CN105967943B - 一种高效降解阿特拉津的生物肥及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效降解阿特拉津的生物肥及其制备方法。该生物肥通过复配对该菌株存活和生长有益的小麦秸秆、草木灰、锯末和自制发酵菌肥料，添加微小杆菌属菌株BTAH1和粒申氏杆菌菌株HBZA0511发酵而成，其中自制发酵肥料由饼粕、麦麸、玉米秸秆、鱼骨粉等营养基质添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌进行发酵而成。将该肥料撒到田间，可以使土壤中阿特拉津除草剂残留量迅速减少95％以上，有利于土壤中生物修复，进行绿色农产品生产，同时可以增加土壤中有机质含量。

Description

一种高效降解阿特拉津的生物肥及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高效降解阿特拉津的生物肥及其制备方法，属于生物肥技术领域。
背景技术
阿特拉津是一种广泛使用的三嗪类除草剂，主要用于玉米田，我国半数以上的玉米田施用阿特拉津进行除草。由于阿特拉津的持效期长，在长期使用过程中土壤中的阿特拉津长期残留，其残留物容易对部分后茬作物(如小麦、水稻、大豆等)产生毒害。其在水中和土壤中滞留期较长，且具有生物蓄积性，此外还能够对生态环境造成一定程度的破坏和污染，进而威胁动物和人类的健康。生物法降解是去除土壤中残留阿特拉津污染的主要方式，由于其降解速度快、费用低、效果好、不产生二次污染等优点，也成为环境污染治理的常用措施。
目前，国内外对阿特拉津生物降解的研究主要集中在阿特拉津降解菌株的筛选及降解机理研究等方面。自1993年以来，几个不同的实验室都分离到能矿化阿特拉津并以之为唯一碳氮源生长的细菌。据报道，不动杆菌DNS32、菌株M91-3、假单胞菌ADP、FR等在人工培养条件下可完全降解阿特拉津，但处于复杂农田环境时，菌株普遍存在生长缓慢，降解性能不稳定等问题。推其原因，一方面可能是环境条件(如pH、水分含量、温度、有机质含量)等变化直接影响到微生物降解阿特拉津的活性；另一方面，投放到环境中去的降解菌会受到抑制物的影响，或受到环境中土著菌群的影响，甚至受到拮抗作用而不能生长等，这些都可能造成接种的微生物不能成为优势菌从而失去降解阿特拉津的活性。因此，目前进行的阿特拉津生物降解研究多停留在实验室水平，市场上尚无商业化阿特拉津生物降解菌剂。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种高效降解阿特拉津的生物肥及其制备方法。该生物肥根据发酵菌的好氧特性和发酵特点，复配了有益于菌群存活和生长的有机和无机原料，将该肥料撒到田间，既能快速降解土壤中残留的阿特拉津，有利于土壤中生物修复，又能增加土壤中的有机质。
本发明的技术方案是：一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，
(1)制备发酵菌肥
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌进行活化，分别得到活化发酵液，备用；
b.将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌进行活化，然后采用麦芽汁培养基(加1％的红糖)进行扩大培养后，分别得到植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的扩大发酵液，备用；
c.发酵物料准备：将饼粕、麦麸、玉米秸秆和鱼骨粉按照质量比(8～12):(8～12):(45～55):1(优选10:10:50:1)的比例进行混合，灭菌晾干后作为发酵物料，备用；
d.发酵：将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的扩大发酵液各按2.5～3.5％的接种量分别加入到发酵物料中，再将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化发酵液各按0.4～0.6％的接种量分别加入到发酵物料中；混合均匀后加入凉开水，以混合后的物料用手攥时成团，掉到地上松散时为宜；然后再于28～32℃下静置发酵1.5～2.5天；最后进行高温杀菌后，即可得到成熟的发酵菌肥料。
(2)发酵菌株的活化
采用微小杆菌属菌株BTAH1(保藏号为CGMCC No.1113)和粒申氏杆菌菌株HBZA0511(保藏号为CGMCC No.1801)这两种菌株，将其活化后，分别得到种子液备用；
(3)菌株发酵
将步骤(2)的两种种子液各按质量比4.5～5.5％的接种量转入发酵罐进行发酵得到液体发酵液；发酵温度为28～32℃，发酵时间为50～70小时；
发酵培养基为：葡萄糖1％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl0.01％，酵母膏0.02％，蛋白胨0.05％，pH值7.2。
(4)固体物料的准备
将小麦秸秆、草木灰、锯末和步骤(1)制备的发酵菌肥按照质量比(3～5):(1.5～2.5):(0.8～1.2):1(优选4:2:1:1)的比例进行混合，制成固体物料，备用；
(5)生物肥的固体发酵：将液体发酵液与固体物料按照1：8～12的质量比例混合，通风处静置1.5～2.5天，即成。透气性编织袋包装。
上述生产路线如图1所示。
优选的，玉米秸秆、小麦秸秆均粉碎至2mm-3mm。
所述饼粕，包括豆饼粕、棉籽饼粕、菜籽饼粕、花生饼粕、芝麻饼粕、胡麻饼粕、葵花饼粕、玉米饼粕、玉米胚芽饼等。
优选的，所述步骤(1)的a步骤具体为：枯草芽孢杆菌(或地衣芽孢杆菌)采用LB液体培养基，摇床中28～32℃下，培养10～15小时；
优选的，所述步骤(1)的b步骤具体为：将植物乳杆菌(或鼠李糖乳杆菌)的冻干粉按0.8～1.2％的用量加入到灭菌后的MRS液体培养基中，35～38℃下静置培养10～15小时；测得OD值为0.45～0.55时再转接一次；待OD值再次达到0.45～0.55时，按8～12％的接种量用麦芽汁培养基(加1％的红糖)进行扩大培养至OD值为0.45～0.55，得到植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌扩大发酵液备用。
优选的，所述步骤(2)具体为：微小杆菌属菌株BTAH1(或粒申氏杆菌菌株HBZA0511)采用1/10的LB培养基为活化培养基，28～32℃下摇床培养20～28小时，待OD值达到0.5～0.6时，得到种子液，备用；
上述方法制备的生物肥含有大量的活菌，能够快速有效降解土壤中阿特拉津类除草剂。该产品在土壤含水量在15～18％时进行撒施，每亩用量30～50斤，撒施后立即进行浅耕，深度为8～10厘米，2～3天后即可进行作物播种。
本发明的有益效果是：该生物肥根据发酵菌的好氧特性和发酵特点，复配了有益于菌群存活和生长的有机和无机原料，以提高阿特拉津降解菌的田间适应性和降解稳定性。将该肥料撒到田间，可以使土壤中阿特拉津除草剂残留量迅速减少95％以上，有利于土壤中生物修复，进行绿色农产品生产，同时可以增加土壤中有机质含量。
附图说明
图1为本发明生物肥的生产路线。
具体实施方式
实施例1：制备发酵菌肥
1、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化
将枯草芽孢杆菌的冻干粉(活菌数≥1000亿个/克)按1％的用量加入到灭菌后的LB液体培养基中，放置到摇床中，30℃下，转速为180转/分钟活化培养12小时；地衣芽孢杆菌的活化同枯草芽孢杆菌；
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0；
2、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活化
将植物乳杆菌的冻干粉(活菌数≥1000亿个/克)按1％的用量加入到灭菌后的MRS液体培养基中，37℃下静置培养12小时，测得OD值为0.5；然后再转接一次，OD值再次达到0.5时；按10％的接种量用麦芽汁培养基(加1％的红糖)进行扩大培养至OD值为0.5，得到扩大发酵液；鼠李糖乳杆菌的活化同植物乳杆菌；
MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4 4H2O 0.25g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH至6.2～6.4；
麦芽汁培养基：麦芽膏粉130g/L，琼脂15g/L，氯霉素0.1g/L，最终pH 5.8～6.2；上述基础上另外加入1％的红糖。
3、发酵物料准备
取玉米的植株掰掉玉米后趁靑收割，晒干后用粉碎机进行粉碎，粉碎细度为2mm-3mm之间，得到玉米秸秆；将豆饼粕、麦麸、玉米秸秆、鱼骨粉按照质量比10:10:50:1的比例进行混合，80℃均匀灭菌20分钟，晾晒，作为发酵物料，备用；
4、发酵
将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌扩大发酵液各按3％的接种量分别加入到灭菌晾晒后的发酵用物料中，再将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化发酵液各按0.5％的量分别加入到发酵物料中；将发酵剂和物料混合均匀，然后加入凉开水，以感觉混合后的物料用手攥时成团，掉到地上松散即可；然后再于30℃发酵2天；然后再于80℃维持20分钟对发酵菌活性进行抑制，即可得到成熟的发酵菌肥料；发酵成功的发酵菌肥料的活菌数≥100亿/g。
实施例2制备生物肥
1、发酵菌株的活化
采用微小杆菌属菌株BTAH1(保藏号为CGMCC No.1113)和粒申氏杆菌菌株HBZA0511(保藏号为CGMCC No.1801)这两种菌株；
将微小杆菌属菌株BTAH1加入到活化培养基(1/10的LB培养基)中，30℃下转速120转/分钟，摇床培养24小时，待OD值达到0.5以后，得到种子液，备用；粒申氏杆菌菌株HBZA0511的活化同微小杆菌属菌株BTAH1；
1/10的LB培养基：即每1000毫升含有0.5g酵母膏，1克蛋白胨和1g氯化钠。
2、菌株发酵：将种子液按照质量比10％的接种量(两种菌的种子液各按5％的用量)转入发酵罐；发酵温度为30℃，搅拌转速为180转/分钟，通入无氧空气的通气量为1：0.6-1.2，发酵时间为60小时，得到液体发酵液，活菌数≥100亿/g；
发酵培养基配方为：葡萄糖1％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl0.01％，酵母膏0.02％，蛋白胨0.05％，pH值7.2。
3、固体物料的准备：
小麦秸秆用粉碎机进行粉碎，粉碎细度为2mm-3mm；将小麦秸秆、草木灰、锯末和实施例1的发酵菌肥料按照质量比4:2:1:1的比例进行混合，制成固体物料，备用；
4、生物肥的固体发酵：将液体发酵液与固体物料按照1：10的质量比例混合，通风处静置2天，即成。活菌数≥10亿/g。
5、包装方式：透气性编织袋。
以下结合玉米地田间试验来进一步说明其有益效果。
本实验设计了4个处理。处理1为A1：阿特拉津(降解菌空白对照)；处理2为A2：阿特拉津+生物肥(实施例1的发酵菌肥料，不加降解菌)；处理3为A3：阿特拉津+降解阿特拉津生物肥1(即本发明采用的方案，实施例2的生物肥)；处理4为A4：阿特拉津+降解生物肥2(实施例2中仅采用微小杆菌属菌株BTAH1一种降解菌，其于同实施例2)。每个实验小区面积按15m2计，每种处理需做3个重复，小区周边土壤用地膜覆盖防止喷施农药或菌剂时交互影响。小区中每一行为一个重复实验，为减少不同小区地力差异及操作导致的误差，每一行中的小区排列顺序通过随机抽取确定。
降解效果如表1所示。在本试验所设计的4个处理中，处理3(本发明所涉及的生物肥)对乙草胺的降解效果最好，处理7天残留量低于0.01mg/kg，效果显著。
表1田间阿特拉津降解效果
植株生长情况如表2所示，在播种期相同的条件下，以处理3效果最好，表现为玉米出苗快，较其它处理早出苗1天，营养生长好，地上茎叶生长好于其它处理，表现叶绿素含量高，叶面积大等。
表2玉米产区示范结果
实施例3：制备发酵菌肥
1、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化
同实施例1。
2、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活化
同实施例1。
3、发酵物料准备
取玉米的植株掰掉玉米后趁靑收割，晒干后用粉碎机进行粉碎，粉碎细度为2mm-3mm之间，得到玉米秸秆；将棉籽饼粕、麦麸、玉米秸秆、鱼骨粉按照质量比9:9:48:1的比例进行混合，80℃均匀灭菌20分钟，晾晒，作为发酵物料，备用；
4、发酵
将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌扩大发酵液各按2.8％的接种量分别加入到灭菌晾晒后的发酵用物料中，再将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化发酵液各按0.5％的量分别加入到发酵物料中；将发酵剂和物料混合均匀，然后加入凉开水，以感觉混合后的物料用手攥时成团，掉到地上松散即可；然后再于30℃发酵2天；然后再于80℃维持20分钟对发酵菌活性进行抑制，即可得到成熟的发酵菌肥料；发酵成功的发酵菌肥料的活菌数≥100亿/g。
实施例4制备生物肥
1、发酵菌株的活化
同实施例2。
2、菌株发酵：将种子液按照质量比9％的接种量(两种菌的种子液各按4.5％的平均用量)转入发酵罐；发酵温度为30℃，搅拌转速为180转/分钟，通入无氧空气的通气量为1：0.8-1.0，发酵时间为65小时，得到液体发酵液，活菌数≥100亿/g；
发酵培养基配方同实施例2。
3、固体物料的准备：
小麦秸秆用粉碎机进行粉碎，粉碎细度为2mm-3mm；将小麦秸秆、草木灰、锯末和实施例3的发酵菌肥料按照质量比4.5:1.5:1:1的比例进行混合，制成固体物料，备用；
4、生物肥的固体发酵：将液体发酵液与固体物料按照1：9的质量比例混合，通风处静置2天，即成。活菌数≥10亿/g。
实施例5：制备发酵菌肥
1、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化
同实施例1。
2、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活化
同实施例1。
3、发酵物料准备
取玉米的植株掰掉玉米后趁靑收割，晒干后用粉碎机进行粉碎，粉碎细度为2mm-3mm之间，得到玉米秸秆；将豆饼粕、麦麸、玉米秸秆、鱼骨粉按照质量比11:11:52:1的比例进行混合，80℃均匀灭菌20分钟，晾晒，作为发酵物料，备用；
4、发酵
将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌扩大发酵液各按3.2％的接种量分别加入到灭菌晾晒后的发酵用物料中，再将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化发酵液各按0.45％的量分别加入到发酵物料中；将发酵剂和物料混合均匀，然后加入凉开水，以感觉混合后的物料用手攥时成团，掉到地上松散即可；然后再于30℃发酵2天；然后再于80℃维持20分钟对发酵菌活性进行抑制，即可得到成熟的发酵菌肥料；发酵成功的发酵菌肥料的活菌数≥100亿/g。
实施例6制备生物肥
1、发酵菌株的活化
同实施例2。
2、菌株发酵：将种子液按照质量比11％的接种量(两种菌的种子液各按5.5％的平均用量)转入发酵罐；发酵温度为30℃，搅拌转速为180转/分钟，通入无氧空气的通气量为1：0.8-1.0，发酵时间为58小时，得到液体发酵液，活菌数≥100亿/g；
发酵培养基配方为：同实施例3。
3、固体物料的准备：
小麦秸秆用粉碎机进行粉碎，粉碎细度为2mm-3mm；将小麦秸秆、草木灰、锯末和实施例3的发酵菌肥料按照质量比4.5:1.5:1:1的比例进行混合，制成固体物料，备用；
4、生物肥的固体发酵：将液体发酵液与固体物料按照1：9的质量比例混合，通风处静置2天，即成。活菌数≥10亿/g。

Claims (9)

1.一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，
(1)制备发酵菌肥
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌进行活化，分别得到活化发酵液，备用；
b.将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌进行活化，然后采用加1％的红糖的麦芽汁培养基进行扩大培养后，分别得到植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的扩大发酵液，备用；
c.发酵物料准备：将饼粕、麦麸、玉米秸秆和鱼骨粉按照质量比(8～12):(8～12):(45～55):1的比例进行混合，灭菌晾干后作为发酵物料，备用；
d.发酵：将植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的扩大发酵液各按2.5～3.5％的接种量分别加入到发酵物料中，再将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化发酵液各按0.4～0.6％的接种量分别加入到发酵物料中；混合均匀后加入凉开水，以混合后的物料用手攥时成团，掉到地上松散时为宜；然后再于28～32℃下静置发酵1.5～2.5天；最后进行高温杀菌后，即可得到成熟的发酵菌肥；
(2)发酵菌株的活化
采用微小杆菌属菌株BTAH1和粒申氏杆菌菌株HBZA0511这两种菌株，将其活化后，分别得到种子液备用；
(3)菌株发酵
将步骤(2)的两种种子液各按质量比4.5～5.5％的接种量转入发酵罐进行发酵得到液体发酵液；发酵温度为28～32℃，发酵时间为50～70小时；
发酵培养基为：葡萄糖1％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，酵母膏0.02％，蛋白胨0.05％，pH值7.2；
(4)固体物料的准备
将小麦秸秆、草木灰、锯末和步骤(1)制备的发酵菌肥按照质量比(3～5):(1.5～2.5):(0.8～1.2):1的比例进行混合，制成固体物料，备用；
(5)生物肥的固体发酵：将液体发酵液与固体物料按照1：8～12的质量比例混合，通风处静置1.5～2.5天，即成。
2.如权利要求1所述的一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，所述玉米秸秆、小麦秸秆均粉碎至2mm-3mm。
3.如权利要求1或2所述的一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的a步骤具体为：枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌采用LB液体培养基，摇床中28～32℃下，培养10～15小时。
4.如权利要求1或2所述的一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的b步骤具体为：将植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌的冻干粉按0.8～1.2％的用量加入到灭菌后的MRS液体培养基中，35～38℃下静置培养10～15小时；测得OD值为0.45～0.55时再转接一次；待OD值再次达到0.45～0.55时，按8～12％的接种量用加1％的红糖的麦芽汁培养基进行扩大培养至OD值为0.45～0.55，得到植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌扩大发酵液备用。
5.如权利要求1或2所述的一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，所述步骤(2)具体为：微小杆菌属菌株BTAH1或粒申氏杆菌菌株HBZA0511采用1/10的LB培养基为活化培养基，28～32℃下摇床培养20～28小时，待OD值达到0.5～0.6时，得到种子液，备用。
6.如权利要求1或2所述的一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的c步骤中将饼粕、麦麸、玉米秸秆和鱼骨粉按照质量比10:10:50:1的比例进行混合。
7.如权利要求1或2所述的一种高效降解阿特拉津的生物肥的制备方法，其特征是，所述步骤(4)中将小麦秸秆、草木灰、锯末和步骤(1)制备的发酵菌肥按照质量比4:2:1:1的比例进行混合。
8.权利要求1或2所述的制备方法制备的生物肥。
9.权利要求8所述的生物肥的施用方法，其特征是，在土壤含水量在15～18％时进行撒施，每亩用量30～50斤，撒施后立即进行浅耕，深度为8～10厘米，2～3天后进行作物播种。
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