CN105960408B - 具有抗真菌活性的新型微生物产物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可以成为有前景的创新药物先导化合物的具有新型母核的化合物、其作为抗真菌剂的用途及其制备方法等。本发明提供下式所示的化合物，或其药学上可接受的盐，和包含上述的抗真菌剂等。

Description

具有抗真菌活性的新型微生物产物
技术领域
本发明涉及具有新型母核的化合物、其作为抗真菌剂的用途及其制备方法等。
背景技术
近年来，高龄人群的增加、先进医学的发展、晚期癌症患者的免疫缺陷等真菌感染有所增加。这些感染带来严重影响，甚至经常导致死亡。由于现有抗真菌药种类并不多，且其毒性很高，因此对不同于现有药物的新抗真菌剂的母核存在需求。此外，由于抗真菌药的使用导致耐药菌出现的增加，急需对新型药物进行开发。而基于念珠菌的抗真菌剂显示低毒性，但由于其分子量大，与血清的反应性会带来问题。基于唑类的抗真菌剂鉴于其毒性，难以以高浓度施用。因此，对显示与血清低反应性和低毒性的低分子量有效化合物存在强烈需求。
目前，在从微生物产物寻求药物产品的种子化合物中，主要收集陆地分离来源并对其进行微生物分离。至今发现的微生物代谢产物包括青霉素(penicillin)和阿霉素(adriamycin)，且发现了多种抗生素和抗癌剂，并将其用作针对感染、癌症等的治疗药物。然而，由于长期的连续探索，从陆地区域获得的微生物代谢产物大多为已知化合物，而用于新型药物候选的次级代谢产物非常难于获得。因此，天然物质药物开发公司的新型药物开发迅速减少。为克服该状况，使用化学库(天然物质和合成化合物)的筛选已在全球范围展开。然而意外的是，未从所述化学库获得有前景的新型药物候选化合物。在这种情势下，获得新型药物候选化合物极为困难。
发明概述
本发明所解决的问题
本发明是鉴于技术领域中的上述状况而进行，且目的是提供可以成为有前景的创新药物先导化合物的具有新型母核的化合物、其作为抗真菌剂的用途及其制备方法等。
解决问题的方式
鉴于上述在寻求新型药物候选化合物中的现有状况，本发明注意到了海洋微生物来源。海洋微生物来源几乎未经利用，具有得到新型次级代谢产物的高可能性。然而，需要有用于收集分离来源的特殊技术，对其培养的技术尚未有效建立。本发明对从海洋收集样品的方法、微生物的培养方法和评估方法等实施了深入研究，并在分离用于开发抗真菌剂的有前景的微生物菌株中取得了成功。16S核糖体碱基序列分析揭示了该微生物菌株是链霉菌属(genus Streptomyces)的放线菌(actinomycetes)。此外，本发明成功从微生物培养基分离并纯化了显示活性的化合物。所述化合物具有小分子量、与血清的低反应性和强抗真菌作用。此外，结构分析结果是，发现了该化合物具有新型母核，且作为用于新型药物研发的种子化合物具有前景。发明人进一步实施了基于这些发现的研究并完成了本发明。
相应地，本发明如下所述：
[1]下式所示的化合物：
或其药学上可接受的盐。
[2]化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物使用氘代甲醇作为测量溶剂测量时显示下列13C-NMR和1H-NMR谱：
表1
[3]药物或农药，其包含上述[1]或[2]的化合物或其药学上可接受的盐。
[4]上述[3]的药物或农药，其是抗真菌药。
[5]上述[4]的药物或农药，其靶向选自下组的属的真菌：念珠菌(genus Candida)属和曲霉属(genus Aspergillus)。
[6]制备上述[1]或[2]的化合物或其药学上可接受的盐的方法，该方法包括：在包含碳源的培养基中培养登录号为NITE BP-01677的链霉菌属(genus Streptomyces)的细菌或其变体从而在培养基中产生所述化合物或其药学上可接受的盐，并从所述培养物中回收所述化合物或其药学上可接受的盐。
[7]登录号为NITE BP-01677的链霉菌属的细菌或其变体。
本发明还提供下列：
[8]用于在哺乳动物中预防或治疗真菌病的方法，其包括将治疗有效量的上述[1]或[2]的化合物或其药学上可接受的盐给药至有需要的哺乳动物。
[9]防除植物疾病的方法，其包括：用治疗有效量的上述[1]或[2]的化合物或其药学上可接受的盐处理对象作物和/或对象作物的种子。
[10]上述[1]或[2]的化合物或其药学上可接受的盐用于在哺乳动物中预防或治疗真菌病的用途。
发明效果
由于本发明的化合物具有小分子量、与血清的低反应性和强抗真菌作用，可将其用作抗真菌剂。此外，由于本发明的化合物具有新型母核，因此其在作为种子化合物用于开发新型药物中具有前景。本发明还提供本发明的化合物的制备方法。
附图简述
图1显示了本发明化合物的NMR分析结果。
图2显示了抗真菌药敏感性测试的结果(MIC(μg/mL))，其中KKRM是本发明的化合物，MCFG是米卡芬净(Micafungin)、AMPH是两性霉素B(amphotericin B)、5-FC是氟胞嘧啶(flucytosine)、FLCZ是氟康唑(fluconazole)、ITCZ是伊曲康唑(itraconazole)、VRCZ是伏立康唑(Voriconazole)且MCZ是咪康唑(miconazole)。
实施方案的说明
本发明在下文进行详细解释。
本发明提供通过下式所示的化合物：
或其药学上可接受的盐(这些在下文将统称为本发明的化合物)。本发明的化合物可包含一种以上的异构体如基于不对称碳原子的光学异构体、基于双键的几何异构体等，全部这些异构体及其混合物都涵盖在本发明的保护范围中。在上述式中，与双键部分邻接的波浪线意在涵盖下列两种几何异构体。
药学上可接受的盐的实例包括：与无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐，或与有机酸如乙酸、苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等形成的盐。
本发明的化合物可使用通过本发明的发明人从鹿儿岛县加计吕麻岛(KakeromaIsland,Kagoshima Prefecture)的海砂分离的链霉菌属细菌(以下也称为本发明的细菌)或其变体而产生。该细菌保藏于千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8，独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物保藏中心(National Institute of Technology andEvaluation(NITE)Patent Microorganisms Depositary,Kazusa-kamatari,Kisarazu,Chiba 2-5-8,Japan)(登录号:NITE P-1677，保藏日期：2013年8月1日)，提交了将NITE P-01677转移至基于布达佩斯条约的保藏的移管请求，该请求于2014年7月30日(移管日期)受理，且该细菌的国际保藏登录号为NITE BP-01677。
所述细菌具有灰色的气生菌丝，具有短的螺旋形的孢子链。可溶性色素产生黄色系的色素。背面的颜色为奶油色至淡黄色的色系。成熟的孢子形成孢子团。
所述变体是源自本发明细菌的菌株，只要能产生本发明的化合物，其并不受特定限制。例如，所述变体的16S rRNA基因核苷酸序列与本发明细菌的16S rRNA基因核苷酸序列相同(即100％一致)或实质上相同(例如如下文所述的，当通过在变异原性物质的存在下产生突变时等)。所述变体还可显示与本发明细菌相似的形态、生理学特征。
当用于本发明的说明书时，“与本发明细菌的16S rRNA基因核苷酸序列实质上相同”的核苷酸序列是指，所比较的核苷酸序列具有99％以上，优选99.1％以上，更优选99.2％以上，进一步优选约99.5％以上的核苷酸序列同一性。核苷酸序列的同一性可通过本身已知的方法确定，且例如使用同源性计算算法NCBI BLAST(National Center forBiotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)在下列条件下(预期(expectancy)＝10；允许空格(gap allowed)；过滤(filtering)＝ON；匹配得分＝1；错配得分＝-3)计算。
所述变体，可通过例如修饰处理本发明的细菌来制作。修饰处理的实例包括：在变异原性物质等存在下的突变、导入能够提高本发明的细菌的有用性的基因(例如提高本发明化合物的可生产性的基因)和破坏本发明的细菌所保有的基因，以及这些操作的组合等。
本发明的细菌或其变体可通过在包含碳源的营养培养基中培养而维持和生长。碳源的实例包括糖类(例如单糖如葡萄糖、半乳糖等，二糖如蔗糖等，多糖如淀粉等)、甘油等，优选为淀粉。所述营养培养基优选还包含氮源、且氮源的实例包括酪胨(casitone)、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物等。此外，向培养基中添加NaH2PO4可促进本发明化合物的早期生产。此外，培养基优选包含海水，其浓度为通常海水浓度(即人工海水38.4g/L)的约10％-40％。因此，培养基的人工海水浓度为，例如为0.384g/L-38.4g/L，优选1.92g/L-13.04g/L，更优选3.84g/L-15.36g/L。作为盐分，实例包括氯化钠、氯化镁、硫酸镁、硫酸钙、氯化钾等。示例的培养基的组成可以是淀粉4％、肉提取物0.4％、酪胨0.4％、NaH2PO40.1％，且具有通常海水浓度的10％的液体培养基。其他培养条件，可列举在pH 6.8-7.5(例如7.0)，25-35℃(例如28℃)搅拌培养。
通过在上述培养条件下培养本发明的细菌或其变体例如2-14天，可在培养物中产生本发明的化合物。本发明的化合物可从所述培养物回收，且优选分离并纯化。分离和纯化可通过本技术领域熟知的方法实施。例如，可使用浓缩、提取、层析、再沉淀、重结晶等。
如下文实施例所示，本发明的化合物针对范围广泛的真菌具有强抗真菌活性。因此，本发明的化合物可作为例如抗真菌剂使用。因此，本发明还提供包含本发明的化合物作为活性成分的抗真菌药(下文还称作本发明的抗真菌药)。本发明的抗真菌药可用作药物或农药。
本发明的抗真菌药靶向的真菌的实例，可列举念珠菌属(genus Candida)(例如白 念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌 (Candida tropicalis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、季也蒙念珠菌(Candida quilliermondii)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)等)、曲霉属(genus Aspergillus)(例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄 曲菌(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)等)、毛癣菌属(genus Trichophyton)(例如红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、犬小 孢子菌(Microsporum canis)、石膏状小孢子菌(Microsporum gypseum)、疣状毛癣菌 (Trichophyton verrucosum)等)等真菌，但不限于此。作为真菌病，其不受特定限制，可列举深层皮肤真菌病、深部真菌病(deep mycosis)、足菌肿(mycetoma)和真菌血症(fungemia)。
当本发明的抗真菌药用作农药时，对象作物不受特定限制，且可举例：植物如谷类(例如水稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱等)、豆类(大豆、小豆、蚕豆、豌豆、花生等)、果树、果实类(苹果、柑橘、梨、葡萄、桃、梅子(日本李子)、樱桃、核桃、杏仁、香蕉、草莓等)、蔬菜类(卷心菜、西红柿、菠菜、西兰花、生菜、洋葱、葱、柿子椒等)、根茎类蔬菜(胡萝卜、马铃薯、甘薯、萝卜、莲藕、芜青等)、加工用作物(棉、麻、楮、三桠植物、油菜籽、甜菜、啤酒花、甘蔗、甜菜、橄榄、橡胶、咖啡、烟草、茶叶等)、瓜类(南瓜、黄瓜、西瓜、甜瓜等)、草(果园草、高粱、梯牧草、苜蓿(clover)、紫花苜蓿(alfalfa)等)、草皮(韩国草坪草(Korean lawngrass)、剪股颖(bentgrass)等)、香料等用的作物(薰衣草、迷迭香、百里香、香菜、辣椒、生姜等)、花卉类(菊花、玫瑰、兰花等)等。本发明的抗真菌药，通过用其有效量处理对象作物和/或对象作物的种子，可用于防除与上文提及的作物中的真菌相关的疾病。
所述农药可以下列形式使用，且一般与在制剂领域中常规使用的辅助剂共同使用。本发明的化合物通过已知方法配制成例如乳剂储存液、可喷雾糊剂、可喷雾或可稀释的溶液、可稀释乳剂、水和剂、水溶剂、散剂、颗粒剂、悬浮剂、干悬浮剂、烟熏剂、烟蒸剂和例如由聚合物形成的胶囊剂。
当目标是固体剂时，植物性粉末如大豆粉、小麦粉等，矿物质微粉如硅藻土、磷灰石、石膏、滑石、膨润土、粘土等、有机和无机化合物如苯甲酸钠、尿素、芒硝等可作为添加剂和载体使用。
当目标是液体剂型时，芳香烃如植物油、矿物油、煤油、二甲苯和甲苯等，酰胺如甲酰胺和二甲基甲酰胺，亚砜类如二甲基亚砜，酮类如甲基异丁基酮和丙酮、三氯乙烯、水等可作为溶剂使用。为得到均匀和稳定形式的这些制剂，根据需要还可添加表面活性剂。这样获得的水和剂、乳剂、水溶液、悬浮剂和干悬浮剂，用水稀释至给定浓度并用作悬浊液或乳浊液，粉剂和颗粒剂可通过散布于土壤或植物而使用。
包含本发明的化合物的农药中，活性成分的含量和用量取决于剂型、施用对象的真菌种类、对象作物等可在广范围内变化。
另一方面，当将本发明的抗真菌药用作药物时，可将其通过口服或非肠胃给药途径(例如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药)给药至治疗对象，例如，哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、羊、猴等)。
当本发明的抗真菌药经皮给药时，除上述活性成分外，其还可根据需要包含油性基质、乳化剂和乳化稳定剂、增溶剂、粉末成分、高分子成分、粘合性改良剂、成膜剂、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、保存剂、形状保持剂、保湿剂、皮肤保护剂、清凉剂、香料、着色剂、螯合剂、润滑剂、血液循环促进剂、收敛剂、组织修复促进剂、止汗剂、植物提取物成分、动物提取物成分、抗炎剂、止痒剂等其它成分。作为这些添加剂，可使用一般用于制剂的那些。
本发明的抗真菌药可通过将有效成分以外的上述组分等由药物制剂领域常规使用的方法配制成如膏剂、液剂、洗剂、乳剂、酊剂、软膏剂、水性凝胶剂、油性凝胶剂、气溶胶、粉末、香波、肥皂，应用于指甲的指甲油(enamel agent)等外用药物而使用。
当本发明的抗真菌药口服给药时，可将其制备成适于口服给药的剂型如胶囊、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、细粒剂、锭剂等。这些制剂可使用通常用于口服制剂的添加剂如赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、增溶剂、防腐剂、矫味剂、安抚剂、稳定剂等由常规方法制备。
本发明在下文通过参照实施例更详细解释，但其并不应理解为是限制性的。
实施例
实施例1：链霉菌属sp.A84菌株的分离和分析
从鹿儿岛县加计吕麻岛(Kakeroma Island,Kagoshima Prefecture)的海沙采集了分离源。从采集的样品分离菌株，将分离出的微生物菌株进行以抗真菌活性作为指标的评估筛选。结果获得了有前景的菌株，进一步对其进行详细检验。
通过16S rRNA的系统分类法分析该菌株，发现生产菌是链霉菌属的放线菌，且近缘种是结节链霉菌(Streptomyces nodosus)(98.8％同源性)和球团链霉菌(Streptomycesglomeratus)(99.0％同源性)。由于与最近缘的球团链霉菌(Streptomyces glomeratus)的碱基序列的同源性为99.0％，这表明新品种的可能性。将该菌株命名为链霉菌属sp.A84菌株。将链霉菌属sp.A84菌株保藏于千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8，独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物保藏中心(National Institute of Technology andEvaluation(NITE)Patent Microorganisms Depositary,Kazusa-kamatari,Kisarazu,Chiba 2-5-8,Japan)(登记号No.:P-01677,保藏日:2013年8月1日)，提交了将NITE P-01677转移至基于布达佩斯条约的保藏的移管请求，该请求于2014年7月30日(移管日期)受理，且该细菌的国际保藏登录号为NITE BP-01677。
实施例2：用于A84菌株的生产培养基的研究
研究了用于A84菌株的生产培养基。
培养基的研究结果是，在下列培养基中显示了良好的生产性。
培养基组成：
淀粉4％
酪胨0.1％
NaH2PO40.1％
人工海水(MARINE ART SUPER FORMULA 1，Tomita Pharmaceutical Co.,Ltd.生产)0.384％
pH 7.0
培养条件：将培养基(100ml)填充至300ml容量三角烧瓶，并在28℃,200rpm培养2-4天。
实施例3：活性成分的分离、纯化和分析
将A84菌株接种至添加有100ml的具有实施例2中所述组成的培养基的300ml容量三角烧瓶中，并在28℃,200rpm(旋转式振动器)培养3天。使用等量的乙酸乙酯对培养液进行溶剂提取，然后浓缩乙酸乙酯。将干燥样品溶于少量甲醇中，并通过使用ODS柱的HPLC进行柱层析分离，进行了纯化(纯度95％以上,100μg/1L)。
进行了活性成分的LC/MS分析、NMR分析和旋光度测量。测量条件如下所述：
LC/MS:
装置：型号Agilent6540
离子源：AJS-ESI、ESI、APC1
NMR:
装置：ECA-600(JEOL Ltd.制造)
磁体(magnet)：SCM 14.o1T
孔径(bore diameter)：54mm
探针：3mm、5mm、10mm
测量溶剂：氘化甲醇
旋光度：
旋光仪：P-1030(JASCO Corporation制造)
溶剂：甲醇(HPLC用)
样品浓度：4mg/ml
温度：28
比色池(cell)：圆筒形玻璃池(mod.CG3-10)
λ：589nm
结果确定分子式为C15H19NO2，且分子量为245.1416，并确定NMR谱如图1所示。比旋光度为-3.25000deg(Avg)，且旋光是-0.0013deg(Avg)。
实验例1：抗真菌活性的测量
通过痕量液体稀释法测量了最小发育抑制浓度(MIC)。使用酵母样真菌FP‘Eiken’(Eiken Chemical Co.,Ltd.)，并根据产品说明书实施测量。
各种药物对各菌种的MIC(μg/mL)示于图2中。本发明活性成分显示了对念珠菌属spp.和曲霉属spp.的良好活性。
工业应用性
由于本发明的化合物具有小分子量、与血清的低反应活性和强抗真菌作用，其作为抗真菌剂有效。此外，由于本发明的化合物具有新型母核，其作为用于开发新型药物的有前景的种子化合物具有前景。本发明还提供本发明化合物的制备方法。
本申请基于日本提交的专利申请号2013-178707(申请日：2013年8月29日)，其全文内容涵盖于本文之中。

Claims (6)

1.下式所示的化合物：
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物使用氘代甲醇作为测量溶剂测量时显示下列13C-NMR和1H-NMR谱：
表1
3.药物或农药，其包含根据权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3的药物或农药，其是抗真菌药。
5.根据权利要求4的药物或农药，其靶向选自下组的属的真菌：念珠菌属(genusCandida)和曲霉属(genus Aspergillus)。
6.制备根据权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐的方法，该方法包括：在包含碳源的培养基中培养登录号为NITE BP-01677的链霉菌属(genus Streptomyces)的细菌或其变体从而在培养基中产生所述化合物或其药学上可接受的盐，并从所述培养物中回收所述化合物或其药学上可接受的盐。
CN201480047824.2A 2013-08-29 2014-08-29 具有抗真菌活性的新型微生物产物 Active CN105960408B (zh)

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