIP-1A-31、AfIP-1B-32蛋白，将根冻干并将每个样品的2mg粉末重悬于LDS中，加入含有1片/7mL小量完全性蛋白酶抑制剂的1％B-ME。将反应液在80℃下加热10分钟，然后在4℃、20,000g下离心15分钟。按照制造商(英杰公司(InvitrogenTM))说明将上清液样品上样于含MES电泳缓冲液的4-12％Bis-TrisMidi凝胶上，并使用设备(英杰公司(InvitrogenTM))转移到硝化纤维膜上。将硝化纤维膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中温育2小时，然后在以1∶20,000混于PBST中的亲和纯化的多克隆兔抗AfIP-1A-31和亲和纯 化的多克隆兔抗AfIP-1B-32中过夜温育。将膜用PBST冲洗三次再在PBST中温育15分钟，接着冲洗两次并温育5分钟，然后与以1∶20,000混于PBST中的山羊抗兔HRP一起温育2小时。使用ECLTM蛋白质印迹试剂(通用电气医疗集团(GEHealthcare)目录号RPN2106)和MR胶片，检测抗体结合的杀昆虫蛋白。
实例30-转基因植物的粒子轰击转化和再生
用含有编码杀昆虫蛋白的核苷酸序列的质粒对来自温室供体植物的未成熟玉蜀黍胚进行轰击。将穗去壳并在30％漂白剂加0.5％Micro去污剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。采用如下的CaCl2沉淀程序，将包含有效连接至启动子的编码杀昆虫蛋白的核苷酸序列的质粒载体DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨小球上：100μL制备的钨粒子水溶液；10μL(1μg)DNA/TrisEDTA缓冲液(1μg总DNA)；100μL2.5M CaCl2和10μL 0.1M亚精胺。
将每种试剂依序加到钨粒子悬液，同时保持在多管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且允许其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml 100％乙醇洗涤，离心30秒。再次移除液体，将105μL 100％乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μL点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。将样品板在粒子枪中以水平#4进行轰击。所有样品接受650 PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行分培。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(inserts in flats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1个星期，随后在温室中另外生长1-2个星期，然后转移到 典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。通过本领域已知的测定法，如免疫测定和蛋白质印迹，监测植株并对经修饰的AfIP-1A-31和IP032的表达进行评分。
使用本领域已知的标准生物测定法，测试对杀昆虫蛋白表达呈阳性的转基因玉蜀黍植物的杀虫活性。此类方法包括例如根切除生物测定和整株植物生物测定。参见例如美国专利申请公布No.US 2003/0120054和国际公布No.WO 2003/018810。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/L N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000倍SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L 2,4-D和2.88g/L L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/L Gelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/L硝酸银(在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/L N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000倍SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L 2,4-D(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/L Gelrite(在用去离子水定容后加入)和0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/L MS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/L盐酸硫胺、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水定容)(Murashige and Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473(Murashige和Skoog，1962年，《植物生理学》，第15卷，第473页))、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L0.1mM脱落酸(调至pH 5.6后用精制去离子水定容)；3.0g/L Gelrite(在用去离子水定容后加入)和1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0mL/L MS维生素原液(0.100g/L烟酸、0.02g/L盐酸硫胺、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/L肌醇和40.0g/L蔗糖(在调至pH 5.6后用精制去离子水定容)和6g/L细菌琼脂(在用精制去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
以上对本公开各种图示实施例的描述并不是穷举的或者将本发明限制于所公开的精确形式。尽管本发明的特定实施例以及实例出于说明性目的在本文进行了描述，但相关领域的技术人员将认识到，各种等同修改形式都可能在本发明的范围内。本文中提供的本发明的教导可以适用于除上述实例之外的其他目的。除了按照在前面的说明书和实例中具体描述的方式以外，本发明还可以以其他方式实施。因此，根据上述教导对本发明进行的许多修改和变形也在所附的权利要求的范围内。
根据以上具体描述可以对本发明做出这些变化和其他变化。一般来讲，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将本发明限制为说明书和权利要求书中所公开的具体实施例。
与AfIP-1A和AfIP-1B多核苷酸和多肽相关的某些教导内容公开于2012年7月26日提交的美国临时申请No.61/675950、2012年12月19日提交的美国临时申请No.61/739,468以及2013年3月13日提交的美国临时申请No.61/779,457中，这些临时申请的公开内容以引用方式全文并入本文。
背景技术、具体实施方式和实例中所引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容均以引用的方式全文并入本文。
以上列出的实例目的在于为本领域普通技术人员提供如何制造与使用主题发明的完整公开和描述，而无意限制本发明所定义的范围。尽管已尽力确保所使用的数据(例如，数量、温度、浓度等)的准确性，但一些实验误差和偏差在所难免。除非另外指明，份数是重量份，分子量是平均分子量；温度以摄氏度计；并且压力为大气压或接近大气压。
Claims (69)
1.一种编码AfIP-1A多肽的分离的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含如由SEQ ID NO：257的第15-26位、SEQ ID NO：257的第33-53位、SEQ ID NO：257的第71-84位和SEQ ID NO：257的第100-107位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述AfIP-1A多肽包含下式的氨基酸序列：
其中
第6位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Met、Val或Ser；
第7位处的Xaa是Ala、Met、Val、Leu、Ile或Gly；
第8位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；
第9位处的Xaa是Glu、Leu、Gly、Asp、Ala、Ile、Val或Met；
第10位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；
第11位处的Xaa是Ser、Val、Thr、Ile、Leu或Met；
第12位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；
第13位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第14位处的Xaa是Arg、Gln、Lys或Asn；
第16位处的Xaa是Tyr、Gln、Trp、Phe或Asn；
第17位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；
第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；
第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；
第23位处的Xaa是Thr、Glu、Ala、Ser、Asp或Gly；
第24位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Met；
第26位处的Xaa是Val、Ser、Ile、Leu、Met或Thr；
第27位处的Xaa是Val、Glu、Ile、Leu、Met或Asp；
第29位处的Xaa是Ser、Met、Thr、Ile、Leu或Val；
第30位处的Xaa是Asn、Asp、Ser、Glu、Gln或Thr；
第31位处的Xaa是Phe、Ile、Leu、Val或Met；
第32位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；
第33位处的Xaa是Val、Ile、Leu或Met；
第34位处的Xaa是Glu、Lys、Asp或Arg；
第35位处的Xaa是Gly或Asn；
第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；
第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；
第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；
第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；
第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；
第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；
第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；
第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；
第48位处的Xaa是Asp、Asn、Glu、Gln、Leu或Phe；
第50位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；
第51位处的Xaa是Lys、Asn、Arg、Gln、Leu或Phe；
第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；
第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；
第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；
第55位处的Xaa是Pro、Ser、Thr、Leu或Phe；
第56位处的Xaa是Ser、Asp、Thr、Glu或Leu；
第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Asn、Ser、Asp、Leu或Phe；
第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu、Met或Phe；
第60位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；
第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；
第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu、Met、Arg或Phe；
第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Arg、Thr、Asp、Leu或Phe；
第65位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；
第66位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；
第67位处的Xaa是Asp、Thr、Glu或Ser；
第68位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg；
第69位处的Xaa是Tyr、Ser、Trp、Phe或Thr；
第70位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；
第73位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；
第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；
第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第77位处的Xaa是Glu、Ala、Asp或Gly；
第78位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu；
第79位处的Xaa是Ala、Thr、Gly或Ser；
第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；
第86位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；
第88位处的Xaa是Ser、Glu、Thr或Asp；
第89位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；
第91位处的Xaa是Asp、His或Glu；
第92位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu；
第95位处的Xaa是Leu、Trp、Ile、Val、Met、Phe或Tyr；
第96位处的Xaa是Val、Leu、Ile或Met；
第97位处的Xaa是Phe、Ala或Gly；
第98位处的Xaa是Glu、Thr、Asp或Ser；
第100位处的Xaa是Tyr、Lys、Trp或Arg；
第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；
第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；
第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；
第106位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；
第111位处的Xaa是Asp、His、Asn、Glu或Gln；
第112位处的Xaa是Glu、Ser、Asp或Thr；
第113位处的Xaa是Leu、Ser、Ile、Val、Met或Thr；
第114位处的Xaa是Thr或Ser；
第115位处的Xaa是Val、Ile、Val或Met；
第116位处的Xaa是Lys、Thr、Glu、Arg、Ser或Asp；
第117位处的Xaa是Asp或Glu；
第118位处的Xaa是Lys、Asp、Arg或Glu；
第119位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；
第120位处的Xaa是Asn、Lys、Asp或Arg；
第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；
第122位处的Xaa是Thr、Lys、Ser、Arg、Leu或Phe；
第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Met、Phe或Asn；
第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu、Val、Met、Thr、Glu或Phe；
第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；
第126位处的Xaa是Lys、Glu、Arg、Asp、Leu或Phe；
第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；
第129位处的Xaa是Gly、Asn、Ala、Gln、Leu或Phe；
第130位处的Xaa是Ser、Ile、Thr、Leu、Val、Met或Phe；
第131位处的Xaa是Pro、Ser或Thr；
第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；
第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；
第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；
第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；
第142位处的Xaa是Val、Cys、Ile、Leu或Met；
第143位处的Xaa是Val、Ile；Leu或Met；
第145位处的Xaa是Lys、Val、Arg、Ile、Leu或Met；以及
第146位处的Xaa是Ser、Gly、Thr或Ala；
并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码AfIP-1A多肽，所述AfIP-1A多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：94的氨基酸序列。
6.一种转基因植物、转基因植物细胞或其子代，包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子。
7.一种转基因植物、转基因植物细胞或其子代，其已用根据权利要求1所述的分离的核酸分子稳定转化。
8.根据权利要求7所述的转基因植物、转基因植物细胞或其子代，其中所述转基因植物是单子叶植物。
9.根据权利要求7所述的转基因植物、转基因植物细胞或其子代，还包括一种或多种另外的转基因性状。
10.一种表达盒，包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子以及一个或多个调控序列，所述一个或多个调控序列有效连接至所述AfIP-1A多肽并引导所述AfIP-1A多肽的表达。
11.一种转基因植物或植物细胞，包含根据权利要求10所述的表达盒。
12.根据权利要求11所述的转基因植物或其子代的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含所述分离的核酸分子。
13.根据权利要求12所述的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
14.一种分离的AfIP-1A多肽。
15.根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽，包含如由SEQ ID NO：257的第15-26位、SEQ ID NO：257的第33-53位、SEQ ID NO：257的第71-84位和SEQ ID NO：257的第100-107位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
16.根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽，其与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性。
17.根据权利要求16所述的分离的AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含下式的氨基酸序列：
其中
第6位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Met、Val或Ser；
第7位处的Xaa是Ala、Met、Val、Leu、Ile或Gly；
第8位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；
第9位处的Xaa是Glu、Leu、Gly、Asp、Ala、Ile、Val或Met；
第10位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；
第11位处的Xaa是Ser、Val、Thr、Ile、Leu或Met；
第12位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；
第13位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第14位处的Xaa是Arg、Gln、Lys或Asn；
第16位处的Xaa是Tyr、Gln、Trp、Phe或Asn；
第17位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；
第19位处的Xaa是Trp、Glu、Phe、Ile、His、Asn或Tyr；
第20位处的Xaa是Ile、Val、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr；
第23位处的Xaa是Thr、Glu、Ala、Ser、Asp或Gly；
第24位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Met；
第26位处的Xaa是Val、Ser、Ile、Leu、Met或Thr；
第27位处的Xaa是Val、Glu、Ile、Leu、Met或Asp；
第29位处的Xaa是Ser、Met、Thr、Ile、Leu或Val；
第30位处的Xaa是Asn、Asp、Ser、Glu、Gln或Thr；
第31位处的Xaa是Phe、Ile、Leu、Val或Met；
第32位处的Xaa是Lys、Glu、Arg或Asp；
第33位处的Xaa是Val、Ile、Leu或Met；
第34位处的Xaa是Glu、Lys、Asp或Arg；
第35位处的Xaa是Gly或Asn；
第36位处的Xaa是Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第37位处的Xaa是Tyr、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；
第38位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第39位处的Xaa是Arg、Lys、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第40位处的Xaa是Trp、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr；
第41位处的Xaa是Gly、Cys或Gln；
第42位处的Xaa是Lys、Cys、Glu、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg或Thr；
第43位处的Xaa是Phe、Tyr、Ala、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp；
第44位处的Xaa是His、Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp；
第45位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Trp；
第46位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第47位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；
第48位处的Xaa是Asp、Asn、Glu、Gln、Leu或Phe；
第50位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；
第51位处的Xaa是Lys、Asn、Arg、Gln、Leu或Phe；
第52位处的Xaa是Glu、Leu或Phe；
第53位处的Xaa是Ile、Leu或Phe；
第54位处的Xaa是Ser、Thr、Leu或Phe；
第55位处的Xaa是Pro、Ser、Thr、Leu或Phe；
第56位处的Xaa是Ser、Asp、Thr、Glu、Leu；
第57位处的Xaa是Gln、Thr、Glu、Asn、Ser、Asp、Leu或Phe；
第58位处的Xaa是Ile、Val、Leu、Met或Phe；
第60位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；
第61位处的Xaa是Thr、Ile或Phe；
第62位处的Xaa是Ile、Lys、Val、Leu、Met、Arg或Phe；
第64位处的Xaa是Lys、Ser、Glu、Arg、Thr、Asp、Leu或Phe；
第65位处的Xaa是Asp、Ser、Glu、Thr、Leu或Phe；
第66位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；
第67位处的Xaa是Asp、Thr、Glu或Ser；
第68位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg；
第69位处的Xaa是Tyr、Ser、Trp、Phe或Thr；
第70位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；
第73位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；
第74位处的Xaa是Cys、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；
第76位处的Xaa是Arg、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第77位处的Xaa是Glu、Ala、Asp或Gly；
第78位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu；
第79位处的Xaa是Ala、Thr、Gly或Ser；
第82位处的Xaa是Gly、Glu、Asn、Trp或Tyr；
第86位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；
第88位处的Xaa是Ser、Glu、Thr或Asp；
第89位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；
第91位处的Xaa是Asp、His或Glu；
第92位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu；
第95位处的Xaa是Leu、Trp、Ile、Val、Met、Phe或Tyr；
第96位处的Xaa是Val、Leu、Ile或Met；
第97位处的Xaa是Phe、Ala或Gly；
第98位处的Xaa是Glu、Thr、Asp或Ser；
第100位处的Xaa是Tyr、Lys、Trp或Arg；
第101位处的Xaa是Trp、Phe或Tyr；
第104位处的Xaa是Pro、Ala、Phe、Gly、His、Met、Gln、Arg或Val；
第105位处的Xaa是Trp、Asp、Phe、Ile、Leu或Tyr；
第106位处的Xaa是Ser、Ala、Thr或Gly；
第111位处的Xaa是Asp、His、Asn、Glu或Gln；
第112位处的Xaa是Glu、Ser、Asp或Thr；
第113位处的Xaa是Leu、Ser、Ile、Val、Met或Thr；
第114位处的Xaa是Thr或Ser；
第115位处的Xaa是Val、Ile、Val或Met；
第116位处的Xaa是Lys、Thr、Glu、Arg、Ser或Asp；
第117位处的Xaa是Asp或Glu；
第118位处的Xaa是Lys、Asp、Arg或Glu；
第119位处的Xaa是Glu、Asn、Asp或Gln；
第120位处的Xaa是Asn、Lys、Asp或Arg；
第121位处的Xaa是Tyr、Leu或Phe；
第122位处的Xaa是Thr、Lys、Ser、Arg、Leu或Phe；
第123位处的Xaa是Val、Ile、Leu、Met、Phe或Asn；
第124位处的Xaa是Ile、Ser、Asp、Leu、Val、Met、Thr、Glu或Phe；
第125位处的Xaa是Lys、Leu、Phe或Met；
第126位处的Xaa是Lys、Glu、Arg、Asp、Leu或Phe；
第128位处的Xaa是Gly、Leu或Phe；
第129位处的Xaa是Gly、Asn、Ala、Gln、Leu或Phe；
第130位处的Xaa是Ser、Ile、Thr、Leu、Val、Met或Phe；
第131位处的Xaa是Pro、Ser或Thr；
第132位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；
第133位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp；
第134位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第135位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；
第136位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第137位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Glu、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第138位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第139位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第140位处的Xaa是Ile、Ala、Cys、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Tyr；
第142位处的Xaa是Val、Cys、Ile、Leu或Met；
第143位处的Xaa是Val、Ile；Leu或Met；
第145位处的Xaa是Lys、Val、Arg、Ile、Leu或Met；以及
第146位处的Xaa是Ser、Gly、Thr或Ala；
并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至14个氨基酸。
18.根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：94的氨基酸序列。
19.根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽，其中所述AfIP-1A多肽包括选自如下的一种或多种性质：
a)如由SEQ ID NO：257的第15-26位表示的氨基酸基序；
b)如由SEQ ID NO：257的第33-53位表示的氨基酸基序；
c)如由SEQ ID NO：257的第71-84位表示的氨基酸基序；
d)如由SEQ ID NO：257的第100-107位表示的氨基酸基序；
e)杀真菌活性；
f)杀昆虫活性；
g)约12kD至约18kD之间的计算分子量。
20.一种转基因植物，其能够表达编码根据权利要求14所述的AfIP-1A多肽的分离的多核苷酸。
21.根据权利要求20所述的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
22.根据权利要求20所述的转基因植物，其中所述转基因植物表达一种或多种另外的转基因性状。
23.一种组合物，包含杀虫有效量的根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽。
24.一种编码AfIP-1B多肽的分离的核酸分子。
25.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽还包含如由SEQ IDNO：259的第105-115位、SEQ ID NO：259的第133-144位、SEQ ID NO：259的第177-184位、SEQID NO：259的第358-365位和SEQ ID NO：259的第511-520位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
26.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性。
27.根据权利要求26所述的分离的核酸分子，其中所述AfIP-1B多肽包含下式的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Asp或Gly；
第12位处的Xaa是Met、Leu、Ile或Val；
第34位处的Xaa是Ile或Leu；
第38位处的Xaa是Ile或Leu；
第42位处的Xaa是Glu或Asp；
第43位处的Xaa是Ile或Leu；
第53位处的Xaa是Tyr或Phe；
第55位处的Xaa是Tyr或Phe；
第71位处的Xaa是Gly、Cys或Ala；
第82位处的Xaa是Val或Met；
第86位处的Xaa是Val或Leu；
第94位处的Xaa是Tyr或Phe；
第97位处的Xaa是Ile或Leu；
第101位处的Xaa是Tyr或Phe；
第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；
第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；
第106位处的Xaa是Ile或Leu；
第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Asp、Lys或His；
第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；
第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Arg或His；
第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；
第115位处的Xaa是Asp或Glu；
第119位处的Xaa是Val、Ala、Ile或Leu；
第134位处的Xaa是Ser或Leu；
第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser、Cys、Asp、Glu或Arg；
第139位处的Xaa是Glu或Asp；
第141位处的Xaa是Phe、Val、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；
第144位处的Xaa是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；
第148位处的Xaa是Ser、Phe、Thr或Trp；
第152位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；
第155位处的Xaa是Asp或Glu；
第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；
第181位处的Xaa是Ile、Val、Met或Leu；
第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；
第188位处的Xaa是Val或Leu；
第196位处的Xaa是Lys或Glu；
第197位处的Xaa是Thr或Ser；
第201位处的Xaa是Trp、Cys、Tyr或Phe；
第202位处的Xaa是Lys、Asn或Arg；
第203位处的Xaa是Tyr或Phe；
第208位处的Xaa是Glu或Asp；
第214位处的Xaa是Ile或Leu；
第220位处的Xaa是Ile或Leu；
第224位处的Xaa是Tyr或Phe；
第234位处的Xaa是Glu或Asp；
第235位处的Xaa是Val或Leu；
第270位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第296位处的Xaa是Lys或Glu；
第298位处的Xaa是Ala、Glu、Gly或Asp；
第299位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；
第300位处的Xaa是Ile、Val、Ile或Met；
第305位处的Xaa是Asp或Glu；
第308位处的Xaa是Lys或Asn；
第317位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；
第323位处的Xaa是Glu或Asp；
第335位处的Xaa是Glu或Asp；
第343位处的Xaa是Asp或Glu；
第352位处的Xaa是Glu或Asp；
第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Lys或Arg；
第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys、Arg或His；
第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；
第363位处的Xaa是Asp、Gly、Leu、Ile、Trp或Ser；
第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；
第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln、Asp、Glu、Arg或His；
第367位处的Xaa是Glu或Lys；
第368位处的Xaa是Gly或Asp；
第370位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第373位处的Xaa是Arg或Ser；
第374位处的Xaa是Asn、Lys、Gln或Arg；
第377位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；
第384位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；
第385位处的Xaa是Ile、Ser、Leu、Val、Met或Thr；
第388位处的Xaa是Asp或Glu；
第393位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第398位处的Xaa是Ala或Val；
第414位处的Xaa是Tyr或Phe；
第418位处的Xaa是Ile或Leu；
第419位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln；
第423位处的Xaa是Val或Leu；
第425位处的Xaa是Glu或Val；
第427位处的Xaa是Ile或Val；
第434位处的Xaa是Met或Thr；
第481位处的Xaa是Glu或Asp；
第495位处的Xaa是Asp或Glu；
第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；
第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；
第514位处的Xaa是Glu、Gly、Ile、Asp或Arg；
第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；
第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp、Lys或Arg；
第526位处的Xaa是Val或Leu；
第530位处的Xaa是Ile或Leu；
第533位处的Xaa是Val或Ala；
第536位处的Xaa是Ile或Leu；
第538位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第543位处的Xaa是Tyr或Phe；
第544位处的Xaa是Lys或Arg；
第547位处的Xaa是Tyr或Phe；
第550位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第552位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；
第558位处的Xaa是Phe或Leu；
第600位处的Xaa是Met或Val；
第602位处的Xaa是Met、Ile、Leu或Val；
第607位处的Xaa是Asp或Gly；
第610位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；
第612位处的Xaa是Ile或Thr；
第613位处的Xaa是Leu或Pro；
第615位处的Xaa是Asn或Asp；
第619位处的Xaa是Lys或Arg；
第625位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第629位处的Xaa是Lys或Asn；
第631位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第633位处的Xaa是Trp或Phe；
第646位处的Xaa是Gln或Arg；
第661位处的Xaa是Asn或Ser；
第683位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；
第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；
第700位处的Xaa是Ser或Gly；以及
第702位处的Xaa是Phe或Ser；
并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
28.根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码AfIP-1B多肽，所述AfIP-1B多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
29.一种转基因植物、转基因植物细胞或其子代，包含根据权利要求24所述的分离的核酸分子。
30.一种转基因植物、转基因植物细胞或其子代，其已用根据权利要求24所述的分离的核酸分子稳定转化。
31.根据权利要求30所述的转基因植物、转基因植物细胞或其子代，其中所述转基因植物是单子叶植物。
32.根据权利要求30所述的转基因植物、转基因植物细胞或其子代，还包括一种或多种另外的转基因性状。
33.一种表达盒，包含根据权利要求24所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子有效连接至一个或多个调控序列，所述一个或多个调控序列引导所述AfIP-1B多肽的表达。
34.一种转基因植物或植物细胞，包含根据权利要求33所述的表达盒。
35.根据权利要求34所述的转基因植物或其子代的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含所述分离的核酸分子。
36.根据权利要求35所述的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
37.一种分离的AfIP-1B多肽。
38.根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽，还包含如由SEQ ID NO：259的第105-115位、SEQ ID NO：259的第133-144位、SEQ ID NO：259的第177-184位、SEQ ID NO：259的第358-365位和SEQ ID NO：259的第511-520位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
39.根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽，其与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性。
40.根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽，其中所述AfIP-1B多肽包含下式的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Asp或Gly；
第12位处的Xaa是Met、Leu、Ile或Val；
第34位处的Xaa是Ile或Leu；
第38位处的Xaa是Ile或Leu；
第42位处的Xaa是Glu或Asp；
第43位处的Xaa是Ile或Leu；
第53位处的Xaa是Tyr或Phe；
第55位处的Xaa是Tyr或Phe；
第71位处的Xaa是Gly、Cys或Ala；
第82位处的Xaa是Val或Met；
第86位处的Xaa是Val或Leu；
第94位处的Xaa是Tyr或Phe；
第97位处的Xaa是Ile或Leu；
第101位处的Xaa是Tyr或Phe；
第103位处的Xaa是Ile、Leu、Gly、Val、Trp、Phe、Thr、Cys、Glu或Arg；
第105位处的Xaa是Met、Gly、Val、Leu、Trp、Phe、Pro、Thr、Cys、Asn、Gln或Arg；
第106位处的Xaa是Ile或Leu；
第108位处的Xaa是Gly、Ala、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Asp、Lys或His；
第109位处的Xaa是Ile、Leu、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Phe、Pro、Cys、Asn或Glu；
第110位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp或His；
第111位处的Xaa是Tyr、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Lys、Arg或His；
第115位处的Xaa是Asp或Glu；
第119位处的Xaa是Val、Ala、Ile或Leu；
第134位处的Xaa是Ser或Leu；
第137位处的Xaa是Val、Phe、Ala、Leu、Trp、Pro、Ser或Cys；
第139位处的Xaa是Glu或Asp；
第141位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp、Ser或Cys；
第144位处的Xaa是Ala、Val、Gly、Ile、Leu或Met；
第148位处的Xaa是Ser、Phe、Thr或Trp；
第152位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser；
第155位处的Xaa是Asp或Glu；
第179位处的Xaa是Gly、Val、Trp、Ser、Cys或Arg；
第181位处的Xaa是Ile、Val、Met或Leu；
第182位处的Xaa是Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ser、Cys、Glu或Arg；
第188位处的Xaa是Val或Leu；
第196位处的Xaa是Lys或Glu；
第197位处的Xaa是Thr或Ser；
第201位处的Xaa是Trp、Cys、Tyr或Phe；
第202位处的Xaa是Lys、Asn或Arg；
第203位处的Xaa是Tyr或Phe；
第208位处的Xaa是Glu或Asp；
第214位处的Xaa是Ile或Leu；
第220位处的Xaa是Ile或Leu；
第224位处的Xaa是Tyr或Phe；
第234位处的Xaa是Glu或Asp；
第235位处的Xaa是Val或Leu；
第270位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第296位处的Xaa是Lys或Glu；
第298位处的Xaa是Ala、Glu、Gly或Asp；
第299位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala；
第300位处的Xaa是Ile、Val、Ile或Met；
第305位处的Xaa是Asp或Glu；
第308位处的Xaa是Lys或Asn；
第317位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr；
第323位处的Xaa是Glu或Asp；
第335位处的Xaa是Glu或Asp；
第343位处的Xaa是Asp或Glu；
第352位处的Xaa是Glu或Asp；
第359位处的Xaa是Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Trp、Phe、Ser、Thr、Lys或Arg；
第360位处的Xaa是Asn、Gly、Val、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Asn、Asp、Lys或His；
第361位处的Xaa是Ser、Gly、Val、Leu或Glu；
第363位处的Xaa是Asp、Gly、Trp或Ser；
第364位处的Xaa是Val、Pro、Ser、Thr、Asn、Glu或Lys；
第365位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Trp、Phe、Pro、Ser、Thr、Gln、Glu、Arg或His；
第367位处的Xaa是Glu或Lys；
第368位处的Xaa是Gly或Asp；
第370位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第373位处的Xaa是Arg或Ser；
第374位处的Xaa是Asn、Lys、Gln或Arg；
第377位处的Xaa是Leu、Ile、Val或Met；
第384位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；
第385位处的Xaa是Ile、Ser、Leu、Val、Met或Thr；
第388位处的Xaa是Asp或Glu；
第393位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第398位处的Xaa是Ala或Val；
第414位处的Xaa是Tyr或Phe；
第418位处的Xaa是Ile或Leu；
第419位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln；
第423位处的Xaa是Val或Leu；
第425位处的Xaa是Glu或Val；
第427位处的Xaa是Ile或Val；
第434位处的Xaa是Met或Thr；
第481位处的Xaa是Glu或Asp；
第495位处的Xaa是Asp或Glu；
第509位处的Xaa是Phe、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ser、Cys、Tyr、Asn、Asp、Glu或Arg；
第512位处的Xaa是Asn、Ser、Gly、Ala、Leu、Met、Trp、Phe、Ser、Thr、Cys、Gln或Arg；
第514位处的Xaa是Glu、Asp或Arg；
第516位处的Xaa是Gly、Ala、Val、Met、Pro、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu或Lys；
第519位处的Xaa是Leu、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Pro、Tyr、Gln、Asp或Lys；
第526位处的Xaa是Val或Leu；
第530位处的Xaa是Ile或Leu；
第533位处的Xaa是Val或Ala；
第536位处的Xaa是Ile或Leu；
第538位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第543位处的Xaa是Tyr或Phe；
第544位处的Xaa是Lys或Arg；
第547位处的Xaa是Tyr或Phe；
第550位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第552位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；
第558位处的Xaa是Phe或Leu；
第600位处的Xaa是Met或Val；
第602位处的Xaa是Met、Ile、Leu或Val；
第607位处的Xaa是Asp或Gly；
第610位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；
第612位处的Xaa是Ile或Thr；
第613位处的Xaa是Leu或Pro；
第615位处的Xaa是Asn或Asp；
第619位处的Xaa是Lys或Arg；
第625位处的Xaa是Tyr、Phe或Trp；
第629位处的Xaa是Lys或Asn；
第631位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met；
第633位处的Xaa是Trp或Phe；
第646位处的Xaa是Gln或Arg；
第661位处的Xaa是Asn或Ser；
第683位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly；以及
第696位处的Xaa是Glu、Asp或Gln；
第700位处的Xaa是Ser或Gly；以及
第702位处的Xaa是Phe或Ser；
并且其中任选地从所述多肽的C端缺失1至25个氨基酸。
41.根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽，其中所述分离的AfIP-1B多肽包含SEQID NO：4或SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
42.根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽，其中所述分离的AfIP-1B多肽包括选自如下的一种或多种性质：
a)如由SEQ ID NO：259的第101-105位表示的氨基酸基序；
b)如由SEQ ID NO：259的第133-144位表示的氨基酸基序；
c)如由SEQ ID NO：259的第177-184位表示的氨基酸基序；
d)如由SEQ ID NO：259的第358-365位表示的氨基酸基序；
e)如由SEQ ID NO：259的第511-520位表示的氨基酸基序；
f)杀真菌活性；
g)杀昆虫活性；以及
h)约72.5kD与约80kD之间的计算分子量。
43.一种转基因植物，其能够表达编码根据权利要求37所述的AfIP-1B多肽的分离的多核苷酸。
44.根据权利要求43所述的转基因植物，其中所述转基因植物是单子叶植物。
45.根据权利要求43所述的转基因植物，其中所述转基因植物表达一种或多种另外的转基因性状。
46.一种组合物，包含杀虫有效量的根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽。
47.一种组合物，包含杀昆虫有效量的如下物质：
a)根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽；以及
b)根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽。
48.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与根据权利要求47所述的组合物接触。
49.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述抗性昆虫害虫种群与根据权利要求47所述的组合物接触。
50.根据权利要求49所述的防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，其中所述杀虫蛋白选自Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、Cry9c、eCry3.1Ab和CBI-Bt。
51.一种转基因植物或其子代，包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子和根据权利要求24所述的分离的核酸分子。
52.一种转基因植物或其子代，其已用根据权利要求1所述的分离的核酸分子和根据权利要求24所述的分离的核酸分子稳定转化。
53.根据权利要求52所述的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物是单子叶植物。
54.根据权利要求52所述的转基因植物或其子代，其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、裸麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
55.根据权利要求52所述的转基因植物或其子代，还包括一种或多种另外的转基因性状。
56.根据权利要求55所述的转基因植物，其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
57.根据权利要求52所述的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子和根据权利要求24所述的分离的核酸分子。
58.一种DNA构建体，包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子和根据权利要求24所述的分离的核酸分子，其中根据权利要求1所述的分离的核酸分子有效连接至引导AfIP-1A多肽的表达的一个或多个调控序列，根据权利要求24所述的分离的核酸分子有效连接至引导AfIP-1B多肽的表达的一个或多个调控序列。
59.一种转基因植物或植物细胞，包含根据权利要求58所述的DNA构建体。
60.根据权利要求59所述的转基因植物的种子、谷粒或其加工产品，其中所述种子、谷粒或其加工产品包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子和根据权利要求24所述的分离的核酸分子。
61.根据权利要求60所述的种子，其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
62.一种用于在植物中表达编码杀昆虫蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括从包含根据权利要求10所述的表达盒和根据权利要求33所述的表达盒的转化植物细胞产生能够表达编码AfIP-1A多肽和AfIP-1B多肽的核酸分子的植物。
63.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法，包括在所述植物或其细胞中表达杀昆虫有效量的根据权利要求14所述的AfIP-1A多肽和根据权利要求37所述的AfIP-1B多肽。
64.一种用于防治昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的根据权利要求14所述的AfIP-1A多肽和根据权利要求37所述的AfIP-1B多肽接触。
65.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法，包括使所述昆虫害虫与组合物接触，所述组合物包含杀昆虫有效量的根据权利要求14所述的AfIP-1A多肽和根据权利要求37所述的AfIP-1B多肽。
66.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫种群的方法，包括使所述昆虫害虫种群与杀昆虫有效量的根据权利要求14所述的AfIP-1A多肽和根据权利要求37所述的AfIP-1B多肽接触。
67.一种融合蛋白，包含根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽。
68.一种融合蛋白，包含根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽。
69.一种融合蛋白，包含根据权利要求14所述的分离的AfIP-1A多肽和根据权利要求37所述的分离的AfIP-1B多肽。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261675950P | 2012-07-26 | 2012-07-26 | |
| US61/675950 | 2012-07-26 | ||
| US201261739468P | 2012-12-19 | 2012-12-19 | |
| US61/739468 | 2012-12-19 | ||
| US201361779457P | 2013-03-13 | 2013-03-13 | |
| US61/779457 | 2013-03-13 | ||
| PCT/US2013/052254 WO2014018853A1 (en) | 2012-07-26 | 2013-07-26 | Novel insecticidal proteins and methods for their use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105980566A true CN105980566A (zh) | 2016-09-28 |
Family
ID=48949237
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380050024.1A Pending CN105980566A (zh) | 2012-07-26 | 2013-07-26 | 新型杀昆虫蛋白及其使用方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105980566A (zh) |
| AR (1) | AR091910A1 (zh) |
| BR (1) | BR112015001741A2 (zh) |
| CA (1) | CA2880226C (zh) |
| MX (1) | MX357713B (zh) |
| RU (1) | RU2666914C2 (zh) |
| WO (1) | WO2014018853A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110055230A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-26 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 单加氧酶突变体及其应用 |
| CN113234724A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 华中农业大学 | 一种防治白蚁的dsRNA及其应用 |
| CN114990110A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-09-02 | 江西农业大学 | 一种野外蝴蝶监测无损伤取样方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113372421B (zh) * | 2014-10-16 | 2024-08-06 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004002223A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Dow Agrosciences Llc | Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from paenibacillus species |
| WO2004067727A2 (en) * | 2003-01-21 | 2004-08-12 | Dow Agrosciences Llc | Mixing and matching tc proteins for pest control |
| WO2008142036A2 (en) * | 2007-05-22 | 2008-11-27 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-ko |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6489542B1 (en) * | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| US7244607B2 (en) * | 2003-10-01 | 2007-07-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Chromobacterium subtsugae sp. nov. for control of insect pests |
| US8853490B2 (en) * | 2010-10-26 | 2014-10-07 | Pioneer Hi Bred International Inc | Antifungal proteins and methods of use |
-
2013
- 2013-07-25 AR ARP130102664A patent/AR091910A1/es unknown
- 2013-07-26 MX MX2015001046A patent/MX357713B/es active IP Right Grant
- 2013-07-26 BR BR112015001741A patent/BR112015001741A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-07-26 CN CN201380050024.1A patent/CN105980566A/zh active Pending
- 2013-07-26 CA CA2880226A patent/CA2880226C/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-07-26 RU RU2015106500A patent/RU2666914C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-07-26 WO PCT/US2013/052254 patent/WO2014018853A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004002223A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Dow Agrosciences Llc | Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from paenibacillus species |
| WO2004067727A2 (en) * | 2003-01-21 | 2004-08-12 | Dow Agrosciences Llc | Mixing and matching tc proteins for pest control |
| WO2008142036A2 (en) * | 2007-05-22 | 2008-11-27 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-ko |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BARLOY ET AL.: "Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridium bifermentans CH18.", 《GENE》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110055230A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-26 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 单加氧酶突变体及其应用 |
| CN110055230B (zh) * | 2019-04-17 | 2021-06-15 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 单加氧酶突变体及其应用 |
| CN113234724A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 华中农业大学 | 一种防治白蚁的dsRNA及其应用 |
| CN113234724B (zh) * | 2021-05-18 | 2022-04-05 | 华中农业大学 | 一种防治白蚁的dsRNA及其应用 |
| CN114990110A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-09-02 | 江西农业大学 | 一种野外蝴蝶监测无损伤取样方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR091910A1 (es) | 2015-03-11 |
| CA2880226A1 (en) | 2014-01-30 |
| BR112015001741A2 (pt) | 2017-08-08 |
| CA2880226C (en) | 2019-07-16 |
| RU2666914C2 (ru) | 2018-09-13 |
| MX357713B (es) | 2018-07-20 |
| MX2015001046A (es) | 2015-10-20 |
| RU2015106500A (ru) | 2016-09-20 |
| WO2014018853A1 (en) | 2014-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022201132B2 (en) | Insecticidal proteins and methods for their use | |
| US11325949B2 (en) | Insecticidal proteins and methods for their use | |
| US11180775B2 (en) | PHI-4 polypeptides and methods for their use | |
| RU2747978C2 (ru) | Инсектицидные белки и способы их применения | |
| CN106232820A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN106232620A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN107108705A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN104968672A (zh) | 新型杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN109068660A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN109475096A (zh) | 植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN109863167A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN108064233A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN109788735A (zh) | 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN108575091A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN108064303A (zh) | 基于结构的用于修饰pip-72多肽及由其衍生的pip-72多肽的方法 | |
| CN110087471A (zh) | 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN110088123A (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| CN110582508B (zh) | 杀昆虫蛋白及其使用方法 | |
| KR20200123144A (ko) | 바실러스가 농축된 게놈 라이브러리를 생성하고 새로운 cry 독소를 동정하기 위한 방법 | |
| KR20200127180A (ko) | 살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질 | |
| RU2666914C2 (ru) | Новые инсектицидные белки и способы их применения | |
| CN111344411B (zh) | 嵌合杀昆虫蛋白 | |
| BR112021003797A2 (pt) | proteínas inseticidas e métodos para seu uso |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160928 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |