CN105949475A - 一种抗肿瘤的叶酸-钴配位聚合物纳米管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于生物分子叶酸与金属钴离子配位聚合物纳米管(FA‑Co NTs)的制备、体外抗肿瘤活性及作为抗肿瘤化疗药物载体的应用。其制备方法如下：1)将叶酸与氯化钴分散于乙醇水溶液中，超声得混浊液A；2)将A移至反应釜中，预热得浑浊液B；3)将水合肼逐滴加入B中，超声得浆状液C；4)将C在溶剂热条件下进行反应，得叶酸‑钴配位聚合纳米管。本发明中的FA‑Co NTs合成方法简便、重现性好，其以叶酸分子作为骨架可实现叶酸受体靶向。体外细胞实验证实此纳米管自身具有一定的抗肿瘤活性，而对正常细胞的毒性相对较低。纳米管管口清晰，中空结构明显，可用于负载多种抗肿瘤药物。本发明的FA‑Co NTs可作为一类潜在的抗肿瘤纳米药物和药物载体。

Description

一种抗肿瘤的叶酸-钴配位聚合物纳米管及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料领域，特别涉及一种叶酸-钴配位聚合物纳米管，还涉及叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备方法，还涉及叶酸-钴配位聚合物纳米管作为纳米药物的应用。
背景技术
小分子叶酸(folic acid，FA)由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸，是B族维生素的一种。FA的分子量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好，易于与其它基团进一步进行化学键合。研究证实FA可与叶酸受体(folate receptor，FR)高亲和力结合，而FR在正常组织中的表达高度保守，在大部分恶性肿瘤中，如卵巢癌，子宫内膜癌，肾癌，乳腺癌，鼻咽癌等均高度或过度表达。FR收集胞外FA或FA衍生物，通过内化方式将其带入细胞，是介导FA进入细胞的主要途径。
近年来，研究较多的一般为FA修饰的各类药物载体，如FA-脂质体，FA-聚合物胶束，FA-纳米球等FR介导的肿瘤靶向给药体系，主要仍停留在对各类载体表面的FA修饰。这类传统的FA类药物载体存在着一些弊端：修饰方法繁琐，不易制备；载体表面的叶酸含量难以定量；通常将FA通过化学键合连接到抗肿瘤药物，一定程度上影响了药物的释放等。
配位聚合物纳米材料(coordination polymer nanomaterials)是一类新兴的材料，它是以金属离子或金属簇为节点，以有机配体作为联结体搭建起来的。因此这种材料在气体吸附、催化、离子交换、磁性和传感等方面具有潜在的应用价值。但将其应用于生物医药领域鲜有报道。
基于叶酸分子本身具有较强的配位能力，本发明涉及以叶酸为配体的金属配合物纳米材料，叶酸通过与钴离子配位并自组装构筑纳米管。叶酸-钴配位聚合物纳米管自身便具有良好的体外抗肿瘤活性，是一类潜在的抗肿瘤纳米药物。同时，其特殊的纳米管状结构可填充多种药物分子实现有效的靶向药物递送。该纳米管的合成方法简单，结构新颖，在国内外尚无报道。
发明内容
发明目的：本发明第一目的在于提供一种叶酸-钴配位聚合物纳米管。
本发明的第二目的是提供上述叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备方法。
本发明的第三目的是提供上述叶酸-钴配位聚合物纳米管在纳米药物方面的应用。
本发明的第四目的是提供上述叶酸-钴配位聚合物纳米管在药物载体靶向递送药物方面的应用。
其中，所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管由叶酸、钴离子与水合肼形成配合物，通过叶酸分子间氢键和水合肼的桥连作用形成纳米管。
本发明所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管(FA-Co NTs)的制备方法包括以下步骤：
1)将叶酸与氯化钴固体分散于乙醇水溶液中，混合并持续超声，得混浊液A；
2)将浑浊液A移至反应釜中，预热一段时间，得浑浊液B；
3)将水合肼逐滴加入混浊液B中，超声得浆状液C；
4)将浆状液C转移至反应釜中在溶剂热条件下进行反应，得产物叶酸-钴配位聚合物纳米管，用乙醇和水分别洗涤三遍。
在步骤1)中，所选钴盐只要为可溶性即可达到本发明目的，优选氯化钴；叶酸与氯化钴的摩尔比为1∶(1-3)；乙醇水溶液中，乙醇和水的体积比为3∶(12-21)，体积为15-24ml；叶酸的摩尔数与乙醇的体积比为0.5mmol∶(3-5)ml；超声时间为10-30min。
在步骤2)中，预热时间为2h，预热温度120℃。
在步骤3)中，水合肼的浓度为85％，加入量为5-20ml，超声时间为10-30min。
在步骤4)中，溶剂热条件下反应温度为120-140℃，反应时间为2-12h。
本发明还提供了上述叶酸-钴配位聚合物纳米管在抗肿瘤药物中的应用。
以上所述叶酸-钴配位聚合物纳米管作为抗肿瘤药物及抗肿瘤活性化合物载体。
以上所述具体包括以下步骤：将叶酸-钴配合物纳米管和抗肿瘤活性化合物分别溶解(分散)在水溶液中，二者混合后黑暗条件下振荡，超纯水透析，离心、冷冻干燥。
上述所述抗肿瘤活性化合物为盐酸阿霉素(DOX·HCI)。
所述抗肿瘤活性化合物的水溶液的质量百分比浓度为65-75％；所述叶酸-钴配位聚合物纳米管与活性化合物的质量比为(40-50)∶(20-50)。
上述振荡时间为24-48h，透析时间为24-72h。
本发明所述一种FA-Co NTs自身具有良好的体外抗肿瘤活性，且其较大的空腔可装载多种类型的抗肿瘤药物，能够特异性识别表面具有高水平叶酸受体表达的肿瘤细胞，在肿瘤靶向治疗上的应用前景较好。
本发明中的FA-Co NTs经透射电镜(TEM)检测，长度在150-500nm之间，内径5-9nm，外径10-20nm，管口清晰，中空结构明显，X-射线衍射(XRD)显示纳米管呈非晶态。经红外光谱表征，原叶酸配体的ν(C＝O)消失，叶酸分子通过羧基与金属形成双齿配位模式。经光电子能谱(XPS)表证，Co以二价离子形式存在，叶酸羧酸基团的两个氧原子均参与了与金属的配位。
MTT实验表明FA-Co NTs自身具有良好的体外抗肿瘤活性。作为药物载体装载抗肿瘤药物DOX后，DOX-FA-Co NTs载药体系表现出更强的肿瘤细胞抑制活性。激光共聚焦(CLSM)扫描结果进一步证实FA-Co NTs载药体系能与HeLa细胞表面的叶酸受体发生特异性结合，并在胞质内释放药物进入细胞核，而在正常细胞中纳米管分布较少。
本发明中的叶酸-钴配位聚合物纳米管作为药物载体具有许多显著优点：
1)稳定可控。叶酸-钴配位聚合物纳米管结构新颖，制备方法简单可控，化学稳定性好。
2)靶向性。该纳米管以生物分子叶酸作为基本骨架，可最大限度地结合叶酸受体，从而特异性地结合肿瘤组织细胞，具有良好的叶酸受体靶向性。
3)可作为药物载体。纳米管空腔结构明显，形貌均一，药物装载方便，可通过物理扩散法装载不同类型的抗肿瘤药物，且载药量大。
4)安全有效。纳米管自身具有明显的体外抗肿瘤活性，可与装载的抗肿瘤药物协同发挥抗肿瘤作用。纳米管靶向至肿瘤部位后，可在肿瘤微环境下引起纳米管中配位键断裂，纳米管自身结构崩解，释放负载药物，有利于在肿瘤细胞内积聚高浓度的药物分子，增强抑制肿瘤细胞的效率，同时减小对正常细胞的伤害，增加用药安全性及有效性(见图5)。
附图说明
图1为FA-Co NTs的透射电镜图片：a图纳米管相对聚集(200nm下)；b图为单分散的纳米管(200nm下)；图中可清晰看到纳米管的管口和中空结构。
图2为单独FA与FA-Co NTs的X-射线衍射图：横坐标为衍射角(10-90°)，纵坐标为对应强度。单独FA表现明显的晶体衍射峰，而FA-Co NTs为非晶结构。
图3为FA-Co NTs红外图谱。自由叶酸的1694cm-1ν(C＝O)的振动吸收带消失，出现迁移后的两个特征峰1541和1439cm-1。
图4为FA-Co NTs的光电子能谱(XPS)图。横坐标为电子结合能(Binding energy)，纵坐标为电子强度。图中可见C1s，N1s，O1s，Co 2p3/2和Co 2p1/2的谱图，其中水合肼-钴配合物中氮元素的谱峰为400eV；2p2/3和2p1/2轨道谱峰分别为780和796eV。
图5为不同pH条件下DOX-FA-Co NTs体外药物释放情况，在模拟肿瘤细胞酸性条件下的DOX-FA-Co NTs在相同时间内的药物释放量显著高于模拟人体正常中性条件。
图6为HeLa和L-O2细胞分别与FITC标记的DOX-FA-Co NTs共培养2h后纳米管在细胞内的分布情况。a图从左向右依次为FITC、DAPI和二者层叠图；b图从左向右依次为DOX、DAPI和二者层叠图；c图从左向右依次为FITC、DOX、DAPI和三者层叠图；d图从左向右依次为FITC、DOX、DAPI和三者层叠图。
图7为FITC标记的FA-Co NTs在HeLa和L-O2细胞内的摄取情况：黑线代表单独的FITC，红线代表FITC标记的FA-Co NTs。
具体实施方式
实施例1叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备
1)将叶酸0.5mmol与CoCl2·6H2O 1mmol分散于3ml乙醇和12ml水中，室温下充分混合并持续超声10min，得混浊液A；
2)将浑浊液A移至含聚四氟乙烯高压反应釜中，120℃下预热2h，得浑浊液B；
3)将15ml 85％的水合肼逐滴加入混浊液B中，充分超声10min，得浆状液C，溶液pH值为10.8；
4)将以上浆状液转移至反应釜中，120℃下高温反应12h，收集橙红色固体，用乙醇和水分别洗涤三遍，冷冻干燥即得产物FA-Co NTs。产率为90％。
实施例2叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备
将叶酸0.5mmol与CoCl2·6H2O 0.5mmol分散于4ml乙醇和24ml水中，室温下充分混合并持续超声30min，得混浊液A；
1)将浑浊液A移至含聚四氟乙烯高压反应釜中，120℃下预热2h，得浑浊液B；
2)将15ml 85％的水合肼逐滴加入混浊液B中，充分超声10min，得浆状液C，溶液pH值为10.6；
3)将以上浆状液转移至反应釜中，120℃下高温反应12h，收集橙红色固体，用乙醇和水分别洗涤三遍，冷冻干燥即得产物FA-Co NTs。产率为80％。
实施例3叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备
1)将叶酸0.5mmol与CoCl2·6H2O 1mmol分散于3ml乙醇和12ml水中，室温下充分混合并持续超声30min，得混浊液A；
2)将浑浊液A移至含聚四氟乙烯高压反应釜中，120℃下预热2h，得浑浊液B；
3)将10ml 85％的水合肼逐滴加入混浊液B中，充分超声10min，得浆状液C，溶液pH值为10.0；
4)将浆状液C转移至反应釜中，120℃下高温反应2h，收集橙红色固体，用乙醇和水分别洗涤三遍，冷冻干燥即得产物FA-Co NTs。产率为75％。
实施例4叶酸-钴配位聚合物纳米管的表征
用透射电子显微镜确证FA-Co NTs的结构，发现纳米管分布均匀，管口清晰，中空结构明显，长度150-500nm，内径5-10nm，外径10-20nm，反应时间12h纳米管易聚集形成纳米管簇(见图1a)。
FA-Co NTs的红外数据(见图3)显示：自由叶酸的1694cm-1ν(C＝O)的振动吸收带消失，而同时1570和1453cm-1的νas(COO-)和νs(COO-)谱带分别移至1541和1439cm-1，证明叶酸中COO-是以双齿配位模式与Co2+配位。另外，利用X射线衍射可知FA-Co NTs为非晶结构(见图2)。
FA-Co NTs的光电子图谱(见图4)显示出C1s，N1s，O1s，Co 2p3/2和Co 2p1/2，其中780和796eV分别为Co 2p3/2和Co 2p1/2的结合能。单质Co的谱峰(778eV)没有出现，证明FA-Co NTs中Co的氧化态为+II。399eV属于N2H4-Co中水合肼N，从而确定了水合肼参与了配位。
实施例5叶酸-钴配位聚合物纳米管载阿霉素(DOX-FA-Co NTs)的制备
将20mL 2mg/mL的DOX水溶液加入至25ml 2mg/mL超声分散的FA-Co NTs中，避光条件下磁力搅拌48h后，高速离心，收集固体，用超纯水洗5遍以去除游离药物，避光干燥得到DOX-FA-Co NTs。
测试步骤和方法：
DOX标准曲线的绘制：配制0.5mg/mL的DOX/H2O溶液10ml为母液，分别取一定量的母液定容至5个10ml的容量瓶中，得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的DOX/H2O溶液，室温下进行紫外-吸收分光光度计扫描，以DOX溶液的浓度为横坐标，以483nm处吸光度值为纵坐标作标准曲线。
样品测试：将20mL 2mg/mL的DOX水溶液加入至25ml 2mg/mL超声分散的FA-CoNTs中，避光条件下磁力搅拌48h后。将溶液10000转/分高速离心3min，取出上清液，并对固体用水洗至洗出液无色，合并洗出液，定容至100ml容量瓶中，进行紫外-吸收分光光度计扫描，记录吸光度，对比标准曲线得出DOX的含量。
包封率(％)＝(加入的药物量-滤出液中药物含量)/加入的药物量×100％ (I)
载药量(％)＝(纳米管内药物质量/纳米管总质量)×100％ (II)
计算包封率为98.1％，根据式(II)计算载药量为38.0％。
实施例6异硫氰酸盐标记叶酸-钴配位聚合物纳米管(FITC-FA-Co NTs)的制备
将20mL 2mg/mL的FITC水溶液加入至25ml 2mg/mL超声分散的FA-Co NTs中，避光条件下磁力搅拌48h后，高速离心，收集固体，用超纯水洗5遍以去除游离FITC，得到FITC-FA-Co NTs。
DOX-FA-Co NTs的FITC标记方法同上。
实施例7人宫颈癌HeLa细胞(FR高表达)，人肺腺癌A549细胞(FR低表达)和人正常肝L-O2细胞的培养
取冻存于液氮中的HeLa细胞株置37℃恒温水浴中快速解冻复苏后，在含10％胎牛血清和1％青、链霉素双抗的DMEM培养基中培养，培养条件为温度37℃，5％CO2和饱和湿度，每48h更换培养基。
取冻存于液氮中的A549细胞株置于37℃恒温水浴中快速解冻复苏后，在含10％胎牛血清和1％青、链霉素双抗的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为温度37℃，5％CO2和饱和湿度，每48h更换培养基。
取冻存于液氮中的L-O2细胞株置37℃恒温水浴中快速解冻复苏后，在含10％小牛血清和1％青、链霉素双抗的DMEM培养基中培养，培养条件为温度37℃，5％CO2和饱和湿度，每48h更换培养基。
观察细胞生长情况，当单层生长至80％-90％密度时去除旧培养基，用0.25％胰蛋白酶消化。倒置显微镜下观察并判断消化情况，用完全培养基终止消化后轻柔吹打成均匀单细胞悬液，传代扩增后，取对数生长期细胞用于测试。
实施例8DOX-FA-Co NTs对HeLa、A549和L-O2细胞株的毒性实验
将HeLa、A549和L-O2细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入200μL细胞悬液(每孔1×104个细胞)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，轻轻吸出培养基，每孔加入200μL不同浓度的含药(DOX，FA-Co NTs，DOX-FA-Co NTs)培养基，同时设立空白对照组。
药物与细胞共培养96h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4h；弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解晶体，摇床10min轻轻混匀；在酶标仪(λ＝490nm)上读出每孔的吸光度值，计算抑制率和各组的半数抑制浓度IC50值(见表1)。
IC50值表明，FA-Co NTs自身即表现出较优良的体外抗肿瘤活性(HeLa：1.47μg/mL，A549：5.43μg/mL)，其中HeLa抑制活性与对照组DOX相当(HeLa：1.05μg/mL，A549：0.56μg/mL)。装载抗肿瘤药DOX后，按载药体系实际载药量38.0％推算，以DOX含量为标准，DOX-FA-CoNTs表现出更好的细胞活性(Hela：0.807μg/mL，A549：1.66μg/mL)。我们继而考察各药物体系对人正常细胞的毒性，数据表明FA-Co NTs对L-O2的毒性最低(L-O2：6.98μg/mL)。由此说明，DOX-FA-Co NTs具备了载体FA-Co NTs和装载药物DOX的双重抗肿瘤活性，并通过载体FA-Co NTs有效递药至细胞内，增加了抗肿瘤药物在癌细胞内的浓度，提高了肿瘤细胞的抑制活性，同时避免了对正常细胞的毒副作用。同时，对照FR表达水平不同的HeLa细胞、A549细胞和L-O2细胞，DOX-FA-Co NTs的抗肿瘤活性具有一定的差异性，表明纳米管载药体系发挥了FR介导的靶向功能，可提高对肿瘤细胞的识别，有利于药物靶向输送。
表1不同样品与HeLa、A549和L-O2细胞共培养96h后的IC50值
实施例9叶酸靶向荧光共聚焦实验
将HeLa和L-O2细胞与用FITC标记的FA-Co NTs共培养后通过共聚焦荧光显微镜观察细胞对纳米管的摄取和纳米管在细胞内的分布情况。具体步骤如下：
1)取对数生长期的Hela和L-O2细胞，消化离心后用DMEM完全培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×103个，接种于单孔共聚焦专用皿内，每孔体积2ml；
2)细胞贴壁生长24h后，吸去孔内的培养基，加入DMEM稀释的FITC标记的DOX-FA-Co NTs共培养4h，药物浓度为20μg/ml；
3)培养结束后吸去全部培养溶液，用无菌PBS洗涤2遍，加入0.5ml 4％多聚甲醛溶液，室温下固定细胞30min，无菌PBS洗涤2遍，用0.5ml 4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，2μg/mL)进行细胞核染色15min，PBS液充分洗涤，最终加入0.5ml PBS液浸润细胞。激光共聚焦荧光显微镜下扫描DOX-FA-Co NTs在细胞内的分布情况。
如图6所示，a图为单独的FITC与HeLa细胞共培养2h后，FITC基本在细胞膜外，说明单独的FITC较难进入细胞(蓝色为细胞核，最后一张为前两张的层叠图)；b图中单独的DOX可穿透细胞膜并进入细胞核内；c图将HeLa细胞与将20μg/mL FITC标记的DOX-FA-CoNTs共培养2h，可见鲜明的绿色和红色荧光分布于蓝色的HeLa细胞核内及胞质部分，说明纳米管可通过FR介导进入细胞质，并在细胞质内释放负载的药物DOX。而相同剂量的DOX(图b)在与HeLa细胞共培养相同后，在细胞核内的荧光强度明显低于图c，说明FA-Co NTs能提高药物在肿瘤细胞内的聚集浓度。因为DOX-FA-Co NTs通过内吞作用进入细胞的内涵体中，这些内涵体在溶酶体的作用下释放出DOX-FA-Co NTs，因此可在细胞质中看见DOX-FA-Co NTs。没有发现DOX-FA-Co NTs进入细胞核。作为对照，d图显示，在相同的浓度下，经FITC标记的DOX-FA-Co NTs较难进入正常细胞L-O2内，其细胞核内出现的微弱红色荧光可能为少量DOX从纳米管中释放并进入到细胞核内。
实施例10流式细胞实验定量检测细胞对纳米管摄取量
将HeLa、L-O2细胞与FITC-FA-Co NTs共培养后通过流式细胞仪定量细胞摄取纳米管的情况。具体步骤如下：
1)取对数生长期的HeLa和L-O2细胞，消化离心后用DMEM完全培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×104个，接种于6孔板内，每孔体积2ml；同时设置空白细胞组。
2)贴壁生长24h后，吸去孔内的培养基，加入以DMEM稀释的FITC-FA-Co NTs共培养2h，药物浓度为20μg/mL；
3)培养结束后吸去全部培养基，用PBS液充分洗涤，经0.25％胰蛋白酶消化细胞，离心，弃去上液，加入1ml PBS洗涤两次。最终细胞分散于1ml PBS中用于流式细胞检测。
4)流式检测结果如图7所示。a图为HeLa细胞与FITC-FA-Co NTs共培养2h后，细胞内出现明显的FITC荧光，说明纳米管已进入细胞内(红线表示纳米管，黑线表示单独的FITC)，而对于正常细胞L-O2，共培养相同时间后，细胞内纳米管的荧光微弱(8b)，定量结果显示，HeLa细胞纳米管摄取量为98.5％，L-O2细胞摄取量为50.6％，进一步证明了FA-CoNTs对FR高表达的细胞的确具有靶向性。

Claims (10)

1.一种多功能叶酸-钴配位聚合物纳米管(FA-Co NTs)，其以生物分子叶酸为基本骨架，由叶酸、钴离子和水合肼通过配位键构筑。所述FA-Co NTs通过叶酸分子间的氢键和水合肼分子的桥联作用形成纳米管。FA-Co NTs自身具有一定的抗肿瘤活性，其叶酸骨架赋予纳米管肿瘤靶向性，纳米管的管状结构赋予其载药功能。
2.一种多功能叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备方法，主要包括以下步骤：
1)将叶酸与氯化钴固体分散于乙醇水溶液中，持续超声，得混浊液A；
2)将浑浊液A移至反应釜中，预热一段时间，得浑浊液B；
3)将85％的水合肼逐滴加入混浊液B中，超声得浆状液C；
4)将浆状液C转移至反应釜中在溶剂热条件下进行反应，得产物叶酸-钴配位聚合物纳米管，用乙醇和水分别洗涤三遍。
3.如权利2所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述叶酸与氯化钴的摩尔比为1∶2，乙醇和水的体积比为3∶(12-21)，超声时间为10-30min。
4.如权利2所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述水合肼的体积为15ml，超声时间为10min。
5.如权利2所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述反应温度为120-140℃，反应时间为2-12h。
6.如权利2所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管，其特征在于自身具有抑制肿瘤细胞生长的能力，其体外抗肿瘤性能与阿霉素(DOX)相当。
7.如权利2所述一种叶酸-钴配位聚合物纳米管作为药物载体在肿瘤靶向治疗上的应用，其特征在于：FA-Co NTs装载抗肿瘤药物递药体系的制备，包括以下步骤：将叶酸-钴配位聚合物纳米管和抗肿瘤活性化合物分别分散(溶解)在水溶液中，二者混合后黑暗条件下振荡，超纯水透析，离心、冷冻干燥，即得抗肿瘤药物。
8.如权利7所述FA-Co NTs装载抗肿瘤药物递药体系的制备方法，其特征在于抗肿瘤药物可为DOX和顺铂(CDDP)。
9.如权利7所述FA-Co NTs装载抗肿瘤药物递药体系的制备方法，其特征在于所述FA-Co NTs的用量为40mg-50mg，抗肿瘤药物用量为20mg-50mg。
10.如权利7所述FA-Co NTs装载抗肿瘤药物递药体系的制备方法，其特征在于所得产物在超纯水中透析24h～72h，超纯水洗后，冷冻干燥。
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