CN105943676A - 一种预防龋齿的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种预防龋齿的药物组合物,由黄柏,白藜芦醇按(0.9‑1.1):(1.8‑2.2)的重量比组成。本发明提供的药物组合物可制成漱口液,对于致龋菌乳酸杆菌、变异链球菌具有良好的抑制效果,特别是二者配合比单独使用具有更低的作用浓度,说明二者配合具有协同增效的效果。本发明使用的原料提取自植物,不含任何化学添加剂,对粘膜无刺激性、无生殖毒性、对人体安全无毒。
Description
技术领域
本发明属于预防医学领域,涉及一种预防龋齿的药物组合物。
背景技术
口腔是细菌极易感染和增殖的器官,口腔里的细菌种类繁多,包括致病菌、非致病菌和条件致病菌。有实验表明,正常健康人每一克牙垢中存在50-100亿个细菌,每一克牙龈分泌物中存在10亿个厌氧菌。龋齿是在以细菌为主的多种因素影响下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病,属于口腔常见病,也是人类发病率最高的疾病之一,在我国龋齿患病率为37.3%。世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。龋齿为细菌性疾病,致龋细菌感染是形成龋齿的重要原因,龋齿可继发牙髓炎和根尖周炎,甚至引起牙槽骨和颌骨炎症、牙冠完全破坏消失,因此养成良好的口腔卫生习惯、定期口腔检查、采用有效预防龋齿的漱口液是降低龋齿发病率的重要措施。刷牙是最基础的口腔清洁方法,其可以清除牙齿表面的食物残渣、色素、去除和干扰牙斑的形成,含有药物的漱口液是保持良好的口腔卫生、预防龋齿发生的有效措施,其可以抑制口腔内致病微生物的生长繁殖。
随着经济的不断发展,伴随环境污染、生态失调等问题的日益出现,消费者对产品的安全性越来越重视,以化学物质为主要有效成分的漱口液存在环境降解周期长、长期使用会产生刺激性、广谱消毒杀菌对环境与人体微生态产生影响等缺点,进而可能影响机体代谢而对人类健康产生潜在不良影响。近年来,人群的肿瘤、代谢紊乱性疾病的发病率不断上升。因此开发研究绿色环保、无毒、无残留的中草药口腔护理产品以取代含化学药物的漱口液成为人们的研究共识。现有含有多种中草药成分的漱口液配方复杂,有效成分难以确定,生产成本高,抗菌效果不显著,因此,需要开发抗菌效果确切,配方简单的预防龋齿的漱口液中药配方。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防龋齿的药物组合物,该组合物配比简单,对于致龋齿的乳酸杆菌、变异链球菌具有良好的抑菌效果。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明提供一种预防龋齿的药物组合物,由下列成分组成:由黄柏和白藜芦醇组成,所述黄柏和白藜芦醇的重量比为(0.9-1.1):(1.8-2.2)。
优选地,所述黄柏和白藜芦醇的重量比为1:2。
优选地,所述药物组合物的剂型为漱口液。
更优选地,所述漱口液中黄柏和白藜芦醇的含量为:黄柏6.25mg/mL,白藜芦醇12.5mg/mL。
黄柏为芸香科植物黄蘖、黄树皮的干燥树皮,临床上广泛用于湿热痢疾、腹泻、黄疸、皮肤湿疹等。现代药理研究表明,黄柏具有抗菌、抗真菌、镇咳、降压、抗溃疡以及免疫抑制作用。文献记载,黄柏对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、绿色链球菌、痢疾杆菌、溶血性链球菌、百日咳杆菌、破伤风杆菌、脑膜炎球菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌均有抑制作用,但未见有对乳酸杆菌、变异链球菌抑菌作用的报道。
白藜芦醇是植物遇真菌侵袭时产生的一种植物防御成分,属于天然多酚类物质。白藜芦醇具有抗癌、免疫调节、预防心血管疾病、骨质疏松、痤疮及老年痴呆等多种生物活性。此外,白藜芦醇对多种细菌、真菌和病毒有抑制作用,资料报道其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、沙雷氏菌、福氏痢疾杆菌、雷极氏普罗维登氏菌等均有抗菌效果,但未见有对乳酸杆菌、变异链球菌抑菌作用的报道。
变异链球菌(Streptococcus mutans)是口腔主要的致龋齿菌之一,常见于牙菌斑中,可通过代谢产生的酸性物质导致龋齿的发生。
乳酸杆菌(Lacticacid bacteria)为革兰氏阳性细菌,可发酵碳水化合物产生大量乳酸,在自然界分布广泛,是动物和人肠道等处的重要正常菌群之一,对动物和人类无害并有重要的生理功能。但是,当其通过饮食滞留于口腔时,易与唾液中的黏蛋白和食物残屑混合在一起,牢固地粘附在牙齿表面形成菌斑,容易造成牙齿釉质表面脱钙、溶解,形成龋齿,因此也是口腔致龋齿菌。
本发明通过在10余种中草药中筛选出有抑菌作用的黄柏、以其与白藜芦醇配制成复方合剂,对其进行最小抑菌浓度和毒理学研究,研制出的一种具有有效抑菌作用、使用浓度低、无毒性、无粘膜刺激作用的新型预防龋齿漱口液配方。
其中黄柏制成1:12提取物,采用热回流低温提取浓缩机提取,制成粉末,溶剂均为乙醇,乙醇温度≤85℃,提取温度为65-85℃,浓缩温度为50-70℃、重金属、农药残留及微生物指标符合国家标准要求,使用时用量折成原药计算。
本发明的有益效果在于:
本发明提供一种预防龋齿的漱口液配方,该配方由黄柏和白藜芦醇组成,对于致龋菌乳酸杆菌、变异链球菌具有良好的抑制效果,特别是二者配合比单独使用具有更低的作用浓度,说明二者配合具有协同增效的效果。本发明使用的原料提取自植物,不含任何化学添加剂,对粘膜无刺激性、无生殖毒性、对人体安全无毒。
附图说明
图1为本发明提供的药物组合物的复方漱口液对乳酸杆菌的抑菌环。
图2为本发明提供的药物组合物的复方漱口液对变异链球菌的抑菌环。
具体实施方式
以下仅以实施例说明本发明可能的实施形式,但并非用以限制本发明所要保护的范畴。
实施例:
1.试验材料与试剂
1.1黄柏购自深圳华润三九医药股份有限公司,原药抗菌有效成分盐酸小蘖碱含量4.81%。
1.2白藜芦醇由美国MedChemExpress公司生产,纯度为99.9%。
1.3龋齿的指示菌变异链球菌(ATCC35668)、乳酸杆菌(ATCC4546)购自北京豫鼎鑫捷科技有限公司。
1.4脑心浸液琼脂培养基购买自青岛高科园海博生物科技有限公司、MRS培养基购买自由青岛尼赛欣合生物技术有限公司。
2.试验方法与结果
2.1单一抑菌物质抑菌环试验
取黄柏提取物、白藜芦醇,分别配制成含原药400mg/mL的溶液进行抑菌试验。用双倍稀释法将黄柏提取物、白藜芦醇按原药浓度分别配制成5个浓度梯度溶液:400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL,并煮沸灭菌。取配制好的溶液各20μl,滴加于无菌干燥的圆形滤纸片(d=5mm)上,同时以滴加20μl无菌蒸馏水的滤纸片作为阴性对照,将滤纸片晾干备用。
分别将变异链球菌、乳酸杆菌配制成浓度为5×105cfu/mL~5×106cfu/mL的试验菌液。用无菌棉拭子蘸取菌液,均匀涂抹变异链球菌于脑心浸液琼脂培养基、乳酸杆菌于MRS培养基表面,室温下干燥5min。在染菌平板上贴放制备好的滤纸片及阴性对照,置于厌氧缸中37℃恒温箱培养,乳酸杆菌18-24h后观察结果、变异链球菌40-48h后观察结果,试验平行做3组。
试验结果:用游标卡尺测量并记录抑菌环直径,结果如表1和表2所示。其中,阴性对照组应无抑菌环产生,否则试验无效。抑菌环直径大于7mm者,为有抑菌作用,小于或等于7mm者,为无抑菌作用,结果为3组试验的平均数。
表1 黄柏、白藜芦醇对乳酸杆菌抑菌环试验结果
表2 黄柏、白藜芦醇对变异链球菌抑菌环试验结果
由表1和表2结果可见,黄柏、白藜芦醇对乳酸杆菌和变异链球菌均有抑菌作用。
2.2单一抑菌物质最小抑菌浓度试验
黄柏、白藜芦醇分别应用400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL 6个浓度梯度,将配制好经煮沸消毒的抗菌物质溶液分别混合溶解于脑心浸液琼脂培养基、MR培养基中,点种变异链球菌和乳酸杆菌,以无菌蒸馏水作为阴性对照组,置于厌氧缸中37℃恒温箱培养,乳酸杆菌18-24h后观察结果、变异链球菌40-48h后观察记录各组平皿菌落生长情况。
试验结果:黄柏对乳酸杆菌的最小抑菌浓度为100mg/mL、对变异链球菌的最小抑菌浓度为25mg/mL;白藜芦醇对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度均为50mg/mL。
2.3药物组合物的筛选
根据抑菌环试验和单一抑菌成分最小抑菌浓度筛选试验结果,选取抑菌效果较好的黄柏、白藜芦醇按照不同比例配制成溶液1-16号。具体方法为:将上述成分分别溶解于100mL蒸馏水中,煮沸灭菌后,冷却备用,各组组合物中有效成分浓度见表3。
表3:不同浓度配比的组合物
2.4各组合物抑菌试验结果
将表3中组合物,采用滤纸片扩散法分别对乳酸杆菌、变异链球菌进行抑菌试验。具体方法为:取配制好的溶液各20μl,滴加于无菌干燥的圆形滤纸片(d=5mm)上,同时以滴加20μl无菌蒸馏水的滤纸片作为阴性对照,将滤纸片晾干备用。
分别将变异链球菌、乳酸杆菌配制成浓度为5×105cfu/mL~5×106cfu/mL的试验菌液。用无菌棉拭子蘸取菌液,均匀涂抹变异链球菌于脑心浸液琼脂培养基、乳酸杆菌于MRS培养基表面,室温下干燥5min。在染菌平板上贴放制备好的滤纸片及阴性对照,置于厌氧缸中37℃恒温箱培养,乳酸杆菌18-24h后观察结果、变异链球菌40-48h后观察结果,试验平行做3组。
试验结果:用游标卡尺测量并记录抑菌环直径,结果如表4所示。其中,阴性对照组应无抑菌环产生,否则试验无效。抑菌环直径大于7mm者,为有抑菌作用,小于或等于7mm者,为无抑菌作用,结果为3组试验的平均数。
表4 各组合物抑菌试验结果
以上研究已得出黄柏对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度分别为100mg/mL、25mg/mL,白藜芦醇对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度均为50mg/mL。黄柏和白藜芦醇配伍使用时,在表4试验结果中,根据有抑菌效果使用药物浓度最低的原则,含黄柏12.5mg/mL、白藜芦醇25mg/mL的14号配方对两种试验菌均有明显的抑菌效果,如图1和图2所示,11号配方对变异链球菌有抑菌作用、对乳酸杆菌的抑菌环直径未达到7mm,故应用14号配方进行最小抑菌浓度试验,各组浓度见表5。试验结果为2号组,即含黄柏为6.25mg/mL、白藜芦醇为12.5mg/mL组可有效抑制乳酸杆菌和变异链球菌。
表5 各组配方有效抑菌成分浓度
3毒理学试验
3.1急性经口毒性试验
选体重18-22g小鼠20只,雌雄各半,分笼饲养。试验前预饲7d,试验前禁食过夜,不限制饮水,采用一次最大限度试验方法,一次灌胃剂量5000mg/(kg·bw)。按黄柏:白藜芦醇的比例1:2配制溶液,用经口灌胃方式将上述配好的复方漱口液合剂给予小鼠。每只小鼠称重后,按每次30mL/(kg·bw)剂量分2次灌胃,中间间隔12h。染毒后14d内观察动物中毒表现、有无死亡、死亡数量及时间。
结果:14d内实验动物均无中毒表现,无死亡。根据判断标准,可判定复方漱口液合剂LD50大于5000mg/kg体重,为实际无毒级物质。
3.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
因本复方合剂LD50>5000mg/Kg体重,为实际无毒级物质,故试验分为5组。选体重25-30g小鼠50只,随机分成5组,每组10只雌雄各半。试验设高、中、低剂量组,以5000mg/kg体重为高剂量组、1000mg/kg体重为中剂量组、250mg/kg体重为低剂量组,阳性对照组用环磷酰胺(40mg/kg体重),阴性对照组用蒸馏水。动物染毒采用经口灌胃30h染毒法,两次染毒间隔24h,第二次染毒后6h取材。处死小鼠后以5mL生理盐水冲洗骨髓腔,将骨髓细胞冲入离心管中。所得细胞悬浮液1000rpm离心10min,滴悬液于载玻片的一端,按常规涂片法涂片,晾干。将载玻片置于固定液(甲醇和冰乙酸按3:1混合)中固定10min。置于Giemsa染色液(10%)染色10min-15min,然后用流水冲洗掉浮色,晾干。选择细胞形态完整、分布均匀、着色适当的区域,在油镜下按一定顺序计数嗜多染红细胞(PCE)和微核。PCE呈灰蓝色,微核多数为圆形、边缘光滑、整齐,质地均匀,呈紫红色或蓝紫色。直径通常为红细胞主核的1/20-1/5。每只动物计数1000个PCE,微核细胞率以千分率表示。
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果:
通过检测复方漱口液合剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响,评价其染色体损伤毒性。微核试验结果见表6,阴性对照组、阳性对照组微核细胞率分别为4.1‰、25.0‰,试验1组(LD50)、试验2组(1/5LD50)和试验3组(1/20LD50)微核细胞率分别为5.0‰、5.1‰、4.4‰,将微核细胞率经平方根转换后进行单因素方差分析,结果显示,试验组与阴性对照组比较,无显著性差异(F=0.084,P>0.05);试验组与阳性对照组比较,有显著性差异(F=16.410,P<0.05);各剂量组之间比较,无显著性差异(F=0.057,P>0.05)。说明该复方漱口液合剂对小鼠无体内染色体损伤作用。
表6 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果
注a:为微核率进行平方根数据转换后的结果;
3.3粘膜刺激试验
应用3月龄的雄性大鼠,用乙醚将大鼠麻醉、以碘伏消毒口腔内外组织,用灭菌棉试子蘸取含黄柏12.5mg/mL、白藜芦醇25mg/mL的复方漱口液合剂在口腔两侧颊粘膜表面涂抹,一侧为试样、另一侧为无菌生理盐水对照,24h内观察结果。
试验结果:3只大鼠口腔粘膜试样侧、对照侧均无红斑形成,记分为0分,为无刺激反应。
本发明提供的以黄柏和白藜芦醇复配的药物组合物,对于引起龋齿最常见的变异链球菌和乳酸杆菌为指标菌进行抑菌作用研究,是在多种中草药提取物中筛选出的对变异链球菌和乳酸杆菌有抑菌作用的组方,进一步进行最小抑菌浓度试验,结果:黄柏对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度分别为100mg/mL、25mg/mL,白藜芦醇对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度均为50mg/mL。
为了减少药物的使用浓度增强药物的抑菌效果,将黄柏和白藜芦醇制成复方合剂,最佳配方比例为14号,即含黄柏12.5mg/mL、白藜芦醇25mg/mL,进一步对该配方合剂进行最小抑菌浓度试验,结果为含黄柏6.25mg/mL、白藜芦醇12.5mg/mL组可有效抑制乳酸杆菌、变异链球菌。因此,黄柏和白藜芦醇以1:2的比例混合,对于引起龋齿的细菌-乳酸杆菌、变异链球菌的抑菌作用有明显增效作用。故可用含黄柏6.25mg/mL、白藜芦醇12.5mg/mL的溶液作为漱口液预防龋齿。
从上述实施例可以看出,本发明提供的预防龋齿的药物组合物,原料提取自天然植物,动物实验表明,该复方漱口液为实际无毒级物质,无生殖毒性、对粘膜无刺激性、对人体安全无毒。
Claims (4)
1.一种预防龋齿的药物组合物,其特征在于,由黄柏和白藜芦醇组成,所述黄柏和白藜芦醇的重量比为(0.9-1.1):(1.8-2.2)。
2.如权利要求1所述的预防龋齿的药物组合物,其特征在于,所述黄柏和白藜芦醇的重量比为1:2。
3.如权利要求1所述的预防龋齿的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的剂型为漱口液。
4.如权利要求3所述的预防龋齿的药物组合物,其特征在于,所述漱口液中黄柏和白藜芦醇的含量为:黄柏6.25mg/mL,白藜芦醇12.5mg/mL。
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