CN105960247A - 用抗vegf darpin治疗眼病的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于治疗患有渗出性年龄相关性黄斑变性和其它视网膜病症的患者的方法，所述方法是通过施用包含锚蛋白重复结构域的结合蛋白实现，其中首先施用2至5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，然后施用另外的剂量，并且剂量之间间隔更长时间。

Description

用抗VEGF DARPIN治疗眼病的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年6月24日提交的美国临时申请号62/016,620及2013年11月5日提交的美国临时申请号61/900,246的权益。这些申请的完整内容通过引用并入本文。
背景
视网膜是内衬于眼睛后壁内表面的一薄层的神经组织。视网膜由各种类别的神经元组成，其中最熟悉的是负责视觉的光感受器：对光较为敏感的视杆细胞，及对颜色较为敏感的锥体细胞。锥体细胞主要集中在黄斑(视网膜的较小的中心部分)中。眼睛的这一部分负责中心的高敏锐度视觉。
在发达国家，视网膜，特别是黄斑的疾病是引起年龄超过50岁的人视觉障碍和失明的主导原因。这些疾病包括年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、视网膜分支静脉阻塞及视网膜中央静脉阻塞。黄斑变性也可能在儿童中发生。
这些疾病中有一些可以用抑制一种称为血管内皮生长因子A(VEGF-A)的蛋白质的药剂进行治疗。VEGF-A刺激血管的生长。在渗出性(或血管性)年龄相关性黄斑变性中，异常高含量的VEGF刺激黄斑中新血管的生长，使得光感受器不可逆地受损；此外，这些新形成的血管将血液和蛋白质渗漏到视网膜中，导致在先前被光感受器占据的区域中形成瘢痕。抑制VEGF-A将阻止这些新血管的形成，并且阻止血液和蛋白质的渗漏，由此保护视觉。
目前仅有少数药物被用于抑制眼中的VEGF-A：贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、阿柏西普(aflibercept)及哌加他尼(pegaptanib)。兰尼单抗是抑制VEGF-A的抗体片段；贝伐单抗是也抑制VEGF-A的人源化单株抗体并且源自于与兰尼单抗相同的亲本抗体。阿柏西普是包含人VEGF受体1和2的细胞外结构域与人IgG1的Fc部分的融合物的重组融合蛋白。哌加他尼不如兰尼单抗、贝伐单抗或阿柏西普有效，因此不常使用。
实际上，仅有两种疗法可以用于抑制眼中的VEGF：贝伐单抗/兰尼单抗和阿柏西普。因此，本领域中需要能够治疗视网膜疾病的疗法，这些疗法比可用的少数疗法更有效，或提供与这些少数疗法不同的益处。
发明内容
本发明人发现，本发明的方法可以用于治疗患者的渗出性年龄相关性黄斑变性和其它视网膜病症，并且带来意外的益处。在一个实施方案中，该方法包括递送频繁剂量的重组结合蛋白，随后递送不太频繁的剂量。
因此，在本发明的一个实施方案中，向患者施用约0.25mg至约4mg结合蛋白，然后在25至35天后施用相同剂量；接着可以任选地施用结合蛋白多至三次以上，并且剂量之间具有相同间隔。在这些初始的频繁剂量之后，继续施用结合蛋白，给予至少一次另外的剂量，但每次另外的剂量之间间隔50至115天。以此方式继续治疗，以50至115天的间隔施用结合蛋白，持续患者需要的时间。
此处是实例：
这一方法可以用于改善患有视网膜疾病的患者的视力，减少视网膜中的异常液体并减小异常视网膜厚度。
以下更详细地描述这些和其它实施方案。
附图简述
图1示出了在第1天及第4周和第8周接受1mg和2mg根据本发明的结合蛋白abicipar的渗出性年龄相关性黄斑变性(“AMD”)患者以及在第1天及第4周、第8周、第12周和第16周接受0.5mg兰尼单抗的患者在基线时及在第1周、第4周、第8周、第12周、第16周和第20周时的最佳矫正视力(“BCVA”)。图2-7还显示出从以此方式治疗的患者得到的数据。
图2示出了在上述三组患者中BCVA具有15或更多个字母的改善的患者的比例。在所显示的每周的一组三个条柱中，2.0mg abicipar是左侧的条柱；1.0mg abicipar是中间的条柱；并且0.5mg兰尼单抗是右侧的条柱。
图3示出了以不到15个字母的BCVA损失评估的达到稳定视力的患者的比例。在所显示的每周的一组三个条柱中，2.0mg abicipar是左侧的条柱；1.0mg abicipar是中间的条柱；并且0.5mg兰尼单抗是右侧的条柱。
图4示出了接受2.0mg abicipar、1.0mg abicipar及0.5mg兰尼单抗的患者的平均中心视网膜厚度。
图5示出了视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体(全部三个隔室)在治疗后得到解决的患者的比例。在所显示的每周的一组三个条柱中，2.0mg abicipar是左侧的条柱；1.0mg abicipar是中间的条柱；并且0.5mg兰尼单抗是右侧的条柱。
图6示出了基线视力(Snellen)是20/320+1并在基线(第1天)时及第4周和第8周时用2mg abicipar治疗的88岁白种男性的视网膜图像。显示了基线图像(图6A)和之后每四周的图像(图6B-6G)。
图7示出了基线视力(Snellen)是20/63+1并在基线(第1天)时及第4周和第8周时用2mg abicipar治疗的75岁西班牙女性的视网膜图像。显示了基线(图7A)和之后每四周(图7B-7G)的图像。
图8和9示出了在研究的175名渗出性AMD患者中，在第1天然后在第16周或更早时间(如果其满足某些再治疗标准)给予患者4.2mg abicipar、3.0mg abicipar及0.5mg兰尼单抗治疗之后视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体得到解决的患者的比例。图8示出了全部三个隔室中的液体都得到解决的患者的比例；在所显示的每周的一组三个条柱中，4.2mg abicipar是左侧条柱；3.0mg abicipar是中间条柱；并且兰尼单抗是右侧条柱。图9示出了这些隔室中的一个、两个、全部三个的液体都得到解决或都未得到解决的患者的比例。
发明详细说明
重组结合蛋白
本发明的方法施用包含结合结构域的结合蛋白，所述结合结构域包括设计的锚蛋白重复结构域。此类结合蛋白及其包含的设计的锚蛋白重复结构域的实例描述于美国专利号7,417,130、美国专利号8,110,653及美国专利申请公布号2011/0207668中，全部三项专利的完整内容都通过引用并入本文中。
术语“重复蛋白质”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。在一个实施方案中，重复蛋白质各自包含最多四个重复结构域。在另一实施方案中，重复蛋白质各自包含最多两个重复结构域。在另一实施方案中，重复蛋白质各自仅包含一个重复结构域。重复蛋白质还可以包含另外的非重复蛋白质结构域、多肽标签和/或多肽连接子。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复单元(模块)作为结构单元的蛋白质结构域，其中这些结构单元具有相同折叠，并且紧密堆叠以产生例如具有共同疏水性核心的超螺旋结构。
术语“设计的重复蛋白质”和“设计的重复结构域”分别是指由美国专利号7,417,130和美国专利号8,110,653中解释的程序获得的重复蛋白质或重复结构域。设计的重复蛋白质和设计的重复结构域是合成的而非自然界来源的。其分别是通过表达相应设计的核酸而获得的人造蛋白质或结构域。
哺乳动物VEGF家族由五种糖蛋白组成，称为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D(又称FIGF)及胎盘源性生长因子(PIGF，又称PGF)。经显示，VEGF-A是抗血管生成疗法的有效靶(Ellis,L.M.和Hicklin,D.J.,Nature Rev.Cancer 8,579-591,2008)。VEGF-A配体结合到并且活化三种结构类似的III型受体酪氨酸激酶，名为VEGFR-1(又称FLT1)、VEGFR-2(又称KDR)及VEGFR-3(又称FLT4)。VEGF配体对于这些酪氨酸激酶受体中的每一种具有截然不同的结合特异性，由此引起其功能的多样性。响应于配体结合，VEGFR酪氨酸激酶活化不同的下游信号传导路径网络。VEGFR-1和VEGFR-2主要见于血管内皮上，而VEGFR-3主要见于淋巴管内皮上。这些受体都具有细胞外结构域、单一跨膜区及间插激酶插入结构域的共同酪氨酸激酶序列。近来已显示，最初被鉴别为神经元导向介体臂板蛋白(semaphorin)/脑衰蛋白(collapsin)家族的受体的神经菌毛素(NRP-1)可充当VEGF-A的同工型特异性受体。
已知VEGF-A的各种同工型是通过替代性剪接VEGF-A基因内的八个外显子而产生的。所有同工型都含有外显子1-5和末端外显子，即外显子8。编码肝素结合结构域的外显子6和7可以包括或不包括在内。由此产生根据氨基酸数量命名的蛋白质家族：VEGF-A165、VEGF-A121、VEGF-A189等等。不过，外显子8在核苷酸序列中含有两个3'剪接位点，这些位点可以被细胞用于产生长度相同但C末端氨基酸序列不同的两个同工型家族(Varey,A.H.R.等人,British J.Cancer 98,1366-1379,2008)。VEGF-Axxx(“xxx”表示成熟蛋白质的氨基酸数量)，促血管生成的同工型家族，是利用外显子8中的最近端序列(导致包含外显子8a在内)产生的。最近描述的抗血管生成VEGF-Axxxb同工型是利用远端剪接位点(沿所述基因距近端剪接位点66bp)产生的。由此导致剪接去除外显子8a并且产生了编码VEGF-Axxxb家族的mRNA序列。VEGF-A165是主要的促血管生成同工型并且通常在多种人实体肿瘤中过度表达。VEGF-A165b是最先鉴别的外显子8b编码的同工型并且经显示，其具有抗血管生成作用(Varey等人，在上述引文中；Konopatskaya,O.等人,Molecular Vision12,626-632,2006)。其为VEGF-A的内源抑制性形式，降低VEGF-A诱导的内皮细胞增殖和迁移。尽管VEGF-A165b可以结合到VEGFR-2，但其结合不会引起受体磷酸化或下游信号传导路径的活化。
术语“蛋白质”是指多肽，其中该多肽的至少一部分具有或能够通过在其多肽链内和/或其多肽链间形成二级、三级或四级结构而获得确定的三维布置。如果一种蛋白质包含两个或更多个多肽，那么个别多肽链可以非共价连接或例如通过两个多肽之间的二硫键共价连接。蛋白质中独立地具有或能够通过形成二级或三级结构而获得确定的三维布置的一部分称为“蛋白质结构域”。此类蛋白质结构域是本领域的熟练从业人员众所周知的。
在重组蛋白、重组蛋白结构域等中使用的术语“重组”意思指，这些多肽是利用相关领域的熟练从业人员众所周知的重组DNA技术产生的。举例来说，编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)可以被克隆到细菌表达质粒(例如pQE30，Qiagen)中。当将如此构建的重组表达质粒插入细菌(例如大肠杆菌)中时，这一细菌可以产生由这一重组DNA编码的多肽。相应地产生的多肽称为重组多肽。
术语“多肽标签”是指连接到多肽/蛋白质的氨基酸序列，其中该氨基酸序列可用于该多肽/蛋白质的纯化、检测或靶向，或其中该氨基酸序列改善该多肽/蛋白质的物理化学特性，或其中该氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的个别多肽标签、部分和/或结构域可以直接彼此连接，或经由多肽连接子彼此连接。这些多肽标签都是本领域众所周知的并且是本领域技术人员完全可得到的。多肽标签的实例是小多肽序列，例如His、myc、FLAG或Strep标签或部分，如允许检测多肽/蛋白质的酶(例如，碱性磷酸酶)，或可以用于靶向的部分(如免疫球蛋白或其片段)和/或效应分子。
术语“多肽连接子”是指这样一种氨基酸序列，该氨基酸序列能够连接例如两个蛋白质结构域、一个多肽标签与一个蛋白质结构域、一个蛋白质结构域与一个非多肽部分(如聚乙二醇)或两个序列标签。此类另外的结构域、标签、非多肽部分及连接子是相关领域的技术人员已知的。实例的清单提供于美国专利号7,417,130和美国专利号8,110,653中。此类连接子的实例是不同长度的甘氨酸-丝氨酸连接子和脯氨酸-苏氨酸连接子。在一个实施方案中，连接子的长度介于2与24个氨基酸之间；在另一个实施方案中，连接子的长度介于2与16个氨基酸之间。
术语“多肽”是指由通过多个(即，两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸形成的一条或多条链组成的分子。在一个实施方案中，多肽由超过八个氨基酸经肽键连接而组成。
术语“聚合物部分”是指蛋白质聚合物部分或非蛋白质聚合物部分。在一个实施方案中，“蛋白质聚合物部分”是不会形成稳定三级结构，而当在室温下以约0.1mM浓度在PBS中储存一个月时不会形成超过10％(或不超过5％、不超过2％、不超过1％及不超过任何可检测的量，如通过尺寸排阻层析法(SEC)测定)的低聚物或聚集物的多肽。当使用球状蛋白质作为SEC的分子量标准品时，此类蛋白质聚合物部分在SEC中执行的表观分子量高于其有效分子量。在一个实施方案中，由SEC测定的蛋白质聚合物部分的表观分子量是由其氨基酸序列计算的有效分子量的1.5倍、2倍或2.5倍。在一个实施方案中，由SEC测定的非蛋白质聚合物部分的表观分子量是由其分子组成计算的有效分子量的2倍、4倍或8倍。在一个实施方案中，如通过圆二色谱(CD)测量法所测定，蛋白质聚合物部分中超过50％、70％或甚至90％的氨基酸在室温下在PBS中浓度是约0.1mM时不会形成稳定的二级结构。在一个实施方案中，蛋白质聚合物显示出随机螺旋构型的典型近UV CD谱图。此类CD分析是本领域技术人员众所周知的。也可以使用包含超过50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸的蛋白质聚合物部分。
蛋白质聚合物部分的实例是(Amunix的注册商标；WO07/103515)多肽，或包含脯氨酸、丙氨酸及丝氨酸残基的多肽，如WO 08/155134中所描述。这些蛋白质聚合物部分可以通过使用标准DNA克隆技术，随后进行其标准表达和纯化来产生基因融合多肽，由此共价连接到例如本发明的结合结构域。包含了结合VEGF-Axxx和此类蛋白质聚合物部分的重复结构域的结合蛋白的实例以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4显示。SEQ ID NO:1中的1至159位氨基酸对应于重复结构域并且SEQ ID NO:1中的161至1025位氨基酸对应于蛋白质聚合物部分。SEQ ID NO:4中的1至126位氨基酸对应于重复结构域，并且SEQ ID NO:4中的131至640位氨基酸对应于蛋白质聚合物部分。
本发明聚合物部分的分子量可能变化极大(即，从约1kDa至约150kDa)。在一个实施方案中，聚合物部分的分子量是至少2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、50kDa、70kDa或100kDa。
在一个实施方案中，聚合物部分是通过多肽连接子连接到结合结构域。此类多肽连接子的实例是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸1至8。
非蛋白质聚合物部分的实例是羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。术语“聚乙二醇化”意思指，PEG部分共价连接到例如本发明的多肽。在重复结构域与C末端Cys残基之间含有多肽连接子的可用于结合非蛋白质聚合物部分的重复蛋白质的实例是SEQ ID NO:2、3、5、6及7。在一些实施方案中，如果使用PEG，那么其可以呈线性或分支布置。
在一个具体实施方案中，PEG部分或任何其它非蛋白质聚合物可以例如经由马来酰亚胺连接子与半胱氨酸硫醇偶联，其中半胱氨酸经由肽连接子与本文所描述的结合结构域(例如SEQ ID NO:3)的N末端或C末端偶联。
术语“结合蛋白”是指包含一个或多个结合结构域并且在一个实施方案中包含一个或多个聚合物部分(以下进一步解释)的蛋白质。在一个实施方案中，结合蛋白包含最多四个结合结构域。在一个实施方案中，结合蛋白包含最多两个结合结构域。在另一实施方案中，结合蛋白仅具有一个结合结构域。此外，任何此类结合蛋白都可以包含另外的蛋白质结构域，这些蛋白质结构域不是结合结构域、多聚化部分、多肽标签、多肽连接子和/或单一Cys残基。多聚化部分的实例是配对以提供功能性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区，以及亮氨酸拉链或包含游离硫醇的多肽，该游离硫醇在两个此类多肽之间形成分子间二硫键。可以使用单一Cys残基，例如通过使用本领域技术人员众所周知的马来酰亚胺化学将其它部分与多肽偶联。
在一个实施方案中，结合蛋白包含最多四个聚合物部分。在另一实施方案中，结合蛋白包含最多两个聚合物部分。在另一实施方案中，结合蛋白仅具有一个聚合物部分。
在一个实施方案中，当使用球状蛋白质作为分子量标准品，在室温下，利用SEC以在PBS中0.1mM浓度分析时，结合蛋白的表观分子量是约10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa、90kDa、95kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa或1,000kDa。在一个实施方案中，结合蛋白的表观分子量是34kDa。
本领域技术人员应理解本文使用的各种程度术语的含义。举例来说，如本文在提到量的上下文中所使用，术语“约”表示接近于并且包括所陈述的量的那些量，这些量也执行所希望的功能或达到所希望的结果，例如“约1mg”包括1mg以及合理地接近于1mg并且也执行所希望的功能或达到所希望的结果的那些量。
术语“结合结构域”意思指展现与蛋白质骨架相同的“折叠”(三维布置)并且具有预定特性(如下文所定义)的蛋白质结构域。此类结合结构域可以通过本领域中已知的合理或更通常地，组合蛋白质工程改造技术获得(Skerra,2000,在上述引文中；Binz等人,2005,在上述引文中)。举例来说，具有预定特性的结合结构域可以通过以下方法获得，该方法包括以下步骤：(a)提供展现与蛋白质骨架(如下文进一步定义)相同的折叠的一组不同蛋白质结构域；及(b)筛选该不同组和/或从该不同组中选择以获得至少一个具有预定特性的蛋白质结构域。该组不同的蛋白质结构域可以根据所使用的筛选和/或选择系统，通过若干方法提供，并且可以包括使用本领域技术人员众所周知的方法，如噬菌体展示或核糖体展示。
术语“蛋白质骨架”意思指具有高度可耐受氨基酸插入、取代或缺失的暴露表面区域的蛋白质。可以用于产生本发明的结合结构域的蛋白质骨架的实例是抗体或其片段，如单链Fv或Fab片段、来自金黄葡萄球菌的蛋白质A、来自大菜粉蝶(Pieris brassicae)的胆色素结合蛋白或其它脂钙蛋白、锚蛋白重复蛋白质或其它重复蛋白质，及人纤连蛋白。蛋白质骨架是本领域技术人员已知的(Binz等人,2005,在上述引文中；Binz等人,2004,在上述引文中)。
术语“预定特性”是指如结合到靶、阻断靶、活化靶介导的反应、酶促活性及相关其它特性等特性。取决于所希望的特性的类型，普通技术人员将能够鉴别出用于执行对具有所希望特性的结合结构域的筛选和/或选择的方式和必要步骤。优选地，预定特性是结合到靶。
在一个实施方案中，本发明的结合结构域不包含如在抗体中存在的免疫球蛋白折叠，和/或纤连蛋白III型结构域。免疫球蛋白折叠是一种常见的全-β蛋白质折叠，该折叠由以两个β-折叠布置的约7个反平行β链构成的2层夹层组成。免疫球蛋白折叠是本领域技术人员众所周知的。举例来说，这些包含免疫球蛋白折叠的结合结构域描述于WO 07/080392或WO 08/097497中。
在另一实施方案中，本发明的结合结构域不包含如在VEGFR-1或VEGFR-2中所发现的免疫球蛋白样结构域。此类结合结构域描述于WO 00/075319中。
在一个实施方案中，结合结构域包含70个氨基酸至300个氨基酸；在另一实施方案中，结合结构域包含100个氨基酸至200个氨基酸。
在一个实施方案中，结合结构域不含游离Cys残基。游离Cys残基不涉及二硫键的形成。在另一实施方案中，结合结构域不含任何Cys残基。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白可以在真核或原核细胞(如细菌细胞)中表达，或通过使用无细胞体外表达系统表达。
术语“结构单元”是指由沿多肽链彼此邻近的两个或更多个二级结构区段之间的三维相互作用形成的多肽的局部有序部分。此类结构单元展现结构基元。术语“结构基元”是指至少一个结构单元中存在的二级结构元件的三维布置。结构基元是本领域技术人员众所周知的。仅仅结构单元不能够获得确定的三维布置；不过，其连续的布置，例如重复结构域中的重复模块，使相邻单元相互稳定，从而产生超螺旋结构。
术语“重复单元”是指构成一种或多种天然存在的重复蛋白质的重复序列基元的氨基酸序列，其中“重复单元”以多个拷贝存在，并且展现决定该蛋白质的折叠的所有基元共有的确定的折叠拓扑结构。此类重复单元的实例是犰狳重复单元、富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、三十四肽重复单元、HEAT重复单元及富含亮氨酸的变体重复单元。含有两个或更多个此类重复单元的天然存在的蛋白质称为“天然存在的重复蛋白质”。重复蛋白质的个别重复单元的氨基酸序列当彼此比较时可能具有相当多的突变、取代、添加和/或缺失，同时仍基本上保留重复单元的一般模式或基元。
术语“重复序列基元”是指由一个或多个重复单元推导出的氨基酸序列。在一个实施方案中，重复单元来自对相同靶具有结合特异性的重复结构域。
术语“折叠拓扑结构”是指重复单元的三级结构。折叠拓扑结构将由形成α螺旋或β-折叠的至少一部分的氨基酸链，或形成线性多肽或环的氨基酸链，或者α-螺旋、β-折叠和/或线性多肽/环的任何组合确定。
术语“连续”是指重复单元或重复模块串联布置的一种布置。在设计的重复蛋白质中，存在至少2个重复单元，但通常存在约2个重复单元至6个重复单元，而且还可能存在6个或更多个重复单元，或者20个或更多个重复单元。在大多数情况下，重复单元将展现高度的序列同一性(在相应位置具有相同氨基酸残基)或序列相似性(氨基酸残基不同，但具有相似的物理化学特性)，并且一些氨基酸残基可能是在天然存在的蛋白质中所发现的不同重复单元中高度保守的关键残基。然而，天然存在的蛋白质中所发现的不同重复单元之间由氨基酸插入和/或缺失，和/或取代引起的高度序列变化性将是可能的，只要维持共同的折叠拓扑结构即可。
通过物理化学方式，如X射线结晶法、NMR或CD谱法直接确定重复蛋白质的折叠拓扑结构的方法是本领域熟练从业人员众所周知的。用于鉴别和确定重复单元或重复序列基元或用于鉴别包含此类重复单元或基元的相关蛋白质家族的方法，如同源搜索(BLAST等)，是生物信息学领域中充分确定的，并且是本领域从业人员众所周知的。改进初始重复序列基元的步骤可以包括迭代过程。
术语“重复模块”是指设计的重复结构域的重复氨基酸序列，这些氨基酸序列最初源自于天然存在的重复蛋白质的重复单元。重复结构域中包含的每一重复模块是源自于天然存在的重复蛋白质家族或亚家族(例如犰狳重复蛋白质或锚蛋白重复蛋白质家族)的一个或多个重复单元。
“重复模块”可以包含氨基酸残基存在于相应重复模块的所有拷贝中的位置(“固定位置”)及具有不同或“随机”氨基酸残基的位置(“随机位置”)。
术语“加帽模块”是指与重复结构域的N末端或C末端重复模块融合的多肽，其中该加帽模块与该重复模块形成紧密的三级相互作用，由此提供了在不与连续重复模块接触的一侧处保护重复模块的疏水性核心免受溶剂影响的帽。N末端和/或C末端加帽模块可以是，或者可以源自于加帽单元或在天然存在的重复蛋白质中发现的邻近重复单元的其它结构域。术语“加帽单元”是指天然存在的折叠的多肽，其中该多肽确定了通过N末端或C末端与重复单元融合的特定结构单元，其中该多肽与重复单元形成紧密的三级相互作用，由此提供了在一侧保护重复单元的疏水性核心免受溶剂影响的帽。此类加帽单元可能与重复序列基元具有序列相似性。加帽模块和加帽重复序列描述于美国专利号7,417,130和美国专利号8,110,653中。举例来说，SEQ ID NO:2的N末端加帽模块是由1至32位的氨基酸编码。此类N末端加帽模块在5位具有甘氨酸或天冬氨酸残基也是优选的。
术语“靶”是指个别分子，如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物，或任何其它天然存在的分子，包括此类个别分子的任何部分，或此类分子中两个或更多个的复合物。靶可以是全细胞或组织样品，或其可以是任何非天然的分子或部分。优选地，靶是天然存在或非天然的多肽或含有化学修饰，例如通过天然或非天然磷酸化、乙酰化或甲基化修饰的多肽。在一些实施方案中，靶是VEGF-Axxx或VEGFR-2。
术语“共同序列”是指这样一种氨基酸序列，其中该共同序列是通过多个重复单元的结构和/或序列比对获得。使用两个或更多个结构和/或序列比对的重复单元，并且在该比对中允许空位，有可能确定在每一位置处的最常见的氨基酸残基。共同序列是包含在每一位置处最常出现的氨基酸的序列。如果在单一位置处呈现两个或更多个氨基酸超过平均值，那么共同序列可能包括一小组所述氨基酸。两个或更多个重复单元可能来自单一重复蛋白质中所包含的重复单元，或来自两种或更多种不同的重复蛋白质。
共同序列及其测定方法是本领域技术人员众所周知的。
“共同氨基酸残基”是在共同序列中的某一位置处发现的氨基酸。如果在两个或更多个重复单元中以类似概率发现两个或更多个，例如三个、四个或五个氨基酸残基，那么共同氨基酸可能是最常发现的氨基酸之一，或者两个或更多个氨基酸残基的组合。
在一个实施方案中，还可以使用非天然存在的结合蛋白或结合结构域。
术语“非天然存在”意思指合成的或非自然界来源的，例如人造的。术语“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合结构域”意思指，该结合蛋白或结合结构域是合成的(即，由氨基酸通过化学合成而产生)或重组的并且不是自然界来源的。“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合结构域”分别是通过表达相应地设计的核酸而获得的人造蛋白质或结构域。优选地，该表达是在真核细胞或细菌细胞中进行，或是通过使用无细胞体外表达系统进行。此外，该术语意思指，所述结合蛋白或结合结构域的序列不是作为非人工序列条目存在于序列数据库，例如GenBank、EMBL-Bank或Swiss-Prot中。这些数据库和其它类似的序列数据库是本领域技术人员众所周知的。
结合结构域可以通过结合到VEGF-Axxx或通过结合到VEGFR-2来抑制VEGF-Axxx与VEGFR-2的结合，其方式是使VEGF-Axxx与VEGFR-2之间的表观解离常数(Kd)增加超过102倍。在其它实施方案中，解离常数增加超过103倍、超过104倍、超过105倍或超过106倍。在一个实施方案中，结合结构域与VEGF-Axxx或VEGFR-2相互作用的Kd低于107M、低于108M，或低于109M、低于1010M，或低于1011M。测定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，如基于表面等离子体共振(SPR)的技术，是本领域技术人员众所周知的。
结合结构域结合VEGF-Axxx。在一个实施方案中，结合结构域结合人VEGF-A165。在其它实施方案中，其可以结合其它VEGF-A同工型。
在一个实施方案中，结合蛋白和/或结合结构域在37℃下于含有100mM二硫苏糖醇(DTT)的PBS中孵育1或10小时之后不会丧失其天然三维结构。如此处所使用，“PBS”意思指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH值是7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
在一个实施方案中，结合蛋白包含抑制VEGF-Axxx与VEGFR-2的结合并且具有中点变性温度和不聚集特性(如以上所定义)的结合结构域，其中该结合蛋白抑制HUVEC球体的血管再生，并且IC50值低于100nM。
术语“HUVEC”是指人脐静脉内皮细胞，这些细胞可以从正常人脐静脉分离并且对VEGF-A刺激起反应。
测量HUVEC球体血管再生的测定是本领域技术人员众所周知的。
IC50值是在体外抑制实验确定的参数(如HUVEC球体的血管再生)达到50％所需的物质(如结合蛋白或结合结构域)的浓度。IC50值易于由本领域技术人员测定(Korff T.和Augustin H.G.,J.Cell Biol.143(5),1341-52,1998)。
在一个实施方案中，结合蛋白和/或结合结构域抑制HUVEC球体的血管再生，其中IC50值低于10nM、低于1nM、低于0.1nM或低于0.05nM。
在另一实施方案中，可以使用抑制HUVEC球体的血管再生的单体结合蛋白和/或结合结构域，其中IC50值低于兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼的相应IC50值。
在一个实施方案中，结合结构域与VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF或PDGF相互作用的Kd大于1nM、大于10nM、大于102nM、大于103nM或大于104nM。
在一个实施方案中，VEGF-Axxx是狗VEGF-A 164或猿VEGF-A165或人VEGF-A165，并且VEGF-Axxxb是狗VEGF-A 164b或猿VEGF-A 165b或人VEGF-A 165b。
另一实施方案是包含结合结构域的重组结合蛋白，其中该结合结构域抑制VEGF-Axxx与VEGFR-2的结合并且其中该结合结构域是重复结构域或设计的重复结构域。此类重复结构域可以包含参与结合到VEGF-Axxx的一个、两个、三个或更多个内部重复模块。在一个实施方案中，此类重复结构域包含N末端加帽模块、两个至四个内部重复模块及一个C末端加帽模块。在一个实施方案中，结合结构域是锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，结合蛋白包含如本文所描述的结合结构域，其与聚乙二醇(PEG)部分缀合。在一个实施方案中，PEG部分与结合结构域的单一Cys残基偶联。Cys残基可以通过遗传方式引入结合结构域的C末端。然后，可以通过化学方式，例如通过使用本领域技术人员众所周知的马来酰亚胺化学来偶联PEG部分。
另一实施方案是包含至少一个对VEGF-Axxx具有结合特异性的重复结构域的如以上所定义的重组结合蛋白，其中该重复结构域与选自SEQ ID NO:1至7的重复结构域的组的重复结构域竞争结合到VEGF-Axxx。在一个实施方案中，该重复结构域与SEQ ID NO:1或3的重复结构域竞争结合到VEGF-Axxx。在另一实施方案中，该重复结构域与SEQ ID NO:3的重复结构域竞争结合到VEGF-Axxx。
术语“竞争结合”意思指两种不同的本发明结合结构域无法同时结合到同一靶，但两者能够个别地结合同一靶。因此，这两个结合结构域竞争结合到靶。确定两个结合结构域是否竞争结合到靶的方法，如竞争ELISA或竞争SPR测量法(例如，通过使用来自BioRad的Proteon仪器)，是本领域从业人员众所周知的。
与所选重复蛋白质竞争结合到VEGF-Axxx的重组结合蛋白可以通过本领域技术人员众所周知的方法，如竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)鉴别。
另一实施方案是包含对VEGF-Axxx具有结合特异性的重复结构域的重组结合蛋白，该重复结构域选自由SEQ ID NO:1至7的重复结构域组成的组。在一个实施方案中，该重复结构域选自SEQ ID NO:2或3的重复结构域。在另一实施方案中，该重复结构域是SEQ IDNO:3的重复结构域。
在一个实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVNA(SEQ ID NO:10)
其中1、2、3、4、5、6及7彼此独立地表示选自组A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23GWTPLHLAA45GHLEIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:11)
其中1表示选自由F、T、N、R、V、A、I、K、Q、S及Y组成的组的氨基酸残基；在一个实施方案中，1是F、T、N、R或V；而在另一实施方案中，1是F或T；2表示选自由W、Y、H及F组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，2是W、Y或H；3表示选自由M、I、F及V组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，3是M或I；4表示选自由H、A、K、G、L、M、N、T、V、W及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，4是H、A或K；5表示选自由E、Y、F、V、H、I、L、N及R组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，5是E、Y、F、V或H；在另一实施方案中，5是E、Y、F或V；并且6表示选自由A、N、Y、H及R组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVN8(SEQ ID NO:12)
其中1表示选自由T、E、A、D、F、K、N、Q、R、S、W及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，1是T或E；2表示选自由V、F、Y、A、H、I、K、R、T及W组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，2是V、F或Y；3表示选自由S、A、N、F及M组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，3是S、A或N；在另一实施方案中，3是S或A；4表示选自由Y、F、S及W组成的组的氨基酸残基；5表示选自由A、S、L及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，5是A或S；6表示选自由D、N、M、A、I、K及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，6是D、N或M；在另一实施方案中，6是D或N；7表示选自由A、Y、H、N及D组成的组的氨基酸残基；并且8表示氨基酸残基T或A。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23GWTPLHL4ADLG5LEIVEVLLK6GADVN7(SEQ ID NO:13)
其中1表示选自由K、T及Y组成的组的氨基酸残基；2表示氨基酸残基N或M；3表示氨基酸残基T或F；4表示氨基酸残基S或A；5表示氨基酸残基H或R；6表示选自由A、Y、H及N组成的组的氨基酸残基；并且7表示氨基酸残基A或T。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPLHLAA56GH7EIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:14)
其中1表示选自由A、N、R、V、Y、E、H、I、K、L、Q、S及T组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，1是A、N、R、V或Y；在另一实施方案中，1是A或R；2表示选自由S、A、N、R、D、F、L、P、T及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，2是S、A、N或R；3表示选自由T、V、S、A、L及F组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，3是T、V、S、A或L；在另一实施方案中，3是T、V或S；4表示选自由W、F及H组成的组的氨基酸残基；5表示选自由P、I、A、L、S、T、V及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，5是P或I；6表示选自由W、F、I、L、T及V组成的组的氨基酸残基；7表示氨基酸残基L或P；并且8表示选自由A、H、N及Y组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVNA(SEQ ID NO:15)
其中1表示选自由H、Q、A、K、R、D、I、L、M、N、V及Y组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，1是H、Q、A、K或R；在另一实施方案中，1是A或R；2表示选自由Y、F及H组成的组的氨基酸残基；3表示选自由Q、F及T组成的组的氨基酸残基；4表示选自由W、M、G、H、N及T组成的组的氨基酸残基；优选W和M；5表示选自由T、A、M、L及V组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，5是T、A或M；6表示选自由I、L、V、D及T组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，6是I、L或V；并且7表示选自由A、H、N及Y组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23GWTPLHLAA45GHLEIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:16)
其中1表示选自由K、M、N、R及V组成的组的氨基酸残基；2表示选自由Y、H、M及V组成的组的氨基酸残基；3表示选自由F、L、M及V组成的组的氨基酸残基；4表示选自由R、H、V、A、K及N组成的组的氨基酸残基；优选R、H、V及A；5表示选自由F、D、H、T、Y、M及K组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，5是F、D、H、T或Y；并且6表示选自由A、H、N及Y组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVN8(SEQ ID NO:17)
其中1表示选自由T、A、H、I、N及S组成的组的氨基酸残基；2表示选自由F、I、Q、R、V及N组成的组的氨基酸残基；3表示选自由A、G、N、Q及V组成的组的氨基酸残基；4表示氨基酸残基W或Y；5表示选自由A、S、T及M组成的组的氨基酸残基；6表示选自由N、V、S、F、M及W组成的组的氨基酸残基；7表示选自由A、H、N及Y组成的组的氨基酸残基；并且8表示氨基酸残基T或A。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPLHL5A67GHLEIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:18)
其中1表示选自由K、A、V及N组成的组的氨基酸残基；2表示选自由N、I及Y组成的组的氨基酸残基；3表示选自由T、F、Y及W组成的组的氨基酸残基；4表示选自由W、D及Y组成的组的氨基酸残基；5表示氨基酸残基S或A；6表示选自由D、I及M组成的组的氨基酸残基；7表示选自由L、T及Y组成的组的氨基酸残基；并且8表示选自由A、H、Y及N组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1DFK2DTPLHLAA34GH5EIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:19)
其中1表示选自由L、S及T组成的组的氨基酸残基；2表示选自由G、S及C组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，2是G或S；3表示氨基酸残基S或A；4表示选自由Q、S、M及N组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，4是Q或S；5表示选自由L、M及Q组成的组的氨基酸残基；并且6表示选自由A、H、N、Y及D组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D2L34TPLHLA567GHLEIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:20)
其中1表示选自由Y、H、F、I、L及W组成的组的氨基酸残基；优选Y和H；2表示选自由M、D、I、L、V组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，2是M或D；3表示选自由G、S及V组成的组的氨基酸残基；4表示氨基酸残基W或F；5表示选自由A、G及T组成的组的氨基酸残基；6表示氨基酸残基D或W；7表示氨基酸残基L或F；并且8表示选自由A、H、N及Y组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23G4TPL5LAA67GHLEIVEVLLK8GADVNA(SEQ ID NO:21)
其中1表示选自由K、S、I、N、T及V组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，1是K或S；2表示选自由K、N、W、A、H、M、Q及S组成的组的氨基酸残基；优选K和N；3表示选自由F、Q、L、H及V组成的组的氨基酸残基；优选F、Q及L；4表示氨基酸残基F或T；5表示氨基酸残基Q或H；6表示氨基酸残基Y或S；7表示选自由N、H、Y及M组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，7是N或H；并且8表示选自由A、H、N及Y组成的组的氨基酸残基。
在另一实施方案中，锚蛋白重复结构域包含具有以下锚蛋白重复序列基元的重复模块
1D23GWT4LHLAADLG5LEIVEVLLK6GADVNA(SEQ ID NO:22)
其中1表示选自由F、Y、H及W组成的组的氨基酸残基；优选F、Y及H；2表示选自由I、M、D及V组成的组的氨基酸残基；在另一实施方案中，2是I、M或D；3表示氨基酸残基F或L；4表示氨基酸残基L或P；5表示选自由H、L及Y组成的组的氨基酸残基；并且6表示选自由A、H、N、C及Y组成的组的氨基酸残基。
可以将一个或多个聚乙二醇部分连接于结合蛋白中的不同位置，并且此连接可以通过与胺、硫醇或其它适合反应性基团反应来实现。聚乙二醇部分的连接(聚乙二醇化)可以是定点的，其中将适合的反应性基团引入蛋白质中以产生优先发生聚乙二醇化的位点，或适合反应性基团原本存在于结合蛋白中。硫醇基可以存在于半胱氨酸残基中；而胺基可以例如是在多肽N末端处所见的伯胺，或存在于如赖氨酸或精氨酸等氨基酸的侧链中的胺基。在一个实施方案中，结合蛋白经过修饰而在希望的位置处具有半胱氨酸残基，由此允许例如通过与带有马来酰亚胺官能团的聚乙二醇衍生物反应而在半胱氨酸上进行定点聚乙二醇化。聚乙二醇部分的分子量可能变化极大(即，从约1kDa至约100kDa)并且可以是分支或线性的。在一个实施方案中，聚乙二醇的分子量是约1至约50kDa；在另一实施方案中，聚乙二醇的分子量是约10kDa至约40kDa、约15kDa至约30kDa，或是约20kDa。此类结合蛋白及其合成方法的实例提供于美国专利号8,710,187(另以WO 2011/135067公布)中，其完整内容通过引用并入本文中。
在一个实施方案中，可以使用包含本文所描述的结合结构域的重组蛋白，其中该重组蛋白在其C末端半胱氨酸硫醇处与马来酰亚胺偶联的PEG，如与α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯(NOF，Sunbright ME-200MA(20kD)或Sunbright ME-400MA(40kD))缀合。在一个实施方案中，可以使用包含本文所描述的结合结构域的重组结合蛋白，其中该结合结构域在其C末端经由肽键与SEQ ID NO:8缀合，而该SEQID NO:8在C末端半胱氨酸硫醇处与马来酰亚胺偶联的PEG，如与α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯(NOF，Sunbright ME-200MA(20kD)或SunbrightME-400MA(40kD))缀合。
在一些实施方案中，C末端半胱氨酸硫醇可以与吡啶基二硫化物偶联的PEG、乙烯基砜偶联的PEG或经由其它硫醇试剂偶联的PEG缀合。
在一些实施方案中，PEG和适当连接化合物的分子量是至少约2kD、5kD、10kD、20kD、30kD、40kD、50kD、70kD或100kD。在一个实施方案中，马来酰亚胺偶联的PEG的分子量是至少约2kD、5kD、10kD、20kD、30kD、40kD、50kD、70kD或100kD。
在某些实施方案中，α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯的分子量是至少约20kD或至少约40kD。
在一些实施方案中，重组结合蛋白可以在N末端氨基处与适合的含PEG连接化合物偶联。在此类实施方案中，PEG-乙烯试剂、PEG NHS-酯、PEG NHS-碳酸酯、PEG-对硝基苯基碳酸酯、PEG-三嗪试剂等可以在本文所描述的适合结合蛋白的N末端处缀合。
在另一实施方案中，本发明涉及编码特定重组结合蛋白的核酸分子。此外，还涉及包含该核酸分子的载体。
另外，还涉及一种药物组合物，该药物组合物包含一种或多种以上提及的结合蛋白，特别是包含重复结构域的重组结合蛋白，或编码特定重组结合蛋白的核酸分子，及任选的药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
配制物
药学上可接受的载剂和/或稀释剂是本领域技术人员所知的并且将于下文更详细地解释。又另外，涉及一种诊断组合物，该组合物包含一种或多种以上提及的重组结合蛋白，特别是包含重复结构域的结合蛋白。
药物组合物包含以上描述的结合蛋白及药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 1,第六版,Osol,A.编辑[1980])。技术人员已知的适合载剂、赋形剂或稳定剂有生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、汉氏溶液(Hank's solution)、不挥发油、油酸乙酯、含5％右旋糖的生理盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲剂及防腐剂。其它适合的载剂包括本身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载剂，所述组合物如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚氨基酸及氨基酸共聚物。药物组合物还可以是包含另外的活性剂，如抗癌剂或抗血管生成剂(例如人VEGF-Axxxb；优选人VEGF-A165b)的组合配制物。
在一个实施方案中，配制物包含以上描述的结合蛋白质及清洁剂，如非离子型清洁剂，包括但不限于，0.04％的聚山梨醇酯20；缓冲剂，如组氨酸、磷酸盐或乳酸；及糖，如蔗糖或海藻糖。配制物还可以包含PBS。
欲用于体内施用的配制物必须是防腐或无菌的。这易于通过滤过无菌过滤膜实现。
治疗方法
在一个实施方案中，本发明的方法包括一种抑制VEGF-Axxx与VEGFR-2之间的结合的方法，该方法是通过向需要此抑制的患者施用约0.25mg至约4mg剂量的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白实现，其中该锚蛋白重复结构域选自由SEQ ID NO:1至7的锚蛋白重复结构域组成的组。
在一些实施方案中，锚蛋白重复结构域选自由SEQ ID NO:1至5的锚蛋白重复结构域组成的组。在一些实施方案中，锚蛋白重复结构域选自由SEQ ID NO:2或3的锚蛋白重复结构域组成的组。在一个实施方案中，重组结合结构域结合VEGF-Axxx，并且Kd低于109M。
所述方法可以用于治疗某些眼部病症，包括与缺血性视网膜病变、新生血管性视网膜病变或缺血性视网膜病变与新生血管性视网膜病变有关的那些。可用本文公开的方法治疗的一些与缺血性视网膜病变有关的病症可以包括糖尿病性黄斑水肿、中央静脉阻塞及分支静脉阻塞。可以用本文公开的方法治疗的一些与新生血管性视网膜病变有关的病症可以包括增生性糖尿病性视网膜病变、渗出性年龄相关性黄斑变性、病理性近视、脉络膜新生血管、组织胞浆菌病继发新生血管、息肉状脉络膜新生血管及视网膜血管瘤样增生。所述方法可以用于治疗年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜分支静脉阻塞及视网膜中央静脉阻塞。所述方法还可以用于治疗患有以上所列疾病并且用现有抗VEGF疗法难治疗的患者。
如此处所使用，“治疗”意思指通过医学方法处理。其包括例如施用本发明的重组结合蛋白以防止AMD发作以及减轻其严重程度。
黄斑变性是由位于黄斑下方的脉络膜血管的新生血管生长引起。晚期黄斑变性存在两种类型：渗出性和萎缩性。尽管渗出性黄斑变性仅占全部黄斑变性的15％，但几乎所有的渗出性黄斑变性都会导致失明。一旦一只眼受到渗出性黄斑变性影响，那么该病症几乎总是会影响另一只眼。渗出性黄斑变性和萎缩性黄斑变性通常称为年龄相关性黄斑变性或年龄相关性“湿性”黄斑变性，因为这些疾病主要见于老年人。
如此处所使用，“抗VEGF疗法难治疗”是指用已知的抗VEGF疗法，如兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼疗法无法达到令人满意的生理反应。这些患者在至少3次玻璃体内注射兰尼单抗、贝伐单抗或阿柏西普(或至少3次玻璃体内注射前述疗法中任一种的组合)之后，异常中心视网膜厚度(黄斑中心1mm2区域)可能例如具有不到20％减小。在一个实施方案中，尽管利用了兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼疗法，但抗VEGF疗法难治疗的患者仍经历视力的持续恶化。在另一实施方案中，尽管利用了兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼疗法，但抗VEGF疗法难治疗的患者仍经历视网膜的增厚。在一些实施方案中，尽管利用了兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼疗法，但抗VEGF疗法难治疗的患者展现的解剖学改善可忽略。
在一些实施方案中，经玻璃体内施用结合蛋白，每次注射的剂量介于约0.1mg与约10mg结合蛋白之间。在一些实施方案中，施用的结合蛋白的剂量介于每次注射约0.25mg与约5mg结合蛋白之间，介于每次注射约0.25mg与约4mg结合蛋白之间，介于每次注射约0.25mg与约3mg结合蛋白之间，介于每次注射约0.25mg与约2mg结合蛋白之间，并且介于每次注射约0.25mg与约1mg结合蛋白之间；在其它实施方案中，施用的结合蛋白的剂量介于每次注射约0.5mg与约5mg结合蛋白之间，介于每次注射约0.5mg与约4mg结合蛋白之间，介于每次注射约0.5mg与约3mg结合蛋白之间，介于每次注射约0.5mg与约2mg结合蛋白之间，并且介于每次注射约0.5mg与约1mg结合蛋白之间；在其它实施方案中，施用的结合蛋白的剂量介于每次注射约1mg与约5mg结合蛋白之间，介于每次注射约1mg与约4mg结合蛋白之间，介于每次注射约1mg与约3mg结合蛋白之间，并且介于每次注射约1mg与约2mg结合蛋白之间。
在一个实施方案中，施用的结合蛋白的剂量是每次注射约0.1mg、约0.2mg、约0.25mg、约0.3mg、约0.35mg、约0.4mg、约0.45mg、约0.5mg、约0.55mg、约0.6mg、约0.65mg、约0.7mg、约0.75mg、约0.8mg、约0.9mg、约0.95mg、约1mg、约1.1mg、约1.2mg、约1.3mg、约1.4mg、约1.5mg、约1.6mg、约1.7mg、约1.8mg、约1.9mg、约2mg、约2.0mg、2.1mg、约2.2mg、约2.3mg、约2.4mg、约2.5mg、约2.6mg、约2.7mg、约2.8mg、约2.9mg、约3mg、约3.0mg、3.1mg、约3.2mg、约3.3mg、约3.4mg、约3.5mg、约3.6mg、约3.7mg、约3.8mg、约3.9mg、约4mg、约4.0mg、4.1mg、约4.2mg、约4.3mg、约4.4mg、约4.5mg、约4.6mg、约4.7mg、约4.8mg、约4.9mg、约5mg及约5.0mg结合蛋白。
在一个实施方案中，施用的结合蛋白的初始剂量是2至5剂，并且每次剂量之间间隔25至35天；也就是说，向患者的眼睛施用单次剂量的结合蛋白，然后在25至35天之后向同一只眼施用另一次剂量，并且必要时重复这些剂量，直到该眼接受总计2至5次初始剂量。
在一个实施方案中，首先施用2次剂量的结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。在这一实施方案中，向眼施用单次剂量的结合蛋白(例如，单次注射0.5mg至约4mg结合蛋白)，然后在25至35天后向该眼施用相同剂量，每只所治疗的眼总计2次初始剂量。
在一个实施方案中，首先施用3次剂量的结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。在这一实施方案中，向眼施用单次剂量的结合蛋白(例如，单次注射0.5mg至约4mg结合蛋白)，在25至35天后向该眼施用相同剂量，然后再在25至35天后施用相同剂量，每只所治疗的眼总计3次初始剂量。
在一个实施方案中，首先施用4次剂量的结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。在这一实施方案中，向眼施用单次剂量的结合蛋白(例如，单次注射0.5mg至约4mg结合蛋白)，在25至35天后向该眼施用相同剂量，再在25至35天后施用相同剂量，然后又再在25至35天后施用相同剂量，每只所治疗的眼总计4次初始剂量。
在一个实施方案中，首先施用5次剂量的结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。在这一实施方案中，向眼施用单次剂量的结合蛋白(例如，单次注射0.5mg至约4mg结合蛋白)，在25至35天后向该眼施用相同剂量，再在25至35天后施用相同剂量，并且又再在25至35天后施用相同剂量，然后再次在25至35天后施用相同剂量，每只所治疗的眼总计5次初始剂量。
在另一实施方案中，首先向眼施用2至5次初始剂量的结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，然后继之以至少一种另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至130天。
在一个实施方案中，每次另外的剂量之间间隔50至100天、50至95天、50至90天、50至85天、50至80天、50至75天、50至70天、50至65天及50至60天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔55至100天、55至95天、55至90天、55至85天、55至80天、55至75天、55至70天、55至65天及55至60天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔60至100天、60至95天、60至90天、60至85天、60至80天、60至75天、60至70天及60至65天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔65至100天、65至95天、65至90天、65至85天、65至80天、65至75天及65至70天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔70至100天、70至95天、70至90天、70至85天、70至80天及70至75天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔75至100天、75至95天、75至90天、75至85天及75至80天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔80至100天、80至95天、80至90天及80至85天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔85至100天、85至95天及85至90天；在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔90至100天及90至95天。在另一实施方案中，每次另外的剂量之间间隔30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130天。
举例来说，在一个实施方案中，向眼施用单次剂量的结合蛋白(如单次注射0.5mg至约4mg结合蛋白)，在25至35天后向该眼施用相同剂量，然后再在25至35天后施用相同剂量，每只所治疗的眼总计3次初始剂量，之后每55至65天向该眼施用相同剂量，持续该眼需要治疗的时间。
根据一些实施方案，根据本发明的方法接受注射重组结合蛋白的患者的异常中心视网膜厚度可以展现自基线的20％或更高百分比减小、25％或更高百分比减小、30％或更高百分比减小、35％或更高百分比减小、40％或更高百分比减小、45％或更高百分比减小、50％或更高百分比减小、55％或更高百分比减小、60％或更高百分比减小、65％或更高百分比减小、70％或更高百分比减小、75％或更高百分比减小、80％或更高百分比减小、85％或更高百分比减小、90％或更高百分比减小、95％或更高百分比减小、99％减小或100％减小。
根据一些实施方案，抗VEGF治疗，如兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼难治疗的患者在接受一次或多次注射本文公开的结合蛋白之后，可以展现异常中心视网膜厚度自基线的约20％或更高百分比减小。根据一些实施方案，患者在接受一次或多次注射本文公开的结合蛋白之后，可以展现异常中心视网膜厚度自基线的约30％或更高百分比减小。根据其它实施方案，患者在接受一次或多次注射本文公开的结合蛋白之后，可以展现异常中心视网膜厚度自基线的低于40％或更高百分比减小。
举例来说，用于治疗眼部病症，如年龄相关性黄斑变性的方法可以包括以本文所描述的频率玻璃体内注射在0.5mg至5mg范围内的量的重组结合蛋白。该重组结合蛋白包含SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域。
在另一实例中，用于治疗抗VEGF治疗如兰尼单抗、贝伐单抗或兰尼单抗和贝伐单抗等难治疗的患者的年龄相关性黄斑变性的方法可以包括玻璃体内注射在0.5mg至5mg范围内的量的重组结合蛋白。该重组结合蛋白包含SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域。在此类实例中，接受一次或多次此类注射的患者在接受一次或多次注射之后，会经历异常中心视网膜厚度超过20％的减小。在一些实施方案中，接受一次或多次此类注射的患者在接受一次、两次、三次、四次、五次或更多次注射之后不经历视网膜变厚。
在另一实例中，用于治疗抗VEGF治疗如兰尼单抗、贝伐单抗或兰尼单抗和贝伐单抗等难治疗的患者的糖尿病性黄斑水肿的方法可以包括玻璃体内注射在0.5mg至5mg范围内的量的重组结合蛋白。该重组结合蛋白包含SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域。在此类实例中，接受一次或多次此类注射的患者在接受一次、两次、三次、四次、五次或更多次注射之后，会经历异常中心视网膜厚度超过20％的减小。在一些实施方案中，接受一次或多次此类注射的患者在接受一次、两次、三次、四次、五次或更多次注射之后不经历视网膜变厚。
实施例
以下实施例进一步说明本发明。本发明人测试了abicipar pegol，这是与聚乙二醇缀合的包含SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域的本发明结合蛋白(该化合物的一般名称是“abicipar pegol”，在本文中有时简称为“abicipar”)。
概况
本发明人在开放标记的剂量递增安全性评估中预先测试了通过向抗VEGF疗法难治疗的晚期渗出性AMD患者玻璃体内注射而施用abicipar pegol。其遵循的研究是在未经过治疗的渗出性AMD患者中对abicipar和兰尼单抗进行随机化、双盲评价(“第2阶段研究”)。目的在于评估利用4.2mg和3mg abicipar对于视网膜水肿和最佳矫正视力(BCVA)的安全性和治疗作用持续时间以及表征abicipar的全身药物代谢动力学特征。
在本实施例中，本发明人执行了abicipar与兰尼单抗的随机化、双盲比较(“第3阶段研究”)。患者被随机分入三组之一，即abicipar1mg、abicipar 2mg或兰尼单抗0.5mg，并跟踪20周。所有患者在第0周、第4周及第8周时接受每月3次剂量。兰尼单抗治疗的患者在第12周和第16周时接受另外的兰尼单抗剂量，而abicipar患者接受空白(sham)注射。第3阶段的目标是评估用较少剂量的abicipar(3次剂量)相比兰尼单抗(5次剂量)能对BCVA和视网膜水肿实现类似作用还是更佳作用；比较是在最后一剂abicipar后8周和12周与在第四剂和第五剂兰尼单抗后4周之间进行。
第3阶段中的主要功效变量是第16周(第三次注射之后8周)时研究眼的BCVA自基线的平均变化。相较于兰尼单抗治疗的患者增加5.3个字母(第四次注射后4周)，用2mg和1mg abicipar治疗的患者分别增加8.2和6.3个字母。关键的次要功效变量是视网膜内液体的消除。如通过光学相干断层扫描术所评估，玻璃体内液体是以视网膜内水肿、视网膜内囊肿及视网膜下液体表征。在第12周(第三剂治疗后4周)时，在abicipar 2mg组、abicipar1mg组及兰尼单抗组中无视网膜内液体的患者比例是78％、68％及50％。在第16周(第三剂abicipar后8周和第四剂兰尼单抗后4周)时，在abicipar 2mg组、abicipar 1mg组及兰尼单抗组中无视网膜内液体的患者比例分别是52％、44％及19％。视网膜内液体的存在引起视网膜中神经网络的破坏，从而导致视力损失。消除视网膜内液体可保护视力。
患者选择
将约64位患者以3:3:2的分配比随机分入以下各组之一：
·在基线、第4周及第8周时施用2mg abicipar(3次注射)
·在基线、第4周及第8周时施用1mg abicipar(3次注射)
·在基线、第4周、第8周、第12周及第16周时施用0.5mg兰尼单抗(5次注射)
选出六十四位患者。这些患者的平均年龄是76.6岁，主要是白种人并且大多数是女性。在基线时，平均BCVA在58.5个字母至60.4个字母范围内(相当于约20/63Snellen)。平均基线中心视网膜厚度(“CRT”)范围介于463与526μm之间。对于人口统计或基线特征中的任一种来说，治疗组之间无显著差异(表1)，不过主要患有经典病变的患者的比例在abicipar 2.0mg组中明显高于其它治疗组。
BCVA是通过使用Arch Ophthalmol.,119(10):1417-36(2001)中所描述的修改的ETDRS方法定量。BCVA测试是在需要与眼接触的任何检查之前进行，并且执行以下屈光度检测。
屈光度检测是在4米处执行，除非降低视力(在此情形中，该检测是在1米处执行)。首先测定右眼的屈光度，随后是左眼。将试镜架放在患者脸上并加以调整，以使得镜框与眼眶的前平面平行并集中在瞳孔的前面。将镜框调整成与角膜呈适当距离。不测定屈光度的眼通过用折叠织物掩盖并在该眼上施加黑色遮光板来进行阻挡。将由开始的近似屈光度检测获得的矫正镜片插入试镜架中。镜片通过插入最接近眼睛的隔板中进行定位；将柱面矫正镜片放到球面矫正镜前面的隔室中并调整中轴。鼓励患者使用偏心注视，必要时确保另一只眼完全被遮挡住。然后测定球镜度、柱镜轴及柱镜度并精调。
BVCA测试是在4米处开始。首先，测试右眼，然后测试左眼。从参与者的眼睛到视力表的距离是4米(13英尺1.5英寸，或157.5英寸)。使参与者站立或坐下；在任一情形中，检查者都确保参与者是舒适地站立或坐下，头在测试期间不会前后移动，并且参与者的眼睛保持在4米的距离。检查者记下参与者读取正确或错误的每个字母。一旦参与者辨识出一个字母并以肯定的单字母回答，并且读取下一字母时，关于前一字母的更正就不被接受。如果参与者在大声读取下一字母之前大声地改变回答(例如，“这是‘C’不是‘O’”)，则接受这一改变。如果参与者在开始读取下一字母之后改变回答，那么该改变就不被接受。当参与者说他不能读取字母时，鼓励其进行猜测。如果参与者将一个字母辨识为两个或更多个字母之一，则要求其选出一个字母，并且必要时进行猜测，即使其读出下一个字母。尽管要求进行读取或猜测，但当明显无法进一步作出有意义的读取(通常是参与者无法猜出一个字母)时，检查者停止对该眼的测试。鼓励参与者进行猜测是出于若干原因：参与者陈述其无法辨识一个字母通常是不可靠的；鼓励其猜测有助于使参与者尽最大努力；此举有助于确保在不同诊所执行的程序间的均一性；而且此举可以帮助防止参与者的偏差(装病)。
在4米处正确地读取19个或更少字母的眼睛在1米处进行测试。在1米处测试之前，在试镜架上的4米矫正镜上增加+0.75的球镜以补偿更近的测试距离。尽管参与者在4米测试时可以站立或坐下，但参与者在1米测试时只能坐下。要求参与者在1米处仅读取前6行，得出在该距离处的最高评分30。
右眼测试完成后，对左眼重复该测试，从4米处开始。
表1：人口统计和基线特性(第3阶段，mITT)
关键安全性变量
·不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)
·BCVA
·一般体检
·血液化学检查、血常规和尿分析
·注射后评价
免疫原性和全身药物代谢动力学测量：
·abicipar的全身(血清)水平
·针对abicipar的结合抗体和中和抗体
功效测量
·利用早期糖尿病性视网膜病变治疗研究(ETDRS)视力方案评估的BCVA
○自基线的平均变化
○BCVA反应者分析：
1.自基线≥15个字母的改善(视力改善)
2.自基线损失小于15个字母(稳定视力)
·通过光学相干断层扫描术(OCT)测量并通过中央读取中心(CRC)评价的视网膜水肿或视网膜中心厚度(小凹中心1mm2区域；CRT)
·如通过CRC测量并利用OCT评价视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体。
OCT是提供视网膜的高分辨率光学截面图像的一种基于激光的无创诊断系统。由Heidelberg Engineering使用Spectralis谱域OCT(SD-OCT)或由Carl Zeiss使用Cirrus谱域OCT捕捉研究眼中视网膜中心1mm子域的厚度。在固定于黄斑上的情况下，SpectralisOCT装置在6.0mm×6.0mm下通过512A扫描和49B扫描捕捉容积扫描并在6.0mm扫描长度和768分辨率下通过水平和垂直B扫描捕捉交叉线扫描。该装置用1.6.2.0版Heidelberg EyeExplorer及5.1.2.0版或更高版本的HRA2/Spectralis Family Acquisition Module运行。在固定于黄斑上的情况下，Cirrus OCT装置在6.0mm×6.0mm下通过512A扫描和128B扫描捕捉黄斑立方体扫描并在6.0mm扫描长度和1024A扫描下通过水平和垂直B扫描捕捉交叉线扫描。该装置运行4.5版或更高版本的Cirrus软件。
通过CRC复查在筛选随访时从患者收集的电子OCT图像以确定患者的资格。将在所有研究随访时从所有患者收集的电子OCT图像传送到CRC以评估治疗对视网膜液体解决的影响。
在整个研究中使用相同OCT系统(即，Spectralis或Cirrus)评价任何给定患者的CRT。
用于确定疾病复发的数据包括根据研究眼的中央读取中心分级的BCVA和CRT。将研究人员所评价的新出血或超过1.25mm2的现有出血收集在再治疗病例报告单(CRF)上。捕集在此CRF上的阳性反应用于确定存在新出血或现有出血增加。
如果在第三次注射研究药物(第12周)之后存在活动性疾病的迹象，那么Abicipar治疗的患者可以退出护理疗法标准(SOC)；兰尼单抗治疗的患者以4周的间隔接受重复注射，而不管活动性疾病的迹象如何。
活动性疾病的迹象
本发明人的方案提出，在第12周及随后时间，在OCT上呈现视网膜液体的眼应当加以治疗，除非以4周间隔连续3次注射之后眼中的视网膜液体未减少。对于此类眼，可能的情形是持续治疗可能是无效的，并且眼科专家和患者可以选择延缓治疗。如果在OCT上视网膜液体增加(相对于当治疗停止时的随访)，那么在稍后的随访时可以对这些眼重新进行治疗。如果在OCT上无视网膜液体，但存在活动性CNV的其它征象，则该眼应当予以治疗。这些征象包括新出现的视网膜下或视网膜内出血、持续的视网膜下或视网膜内出血、没有其它原因导致的视力相对于最后一次随访下降、在荧光素血管造影术(FA)上病变大小相对于最后一次血管造影片有所增加，或在FA上存在渗漏。
关键随访
·第1阶段：第3天、第1、2、4、8、12、16、20、24周/退出
·第2阶段：第3天、第1、2、4、6、8、12、16、20、24、28及32周/退出
·第3阶段：第3天、第1、4、8、12、16、20周/退出
分析
针对不良事件分析安全群体，并且针对安排、人口统计特征、基线特征、中心视网膜厚度及BCVA分析调整意向治疗(mITT)群体；在患者接受SOC(例如兰尼单抗、阿柏西普、贝伐单抗)治疗后，使用CRT和BCVA末次观察值结转(last-observation-carried-forward，LOCF)输入数据。
安全性
不管成因如何，研究眼中的最常见(≥2次事件/组)不良事件(AE)在abicipar组中是视网膜出血、玻璃体悬浮物、玻璃体脱离及眼痛，而在兰尼单抗组中是黄斑瘢痕和视网膜出血(表2)。任一组中都未报告严重不良事件。在2mg治疗的患者中有2位及在1mg治疗的患者中有3位出现炎症相关AE(表2)。在第一次研究注射后未出现不良事件；在第二次注射后出现脉络膜炎和葡萄膜炎AE；在第三次注射后出现虹膜炎和玻璃体炎AE。在兰尼单抗治疗组中未报告眼部炎症。
表2：研究眼中的不良事件(不管成因如何；发生率≥2次事件/组)和眼部炎症(任何事件)
功效
在2mg和1mg abicipar组中，所有患者都接受SOC，直到第12周。在2mg组中，有3位患者在第12周时退出SOC，有5位患者在第16周时退出。在1mg组中，有5位患者在第12周时退出，并且有6位患者在第16周时退出。在第12周后有活动性疾病迹象的兰尼单抗治疗的患者继续用兰尼单抗再治疗；有6位兰尼单抗治疗的患者在第12周时满足SOC标准，并且有3位在第16周时满足该标准。
最佳矫正视力(BCVA)
在所有组中，平均BCVA自基线的变化都有所改善；在第12周(最后一剂abicipar后4周)时，在2mg治疗组、1mg治疗组及兰尼单抗治疗组中，BCVA自基线的变化分别是8.9、6.2及5.3个字母。在第16周时，主要终点，即BCVA自基线的变化在对应组中是8.2、6.3及5.3个字母，如图1中所示。因此，abicipar治疗组与兰尼单抗治疗组之间的差异虽然在统计学上并不显著，但仍是相当大的(在图1及图2、3和4中，接受护理标准之后的数据被认为缺失；缺失值使用LOCF输入)。
相较于兰尼单抗组，在2mg abicipar组中BCVA的15个或更多个字母改善的患者的比例在数字上更高。在第12周时，2mg abicipar组、1mg abicipar组及兰尼单抗组中改善15个或更多个字母的患者比例分别是22％、8％及13％。在第16周时，这些值是22％、12％及13％(图2)。在abicipar组中没有患者而在兰尼单抗组中有1位患者在20周研究期间损失15个或更多个字母。
稳定视力是以BCVA损失少于15个字母来评估。abicipar组中的所有患者都达到稳定视力；兰尼单抗组中有一位患者未达到(图3)。
中心视网膜厚度
基线CRT值在2mg abicipar治疗组与兰尼单抗治疗组之间相当，而1mg abicipar组中增厚约60μm。到第12周时，CRT减小在三个治疗组中分别是140μm、195μm及126μm。在第16周，这些值是111μm、161μm及127μm；2.0mg abicipar治疗组与兰尼单抗治疗组在任何时间都不存在显著差异。相较于兰尼单抗组，在第1周至第16周时，abicipar组中CRT减小到或低于正常值的上限的患者的比例在数字上较高，并且在第8周时差异在1mg组中明显更高(p＝0.041)。在第12周时，CRT减小到或低于正常值的上限的患者的比例在三个治疗组中分别是57％、64％及44％。在第16周时，这些值是48％、52％及44％。图4示出了整个研究的平均CRT值。
治疗对液体解剖学解决的影响
在sdOCT图像中视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体的存在被读取中心评为活动性渗出性病变的量度。全部3个液体隔室在第一剂、第二剂及第三剂后4周都得到解决(全干)的患者的比例在2mg abicipar组中是52％、74％及78％，在1mg abicipar组中是40％、52％及68％，而在兰尼单抗组中是13％、19％及50％。在第16周(第三次注射abicipar 2.0mg和1.0mg之后8周，及第四次注射兰尼单抗后4周)，这些值在2mg abicipar组、1mg abicipar组及兰尼单抗组中分别是52％、44％及19％。图5示出了视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体(全部三个隔室)在治疗后得到解决的患者的比例。用2mgabicipar治疗的患者的两个实施例示于图6和7中。如通过中心视网膜中异常液体解决所证实，这些患者的中心视网膜厚度明显减小。
与先前发现的比较
根据较高剂量对这些疾病进展量度的影响，意外地发现，可以使用1.0mg和2.0mgabicipar在开始治疗后4周、8周或12周有效减少视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体。在以175位未经过治疗的渗出性AMD患者进行的临床试验中，发现4.2mg和3.0mgabicipar解决视网膜液体的功效在初始剂量之后与兰尼单抗相当。如果患者满足某些再治疗标准，那么在第1天，随后在第16周或更早时间对患者给药。图8示出了视网膜内液体、视网膜内囊肿及视网膜下液体(全部三个隔室)都得到解决的患者的比例；图9示出了这些隔室中的一个、两个、全部三个的液体都解决或都未解决的患者的比例。
尽管已在某些实施方案和实施例的上下文中公开本发明，但本领域技术人员应了解，本发明将具体公开的实施例扩展到其它替代性实施方案和/或本发明的应用及其明显修改和等效内容。此外，尽管已经详细显示和描述多种变化，但基于此公开内容，本领域技术人员将易于了解在本发明的范围内的其它修改。另外，预期可以提出实施方案的具体特征和方面的各种组合或子组合并且仍在本发明范围内。因此，应了解，所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或取代，以便执行所公开的发明的不同模式。因此，预期本文公开的本发明的范围不应受特别公开的上述实施方案的限制，而应当仅通过清楚地阅读权利要求书来决定。

Claims (61)

1.一种抑制VEGF-Axxx与VEGFR-2之间的结合的方法，所述方法包括以下步骤：向需要此抑制的患者施用约0.25mg至约4mg的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中施用2至5次剂量的所述重组结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
2.一种治疗黄斑变性的方法，所述方法包括以下步骤：向需要此治疗的患者施用约0.25mg至约4mg的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中施用2至5次剂量的所述重组结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述黄斑变性是渗出性黄斑变性。
4.一种改善患有视网膜疾病的患者的视力的方法，所述方法包括以下步骤：向需要此改善的患者施用约0.25mg至约4mg的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中施用2至5次剂量的所述重组结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述视网膜疾病选自渗出性黄斑变性、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管瘤样增生、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视及视网膜分支静脉阻塞。
6.一种减少视网膜中的液体的方法，所述方法包括以下步骤：向需要此减少的患者施用约0.25mg至约4mg的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中施用2至5次剂量的所述重组结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述液体选自视网膜内液体、视网膜下液体及视网膜内囊肿内的液体。
8.一种减小视网膜厚度的方法，所述方法包括以下步骤：向需要此减小的患者施用约0.25mg至约4mg的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中施用2至5次剂量的所述重组结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中施用2次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中施用3次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中施用4次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
12.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中施用5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天。
13.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括在所述2至5次剂量之后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔25至115天。
14.如权利要求13所述的方法，其中施用2次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至115天。
15.如权利要求14所述的方法，其中施用2次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至90天。
16.如权利要求14所述的方法，其中施用2次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至60天。
17.如权利要求14所述的方法，其中施用2次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔80至90天。
18.如权利要求14所述的方法，其中施用2次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔105至115天。
19.如权利要求13所述的方法，其中施用3次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至115天。
20.如权利要求19所述的方法，其中施用3次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至90天。
21.如权利要求19所述的方法，其中施用3次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至60天。
22.如权利要求19所述的方法，其中施用3次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔80至90天。
23.如权利要求19所述的方法，其中施用3次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔105至115天。
24.如权利要求13所述的方法，其中施用4次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至115天。
25.如权利要求24所述的方法，其中施用4次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至90天。
26.如权利要求24所述的方法，其中施用4次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至60天。
27.如权利要求24所述的方法，其中施用4次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔80至90天。
28.如权利要求24所述的方法，其中施用4次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔105至115天。
29.如权利要求13所述的方法，其中施用5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至115天。
30.如权利要求29所述的方法，其中施用5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至90天。
31.如权利要求29所述的方法，其中施用5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔50至60天。
32.如权利要求29所述的方法，其中施用5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔80至90天。
33.如权利要求29所述的方法，其中施用5次剂量的所述结合蛋白，并且每次剂量之间间隔25至35天，随后施用另外的剂量，并且每次另外的剂量之间间隔105至115天。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白另外包含分子量是至少5kDa的聚乙二醇部分。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述聚乙二醇部分的分子量选自由5kDA、10kDA及20kDa组成的组。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述锚蛋白重复结构域的N末端加帽模块在5位包含Asp残基。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述锚蛋白重复结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7的锚蛋白重复结构域。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸1至126的锚蛋白重复结构域。
39.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白包含含有重复模块的锚蛋白重复结构域，所述重复模块具有选自由以下组成的组的锚蛋白重复序列基元：SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQID NO:22。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述结合结构域以低于109M的Kd结合VEGF-Axxx。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白抑制VEGF-Axxx与VEGFR-1的结合。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述锚蛋白重复结构域在其C末端经由肽键与多肽连接子和C末端Cys残基缀合，其中所述C末端Cys的硫醇进一步与马来酰亚胺偶联的聚乙二醇缀合。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述马来酰亚胺偶联的聚乙二醇是α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述多肽连接子由2至24个氨基酸组成。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白与药学上可接受的载剂和/或稀释剂一起施用。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述载剂是PBS。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中所述结合蛋白通过玻璃体内注射施用。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白以约0.25mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg或约4mg的剂量施用。
49.如权利要求1和9-48中任一项所述的方法，其中所述方法有效治疗患病患者的黄斑变性、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管瘤样增生、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜分支静脉阻塞或视网膜中央静脉阻塞。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述患者的最佳矫正视力在开始治疗12周之后改善至少15个字母。
51.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述患者在开始治疗4、8或12周之后经历中心视网膜中的液体减少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
52.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述患者在开始治疗4、8或12周之后经历视网膜内水肿、视网膜内囊肿及视网膜下液体中的一种或多种减少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
53.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述患者在开始治疗4、8或12周之后经历视网膜内水肿、视网膜内囊肿及视网膜下液体中的一项或多项减少至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述减少通过谱域OCT评估。
55.如权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述患者在开始治疗4、8或12周之后经历以下各项中至少两项，或至少三项，或全部减少：中心视网膜厚度、视网膜内水肿、视网膜内囊肿及视网膜下液体。
56.如权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述患者是兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普或哌加他尼疗法难治疗的。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述患者在3次玻璃体内注射兰尼单抗、贝伐单抗或阿柏西普之后黄斑中心1mm2区域减小少于20％。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次剂量、四次剂量、五次剂量或六次剂量的兰尼单抗疗法难治疗的。
59.如权利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次剂量、四次剂量、五次剂量或六次剂量的贝伐单抗疗法难治疗的。
60.如权利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次剂量、四次剂量、五次剂量或六次剂量的阿柏西普疗法难治疗的。
61.如权利要求56或57所述的方法，其中所述患者是三次剂量、四次剂量、五次剂量或六次剂量的哌加他尼疗法难治疗的。
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