CN105968231B - 一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法 - Google Patents

一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋生物技术领域，具体是一种不同分子量β‑C‑2,3,6‑壳聚糖硫酸酯及其制备方法。不同分子量β‑C‑2，3，6‑硫酸酯‑壳聚糖，其结构式如下，其中n为聚合度：2～200；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3 ‑)的含量为31.3％～36.5％。本发明制备方法属均相反应，简单易行，原料利用率高。

Description

一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体是一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法。
背景技术
甲壳素是世界第二大纤维素资源，由于来源不同，其构型可分为α-甲壳素、β-甲壳素、γ-甲壳素，目前研究最多的为α-甲壳素，为反平行结构，其次为β-甲壳素，为平行结构，不同构型的甲壳素可能显示不同的功效。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得到的产物，其生物相容性好，但由于其难溶于水和大部分有机溶剂而限制了其应用；天然制备的β-壳聚糖分子量通常在2000kDa以上，因而粘度很大不方便应用。
发明内容
本发明的目的是要提供一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯，不同分子量β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，其结构式为：
其中n为聚合度：2～200；化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3 －)的含量为31.3％～36.5％。
不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法：
(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃磺化反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；
(2)不同分子量的β-壳聚糖的制备：将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后再加入双氧水(使溶液中H2O2最终体积分数为1-3％)，混匀后于60-80℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖；
(3)β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上述磺化试剂，混合均匀后在微波辐射40-70℃条件下反应，反应后纯化得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖；
其中，β-壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.5：20-25:(g：ml：ml)；β-壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1：15-25(g：ml)。
所述高分子量β-壳聚糖的分子量为2000kDa-4573kDa。其，来源于鱿鱼软骨、墨鱼软骨等材料。
所述步骤2)酸性溶液为浓度为1-3％甲酸、乙酸或盐酸。
所述步骤(3)将分子量低于10KDa的壳聚糖原料，在40-45℃的微波辅助条件下反应1-3分钟，得到1000-4000Da分子量的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；
将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料，在45-55℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到4.5-10KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；
将分子量在100KDa以上的壳聚糖原料，在45-70℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到10-100KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯。
所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积的无水乙醇，室温沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯的粗产品；将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，再用NaOH溶液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖纯品。
本发明所具有的优点：
本发明将粘度极大的β-壳聚糖最终反应生成不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯类化合物，是壳聚糖经磺化后所得2，3，6位壳聚糖硫酸酯衍生物，具有强聚阴离子性质。具体，本发明用β-壳聚糖原料降解成分子量更小的β壳聚糖，方便制备成不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯，从而获得良好的水溶性，应用更加方便。同时本发明采用的壳聚糖硫酸酯类化合物的含硫量高，对壳聚糖原料利用率高；制备过程采用均相反应，制备方法简单快速，操作成本低，污染少。所用壳聚糖原料为不同分子量的β-壳聚糖，可得到不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯。且不同分子量的壳聚糖在许多活性方面如抑菌、促生长、免疫调节等方面显示不同的活性，因而本发明制备了不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯，从而改善其生物活性。本发明制备方法属均相反应，简单易行，原料利用率高。
附图说明
图1为β-壳聚糖原料的红外表征谱图。在1652cm-1附近，β-壳聚糖只有一个氨基峰，而另一氨基峰则位于1558cm-1附近，符合β-壳聚糖结构特征。
图2为分子量为3169Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1215.33cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在809.04cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图3为分子量为5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1219.52cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在811.99cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图4为分子量为14481Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1213.41cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在810.16cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图5为分子量为3169Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。
图6为图5为分子量为5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。
图7为分子量为14481Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的高效液相谱图。
图8为分子量为5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振氢谱。可以看出在壳聚糖的2，3，6位引入硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使氢的化学位移向低场漂移。
图9为分子量为5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振碳谱。可以看出在壳聚糖的2，3，6位引入硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用化学位移向低场漂移。
具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步说明如下。
实施例1 β-壳聚糖的制备
将日本枪乌贼软骨表面的组织残留物洗净、烘干，称取97g鱿鱼骨置于过量的4％的盐酸中浸泡7h，用蒸馏水洗至中性；然后置于过量的1％的氢氧化钠溶液中，90℃水浴反应2h，用蒸馏水洗净至中性并烘干，即得β-甲壳素，称重为30.7g，产率为31.6％。称取31.6gβ-甲壳素，将其粉碎后与45(wt)％的氢氧化钠溶液按照质量体积比1:8的比例混合95℃反应6小时,获得26.1gβ-壳聚糖，产率为85.02％，紫外光谱法测定脱乙酰度为87.58％、高效液相法测定分子量为4574KDa。
实施例2 不同分子量β-壳聚糖的制备
称取分子量为4574KDa、脱乙酰度为87.58％的β-壳聚糖，溶解于过量的0.8％(体积浓度)的盐酸溶液，搅拌溶解直至获得澄清、均质的质量浓度为1.25％的β-壳聚糖，然后加入过氧化氢(使溶液中H2O2最终体积分数为3％)，60-70℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的壳聚糖，高效液相法测定其分子量分别为8kDa,21kDa,1010kDa。
实施例3 不同分子量的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备
(1)磺化试剂的制备
用N，N－二甲基甲酰胺(DMF)为反应介质制备磺化试剂——DMF·SO3(二甲基甲酰胺—氯磺酸)磺化剂。将装有搅拌装置的三口烧瓶置于冰水浴中，三口瓶中加入500mL的N，N－二甲基甲酰胺，在搅拌状态下，滴加100mL氯磺酸，按照1-2滴/秒控制滴加的速度，并使反应体系的温度保持在0-5℃。滴加完毕后在室温下继续搅拌至澄清，使磺化试剂更为安全有效。
低分子量壳聚糖硫酸酯的制备
称取不同分子量的β-壳聚糖原料2g于三口瓶中，加入50ml甲酰胺，搅拌均匀后，加入5ml甲酸及50ml的磺化剂，混合均匀后，放入微波降解反应器中，在微波辐射条件下，45-70℃反应，然后用反应液2-5倍体积量的无水乙醇沉淀，室温沉化约30min，得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品。将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，并用2M NaOH溶液将其中和，透析，浓缩，冷冻干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。用高效液相色谱仪测β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的分子量(参见表1)。
表1 不同反应条件下不同分子量β-壳聚糖硫酸酯的制备
实施例4
将上述获得的不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，进行免疫增强活性的测定，以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，具体为：
取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml，均设置3个复孔。将96孔板继续培养24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等体积的Griess试剂，室温避光放置10min，酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线求出NO量。(参见表2)
表2 不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖对NO表达量的影响
分子量 NO表达量(uM)
3169Da 10.56±6.05
5030Da 17.51±9.30
14481Da 4.01±0.81
空白对照 1.99±0.49
不同分子量β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖均具有非常好的水溶性，且由于硫酸酯基的加入，其具有非常好的免疫增强活性，具体从上表2可以看出，β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖能够明显促进细胞产生NO，其产生NO的量为空白对照的2-10倍，上表中分子量为5030的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖免疫增强活性最强，表明β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖具有良好的免疫增强活性。

Claims (3)

1.一种不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：
（1）磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为5：1-10：1；
（2）不同分子量的β-壳聚糖的制备：将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后再加入双氧水，混匀后于60-80℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖；
（3）β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上述磺化试剂，混合均匀后在微波辐射40-70℃条件下反应，反应后纯化得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖；
其中，β-壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1：1-2.5：20-25，单位为g：ml：ml；β-壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1：15-25，单位为g：ml；
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的分子量为3169Da或5030Da ；
化合物的活性基团——硫酸酯基（OSO3 －）的含量为31.3%～36.5%。
2.按权利要求1所述的不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积的无水乙醇，室温沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的β- C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯的粗产品；将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，再用NaOH溶液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
3.一种权利要求1或2的制备方法得到的不同分子量β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯，其特征在于：不同分子量β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，其结构式为：
。
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