CN105939616A

CN105939616A - 涉及施用木聚糖酶的玉米面粉基食品的制备方法和玉米基食品诸如获得的湿润粉糊基食品

Info

Publication number: CN105939616A
Application number: CN201580006471.6A
Authority: CN
Inventors: P·库里-布雷那罗梅罗德特雷罗斯; G·阿维莱斯; C·波尔森; R·梅耶达尔; R·H·洛伦森
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2014-01-31
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2016-09-14
Also published as: GB201401676D0; US20160345595A1; WO2015114010A2; EP3099175A2; AR099215A1; CA2935466A1; BR112016016904A2; MX2016009652A; WO2015114010A3

Abstract

本发明公开了一种用于制备玉米基食品的方法，所述方法包括使玉米基面粉与如本文所定义的木聚糖酶接触的步骤，从而使得玉米天然具有的含木聚糖材料降解。本发明还公开了通过该方法制备的面粉、湿润粉糊和湿润粉糊食品，尤其是玉米粉圆饼。

Description

涉及施用木聚糖酶的玉米面粉基食品的制备方法和玉米基食品诸如获得的湿润粉糊基食品

技术领域

本发明涉及玉米基食品，尤其是湿润粉糊食品。具体地，本发明涉及用木聚糖酶制备的湿润粉糊食品。

背景技术

玉米为多种主食提供基础成分。例如，可对玉米进行加工以产生湿润粉糊。湿润粉糊是用于制备例如以下产品的原料：玉米粉圆饼、软玉米粉圆饼、玉米片(corn chips)、未经发酵的玉米片、玉米面豆卷壳、包馅玉米团、和玉米薄片(corn flakes)以及玉米妙脆角。

其它非湿润粉糊玉米基产品如玉米薄片和玉米妙脆角在本领域中也是已知的。其通常通过采用挤出工艺由玉米基面粉制成。

湿润粉糊通常通过碱法蒸煮方法(通常称为碱法烹制(nixtamalisation)方法)制备。碱法烹制方法包括对仍携带其外壳(种皮)的玉米进行蒸煮。蒸煮在碱性溶液如石灰(氢氧化钙)中进行并且通常进行12至24小时。然后浸泡并洗涤蒸煮产品以产生玉米粒(nixtamal)。然后石磨玉米粒以产生面粉(在本说明书中描述为“碱法烹制的玉米面粉”)，将该面粉与水混合以产生称为湿润粉糊的软的湿面团。

在制备湿润粉糊后，可然后以多种方式对其进行加工。可将湿润粉糊引入例如玉米粉圆饼模具或玉米粉圆饼压面机中。这是湿润粉糊的传统最终用途。在一个替代形式中，可将湿润粉糊干燥并研磨为“耐存储”的面粉产品。湿润粉糊可在后续阶段由面粉产品进行重构并然后成型为食品如玉米粉圆饼。

就工业应用而言，通常湿润粉糊以干燥的湿润粉糊形式出售或成型为最终食品如玉米粉圆饼，然后将其包装。在这两个方面中，提供该形式产品的一个优点在于最终用户不需要由玉米组分制备玉米粒和湿润粉糊。对于最终用途所需劳动力、能源和加工时间均有所减小。此外，产品使用起来简单。

多年以来，内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)(本文称为木聚糖酶)用于修饰源于植物细胞壁材料的复合碳水化合物。本领域公知的是，不同木聚糖酶(源于不同微生物或植物)的功能性极为不同。木聚糖酶是一类将直链的多糖β-1,4-木聚糖降解成木寡糖或木糖，因此使半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)分解的酶的命名。

在现有技术中通常述及将酶(包括木聚糖酶)用作玉米的添加剂。例如L.C.Platt-Lucero等人，Journal of Food Process Engineering 36(2013)179–186描述了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶对挤出的碱法烹制的玉米面粉的影响，玉米粉圆饼的制备和木聚糖酶对粘度的影响以及产品的感官评价。

发明内容

本发明人已惊奇地发现，将特定木聚糖酶(如下定义)引入玉米面粉使得湿润粉糊食品能由玉米基面粉制得，与未使用该酶制得的湿润粉糊产品相比，该湿润粉糊食品表现出改善的特征例如质地、耐受性、可折叠性和粘度。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备玉米基食品的方法，所述方法包括使玉米基面粉与木聚糖酶接触的步骤，从而使得玉米天然具有的含木聚糖材料降解；

其中木聚糖酶选自：

(B)如SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19中所示的多肽，或其与SEQID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19具有至少85％(适当地至少90％或至少95％)同一性的变体、片段、同源物或衍生物，或由本文示为SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ IDNo.22的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22的互补序列杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22具有至少80％(适当地至少85％或至少90％或至少95％)同一性的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ ID No.22的核苷酸序列编码；或

(A1)本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列，或其与SEQID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3以及至少一个氨基酸的保守置换的多肽序列，或由本文示为SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、97.7％、至少98％、98.5％或99％同一性)的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ IDNo.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列编码；或

(C)经修饰的GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述经修饰的GH10木聚糖酶或其片段与亲本GH10木聚糖酶相比具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在至少全部五个)下列位置处被修饰：7、33、79、217和298，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)；或

(A2)本文示为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的多肽序列，或其与SEQID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8或SEQ ID No.9以及至少一个氨基酸的保守置换的多肽序列，或由本文示为SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备玉米基食品的方法，所述方法包括使玉米基面粉与木聚糖酶接触的步骤，其中木聚糖酶选自：

根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备湿润粉糊的方法，所述方法包括形成如上所述的玉米基面粉和木聚糖酶的混合物，并将水添加至玉米基面粉与木聚糖酶的混合物中以形成湿润粉糊。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备湿润粉糊的方法，所述方法包括形成如上所述的湿润粉糊，并将湿润粉糊加工成湿润粉糊食品。在特定方面，湿润粉糊食品是玉米粉圆饼。

根据本发明的一个方面，提供了一种包含木聚糖酶的玉米基面粉，其中木聚糖酶选自：

在特定方面，面粉至少部分地包括碱法烹制的玉米面粉。

在特定方面，面粉还包含水性胶体。

根据本发明的一个方面，提供了一种能够通过如上定义的方法获得的或者通过所述方法获得的玉米基食品(如湿润粉糊食品)。

根据本发明的一个方面，提供了一种能够通过以下方法获得的或者通过以下方法获得的湿润粉糊，所述方法包括：

(a)制备如上所定义的玉米基面粉；以及

(b)将水添加至面粉以形成湿润粉糊。

根据本发明的一个方面，提供了一种能够通过以下方法获得的或者通过以下方法获得的湿润粉糊食品：

(a)制备如上所定义的湿润粉糊；以及

(b)对湿润粉糊进行加工以形成湿润粉糊食品。

在特定方面，湿润粉糊食品是玉米粉圆饼。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备湿润粉糊食品的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在碱性溶液中蒸煮玉米；

(ii)在蒸煮期间或蒸煮之后，使木聚糖酶与玉米接触，

其中木聚糖酶选自：

(i)在碱性溶液中蒸煮玉米；

(ii)在蒸煮期间或蒸煮之后，使木聚糖酶与玉米接触，

使得玉米天然具有的含木聚糖材料被降解；

其中木聚糖酶选自：

(i)在碱性溶液中蒸煮玉米；

(ii)在蒸煮期间或蒸煮之后，使木聚糖酶与玉米接触，

使得玉米天然具有的含木聚糖材料被降解；

其中木聚糖酶选自：

根据本发明的一个方面，提供了木聚糖酶用于改善湿润粉糊食品的质地的用途，其中该木聚糖酶选自：

根据本发明的一个方面，提供了木聚糖酶用于改善湿润粉糊食品的耐受性的用途，其中该木聚糖酶选自：

根据本发明的一个方面，提供了木聚糖酶用于改善湿润粉糊食品的可折叠性的用途，其中该木聚糖酶选自：

根据本发明的一个方面，提供了木聚糖酶用于改进湿润粉糊食品的粘度的用途，其中该木聚糖酶选自：

附图说明

图1示出用于本发明的木聚糖酶A1(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.1)。这是前蛋白原。序列的下划线(小写体)部分反映N-末端信号肽可在酶成熟之前裂解。以粗体和斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而裂解。

图2示出用于本发明的木聚糖酶A1(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.2)。这是蛋白原。以粗体和斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而裂解。

图3示出用于本发明的木聚糖酶A1(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.3)。这是酶的活性形式。这在本文可称为酶的成熟形式。

图4示出编码用于本发明的木聚糖酶A1(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.4)。粗体的小写体核苷酸示出内含子序列。信号序列以粗体(大写体)示出。

图5示出编码用于本发明的木聚糖酶A1(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.5)。信号序列以粗体(大写体)示出。

图6示出编码用于本发明的木聚糖酶A1(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.6)。

图7示出pZZH254的质粒图谱。

图8示出用于本发明的木聚糖酶A2(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.7)。这是前蛋白原。序列的下划线(小写体)部分可反映在酶成熟之前可裂解的N-末端信号肽。以粗体和斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而裂解。

图9示出用于本发明的木聚糖酶A2(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.8)。这是蛋白原。以粗体和斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰而裂解。该序列可为蛋白质的活性形式并且可为蛋白质的一种活性形式。这在本文可称为酶的成熟形式。

图10示出用于本发明的木聚糖酶A2(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.9)。这是酶的另一种活性形式。在一些实施方案中，这在本文可称为酶的成熟形式。

图11示出编码用于本发明的木聚糖酶A2(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ IDNo.11)。粗体的小写体核苷酸示出内含子序列。信号序列以粗体(大写体)示出。

图12示出编码用于本发明的木聚糖酶A2(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ IDNo.12)。信号序列以粗体(大写体)示出。

图13示出编码用于本发明的木聚糖酶A2(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ IDNo.13)。

图14示出pZZH135的质粒图谱。

图15示出编码用于本发明的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID No.14)，其来自镰孢属(Fusarium)——可购自Fusarium Comparative Sequencing Project，Broad Instituteof Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。粗体的小写体核苷酸示出内含子序列。信号序列以粗体(大写体)示出。相较于SEQ ID No.4的变化以下划线标注。

图16示出编码用于本发明的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID No.15)，其来自镰孢属(Fusarium)——可购自Fusarium Comparative Sequencing Project，Broad Instituteof Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。信号序列以粗体(大写体)示出。相较于SEQ ID No.5的变化以下划线标注。

图17示出编码用于本发明的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID No.16)，其来自镰孢属(Fusarium)——可购自Fusarium Comparative Sequencing Project，Broad Instituteof Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。相较于SEQ ID No.6的变化以下划线标注。

图18示出编码用于本发明的木聚糖酶B(AclXyn5)的核苷酸序列(SEQ ID No.20)。小写体核苷酸示出内含子序列。信号序列以粗体(大写体)示出。

图19示出编码用于本发明的木聚糖酶B(AclXyn5)的核苷酸序列(SEQ ID No.21)。信号序列以粗体(大写体)示出。

图20示出编码用于本发明的木聚糖酶B(AclXyn5)的核苷酸序列(SEQ ID No.22)。

图21示出用于本发明的木聚糖酶B(AclXyn5)的多肽序列(SEQ ID No.17)。这是前体蛋白。序列的加粗部分反映在酶成熟之前可裂解的N-末端信号肽。

图22示出用于本发明的木聚糖酶B(AclXyn5)的多肽序列(SEQ ID No.18)。这是酶的一种活性形式。这在本文可称为酶的成熟形式。

图23示出用于本发明的木聚糖酶B(AclXyn5)的多肽序列(SEQ ID No.19)。这也是酶的一种活性形式，其可来源于翻译后加工。

图24为pZZH 159的质粒图谱。

图25示出木聚糖酶A1(如本文所定义)和木聚糖酶B(如本文所定义，单独和与羧甲基纤维素结合)对碱性玉米湿润粉糊的粘度的影响；

图26示出与羧甲基纤维素结合的木聚糖酶B对碱性玉米湿润粉糊的粘度的影响；

图27示出在10天储存期后由碱性湿润粉糊制得的玉米粉圆饼，其示出在碱法蒸煮之后，与0.5％的GRINDSTED CMC MAS 550结合的木聚糖酶B相较于对照及其它商品酶的效果；

图28示出在10天储存期后由酸性湿润粉糊制得的玉米粉圆饼，其示出在碱法蒸煮之后，木聚糖酶A1相较于对照及其它商品酶的效果。

图29示出根据本发明的变体GH10木聚糖酶的编码序列的核苷酸序列(无内含子)(SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32和SEQ ID No.33)。

图30示出根据本发明的变体GH10木聚糖酶的编码序列的核苷酸序列(具有示为下划线的内含子)(SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38)。

图31示出根据本发明的成熟变体GH10木聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID No.39、SEQID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42和SEQ ID No.43)。

图32示出pEntry-FveXyn4的质粒图谱。

图33示出pTTT-pyr2(SpeKpn)、pTTT-pyr2-FveXyn4和pTTT-pyr2-FveXyn4变体的质粒图谱。

图34示出木聚糖酶的多肽序列(SEQ ID No.44)，其得自镰孢属(Fusarium)——Fusarium Comparative Sequencing Project，Broad Institute of Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。在一些实施方案中，该序列是骨架序列。

具体实施方式

一般定义

本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology，第20版，John Wiley and Sons,New York(1994)，和Hale和Marham，The HarperCollins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供关于本发明中所用的多个术语的一般性词典。

本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施方案的实施或试验。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左到右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基取向写出。

如本文所用，术语“基本上由…组成”意指可存在未指定的组分，前提是受权利要求书保护的组合物的特征未因此受到显著影响。

术语“由…组成”意指特定成分的比例必须总计为100％。

本文所用术语“包含”可在一些实施方案中修改以指基本上由…组成或由…组成(两者均具有比“包含”更为受限的含义)。

在本说明书中，当成分的量表示为“面粉的重量％”时，这意指以g计的重量/100g面粉(即相对于面粉为100％)。表述“烘焙物％”也意指特定成分的以g计的重量/100g面粉。

氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。

本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature,JCBN)的定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。

术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开文本并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。

在提供数值范围的情况中，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开中。

必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如提及“一种酶”包括此类候选剂的复数，以此类推。

方法

在一个方面，本发明的方法包括使玉米基面粉与木聚糖酶接触的步骤，从而使得玉米天然具有的含木聚糖材料降解；

其中木聚糖酶选自如以上(A1)、(A2)、(B)或(C)所定义的木聚糖酶。

在一些方面，玉米基面粉在本发明方法中用作原料。玉米基面粉可通过已知方法(如研磨)由玉米制得。为了避免疑义，如本文所用术语“玉米(corn)”与玉米(maize)例如玉蜀黍(Zea mays)同义。

在一个实施方案中，玉米是存在于原料中的唯一谷物。

在另一个实施方案中，玉米作为谷物混合物的一部分存在于原料中。在该实施方案中，玉米可包含至少10％的谷物混合物，诸如至少20％的谷物混合物、诸如至少30％的谷物混合物、诸如至少40％的谷物混合物、诸如至少50％的谷物混合物、诸如至少60％的谷物混合物、诸如至少10％的谷物混合物、诸如至少70％的谷物混合物、诸如至少80％的谷物混合物、诸如至少90％的谷物混合物、诸如至少95％的谷物混合物、诸如至少97％的谷物混合物、诸如至少99％的谷物混合物。在该实施方案中，其它谷物可为通常用作食物的任何谷物。其它谷物的示例包括小麦、裸麦、大麦和燕麦，尤其是小麦。

在一个实施方案中，玉米基面粉为碱法烹制的玉米面粉。碱法烹制通过在碱性溶液中蒸煮玉米进行。然后可浸泡并洗涤蒸煮产品以产生玉米粒，然后可对该玉米粒进行研磨以产生玉米基面粉。然后可使面粉与水混合以产生湿润粉糊。

在一个实施方案中，碱法烹制(碱性玉米蒸煮)在9至11的pH下进行。在一个实施方案中，玉米蒸煮过程在10至10.5的pH下进行。

用于碱法烹制(碱性玉米蒸煮)的碱不受特别限制，只要其至少部分地溶于水并升高溶液的pH即可。适宜的碱的示例包括：碱金属氧化物和氢氧化物，如氢氧化钠和氢氧化钾；碱土金属氧化物和氢氧化物，如氢氧化镁和氢氧化钙；碱金属碳酸盐和碳酸氢盐，如碳酸钠和碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾；以及碱土金属碳酸盐和碳酸氢盐，如碳酸镁、碳酸钙、碳酸氢镁和碳酸氢钙。优选的碱为氢氧化钙。

碱法烹制(碱性玉米蒸煮)的温度通常为90至100℃，并优选95至105℃。

碱法烹制(碱性玉米蒸煮)过程的时间通常为12至24小时。

在一个实施方案中，通过研磨由碱法烹制过程得到的玉米粒来制备玉米基面粉。

在一个实施方案中，可通过研磨非碱法烹制的玉米来制备玉米基面粉。

在一个实施方案中，使玉米基面粉(适当地为碱法烹制的玉米基面粉)与水混合以产生湿润粉糊。

在一个实施方案中，湿润粉糊为碱性湿润粉糊。湿润粉糊可因碱法烹制过程而已具有足够的碱性。另选地，湿润粉糊的pH可通过使用另外的碱如以上定义和举例说明的与碱法烹制过程相关的那些来调节。用于碱化湿润粉糊的碱可与用于碱法烹制过程的碱相同或不同。

适当地，碱性湿润粉糊的pH为9至11，优选10至10.5。

在一个实施方案中，湿润粉糊为酸性湿润粉糊。此类酸性湿润粉糊可通过使碱性湿润粉糊或玉米粒与酸接触进行制备。用于酸化湿润粉糊的酸不受特别限制，只要其至少部分地溶于水并降低溶液的pH即可。适宜的酸的示例包括常用于食品生产的那些，包括乙酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸和乳酸。优选的酸为柠檬酸。

湿润粉糊中也可存在附加成分。

在一个实施方案中，特别是当湿润粉糊为酸性湿润粉糊时，湿润粉糊还包含防腐剂。可使用通常用于食品生产的任何防腐剂。特定类别的防腐剂包括抗微生物防腐剂，其抑制细菌或真菌(包括霉菌)的生长，或其可为抗氧化剂如吸氧剂，其抑制食品组分的氧化。常见的抗微生物防腐剂包括山梨酸及其盐(尤其是山梨酸钾)、苯甲酸及其盐、丙酸钙、亚硝酸钠、亚硫酸盐(诸如二氧化硫、亚硫酸氢钠和亚硫酸氢钾)和乙二胺四乙酸二钠。常见的抗氧化剂包括丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)和没食子酸丙酯。其它防腐剂包括乙醇和甲基氯异噻唑啉酮。优选的防腐剂包括丙酸钙和山梨酸钾。

在一个实施方案中，本发明的方法包括使如本文所定义的木聚糖酶与玉米基面粉接触。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括使如本文所定义的木聚糖酶与湿润粉糊接触。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括在蒸煮之前使如本文所定义的木聚糖酶与玉米接触。

本文所用的术语“接触”是指在蒸煮之前将本发明的酶(或包含酶的组合物)间接或直接施加至(a)玉米基面粉；(b)湿润粉糊、和/或(c)玉米中。可用的施用方法的示例包括但不限于：在蒸煮之前或之后将酶引入玉米中，使酶与玉米基面粉混合，或在与水混合之后将酶施加至湿润粉糊中。

可使玉米在蒸煮之前、期间或之后与木聚糖酶接触。

在制备之后，可使湿润粉糊静置。通常，静置时间为30秒至1小时、优选5至30分钟、更优选10至20分钟。通常，静置温度为10至40℃，并优选环境温度。

在一个实施方案中，通常可通过添加水或本领域的技术人员公知的其它成分来处理玉米面粉以产生湿润粉糊(或湿润粉糊面团)。

在制备湿润粉糊后，可然后以多种方式对其进行加工。

在一个实施方案中，然后将湿润粉糊加工成湿润粉糊食品。各种湿润粉糊食品存在包括以下的示例：玉米粉圆饼、软玉米粉圆饼、玉米片、未经发酵的玉米片、玉米面豆卷壳、包馅玉米团、以及它们的衍生物和混合物。该方法可采用本领域的技术人员公知的过程进行。在一个实施方案中，然后将湿润粉糊面团加工成玉米粉圆饼。

可将湿润粉糊引入例如玉米粉圆饼模具或玉米粉圆饼压面机中。这是湿润粉糊的传统最终用途。在一个替代形式中，可将湿润粉糊干燥并研磨为“耐存储”的面粉产品。湿润粉糊可在后续阶段由面粉产品进行重构并然后成型为食品如玉米粉圆饼。

当对湿润粉糊进行加工以形成玉米粉圆饼时，这通常使用形成生玉米粉圆饼后对其进行烘烤的机器来实行以获得成品玉米粉圆饼。通常，烘焙在150℃至300℃，优选200℃至260℃下进行。通常烘焙时间为10秒至10分钟、优选20秒至2分钟、更优选30至90秒。

在另一个实施方案中，将玉米基面粉加工成非湿润粉糊产品，其示例包括玉米面包、玉米薄片和玉米妙脆角。这可通过本领域的技术人员公知的各种方法进行。

当玉米基面粉经历本发明的过程(以产生湿润粉糊或非湿润粉糊产品)时，在一个实施方案中，玉米为存在于面粉中的唯一谷物。

在另一个实施方案中，玉米作为得自不同谷物的面粉的混合物的一部分存在于原料中。在该实施方案中，玉米可在面粉中包含至少10％的谷物，诸如至少20％的谷物、诸如至少30％的谷物、诸如至少40％的谷物、诸如至少50％的谷物、诸如至少60％的谷物、诸如至少10％的谷物、诸如至少70％的谷物、诸如至少80％的谷物、诸如至少90％的谷物、诸如至少95％的谷物、诸如至少97％的谷物、诸如至少99％的谷物。在该实施方案中，其它谷物可为通常用作食物的任何谷物。其它谷物的示例包括小麦、裸麦、大麦和燕麦，尤其是小麦。可在蒸煮阶段将如上所述的其它谷物作为谷物原料引入，或可在添加木聚糖酶之前、期间或之后作为面粉与玉米面粉一起引入，并且/或者在与水混合期间作为湿润粉糊的组分引入以形成湿润粉糊。

木聚糖酶

在本说明书中，术语“木聚糖酶”为在单独使用时能够将直链的多糖β-1,4-木聚糖降解成木寡糖或木糖的酶。此类酶因此能够分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)。本文术语“木聚糖酶”与“内切-β-1,4-木聚糖酶”(EC 3.2.1.8)同义。多年以来，木聚糖酶用于修饰源于植物细胞壁材料的复合碳水化合物。

不希望受理论的束缚，据信木聚糖酶(如下定义)用来降解玉米中含木聚糖的成分。下面描述了降解的程度。

下面描述了用于本发明的木聚糖酶。木聚糖酶可单独使用(即所述木聚糖酶是混合物中的唯一木聚糖酶)或可以按任何组合混合。

木聚糖酶A1

在一个实施方案中，木聚糖酶选自本文命名为“木聚糖酶A1”或“FveXyn4”的酶。该酶通常描述于PCT/EP2013/066255，该申请在本申请的提交日期时尚未公布。

木聚糖酶A1(FveXyn4)定义为本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列，或其与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3以及至少一个氨基酸的保守置换的多肽序列，或由本文示为SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列、或在高度严格条件下能与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、97.7％、至少98％、98.5％或99％同一性)的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A1包含(或由如下组成)本文示为SEQ ID No.1、SEQID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列，或其与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物。

在一个实施方案中，木聚糖酶A1包含(或由如下组成)这样的多肽序列：该多肽序列包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3以及至少一个氨基酸的保守置换。

在一个实施方案中，木聚糖酶A1由本文示为SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ IDNo.6的核苷酸序列，或在高度严格条件下能与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6杂交的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A1由与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、97.7％、至少98％、98.5％或99％同一性)的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A1由因遗传密码简并性而不同SEQ ID No.4或SEQID No.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A1可获自(或获自)真菌如镰孢属的真菌，特别是轮枝样镰孢菌(Fusarium verticilloides)物种。

除其木聚糖酶活性之外，木聚糖酶A1可为具有其它副活性的制剂的一部分。此类副活性可包括例如淀粉酶、乳糖酶、麦芽糖酶、蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性。优选地，木聚糖酶A1制剂的木聚糖酶活性占酶制剂的总活性的至少50％，诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少950％、至少97％、至少99％。

木聚糖酶A2

在一个实施方案中，木聚糖酶选自本文命名为“木聚糖酶A2”或“FoxXyn2”的酶。该酶还通常描述于PCT/EP2013/066255，该申请在本申请的提交日期时尚未公布。

木聚糖酶A2(FoxXyn2)定义为本文示为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的多肽序列，或其与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含SEQID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9以及至少一个氨基酸的保守置换的多肽序列，或由本文示为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQID No.16的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ IDNo.16具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A2包含(或由如下组成)本文示为SEQ ID No.7、SEQID No.8或SEQ ID No.9的多肽序列，或其与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物。

在一个实施方案中，木聚糖酶A2包含(或由如下组成)这样的多肽序列：该多肽序列包含SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9以及至少一个氨基酸的保守置换；

在一个实施方案中，木聚糖酶A2由本文示为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A2由在高度严格条件下能与SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16杂交的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A2由与SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A2由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.11或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶A2可获自(或获自)真菌如镰孢属的真菌，特别是尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)物种。

就木聚糖酶A1和木聚糖酶A2而言，优选地，使用SEQ ID No.3在序列比对中作为主题序列对关于多肽序列的序列同一性百分比进行测定。在一个实施方案中，多肽主题序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9。在一个优选的实施方案中，多肽主题序列选自成熟序列SEQ ID No.3或SEQ ID No.9。

就木聚糖酶A1和木聚糖酶A2而言，优选地，使用SEQ ID No.6在序列比对中作为主题序列对关于核苷酸序列的序列同一性百分比进行测定。在一个实施方案中，核苷酸序列的主题序列可选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。在一个优选的实施方案中，主题序列为序列SEQ ID No.6。

除其木聚糖酶活性之外，木聚糖酶A2可为具有其它副活性的制剂的一部分。此类副活性可包括例如淀粉酶、乳糖酶、麦芽糖酶、蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性。优选地，木聚糖酶A2制剂的木聚糖酶活性占酶制剂的总活性的至少50％，诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少950％、至少97％、至少99％。

木聚糖酶B

在一个实施方案中，木聚糖酶选自本文命名为“木聚糖酶B”或“AclXyn5”的酶。该酶通常描述于PCT/EP2013/066256，该申请在本申请的提交日期时尚未公布。

木聚糖酶B(AclXyn5)定义为如SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19中所示的多肽，或其与SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19具有至少85％(适当地至少90％或至少95％)同一性的变体、片段、同源物或衍生物，或由本文示为SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ ID No.22的核苷酸序列、或在高度严格条件下能与SEQ ID No.20、SEQID No.21或SEQ ID No.22的互补序列杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.20、SEQID No.21或SEQ ID No.22具有至少80％(适当地至少85％或至少90％或至少95％)同一性的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，木聚糖酶B包括如SEQ ID No.19或SEQ ID No.18或SEQ IDNo.17中所示的多肽，或其与SEQ ID No.19或SEQ ID No.18或SEQ ID No.17具有至少85％同一性(诸如至少90％同一性、诸如至少95％同一性、诸如至少97％同一性、诸如至少98％同一性、诸如至少99％同一性)的变体、同源物或衍生物。

在一个实施方案中，木聚糖酶B包括由本文示为SEQ ID No.22、SEQ ID No.21或SEQ ID No.20的核苷酸序列编码的多肽。

在一个实施方案中，木聚糖酶B包括在高度严格条件下能与SEQ ID No.22、SEQ IDNo.21或SEQ ID No.20的互补序列杂交的核苷酸序列编码的多肽。

在一个实施方案中，木聚糖酶B包括由与SEQ ID No.22、SEQ ID No.21或SEQ IDNo.20具有至少80％同一性(诸如至少85％同一性、诸如至少90％同一性、诸如至少95％同一性、诸如至少97％同一性、诸如至少98％同一性、诸如至少99％同一性)的核苷酸序列编码的多肽。

在一个实施方案中，木聚糖酶B包括由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.22、SEQ ID No.21或SEQ ID No.20的核苷酸序列编码的多肽。

在一个实施方案中，木聚糖酶B可获自(或获自)真菌如曲霉(Aspergillus)属的真菌，特别是棒曲霉(Aspergillus clavatus)物种。

除其木聚糖酶活性之外，木聚糖酶B可为具有其它副活性的制剂的一部分。此类副活性可包括例如淀粉酶、乳糖酶、麦芽糖酶、蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性。优选地，木聚糖酶B制剂的木聚糖酶活性占酶制剂的总活性的至少50％，诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少950％、至少97％、至少99％。

木聚糖酶C

在一个实施方案中，木聚糖酶选自本文命名为“木聚糖酶C”的酶。木聚糖酶C为热稳定的木聚糖酶。

在一个实施方案中，木聚糖酶C包括经修饰的GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述经修饰的GH10木聚糖酶或其片段与亲本GH10木聚糖酶相比具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在至少全部五个)下列位置处被修饰：7、33、79、217和298，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C通过编码热稳定性木聚糖酶并包含(或由如下组成)骨架多核苷酸序列的核酸分子(例如分离或重组核酸分子)进行编码，所述骨架多核苷酸序列包含(或由如下组成)选自以下的核苷酸序列：

a.本文示为SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15的核苷酸序列；或

b.与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15具有至少70％同一性(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％同一性)的核苷酸序列；或

c.在高度严格条件下能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15杂交的核苷酸序列；

其骨架多核苷酸序列在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在至少全部五个)密码子处被修饰，所述密码子对编码的多肽中7、33、79、217和298位氨基酸进行编码，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为包含(或由如下组成)骨架多核苷酸序列的载体(例如质粒)或构建体，所述骨架多核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：

在一个实施方案中，木聚糖酶C为包含根据本发明的核酸或根据本发明的载体或构建体的宿主细胞。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为具有木聚糖酶活性的酶，所述酶为GH10木聚糖酶或其片段，所述酶已在两个或更多个(适当地三个或更多个，适当地在至少全部)下列位置处具有修饰：7、33、79、217和298，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)，并且与除所述修饰之外还包含与所述酶相同的氨基酸序列的GH10木聚糖酶相比，所述酶具有更大的热稳定性。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述GH10木聚糖酶包含与GH10木聚糖酶(例如亲本GH10木聚糖酶)具有至少70％(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％)同一性的多肽；并且在两个或更多个(适当地在三个或更多个，适当地在全部)所示位置处包含下列氨基酸：7D；33V；79Y、V、F、I、L或M(优选79Y、F或V，更优选Y)；217Q、E、P、D或M(优选217Q、E或P，更优选Q)；和298Y、F或W(优选Y或F，更优选Y)，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述GH10木聚糖酶包含与GH10木聚糖酶(例如亲本或骨架GH10木聚糖酶)具有至少90％(适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％)同一性的多肽；并且在两个或更多个(适当地在三个或更多个，适当地在全部)所示位置处包含下列氨基酸：7D；33V；79Y；217Q)；和298Y，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述酶或其片段与亲本GH10木聚糖酶相比具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在至少两个下列位置处被修饰：7、33、79、217和298，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为这样一种酶，其中所述酶为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述酶或其片段与亲本GH10木聚糖酶相比具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在至少三个下列位置处被修饰：7、33、79、217和298，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述酶或其片段与亲本GH10木聚糖酶相比具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在至少下列位置被修饰：7、33、79、217和298，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，木聚糖酶C包含至少两个(优选至少三个)下列修饰：

N7D；

T33V；

K79Y、V、F、I、L或M；

A217Q、E、P、D或M；和

T298Y、F或W。

在一个实施方案中，木聚糖酶C在至少两个(优选至少三个)所示位置处包含下列氨基酸：

7D；

33V；

79Y、V、F、I、L或M；

217Q、E、P、D或M；和

298Y、F或W。

N7D；

T33V；

K79Y、F或V；

A217Q、E或P；和

T298Y或F。

7D；

33V；

79Y、F或V；

217Q、E或P；和

298Y或F。

N7D；

T33V；

K79Y；

A217Q；和

T298Y。

7D；

33V；

79Y；

217Q；和

298Y。

在一个实施方案中，木聚糖酶C包含至少下列修饰：

N7D；

T33V；

K79Y、V、F、I、L或M；

A217Q、E、P、D或M；和

T298Y、F或W。

在一个实施方案中，木聚糖酶C在所示位置包含下列氨基酸：

7D；

33V；

79Y、V、F、I、L或M；

217Q、E、P、D或M；和

298Y、F或W。

在一个实施方案中，木聚糖酶C包含至少下列修饰：

N7D；

T33V；

K79Y、F或V；

A217Q、E或P；和

T298Y或F。

在一个实施方案中，木聚糖酶C在所示位置包含下列氨基酸：

7D；

33V；

79Y、F或V；

217Q、E或P；和

298Y或F。

在一个实施方案中，木聚糖酶C包含至少下列修饰：

N7D；

T33V；

K79Y；

A217Q；和

T298Y。

在一个实施方案中，木聚糖酶C在所示位置包含下列氨基酸：

7D；

33V；

79Y；

217Q；和

298Y。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在一个或多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在两个或更多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在三个或更多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在四个或更多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在五个或更多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在七个或更多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

在一个实施方案中，木聚糖酶C除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298上被修饰之外，其可进一步在九个或更多个下列位置处被修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。

当木聚糖酶C进一步在位置25处被修饰时，该修饰可为N25P。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的25位氨基酸残基优选为P。

当木聚糖酶C进一步在位置57处被修饰时，该修饰可选自S57Q、T或V(优选Q)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的57位氨基酸残基优选为Q、T或V(优选Q)。

当木聚糖酶C进一步在位置62处被修饰时，该修饰可选自N62T或S(优选T)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的62位氨基酸残基优选为T或S(优选T)。

当木聚糖酶C进一步在位置64处被修饰时，该修饰可选自G64T或S(优选T)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的64位氨基酸残基优选为T或S(优选T)。

当木聚糖酶C进一步在位置89处被修饰时，该修饰可选自S89G、N、Q、L或M(优选G或Q，更优选G)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的89位氨基酸残基优选为G、N、Q、L或M(优选G或Q，更优选G)。

当木聚糖酶C进一步在位置103处被修饰时，该修饰可选自T103M或K(优选M)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的103位氨基酸残基优选为M或K(优选M)。

当木聚糖酶C进一步在位置115处被修饰时，该修饰可选自V115E或L(优选L)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的115位氨基酸残基优选为E或L(优选L)。

当木聚糖酶C进一步在位置147处被修饰时，该修饰可为N147Q。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的147位氨基酸残基优选为Q。

当木聚糖酶C进一步在位置181处被修饰时，该修饰可选自G181Q、A、D或P(优选Q)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的181位氨基酸残基优选为Q、A、D或P(优选Q)。

当木聚糖酶C进一步在位置193处被修饰时，该修饰可选自S193Y或N(优选Y)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的193位氨基酸残基优选为193Y或N(优选Y)。

当木聚糖酶C进一步在位置219处被修饰时，该修饰可选自G219D或P(优选P)。换言之，本发明的GH10木聚糖酶的219位氨基酸残基优选为D或P(优选P)。

在一个实施方案中，除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298处包含修饰之外，木聚糖酶C进一步在下列残基中包含修饰：25和89(优选N25P和S89G)。

在一个实施方案中，除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298处包含修饰之外，木聚糖酶C进一步在下列残基包含修饰：57、62、64和89(优选S57Q、N62T、G64T和S89G)。

在一个实施方案中，除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298处包含修饰之外，木聚糖酶C进一步在下列残基包含修饰：25、57、62、64、103、115、147、181、193和219(优选N25P、S57Q、N62T、G64T、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y和G219P)。

在一个实施方案中，除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298处包含修饰之外，木聚糖酶C进一步在下列残基包含修饰：25、57、62、89、103、115、147、181、193和219(优选N25P、S57Q、N62T、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、G219P和T298Y)。

在一个实施方案中，除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)位置7、33、79、217和298处包含修饰之外，木聚糖酶C进一步在下列残基包含修饰：25、89和64(优选N25P、S89G、G64T)

在一个实施方案中，木聚糖酶C可在所示位置包含下列氨基酸：

a.7D、25P、33V、64T、79Y、89G、217Q和298Y；

b.7D、25P、33V、79Y、89G、217Q和298Y；

c.7D、25P、33V、57Q、62T、64T、79Y、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；

d.7D、25P、33V、57Q、62T、79Y、89G、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；

e.7D、33V、57Q、62T、64T、79Y、89G、217Q和298Y；

f.79F_217Q_和298F；

g.7D、_33V、_217Q_和298F；

h.7D、_79F和298F；

i.33V、79F和_217Q；

j.7D、33V和_298Y；

k.33V、_217Q_和298Y；

l.7D、_217Q和_298F；

m.7D、_33V和217Q；

n.79F和298F；

o.7D和79F；

p.33V_和79F；

q.33V和_298Y；

r.7D_和33V；或

s.33V和_A217Q。

a.7D、25P、33V、64T、79Y、89G、217Q和298Y；

b.7D、25P、33V、79Y、89G、217Q和298Y；

e.7D、33V、57Q、62T、64T、79Y、89G、217Q和298Y；

在一个实施方案中，木聚糖酶C可包含下列修饰：

a.N7D、N25P、T33V、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；

b.N7D、N25P、T33V、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；

c.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；

d.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、K79Y、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；

e.N7D、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；

f.K79F_A217Q_T298F；

g.N7D_T33V_A217Q_T298F；

h.N7D_K79F_T298F；

i.T33V_K79F_A217Q；

j.N7D_T33V_T298Y；

k.T33V_A217Q_T298Y；

l.N7D_A217Q_T298F；

m.N7D_T33V_A217Q；

n.K79F_T298F；

o.N7D_K79F；

p.T33V_K79F；

q.T33V_T298Y；

r.N7D_T33V；或

s.T33V_A217Q。

在一个实施方案中，木聚糖酶C可包含下列修饰：

a.N7D、N25P、T33V、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；

b.N7D、N25P、T33V、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；

e.N7D、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；

在一个实施方案中，木聚糖酶C具有骨架氨基酸序列(在修饰之前)，该序列包含(或由如下组成)选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44的氨基酸序列；或与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No 7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44具有至少70％同一性(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％同一性)的氨基酸序列；或由包括本文示为SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15的核苷酸序列的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或由包括以下的核苷酸序列的核苷酸序列编码的氨基酸序列：与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15具有至少70％同一性(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％同一性)；或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

术语“亲本”意指对其进行改变而产生本发明的经修饰酶的木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶。在一个实施方案中，亲本酶是GH10木聚糖酶。适当地，亲本酶可为天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。在一个优选的实施方案中，亲本酶是天然存在的(野生型多肽)。

适当地，木聚糖酶C包含(或基本上由如下组成，或由如下组成)这样的氨基酸序列，该氨基酸序列除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在至少全部五个)以下位置7、33、79、217和298处被修饰之外与所述亲本酶相同或基本上相同，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

在一些实施方案中，木聚糖酶C包含(或基本上由如下组成，或由如下组成)氨基酸序列，所述氨基酸序列除在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在至少全部五个)以下位置7、33、79、217和298处以及在一个或多个以下位置25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219处被修饰之外与所述亲本酶相同或基本上相同，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.1)。

木聚糖酶C与亲本酶适当地具有约至少90％序列同一性(优选至少93％、适当地至少97％、适当地至少99％序列同一性)。

如本文所用，术语“骨架”意指作为GH10木聚糖酶多肽的多肽序列，其被修饰以在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)所示位置包含下列氨基酸：7D；33V；79Y、V、F、I、L或M(优选79Y、F或V，更优选Y)；217Q、E、P、D或M(优选217Q、E或P，更优选Q)；和298Y、F或W(优选Y或F，更优选Y)，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

木聚糖酶C优选地包含与GH10木聚糖酶(例如亲本或骨架GH10木聚糖酶)具有至少70％(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％)同一性的多肽；并且在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)所示位置包含下列氨基酸：7D；33V；79Y、V、F、I、L或M(优选79Y、F或V，更优选Y)；217Q、E、P、D或M(优选217Q、E或P，更优选Q)；和298Y、F或W(优选Y或F，更优选Y)，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.3)。

木聚糖酶C优选地包含与GH10木聚糖酶(例如亲本或骨架GH10木聚糖酶)具有至少95％(适当地至少98％、适当地至少99％)同一性的多肽；并且在两个或更多个(优选在三个或更多个，更优选在全部)所示位置包含下列氨基酸：7D；33V；79Y；217Q)；和298Y，其中所述编号基于FveXyn4的氨基酸编号(SEQ ID No.1)。

在一个实施方案中，亲本或骨架GH10木聚糖酶(在修饰之前)为：

a.包含选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44的氨基酸序列的木聚糖酶；或

b.包含与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No 7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44具有至少70％同一性(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％同一性)的氨基酸序列的木聚糖酶；或

c.由包括本文示为SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15的核苷酸序列的核苷酸序列编码的木聚糖酶；或

d.由包括以下的核苷酸序列的核苷酸序列编码的木聚糖酶：与SEQ ID No.6、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQID No 14或SEQ ID No.15具有至少70％同一性(适当地至少80％、适当地至少90％、适当地至少95％、适当地至少98％、适当地至少99％同一性)；或

e.由在高度严格条件下能与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15杂交的核苷酸序列编码的木聚糖酶。

在一个实施方案中，亲本或骨架氨基酸序列与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No 7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44具有至少80％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架氨基酸序列与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No 7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44具有至少90％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架氨基酸序列与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No 7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44具有至少95％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架氨基酸序列与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.9、SEQ ID No 7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.44具有至少98％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架木聚糖酶可由包括以下的核苷酸序列的核苷酸序列编码：与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15具有至少80％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架木聚糖酶可由包括以下的核苷酸序列的核苷酸序列编码：与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15具有至少90％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架木聚糖酶可由包括以下的核苷酸序列的核苷酸序列编码：与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15具有至少95％同一性。

在一个实施方案中，亲本或骨架木聚糖酶可由包括以下的核苷酸序列的核苷酸序列编码：与SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 14或SEQ ID No.15具有至少98％同一性。

适当地，亲本或骨架GH10木聚糖酶可获自(适当地获自)镰孢属生物体。

适当地，亲本或骨架木聚糖酶为内切-1,4-β-d-木聚糖酶。

根据本发明的经修饰的木聚糖酶或GH10木聚糖酶优选为内切-1,4-β-d-木聚糖酶。

在一个优选的实施方案中，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段具有大于70℃(优选大于75℃)的Tm值，其中Tm值测为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。

根据本发明的木聚糖酶(例如木聚糖酶C)的热稳定性可采用“用于测量热稳定性的测定法”(参见下文)测定。

用于测量热稳定性的测定法

通过以下来测定FveXyn4变体的热变性特征：在变化的温度(分别为63、65.5、66.7、68.2、70.6、73.5、76、76.5、76.8、79.7、81.9、83.5、84.6和85℃)下，在25mM MES缓冲液(pH 6.0)中稀释酶样品并预温育10分钟，并随后通过实施例1所述的木聚糖酶活性方法测量残留活性。将未预温育情况下测得的活性设为100％并相对于其来计算各个温度下各变体的残留活性。由热变性特征将Tm值计算为获得50％残留活性的温度。

在一个实施方案中，根据本发明，如果酶具有大于70℃的Tm值，则其被视为热稳定的，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。该Tm值可根据如本文提出的用于测量热稳定性的测定法来测定。

在一个实施方案中，根据本发明，如果酶具有大于76℃的Tm值，则其被视为热稳定的，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。该Tm值可根据如本文提出的用于测量热稳定性的测定法来测定。

在一个实施方案中，根据本发明，如果酶具有大于85℃的Tm值，则其被视为热稳定的，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。该Tm值可根据如本文提出的用于测量热稳定性的测定法来测定。

优选地，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含其的组合物)可经受至多约70℃；例如至多75℃，例如至多76℃，例如至多约85℃；例如或至多约95℃的热处理(例如在粒化过程期间)。热处理可进行至多约1分钟；至多约5分钟；至多约10分钟；至多约30分钟；至多约60分钟。经受此类热处理意指在加热到指定温度之前在添加剂中存在/有活性的酶有至少约50％在其冷却到室温后仍存在/有活性。优选地，在加热到指定温度之前在添加剂中存在和有活性的酶有至少约80％在其冷却到室温后仍存在和有活性。

术语“热稳定性”是酶在相对较高温度下抵抗不可逆失活(通常通过变性)的能力。这意指酶在暴露于所确定温度给定的时间段之后保留指定量的酶活性。

有许多方法可测定热稳定性。作为示例，相较于使酶在更长时间(数日)内稳定的温度，可在升高的温度下，在无底物条件下将酶样品温育规定的时间段(例如10分钟或1至30分钟)。在升高的温度下温育之后，在许可温度例如30℃(另选地25-50℃或甚至至多70℃)下对酶样品的残留活性进行测定。相对于未在升高的温度下温育的酶样品，计算残留活性。

热稳定性也可测定为随温度变化的酶失活。在无底物条件下，在各个温度下将此处酶样品温育规定的时间段(例如10分钟或1至30分钟)并在温育之后在许可温度例如30℃(另选地25-70℃或甚至更高)下测定残留活性。相对于未在升高的温度下温育的酶样品，计算各个温度下的残留活性。所得的热变性特征(温度相对残留活性)可用于计算获得50％残留活性的温度。该值定义为Tm值。

甚至进一步，热稳定性可测定为随时间变化的酶失活。在无底物条件下，在规定的升高温度(例如76℃)下将此处酶样品温育不同的时间段(例如10秒至30分钟之间)并在温育之后在许可温度例如30℃(另选地25-70℃或甚至更高)下测定残留活性。相对于未在升高的温度下温育的酶样品，计算各个温度下的残留活性。所得的失活特征(时间相对残留活性)可用于计算获得50％残留活性的时间。这通常以T1/2表示。

这些是如何测定热稳定性的示例。热稳定性也可通过其它方法测定。优选地，通过使用如本文提出的“用于测量热稳定性的测定法”来评估热稳定性。

与热稳定性不同，热活性为随温度变化的酶活性。为了测定热活性，在底物存在下，可将酶样品于不同温度下温育(测定)由测定法限定的时间段。在由测定法所限定的温育期间或紧接之后得出酶活性(例如读取反映所形成反应产物的量的OD值)。获得最高活性的温度为给定测定条件下的酶的最佳温度。可相对于在最佳温度下获得的活性计算各个温度下所得的活性。这将提供酶在给定测定条件下的温度特征。

在本申请中，热稳定性不同于热活性。

在一个优选的实施方案中，木聚糖酶C包含本文示为SEQ ID No.39、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.41,SEQ ID No.42或SEQ ID No.43的氨基酸序列中的一者或其具有木聚糖酶活性的片段。

在一个实施方案中，骨架多核苷酸序列中的修饰使得可以得到所编码氨基酸序列中的上文详述修饰。

本发明的方法适于在多核苷酸或氨基酸序列中得到如上文提出的修饰。

除其木聚糖酶活性之外，木聚糖酶C还可具有其它副活性。此类副活性可包括例如淀粉酶、乳糖酶、麦芽糖酶、蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性。优选地，木聚糖酶A1的木聚糖酶活性占酶的总活性的至少50％，诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％。

在本发明的一个方面，用于本发明的木聚糖酶是糖苷水解酶(GH)家族10的木聚糖酶。术语“糖苷水解酶(GH)家族10的”意指所考虑的木聚糖酶被归入或可被归入GH家族10。

蛋白质相似性搜索(Protein similarity searches)(例如在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&PAGE_TYPE＝BlastHome中蛋白质blast)可确定未知序列是否属于术语GH10木聚糖酶家族成员，特别是GH家族可基于关键区域中的序列同源性分类。此外或另选地，为了确定未知蛋白质序列是否为GH10家族内的木聚糖酶蛋白质，不仅可对序列相似性/同源性/同一性进行评估，还可对3D结构相似性进行评估。GH家族的分类通常基于3D折叠。将预测未知蛋白质序列的3D折叠的软件是HHpred(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。这种用于预测蛋白质结构的软件的效用依赖于采用已知结构用作模板对同源序列进行鉴定。其效果很好，因为结构趋异的速度比一级序列要慢得多。相同家族的蛋白质即使其序列已趋异到不能识别的程度，也可具有极类似的结构。

在实施过程中，可将未知序列以FASTA格式粘贴到软件中(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。进行该操作后，可提交搜索。搜索的输出将示出具有已知3D结构的序列的列表。为了确认未知序列实际上为GH10木聚糖酶，GH10木聚糖酶可见于具有>90的概率的同源物列表内。并非所有识别为同源物的蛋白质都将被表征为GH10木聚糖酶，但是一些会如此。后者蛋白质是具有起到木聚糖酶识别作用的已知结构和生化特征的蛋白质。前者无GH10木聚糖酶的生物化学特征。一些参考文献描述了此种方案，例如J.(2005)HMM-HMM comparison-Bioinformatics的Protein homology detection,21,951-960(doi:10.1093/bioinformatics/bti125)和J,Biegert A，和Lupas AN.(2005)The HHpred interactive server for protein homology detection andstructure prediction-Nucleic Acids Research 33,W244--W248(网络服务器专辑)(doi:10.1093/nar/gki40)。

根据Cazy网站(http://www.cazy.org/)，家族10糖苷水解酶可为如下特征：

已知活性：内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；内切-1,3-β-木聚糖酶(EC3.2.1.32)；番茄皂甙酶(tomatinase)(EC 3.2.1.-)

机制：保留

宗族：GH-A

催化剂亲核体/碱：Glu(实验)

催化质子供体：Glu(实验)

3D结构状态：(β/α)₈

用于本发明的GH10木聚糖酶可具有催化结构域，分子量在32-39kDa范围内。本发明的GH10木聚糖酶的催化结构域的结构由八重β/α桶状结构组成(Harris等人1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。

已获知大量GH10家族酶的三维结构，首先被解析的是如下酶的三维结构：浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶A(Derewenda等人，J Biol Chem 1994年8月19日；269(33)20811-4)、粪肥纤维单胞菌(C.fimi)内切聚糖酶Cex(White等人Biochemistry1994年10月25日；33(42)12546-52)和日本纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(先前的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)亚种木聚糖酶A)(Harris等人，Structure1994年11月15日；2(11)1107-16.)。作为宗族GHA的成员，其具有经典的(α/β)₈TIM桶状折叠，其中两个关键活性位点谷氨酸位于β链4(酸/碱)和7(亲核体)的C末端(Henrissat等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1995年7月18日；92(15)7090-4)。

如本文所用，术语“GH10木聚糖酶”意指具有木聚糖酶活性并且具有(α/β)₈TIM桶状折叠的多肽，其中两个关键活性位点谷氨酸位于β链4(酸/碱)和7(亲核体)的C-末端。

用于本文的骨架(或亲本)木聚糖酶可称为FveXyn4或FoxXyn 2(这些术语是指活性蛋白质，例如成熟蛋白质)。

在一个实施方案中，优选地，木聚糖酶是真菌木聚糖酶。

具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段和/或亲本酶为GH10木聚糖酶。

在一个实施方案中，优选地，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(和/或亲本木聚糖酶)为真菌GH10木聚糖酶。

在一个实施方案中，优选地，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(和/或亲本木聚糖酶)为内切木聚糖酶，例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶。内切-1,4-β-d-木聚糖酶的分类号为E.C.3.2.1.8。

如本文所用的术语“其片段”意指活性片段。换句话讲，所述片段是具有木聚糖酶活性的片段。适当地，片段可与片段所来源的经修饰全长GH10木聚糖酶具有相同的木聚糖酶活性。另选地，与片段所来源的经修饰全长GH10木聚糖酶相比，片段可具有改进的活性(例如增强的特异性、比活性、pH或温度特征)。此外，片段必须保留经修饰的GH10木聚糖酶(它是该木聚糖酶的片段)的热稳定性能。

在一个实施方案中，片段为片段所来源的经修饰的GH10木聚糖酶的全长的至少60％。

在一个实施方案中，片段为片段所来源的经修饰的GH10木聚糖酶的全长的至少75％。

在一个实施方案中，片段为片段所来源的经修饰的GH10木聚糖酶的全长的至少85％。

在一个实施方案中，片段为片段所来源的经修饰的GH10木聚糖酶的全长的至少95％。

在一个实施方案中，片段为片段所来源的经修饰的GH10木聚糖酶的全长的至少98％。

在一个实施方案中，片段为一个或多个选自SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42或SEQ ID No.43的序列的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶例如GH10木聚糖酶(如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段a)包含本文示为SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42或SEQ ID No.43的氨基酸序列中的一者，或b)包含与本文示为SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42或SEQ ID No.43的氨基酸序列有至少96％、优选至少98.5％同一性的氨基酸序列，只要7、33、79、217和298位的氨基酸与SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42或SEQ ID No.43中所示的那些相同即可。

在一个实施方案中，本发明提供根据本发明的核酸分子或包含其的载体或构建体，其中核苷酸序列选自：SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；或与本文示为SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38的核苷酸序列有至少96％、优选98.5％同一性的核苷酸序列，只要编码成熟蛋白质的7、33、79、217和298位氨基酸的密码子与SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38的那些相同即可。

如本文所用，“修饰”意指改变或变更。具体地，如本文所用“修饰”意指从天然存在的情形变更。换句话讲，当修饰酶时，即会以一定方式改变酶，使得酶从亲本骨架酶变更。优选地，经修饰的酶本身不存在于自然界。因此，经修饰的酶是非天然存在的酶。

如本文所用，术语“经修饰的”意指例如从其天然存在的形式变更。根据本发明的经修饰的酶优选地不是天然存在的酶或天然存在的变体。换句话讲，根据本发明的经修饰的酶优选地为自然界中尚未发现的经修饰的酶。本发明的经修饰的酶优选地不会自发形成。

在一些实施方案中，具有木聚糖酶活性的酶，例如本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段通过对亲本酶或骨架酶进行修饰而制得。然而，在其它实施方案中，具有木聚糖酶活性的酶，例如本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰的GH10木聚糖酶)或其片段无需修饰亲本酶或骨架酶而制得，例如其可合成制得。如本文所用，术语“经修饰的木聚糖酶”或“经修饰的GH10木聚糖酶”不表示通过使亲本酶突变而制得木聚糖酶。经修饰的木聚糖酶可适当地通过其它方法例如合成来制备。

含木聚糖的材料

本发明中所用的木聚糖酶可用于降解任何含木聚糖的材料。术语“分解”或“降解”与水解同义。在一个实施方案中，含木聚糖的材料为任何包含阿糖基木聚糖的植物材料。

在一个实施方案中，木聚糖酶将含木聚糖的材料完全降解成其木糖组分单元。

在一个实施方案中，木聚糖酶将含木聚糖的材料部分地降解成木糖单糖单元和包含木糖单元的低聚糖和/或多糖的混合物。在本说明书中，术语“低聚糖”意指包含2至10个单糖单元的碳水化合物。在本说明书中，术语“多糖”意指包含多于10，例如10至100,000，例如50至50,000，例如100至10,000，例如950至2000个单糖单元的碳水化合物。

在另一个实施方案中，含木聚糖的材料可为谷类面粉(例如玉米面粉、小麦、燕麦、裸麦或大麦面粉)，尤其是玉米面粉。

剂量

木聚糖酶的剂量根椐所用酶的类型、蒸煮玉米产品的条件、存在的任何附加成分、以及预期产物而有所不同。以下所示的剂量是关于酶产物的。

通常，木聚糖酶剂量可为0.001至5mg/kg玉米面粉、优选0.01至2mg/kg玉米基面粉。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶A1时，木聚糖酶剂量通常为0.04至0.64mg/kg玉米基面粉、优选0.08至0.32mg/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶A1时，木聚糖酶剂量通常为0.08至1.28mg/kg玉米基面粉、优选0.16至0.64mg/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

当木聚糖酶为木聚糖酶A2(如本文定义)或木聚糖酶C时，典型和优选的剂量可如上文对木聚糖酶A1所详述的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶B时，木聚糖酶剂量通常为0.04至0.60mg/kg玉米基面粉、优选0.08至0.3mg/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶B时，木聚糖酶剂量通常为0.08至1.2mg/kg玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或玉米粉圆饼在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

通常，木聚糖酶剂量可为10至20000木聚糖酶活性单位(XU)，优选50至10000单位/kg玉米基面粉。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶A1时，木聚糖酶剂量通常为100至2000木聚糖酶活性单位(XU)，优选200至1000单位/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶A1时，木聚糖酶剂量通常为200至4000木聚糖酶活性单位(XU)，优选400至2000单位/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶B时，木聚糖酶剂量通常为200至3200木聚糖酶活性单位(XU)，优选400至1600单位/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶B时，木聚糖酶剂量通常为400至6400木聚糖酶活性单位(XU)，优选800至3200单位/kg玉米基面粉。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

木聚糖酶活性以在pH 5.0下用AZCL-阿糖基木聚糖(天青精交联的小麦阿拉伯木聚糖，Xylazyme片剂，Megazyme)作为底物测得的木聚糖酶单位(XU)表示。由内切-(1-4)-β-D-木聚糖酶(木聚糖酶)水解产生水溶性染色片段，并且释放这些的速度(在590nm处吸光度增大)可与酶活性正相关。在标准反应条件(40℃、McIlvaine缓冲液中5分钟反应时间、pH5.0)下，相对于酶标准品(Danisco木聚糖酶，购自DuPont Industrial Biosciences)来测定木聚糖酶单位(XU)。

标准酶的木聚糖酶活性测定为在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦-斯佩尔特小麦-木聚糖底物释放的还原糖端基的量。还原糖端基与3,5-二硝基水杨酸反应并且反应产物的形成可测为在540nm处吸光度的增大。酶活性相对于木糖标准曲线(还原糖当量)进行定量。一个木聚糖酶单位(XU)为在5.3和50℃下每分钟释放0.5μmol还原糖当量的标准酶的量。

水性胶体

在本发明的方法的一个优选的方面，除玉米基面粉与木聚糖酶的混合物之外，还存在水性胶体。通常，将水性胶体添加至干玉米面粉中。

在一个优选的方面，除木聚糖酶之外，本发明的面粉还包含水性胶体。

在一个优选的方面，本发明的湿润粉糊还包含水性胶体。

在一个优选的方面，本发明的湿润粉糊食品还包含水性胶体。

水性胶体优选地以按重量计0.01％至4％，优选0.2至2％，例如0.4至1.2％，尤其是按所述面粉的重量计0.5至1％的量存在。如在以上一般定义中所指出的，当术语“按所述面粉的重量计的％”定义水性胶体的量时，意指以g计的水性胶体的重量/100g面粉(即相对于面粉为100％)。

在一个实施方案中，水性胶体作为面粉的初始组分存在。在该实施方案中，水性胶体优选地以按重量计0.01％至4％，优选0.2至2％，例如0.4至1.2％，尤其是按所述面粉的重量计0.5至1％的量存在。

在一个实施方案中，将水性胶体添加至面粉中。在该实施方案中，水性胶体优选地以按重量计0.01％至4％，优选0.2至2％，例如0.4至1.2％，尤其是按所述面粉的重量计0.5至1％的量存在。

优选地，水性胶体选自羧甲基纤维素(CMC)、角叉菜胶、瓜尔胶、果胶以及它们的混合物。

更优选地，水性胶体为羧甲基纤维素(CMC)。羧甲基纤维素(CMC)或纤维素胶为带有结合到构成纤维素主链的吡喃葡萄糖单体的一部分羟基的羧甲基(-CH₂-COOH)的纤维素衍生物。

优选地，CMC的粘度为2000至10 000mPa.s，更优选5000-9000mPa.s。

优选地，CMC的取代度为0.5至1，更优选0.7至0.85。

在一个特别优选的实施方案中，水性胶体为GRINDSTED^TMCMC MASS 550。这可从DuPont Nutrition BioSciences ApS商购获得。

在一个实施方案中，羧甲基纤维素作为面粉的初始组分存在。在该实施方案中，羧甲基纤维素优选地以按重量计0.01％至4％，优选0.2至2％，例如0.4至1.2％，尤其是按所述面粉的重量计0.5至1％的量存在。

在一个实施方案中，将羧甲基纤维素添加至面粉中。在该实施方案中，羧甲基纤维素优选地以按重量计0.01％至4％，优选0.2至2％，例如0.4至1.2％，尤其是按所述面粉的重量计0.5至1％的量存在。

在一个实施方案中，木聚糖酶为木聚糖酶A1，木聚糖酶剂量通常为0.04至0.64mg/kg玉米基面粉、优选0.08至0.32mg/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或玉米粉圆饼在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，木聚糖酶为木聚糖酶A1，木聚糖酶剂量通常为0.08至1.28mg/kg玉米基面粉、优选0.16至0.64mg/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，木聚糖酶为木聚糖酶B，木聚糖酶剂量通常为0.08至1.2mg/kg玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，木聚糖酶为木聚糖酶B，木聚糖酶剂量为0.08至1.2mg/kg玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，木聚糖酶为木聚糖酶A1，木聚糖酶剂量通常为100至2000木聚糖酶活性单位(XU)，优选200至1000单位/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶A1时，木聚糖酶剂量通常为200至4000木聚糖酶活性单位(XU)，优选400至2000单位/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶B时，木聚糖酶剂量通常为这样的木聚糖酶剂量：200至3200木聚糖酶活性单位(XU)，优选400至1600单位/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在酸性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

在一个实施方案中，当木聚糖酶为木聚糖酶B时，木聚糖酶剂量通常为400至6400木聚糖酶活性单位(XU)，优选800至3200单位/kg玉米基面粉，并且水性胶体(优选羧甲基纤维素)以按面粉重量计0.2至2％，优选0.4至1％的量存在。当湿润粉糊和/或湿润粉糊食品(优选玉米粉圆饼)在碱性条件下制得时，此类剂量是特别优选的。

湿润粉糊产品

在一个实施方案中，使根据本发明的方法制得的玉米基面粉和/或玉米面粉与水混合以产生湿润粉糊(也称为湿润粉糊面团)。

然后可将湿润粉糊加工为各种湿润粉糊食品，其示例包括玉米粉圆饼、软玉米粉圆饼、玉米片、未经发酵的玉米片、玉米面豆卷壳、玉米薄片、包馅玉米团、以及它们的衍生物和混合物。在一个实施方案中，湿润粉糊食品是玉米粉圆饼。

在一个实施方案中，玉米是存在于湿润粉糊产品中的唯一谷物。

在另一个实施方案中，玉米作为谷物混合物的一部分存在于湿润粉糊产品中。在该实施方案中，玉米可包含至少10％的谷物混合物，诸如至少20％的谷物混合物、诸如至少30％的谷物混合物、诸如至少40％的谷物混合物、诸如至少50％的谷物混合物、诸如至少60％的谷物混合物、诸如至少10％的谷物混合物、诸如至少70％的谷物混合物、诸如至少80％的谷物混合物、诸如至少90％的谷物混合物、诸如至少95％的谷物混合物、诸如至少97％的谷物混合物、诸如至少99％的谷物混合物。在该实施方案中，其它谷物可为通常用作食物的任何谷物。其它谷物的示例包括小麦、裸麦、大麦和燕麦，尤其是小麦。

玉米基产品

在一些实施方案中，本发明的方法使用木聚糖酶(如本文定义)和水性胶体。虽然该方法可用于形成如本文所述的湿润粉糊产品，但是除湿润粉糊产品之外，该方法也可用于产生玉米基产品。

如本文所用，术语“玉米基产品”意指包含(或基本上由如下组成或由如下组成)玉米(玉蜀黍)种子或谷物或玉米粒副产品的植物组合物。

在一个实施方案中，玉米是存在于玉米基产品中的唯一谷物。

其它成分

用于本发明的木聚糖酶A1、A2和B和C(如本文定义)例如可与其它组分结合使用。

本发明的组合包含用于本发明的木聚糖酶A1、A2和B(如本文定义)和适于人类或动物食用且能够为食用者提供医学或生理学益处的另一组分。

用于本发明中的合适的额外酶可为选自如下的酶中的一者或多者：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣多糖酶(E.C.3.1.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常划分为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4,E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、其它木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。

在一个实施方案中，附加组分可为稳定剂或乳化剂或粘合剂或载体或赋形剂或稀释剂或崩解剂。

如本文所用的术语“稳定剂”定义为防止产品免于随时间推移而变化的成分或成分的组合。

本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分。

技术效应和惊人的发现

本发明人已惊奇地发现，将特定木聚糖酶(如下定义)引入玉米基面粉，可对该面粉进行加工以产生湿润粉糊产品(例如玉米粉圆饼)，该湿润粉糊产品与未使用此种酶制得的湿润粉糊产品相比表现出改善的特征例如质地、耐受性、可折叠性和粘性。

特别地，已发现，当将木聚糖酶A1(如上定义)尤其是以0.08至1.28mg/kg的玉米基面粉、优选0.16至0.64mg/kg玉米基面粉的浓度引入在碱性条件下制得的湿润粉糊时，这会使得湿润粉糊相较于没有此种酶的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的粘度。

还已发现，当将木聚糖酶A1(如上定义)尤其是以0.02至1.28mg/kg的玉米基面粉、优选0.04至0.64mg/kg玉米基面粉的浓度引入在酸性条件下制得的湿润粉糊时，这会使得湿润粉糊相较于没有此种酶的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的水分保持能力。

还已发现，当将木聚糖酶A1(如上定义)尤其是以0.08至1.28mg/kg的玉米基面粉、优选0.16至0.64mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入在碱性条件下制得的湿润粉糊时，这会使得湿润粉糊相较于具有相同CMC浓度但无此种酶的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的粘度。

还已发现，当将木聚糖酶A1(如上定义)尤其是以0.02至1.28mg/kg的玉米基面粉、优选0.04至0.64mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.01至4％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入在酸性条件下制得的湿润粉糊时，这会使得湿润粉糊相较于具有相同CMC浓度但无此种酶的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的水分保持能力。

还已发现，当将木聚糖酶A1(如上定义)尤其是以0.08至1.28mg/kg的玉米基面粉、优选0.16至0.64mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入在碱性条件下制得的玉米粉圆饼时，这会使得玉米粉圆饼相较于没有此种酶的玉米粉圆饼具有令人惊奇的改善的柔软性和耐受性。

还已发现，当将木聚糖酶B(如上定义)尤其是以0.08至1.2mg/kg的玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉的浓度引入在碱性条件下制得的湿润粉糊时，这会使得湿润粉糊相较于没有此种酶的湿润粉糊具有令人惊奇的改善的粘度。

还已发现，当将木聚糖酶B(如上定义)尤其是以0.08至1.2mg/kg的玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入在碱性条件下制得的湿润粉糊时，这使得湿润粉糊相较于具有相同CMC浓度但无此种酶的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的粘度。

还已发现，当将木聚糖酶B(如上定义)尤其是以0.04至1.2mg/kg的玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入在酸性条件下制得的湿润粉糊时，这会使得湿润粉糊产品相较于具有相同CMC浓度但无此种酶的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的粘度。

还已发现，当将木聚糖酶B(如上定义)尤其是以0.08至1.2mg/kg的玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入碱性玉米粉圆饼时，这会使得玉米粉圆饼相较于(a)具有相同CMC浓度但无酶或(b)具有相同CMC浓度但具有α-淀粉酶而非木聚糖酶B的湿润粉糊食品具有令人惊奇的改善的柔软性和耐受性。

还已发现，当将木聚糖酶A1(如上定义)尤其是以0.04至0.64mg/kg的玉米基面粉、优选0.08至0.32mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入碱性玉米粉圆饼时，这会使得玉米粉圆饼相较于具有相同CMC浓度但没有此种酶的玉米粉圆饼具有令人惊奇的改善的质地和耐受性。

还已发现，当将木聚糖酶B(如上定义)尤其是以0.08至1.2mg/kg的玉米基面粉、优选0.15至0.6mg/kg玉米基面粉的浓度与量为按面粉重量计0.2至2％、优选0.4至1％的羧甲基纤维素一起引入碱性玉米粉圆饼时，这会使得玉米粉圆饼相较于具有相同CMC浓度但没有此种酶的玉米粉圆饼具有令人惊奇的改善的质地和耐受性。

分离的

在一个方面，优选根据本发明的氨基酸序列、或核酸、或酶为分离的形式。术语“分离的”意指序列或酶或核酸至少实质上不含所述序列、酶或核酸在自然界中天然与之相关联或在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的序列、酶或核酸可以实质上不含所述物质可能原本与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。

纯化的

在一个方面，优选地根据本发明的序列、酶、或核酸为纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑总组合物以干重/干重计来测定的。

核苷酸序列

本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。

本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。

与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。

在一个优选的实施方案中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为了易于指代，我们应该称该优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且在可操作地连接至其天然与之相关联的整个启动子时的整个核苷酸序列，该启动子也处于其天然环境中。然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其与之天然结合的启动子的控制之下。

通常，由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术制备(即重组DNA)。然而，在本发明的另选实施方案中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成(参见Caruthers MH等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

核苷酸序列的制备

编码具有如本文所限定的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。

举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。另选地，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。

另选地，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段插入表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。

在又一个另选方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页所述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人，(1984)EMBO J.3，第801-805页所述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、复性、连接并克隆入适当的载体中。

核苷酸序列可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K等人，(Science(1988)239，第487-491页)中所述。

杂交

本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。

本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。

本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。

术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。

优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。

更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高度严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。

本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。

本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。

优选地，杂交在本文提出的整个序列上进行分析。

氨基酸序列

本发明的范围还涵盖具有如本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。

氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或其可通过合成制备或其可通过利用重组DNA技术制备。

优选地，当与本发明的本身范围有关或当由本发明的本身范围所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。

序列同一性或序列同源性

本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列(下文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。

该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。

在本说明书的语境中，在一些实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸或核苷酸序列，其可与主题序列有至少97.7％同一性、优选至少98或99％同一性。

在一些实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸或核苷酸序列，其可与主题序列有至少85％同一性、优选至少90或95％同一性。

通常，同源物将包含与例如主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

在一个实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸序列或核苷酸序列，其与主题序列相比有一个或数个添加、缺失和/或置换。

在本说明书的语境中，“主题序列”涉及根据本发明的核苷酸序列或多肽/氨基酸序列。

“亲本核酸”或“亲本氨基酸”分别意指编码亲本多肽或对亲本多肽进行编码的核酸序列或氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及具有本文所示氨基酸序列的蛋白质，或通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或数个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，例如10个或多于10个氨基酸。

适当地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上，优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上测定。

在一个实施方案中，本发明涉及一种核酸序列(或基因)，其编码具有本文所示氨基酸序列的蛋白质，或编码通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或数个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，例如10个或多于10个氨基酸。

在本说明书的语境中，在一个实施方案中，同源序列或外来序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少97.7％同一性，优选至少98或99％同一性。

在另一个实施方案中，同源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少85％同一性，优选至少90或95％同一性。

通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

同源性比较可通过眼来进行，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的同源性百分数或同一性百分数。

同源性百分数或同一性百分数可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位(ungapped)”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对短数目的残基范围内进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其未考虑到，例如在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分数或同一性百分数大为降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gapcost)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。

最大同源性百分数或同一性百分数的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI(英杰公司(InvitrogenCorp.))。可进行序列比较的软件的示例包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第4版—第18章)、BLAST 2(参见FEMSMicrobiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等人1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999年，第7-58页至7-60页)，例如GenomeQuest搜索工具(www.genomequest.com)。

尽管最终的同源性百分数或同一性百分数也可按同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无(all-or-nothing)的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。常用的这种矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(更多细节请参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用Vector NTI软件包的各默认值。

另选地，同源性百分数可用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多比对特征来计算，该特征基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1),237-244)的算法。

一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算同源性百分数，优选序列同一性百分数。该软件通常进行这种计算作为序列比较的一部分，并产生数值结果。

如果在测定序列同一性时使用空位罚分(Gap Penalties)，则优选地将如下参数用于成对比对：

对于BLAST
		空位开放(GAP OPEN)	9
空位延伸(GAP EXTENSION)	2

对于CLUSTAL	DNA	蛋白质
			权重矩阵	IUB	Gonnet 250
空位开放(GAP OPENING)	15	10
			空位延伸(GAP EXTEND)	6.66	0.1

在一个实施方案中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。

适当地，关于核苷酸序列或蛋白质序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少30个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少40个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少50个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少60个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少100个连续核苷酸/氨基酸上测定。

适当地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上，优选在至少200个连续核苷酸上，优选在至少300个连续核苷酸上，优选在至少400个连续核苷酸上，优选在至少500个连续核苷酸上，优选在至少600个连续核苷酸上，优选在至少700个连续核苷酸上，优选在至少800个连续核苷酸上测定。

适当地，关于核苷酸序列的同一性程度可在本文提出的整个序列上测定。

适当地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度是在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上测定。

适当地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文提出的整个序列上测定。

在本说明书的语境中，术语“查询序列”意指同源序列或外来序列，将其与主题序列进行比对，以观察主题序列是否落入本发明的范围内。因此，此类查询序列可例如为现有技术序列或第三方序列。

在一个优选的实施方案中，通过全局比对程序对序列进行比对，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以主题序列的长度而计算得到。

在一个实施方案中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，将所述两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以主题序列的长度。

在另一个优选的实施方案中，全局比对程序选自CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以主题序列的长度而计算得到。

序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，所述缺失、插入或置换导致功能等同的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

可以例如根据下表进行保守置换。第二列中同一区组内的氨基酸，优选第三列中同一行内的氨基酸可以彼此置换：

本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指现有的氨基酸残基与另选的残基的交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或另选地涉及到加入非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。

还可以用非天然氨基酸进行置换，包括：α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物(如三氟酪氨酸*、对氯苯丙氨酸*、对溴苯丙氨酸*、对碘苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸^#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸^#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*)、L-Phe(4-氨基)^#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。为了上面论述的目的(与同源性或非同源性置换相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。

变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。

适当地，可存在至少2个保守置换，诸如至少3个或至少4个或至少5个。

适当地，可存在少于15个保守置换，例如少于12个、少于10个、或少于8个或少于5个。

用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。

不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且这种同源物及其片段一般将能够选择性杂交至本文所列序列中所示的序列。这种序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。

变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。

简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格性条件低的严格性条件下使用。

另选地，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是期望的以便引入限制性酶识别位点，或以改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、另选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealinglabel)的探针)，或可将多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，诸如至少25、30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。

根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。

通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需的核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域轻易获得的。

较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。

氨基酸编号

在本发明中，可采用用于本发明的木聚糖酶中氨基酸残基位置的特定编号。通过将样品木聚糖酶的氨基酸序列与本发明的木聚糖酶(具体地为SEQ ID No.3)进行比对，可以将编号分配给所述样品木聚糖酶中的氨基酸残基位置，其对应于本发明的SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的氨基酸残基位置或编号。

宿主细胞

与本发明有关的术语“宿主细胞”包括包含所述核苷酸序列或上述表达载体并用于重组产生具有本文所限定的特定性质的蛋白质的任何细胞。

在一个实施方案中，生物体是表达宿主。

因而，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。细胞将选择为与所述载体相容，并且可以例如是原核(例如细菌)、真菌或酵母细胞。

合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌物种。

在一个实施方案中，本文提出的木聚糖酶表达于表达宿主里氏木霉(Trichodermareesei)中。

在一些实施方案中，本文提出的木聚糖酶的表达宿主可为以下真菌表达宿主中的一种或多种：镰孢属物种(如尖孢镰孢菌)；曲霉属(Aspergillus)物种(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、或泡盛曲霉(A.awamori))或木霉属(Trichoderma)物种(例如里氏木霉)。

在一些实施方案中，表达宿主可为以下细菌表达宿主中的一种或多种：链霉菌属(Streptomyces)物种或芽孢杆菌属(Bacillus)物种(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))。

合适宿主细胞例如酵母和真菌宿主细胞的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。

生物体

与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子可允许在存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。

在一个实施方案中，生物体是表达宿主。

合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。

与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。

术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。

因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。

例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。

宿主细胞/生物体的转化

如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。适宜的原核宿主的示例包括大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces)物种和芽孢杆菌属物种例如枯草芽孢杆菌。

有关原核生物宿主的转化的教导在本领域的文献中有充分记载，例如参见Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，1989,Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。

可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉菌作为宿主微生物在EP 0238 023中进行了描述。

原核生物、真菌和酵母的转化对本领域的技术人员而言是公知的。

宿主生物体可以是真菌例如霉菌。合适的此类宿主的示例包括属于以下各属的任何成员：木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉)、嗜热真菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、镰孢属、曲霉属、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)等。

在一个实施方案中，宿主生物体可以是真菌。在一个优选的实施方案中，宿主生物体属于木霉属例如里氏木霉。

培养和生产

使用用于本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。

用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。

由重组细胞产生的蛋白质可展示在细胞的表面。

蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。

分泌

通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的该方面。

一般的重组DNA方法技术

除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域一般技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版，第1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology,ch.9,13,and16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press；以及D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure PartA:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,AcademicPress。这些一般性文本中的每一个以引用方式并入本文。

实施例

实施例1—轮枝样镰孢菌木聚糖酶(FveXyn4)(木聚糖酶A1)的克隆

分离自轮枝样镰孢菌的菌株的基因组DNA用于扩增木聚糖酶基因。所克隆的基因(称为FveXyn4基因)的序列在SEQ ID No.4中示出。由FveXyn4基因编码的蛋白质在SEQ IDNo.1中示出。基于PFAM搜索(http://pfam.sanger.ac.uk/)，基因FveXyn4的蛋白质产物属于糖基水解酶家族10(GH10)。在N末端，FveXyn4蛋白质具有由SignalP-NN预测的15个氨基酸信号肽(Emanuelsson等人，Nature Protocols,2:953-971,2007)。这表明FveXyn4为分泌的糖基水解酶。

实施例2—FveXyn4蛋白质(木聚糖酶A1)的表达

FveXyn4基因采用以下引物由轮枝样镰孢菌的基因组DNA扩增：引物15’-caccATGAAGCTGTCTTCTTTCCTCTA-3’(SEQ ID No.23)，和引物25’-TTTTTAGCGGAGAGCGTTGACAACAGC-3’(SEQ ID No.24)。将PCR产物克隆到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen K2400)中，以产生FveXyn4pEntry质粒。表达质粒pZZH254通过使用LRII酶试剂盒(Invitrogen 11791)在FveXyn4pEntry质粒和pTrex3gM表达载体(在US 2011/0136197A1中有所描述)之间发生Gateway克隆反应获得。质粒pZZH254的图谱提供为图10A。FveXyn4基因的序列通过DNA测序(SEQ ID No.4)加以证实。采用基因枪方法(Te'o VS等人，J Microbiol Methods,51:393-9,2002)将质粒pZZH254转化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO 05/001036中有所描述)。

在证实序列后，使用PEG原生质体方法(Penttila等人，Gene,61:155-164,1987)用表达质粒pZZH254转化四重缺失的里氏木霉菌株(在WO05/001036中有所描述)的原生质体。对于原生质体制备，在24℃下使孢子在木霉属基本培养基MM(20g/L葡萄糖、15g/L KH₂PO₄、pH 4.5、5g/L(NH₄)2SO₄、0.6g/L MgSO₄×7H₂O、0.6g/L CaCl₂×2H₂O、1ml的1000X里氏木霉痕量元素溶液(175g/L无水柠檬酸、200g/L FeSO₄×7H₂O、16g/L ZnSO₄×7H₂O、3.2g/L CuSO₄、1.4g/L MnSO₄×H₂O和0.8g/L硼酸)中生长约10小时。通过离心收获得到发芽孢子并在30℃和100rpm下用30mg/mL Vinoflow FCE(Novozymes,AG Switzerland)溶液处理7小时至过夜以裂解真菌细胞壁。在包含0.6M山梨醇的0.1M Tris HCl缓冲液(pH 7)中洗涤原生质体并使其重悬于包含1.2M山梨醇和10mM氯化钙的10mM Tris HCl缓冲液(pH 7.5)中。对于PEG转化，约1μg的DNA和1-5×10⁷原生质体(总体积为200μl)用2ml的25％PEG溶液处理，用2倍体积的1.2M山梨醇/10mM Tris、pH 7.5/10mM CaCl₂溶液稀释。在包含乙酰胺(作为唯一氮源)的培养基(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；氯化钙二水合物0.6g/L；硫酸亚铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)上选择转化体。在约1周内出现转化的菌落(约50-100个)。在乙酰胺平板上生长之后，收集孢子并在乙酰胺平板上重新选择。在5天后，使用10％甘油收集孢子，并将1×10⁸个孢子接种于具有30ml葡萄糖/槐糖确定成分培养基(用于蛋白质表达)的250ml摇瓶中。蛋白质表达通过SDS-PAGE加以证实。在7L发酵罐中，使孢子悬浮液随后在包含60％葡萄糖-槐糖补料的确定成分培养基中生长。葡萄糖/槐糖确定成分培养基(每升)由以下组成：(NH₄)₂SO₄5g、PIPPS缓冲液33g、酪蛋白氨基酸9g、KH₂PO₄4.5g、CaCl₂(无水)1g、MgSO₄.7H₂O 1g，用50％NaOH将pH调节至5.5，Milli-Q H₂O补至966.5mL。在灭菌后，添加以下物质：26mL 60％葡萄糖/槐糖，以及2.5mL 400X里氏木霉痕量金属。

采用两个色谱柱从7L发酵罐培养物的浓缩发酵液中纯化FveXyn4。将在包含1M硫酸铵的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中缓冲的浓缩发酵液装载到疏水相互作用色谱柱上(Sepharose Phenyl FF,26/10)。采用平衡/洗涤缓冲液到20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)的线性梯度从柱洗脱出蛋白质。将包含FveXyn4蛋白质的级分装载到凝胶过滤柱(HiLoadSuperdex 75pg26/60)上，并且所用流动相为包含0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)。使用3K Amicon Ultra-15装置浓缩经纯化的蛋白质，并且将经浓缩蛋白级分处理为粉末(如所述用于进一步研究中)。

来自于表达质粒pZZH254的FveXyn4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。信号序列以粗体(大写体)示出，并且推测内含子以粗体和小写体示出。

由质粒pZZH254表达的FveXyn4蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。由SignalP-NN软件预测的信号序列以下划线表示。这是前蛋白原。

所预测的成熟形式的FveXyn4蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。这是酶的活性形式。SEQ ID No.2示出蛋白原，即在翻译后修饰之前。根据宿主的不同，翻译后修饰可有所差异，因此本发明还涵盖SEQ ID No.2的成熟的活性形式。

实施例3—FveXyn4(木聚糖酶A1)的木聚糖酶活性

FveXyn4属于糖基水解酶10家族(GH10，CAZy编号)。采用得自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或得自小麦面粉的1％阿糖基木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物来测定FveXyn4的β-1-4木聚糖酶活性。在50℃下，测定在50mM柠檬酸钠(pH 5.3)、0.005％吐温-80缓冲液中进行10分钟。

释放的还原糖通过与3,5-二硝基水杨酸反应并测量540nm处的吸光度来定量。酶活性相对于木糖标准曲线来定量。在该测定中，一个木聚糖酶单位(XU)定义为在测定条件下每分钟产生1微摩尔的木糖还原糖当量所需的酶量。

实施例4：尖孢镰孢菌木聚糖酶FoxXyn2(木聚糖酶A2)的克隆

分离自尖孢镰孢菌的FoxXyn2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11、12和13所示。推测的内含子以斜体和小写体示为SEQ ID No.11(图11)。

FoxXyn2前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.7(图8)所示。预测的信号序列以斜体和小写体示出。

所预测的成熟形式的FoxXyn2的氨基酸序列如SEQ ID No.7和8(示于图8A和10中)所示。SEQ ID No.8示出在蛋白质的完全成熟之前可裂解的多肽部分。蛋白质的活性形式可具有或不具有该部分，并因此活性蛋白质可具有SEQ ID No.8或SEQ ID No.9。

FoxXyn2基因的蛋白质产物属于糖基水解酶家族10。这表明FoxXyn2为分泌的糖基水解酶。

实施例5—FoxXyn2蛋白质(木聚糖酶A2)的表达

FoxXyn2基因采用以下引物由尖孢镰孢菌的基因组DNA扩增：引物15’-ccgcggccgcaccATGAAGCTGTCTTCCTTCCTCTACACC-3’(SEQ ID NO:25)，和引物25’-ccggcgcgcccttaTTAGCGGAGAGCGTTGACAACAG-3’(SEQ ID NO:26)。在用Not I和Asc I消化之后，将PCR产物克隆到经相同限制性酶消化的pTrex3gM表达载体(在US 2011/0136197A1中有所描述)中，并将所得质粒标记为pZZH135。pZZH135的质粒图谱提供于图14中。FoxXyn2基因的序列通过DNA测序加以证实。

采用基因枪方法(在Te'o VS等人，J Microbiol Methods,51:393-9,2002中提出)将质粒pZZH135转化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO05/001036中有所描述，以引用方式并入本文)。使用在过滤后从培养上清液分离的蛋白质来进行SDS-PAGE分析和木聚糖酶活性测定以确认酶表达。

来自于表达质粒pZZH135的FoxXyn2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11(图25)所示。信号序列以粗体示出，并且推测的内含子以斜体和小写体示出。

由质粒pZZH135表达的FoxXyn2蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.7(图10)所示。信号序列以斜体示出。成熟形式的FoxXyn2蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.8(图16)所示。

使用亲和层析树脂Blue Sepharose 6FF从培养上清液中纯化FoxXyn2蛋白质，并且使用样品进行生物化学表征，如在随后实施例中所述。

实施例6—FoxXyn2(木聚糖酶A2)的木聚糖酶活性

FoxXyn2属于糖基水解酶10家族(GH10，CAZy编号)。使用得自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或得自小麦面粉的1％阿糖基木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物来测定FoxXyn2的β-1-4木聚糖酶活性。在50℃下，测定在50mM柠檬酸钠(pH 5.3)、0.005％吐温-80缓冲液中进行10分钟。

实施例7—棒曲霉木聚糖酶AclXyn5(木聚糖酶B)的克隆

棒曲霉的整个基因组序列数据可在线获得(http://www.broadinstitute.org/ annotation/genome/aspergillus_group/GeneDeta ils.html？sp＝S7000001156845959)，棒曲霉中所鉴别出的一个基因(ACLA_063140)编码与各种其它真菌的木聚糖酶有同源性的糖基水解酶，如由BLAST搜索(Altschul等人，J Mol Biol,215:403–410,1990)所确定。该基因(称为AclXyn5基因)的核苷酸序列表示为SEQ ID No.20。由AclXyn5基因编码的蛋白质表示为SEQ ID No.17，并且得到Uniprot数据库的登录号A1CCU0。棒曲霉的基因组DNA用于扩增AclXyn5基因以表达。基于PFAM搜索(http://pfam.sanger.ac.uk/)，AclXyn5基因的蛋白质产物属于糖基水解酶家族11。在N末端，AclXyn5蛋白质具有由SignalP-NN预测的18个氨基酸信号肽(Emanuelsson等人，Nature Protocols,2:953-971,2007)。这表明AclXyn5为分泌的糖基水解酶。

实施例8—AclXyn5蛋白质(木聚糖酶B)的表达

AclXyn5基因采用以下引物由棒曲霉的基因组DNA扩增：引物1(Not I)5’-ccgcggccgcaccATGGTGTCGTTCAAGTATCTTTTCCT-3’(SEQ ID NO:27)，和引物2(Asc I)5’-ccggcgcgcccttaTTAATAGACAGTAATGGAGGAGGAAC-3’(SEQ ID NO:28)。在用Not I和Asc I酶消化之后，将PCR产物克隆到经相同限制性酶消化的pTrex3gM表达载体(在US 2011/0136197A1中有所描述)中，并且所得质粒表示为pZZH159。质粒pZZH159的图谱提供于图24中。AclXyn5基因的序列通过DNA测序加以证实。采用基因枪方法(Te'o VS等人，JMicrobiolMethods,51:393-9,2002)将质粒pZZH159转化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO 05/001036中有所描述)。

在证实序列后，采用PEG原生质体方法(Penttila等人，Gene,61:155-164,1987)使用表达质粒pZZH159转化四重缺失的里氏木霉菌株(在WO05/001036中有所描述)的原生质体。对于原生质体制备，在24℃下使孢子在木霉属基本培养基MM(20g/L葡萄糖、15g/LKH₂PO₄、pH 4.5、5g/L(NH₄)2SO₄、0.6g/L MgSO₄×7H₂O、0.6g/L CaCl₂×2H₂O、1ml的1000X里氏木霉痕量元素溶液(175g/L无水柠檬酸、200g/L FeSO₄×7H₂O、16g/L ZnSO₄×7H₂O、3.2g/LCuSO₄、1.4g/L MnSO₄×H₂O和0.8g/L硼酸)中生长约10小时。通过离心收获得到发芽孢子并在30℃和100rpm下用30mg/mL Vinoflow FCE(Novozymes,AG Switzerland)溶液处理7小时至过夜以裂解真菌细胞壁。在包含0.6M山梨醇的0.1M Tris HCl缓冲液(pH 7)中洗涤原生质体并使其重悬于包含1.2M山梨醇和10mM氯化钙的10mM Tris HCl缓冲液(pH 7.5)中。对于PEG转化，约1μg的DNA和1-5×10⁷原生质体(总体积为200μl)用2ml的25％PEG溶液处理，用2倍体积的1.2M山梨醇/10mM Tris、pH 7.5/10mM CaCl₂溶液稀释。

在包含乙酰胺(作为唯一氮源)的培养基(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；氯化钙二水合物0.6g/L；硫酸亚铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)上选择转化体。在约1周内出现转化的菌落(约50-100个)。在乙酰胺平板上生长之后，收集孢子并在乙酰胺平板上重新选择。在5天后，使用10％甘油收集孢子，并将1×10⁸个孢子接种于具有30ml葡萄糖/槐糖确定成分培养基(用于蛋白质表达)的250ml摇瓶中。蛋白质表达通过SDS-PAGE加以证实。在7L发酵罐中，使孢子悬浮液随后在包含60％葡萄糖-槐糖补料的确定成分培养基中生长。葡萄糖/槐糖确定成分培养基(每升)由以下组成：(NH₄)2SO₄5g、PIPPS缓冲液33g、酪蛋白氨基酸9g、KH₂PO₄4.5g、CaCl₂(无水)1g、MgSO₄.7H₂O 1g，用50％NaOH将pH调节至5.5，Milli-Q H₂O补至966.5mL。在灭菌后，添加以下物质：26mL 60％葡萄糖/槐糖，以及2.5mL400X里氏木霉痕量金属。

采用两个色谱柱从浓缩的7L发酵罐培养上清液中纯化AclXyn5蛋白质。将在包含1M硫酸铵的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中缓冲的浓缩培养上清液装载到疏水相互作用色谱柱上(Sepharose Butyl FF,XK 26/10)。采用平衡/洗涤缓冲液到20mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)的线性梯度从柱洗脱出蛋白质。将包含AclXyn5蛋白质的级分装载到凝胶过滤柱(HiLoad Superdex 75pg 26/60)上，并且所用流动相为包含0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)。使用3K Amicon Ultra-15装置浓缩经纯化的蛋白质，并且使经浓缩蛋白级分用于进一步研究。

来自于表达质粒pZZH159的AclXyn5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。信号序列以粗体示出，并且推测的内含子以斜体和小写体示出。

由质粒pZZH159表达的AclXyn5蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。由SignalP-NN软件预测的信号序列以斜体表示。如SignalP-NN软件所预测的成熟形式的AclXyn5蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。进一步加工的成熟形式的AclXyn5蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，其可源自翻译后加工，例如KexII N-末端加工。

实施例9—AclXyn5(木聚糖酶B)的木聚糖酶活性

AclXyn5属于糖基水解酶家族11(基于CAZy编号系统)。使用得自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或得自小麦面粉的1％阿糖基木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物来测定AclXyn5的β-1-4木聚糖酶活性。在50℃下，测定在50mM柠檬酸钠(pH 5.3)、0.005％吐温-80缓冲液中进行10分钟。

实施例10—制备玉米基食品的方法

用于该研究并代表最常用于墨西哥的玉米面粉玉米粉圆饼配方和加工参数如下：碱性pH条件示于表1并且酸性pH条件示于表2。

表1

表2

加工条件(使用相同的加工条件来获得酸性和碱性玉米面粉玉米粉圆饼两者)

1)称取所有干燥成分

2)在使用桨叶的N-150Hobart混合器中，将液体成分添加至干燥成分中，同时在第一速度下混合一分钟。

3)刮擦转筒和桨叶并在第二速度下继续再混合2分钟。

4)使生面团在环境温度(约27℃)下静置12分钟

5)通过玉米粉圆饼机器“Superior Food Machinery Model CFO 440”加工玉米生面团

6)生玉米粉圆饼重量为26g，直径为14.5cm；在246℃下烘焙50秒的时间。

将成品玉米粉圆饼叠堆成每叠10个玉米粉圆饼，并且封装入塑料袋中。使玉米粉圆饼包装件在储存期内于环境温度(27℃)下储存。

将木聚糖酶与其它干燥成分以如下实施例11所述制得的粉末一起引入玉米面粉中，剂量如下：

A)木聚糖酶A1为0.08、0.16和0.32mg/kg玉米面粉

B)木聚糖酶B为0.075、0.15和0.30mg/kg玉米面粉

因为CMC(羧甲基纤维素)常用于墨西哥玉米面粉玉米粉圆饼制备，将以上剂量的每种酶单独地以及与按玉米面粉重量计0.50％的GRINDSTED CMC MAS 550(高粘度羧甲基纤维素，商购自DuPont)结合测试。

将两种木聚糖酶的性能与均用于玉米面粉玉米粉圆饼应用的DuPont商用共混物即GRINDSTED FSB 700(包含α淀粉酶和水性胶体的共混物)以及POWERFlex 2205(包含α淀粉酶和水性胶体的共混物)(可从DuPont商购获得)的性能进行比较，将两者单独地以及与按玉米面粉重量计0.50％GRINDSTED CMC MAS 550结合测试。

实施例11-木聚糖酶粉末的制备

通过将高浓度的液体酶喷涂到由细磨小麦组成的载体上来制备干产物。用干蒸汽热处理磨碎小麦材料至达到103℃的温度30秒，从而增强吸水率。在混合小麦载体期间采用蠕动泵施用30-35％(w/w)液体。在施用液体后，将材料铺在盘上并在40℃下于循环空气中干燥10小时。在研磨机上研磨干燥材料，以产生200-1000μm的粒度。

实施例12—玉米湿润粉糊的粘度评估

为了测量制备的玉米湿润粉糊的粘度，通过在高速混合器中将150克的玉米湿润粉糊(来自碱性和酸性pH条件两者)与150克的蒸馏水混合来制备“浆液”。在30rpm下使用带有心轴4的Brookfield LV粘度计测量浆液的粘度30秒。

对于碱性pH，结果示于表3和图25，并且对于酸性pH，示于表4和图26。在各个情况下，量以按玉米面粉重量计的％或ppm表示。在所有这些实施例中，术语“ppm”与“mg/kg面粉”同义。

表3

表4

其中测量通过将150克的玉米湿润粉糊(来自碱性和酸性pH条件两者)与150克的蒸馏水混合制备的“浆液”的粘度的结果示出于表3和4，其显示出与对照和仅具有GRINDSTED CMC MAS 550相比，玉米湿润粉糊中0.3ppm木聚糖酶B+0.5％GRINDSTED CMCMAS 550的组合以及0.32ppm木聚糖酶A1+0.5％GRINDSTED CMC MAS 550的组合显著增大了浆液的粘度。此外，在碱性条件下添加0.32ppm的木聚糖酶A1和0.3ppm木聚糖酶B相对于对照粘度增大。与通过添加0.32ppm木聚糖酶A1自身或与0.50％GRINDSTED CMC结合或通过将0.50％GRINDSTED CMC MAS 550单独地添加至玉米湿润粉糊中产生的粘度相比，玉米湿润粉糊中0.3ppm的木聚糖酶B+0.50％GRINDSTED CMC MAS 550的组合显著增大了浆液的粘度。

实施例13—柔软性测试

玉米粉圆饼如上所述制备。用如表5(碱性pH)和6(酸性pH)指出的混合物制备在碱性pH和酸性pH条件下制备的玉米粉圆饼。量表示为相对于100重量％玉米面粉的重量％，或ppm(＝mg/kg玉米面粉)。

表5

表6

根据下面的过程，在制备后第10天拍摄示出各个所测变量下玉米粉圆饼的可折叠性的照片：

当冷却时将玉米粉圆饼对折并将100g的砝码放置于玉米粉圆饼顶部30秒，然后拍摄照片。

结果在其中混合物如表5所指出的图27(碱性pH)，以及其中混合物如表6所指出的图28(酸性pH)中示出。

图27和28所示的结果示出在进行以上过程之后，显示在其10天储存寿命后，0.3ppm的木聚糖酶B+0.50％GRINDSTED CMC MASS 550的组合相较于在碱性条件(图27)下测试的任何其它变量会制得更具柔性和耐受性的玉米粉圆饼，并且0.16ppm的木聚糖酶A1+0.50％GRINDSTED CMC MAS 550的组合相较于在酸性条件(图28)下测试的任何其它变量会制得更具柔性和耐受性的玉米粉圆饼。

除以上之外，与任何其它所测的变量(包括GRINDSTED FSB 700和POWERFlex2205)相比，具有木聚糖酶A1或B两者的玉米粉圆饼的表面质地的触感显著更加柔软。

实施例14——感官评价数据

根据下面的过程，如下表7所示制备玉米面粉玉米粉圆饼：

1)称取所有干燥成分

2)在使用桨叶的N-50Hobart混合器中，将液体成分添加至干燥成分中，同时在第一速度下混合一分钟。

3)在第二速度下继续再混合2分钟。

4)使生面团在环境温度(约27℃)下静置12分钟

在表7中，量表示为相对于100重量％的玉米的按重量计的％或ppm。

表7

根据以下过程，在1天储存期后测试样品1、2和3的耐受性以及样品4、5和6的质地：

耐受性(玉米粉圆饼能耐受激烈处理的程度)——从包装件中取出玉米粉圆饼；然后将其置于手上面并通过将手握成拳头来挤压，在此之后，打开手并观察玉米粉圆饼破碎程度。耐受性按照1(完全没有耐受性—玉米粉圆饼完全破碎)至9(极具耐受性—玉米粉圆饼维持形状)的优选尺度进行评估。

质地(玉米粉圆饼触感柔软程度)—：从包装件中取出玉米粉圆饼；然后，用手指接触其来感觉玉米粉圆饼的表面，根据范围为1(极粗糙和硬)至9(极柔软光滑)的优选尺度来记录质地。

结果在下表8和9中示出。

样品	1	2	3
				木聚糖酶	对照	木聚糖酶B	木聚糖酶A1
耐受性平均分值	2.3	4.4	3.9

表8

表8的结果示出包含木聚糖酶B的样品2和包含木聚糖酶A1的样品3两者均比样品1(对照)显著更具耐受性。

样品	4	5	6
				木聚糖酶	对照	木聚糖酶B	木聚糖酶A1
质地平均分值	4.1	5.5	6.5

表9

表9的结果示出包含木聚糖酶B的样品5和包含木聚糖酶A1的样品6两者均比样品4(对照)显著更柔软。

实施例15—质地和柔软性测试

玉米面粉玉米粉圆饼如下制备：

玉米面粉玉米粉圆饼的配方和加工条件如下：

成分％(基于100％玉米面粉)

商业GRUMA玉米面粉，其具有0.50％的纤维素胶100.00％

水(在15℃下)114.00％

氢氧化钙(溶液，10％w/v，即90ml水中有10g氢氧化钙)16.00％

盐0.55％

木聚糖酶A1和木聚糖酶B按照下面剂量添加：

1)木聚糖酶A1为0.16mg/kg玉米面粉

2)木聚糖酶B为0.15mg/kg玉米面粉

方法：

1)称取所有干燥成分

3)刮擦转筒和桨叶并在第二速度下继续再混合2分钟。

4)使生面团在环境温度(约27℃)下静置12分钟

6)生玉米粉圆饼重量为26g，直径为5.8英寸；在246℃下烘焙50秒的时间

将木聚糖酶A1和B的性能与剂量为0.375％的GRINDSTED FSB 700(用于玉米面粉玉米粉圆饼应用的成分的实际共混物)进行比较；与GRINDSTED FSB 700相比，在环境温度下储存的20天储存期内木聚糖酶A1和B两者均为玉米粉圆饼提供改善的柔软性和改善的耐受性；具有木聚糖酶A1和B两者的玉米粉圆饼的表面质地更柔软，比具有GRINDSTED FSB700的玉米粉圆饼具有更加“柔软光滑的质地”，它们是玉米面粉玉米粉圆饼的积极属性。

如在结果中所见，极积极的属性在于：木聚糖酶A1和木聚糖酶B两者(但尤其是木聚糖酶B)在10至11的pH之间示出良好的性能，该pH是用“经蒸煮浸泡的”玉米(经氢氧化钙处理)制备玉米粉圆饼的pH。产于墨西哥的大部分玉米粉圆饼来自经蒸煮浸泡的玉米。

实施例16—热稳定的木聚糖酶(木聚糖酶C)的制备

材料和方法

质粒和文库构建

对于来自丝状真菌轮枝样镰孢菌的木聚糖酶4(家族GH10)FveXyn4，包含编码区的DNA序列采用经attB1和attB2位点延伸的基因特异性引物由基因组DNA扩增，以使得BP重组克隆到pDonor221载体(Invitrogen,USA)中。厂商BaseClear(Netherlands)和Geneart GmH(Germany)将如图20所示的pEntry-FveXyn4质粒用作模板来构建组合库。

FveXyn4的变体作为组合库或通过引入特异性突变而产生，并且被设计成包括不同数目和组合的表1所示突变。变体A、B、C、D、E包括在这些变体中。

组合变体采用目的载体pTTTpyr2(图33)经由重组技术(Invitrogen,USA)产生。所得的表达具有不同突变的Xyn4的表达质粒pTTTpyr2-FveXyn4_VAR在大肠杆菌DH5a菌株中进行扩增，纯化，测序，独立排列在96MTP中并用于如进一步描述的真菌转化。表达载体包含允许目标基因的强诱导型表达的里氏木霉cbhI启动子和终止子区，使得转化体在基本培养基(具有乙酰胺且无尿苷)上生长的构巢曲霉amdS和里氏木霉pyr2选择性标记物。质粒由于里氏木霉衍生的端粒区而自主维持于真菌细胞中。复制质粒的使用导致转化的频率增大并避开了在整合性真菌转化中观察到的基因座依赖性表达问题。

经由从头基因合成(GeneArt GmbH,Germany)将特异性突变引入轮枝样镰孢菌木聚糖酶Xyn4的基因组序列。然后厂商经由Gateway重组技术(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将合成变体克隆到目的载体pTTT-pyr2中。

真菌菌株、生长培养基和转化

使用PEG-原生质体方法使表达质粒(5-10μl)转化到缺失主要纤维素酶和木聚糖酶2的里氏木霉菌株中(Δcbh1Δcbh2Δegl1Δegl2Δegl3Δegl4Δegl5Δegl6Δbgl1Δman1Δxyn2Prdiv:iRNAxyn1xyn3:amdS pyr2-)。通过向宿主菌株基因组中引入iRNA干扰盒达到同时关闭xyn1和xyn3表达的目的，从而进一步实现内源性木聚糖酶1和3背景的额外下调。所有高通量转化使用Biomek机械手(Beckman Coulter,USA)在24孔MTP形式中机器人式进行。具有变体的质粒接收自厂商，这些质粒根据预定布局排列于96孔微量滴定板中。包含约1μg的DNA和5×10⁶原生质体(总体积为50μl)的转化混合物用200μl的25％PEG溶液处理，用1倍体积的1.2M山梨醇/10mM Tris、pH7.5/10mM CaCl₂溶液稀释，使其自动化重新布置到24孔MTP中并与包含1M山梨醇和10mM NH₄Cl的1ml的3％琼脂糖基本培养基混合。在转化体生长后，将来自每孔的孢子合并，并补加在含基本培养基的新鲜24孔MTP上，其中基本培养基包含乙酰胺以施加额外的选择压力。形成孢子后，收集孢子并用于在24孔MTP格式或摇瓶中的以下生产培养基中接种液体培养物：37g/L葡萄糖、1g/L槐糖、9g/L酪蛋白氨基酸、10g/L(NH₄)₂SO₄、5g/L KH₂PO₄、1g/L CaCl₂x2H₂O、1g/L MgSO₄×7H₂O、33g/L 1,4-哌嗪双(丙磺酸)(pH 5.5)、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4×7H₂O、16g/LZnSO₄×7H₂O、3.2g/L CuSO₄×5H₂O、1.4g/L MnSO₄×H₂O、0.8g/L硼酸)。添加1ml的生产培养基以在24孔MTP中产生变体。对于摇瓶，体积按比例增大。

在200rpm摇动下，将板在28℃和80％湿度下培养6天。培养上清液通过真空过滤收获得到并用于测定其性能以及表达水平。

对于较大规模生产，发酵在6升的耐高压持续搅拌反应器中进行。用孢子接种摇瓶并在摇动下于28℃温育3天，摇瓶培养基如下：5g/L(NH₄)₂SO₄、4.5g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄×7H₂O、14.4g/L柠檬酸×1H₂O、1g/L CaCl₂×2H₂O、27.5g/L葡萄糖、1滴消泡剂(EROL DF6000K)。用NaOH(2M)将pH调节至5.5并在122℃下将培养基高压消毒20分钟。在冷却后，添加2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO₄×7H₂O、16g/L ZnSO₄×7H₂O、3.2g/L CuSO₄×5H₂O、1.4g/L MnSO₄×H₂O、0.8g/L硼酸)。使用得自摇瓶的细胞来接种包含以下生物反应器培养基的生物反应器：4.7g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄×7H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄、45g/L葡萄糖、0.7g/L CaCl₂×2H₂O、0.3g/L消泡剂(EROL DF6000K)、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO₄×7H₂O、16g/L ZnSO₄×7H₂O、3.2g/LCuSO₄×5H₂O、1.4g/L MnSO₄×H₂O、0.8g/L硼酸)。将温度控制于34℃；通过添加20％氢氧化铵来连续控制pH。通过改变搅动速度来使溶解的氧气控制为最低40％饱和度。测定废气二氧化碳和氧气含量。当初始葡萄糖耗尽时，开始葡萄糖/槐糖的定量给料。与此同时，降低温度至并控制于28℃，增大pH至并控制于4.5。在140小时后，终止发酵。从罐中除去发酵液，并通过过滤移除细胞。在分离细胞后，通过超滤来浓缩滤液。最后，将浓缩物无菌过滤并用于造粒稳定性研究。

酶样品

使用用于测定如下所述木聚糖酶活性的方法来测定来自MTP的培养上清液的木聚糖酶活性。将培养上清液用25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH4.0)稀释20和130倍。将25μL稀释的酶样品与150μL 0.5％WE-AX底物(pH 5.0)混合，并在摇动下于30℃温育15分钟。在温育后，将45.4μL反应样品与135μL PAHBAH工作液混合并在95℃下温育5分钟，然后冷却至20℃10秒。将100μL样品转移至微量滴定板孔中并在410nm处读板。

活性计算为三次平行测定的平均值减去包括25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)而不加酶的空白。基于经纯化FveXyn4的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。用25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)将所有样品稀释至50ppm。在以下所述测定中，将这些标准化样品用作酶储备液。

酶储备液中的蛋白质浓度通过如下所述的HPLC进行测定。

来自大规模生产的无菌过滤的浓缩物的木聚糖酶活性通过以下活性测定而测得。将0.5g的各浓缩物称取到100ml容量瓶中，之后用McIlvaine缓冲液(pH 5.0)填充至容积。使用McIlvaine缓冲液(pH 5.0)将样品稀释至约6XU/ml。将100μl的稀释样品添加至试管的1ml McIlvaine缓冲液(pH 5.0)中并在50℃平衡2分钟。添加Xylazyme片剂(100mg)以引发反应并使样品在40℃下温育10分钟，然后通过添加10ml的2％Tris(pH12.0)终止反应。用涡旋混合溶液，使其静置5分钟，然后在再次混合后于3500rpm下离心10分钟。在590nm处测定上清液的吸光度。一式两份测定各个样品。相对于酶标准品(Danisco Xylanase，购自Danisco Animal Nutrition)对木聚糖酶活性进行定量。

基准酶XT可商购获得并提取自商业干配制样品。使用McIlvaine缓冲液(pH 5.0)在33％(w/w)浆液中提取得自XT商业干配制样品的木聚糖酶组分。提取物采用离心(3000RCF，10min)澄清并采用PALL Acrodisc PF注射式过滤器(0.8/0.2μmSupor膜)过滤，并随后于70℃加热20分钟。在通过离心(38 724RCF，15min)除去沉淀后，使缓冲液通过经20mM柠檬酸钠、20mM NaCl(pH 3.4)平衡的Sephadex G25柱(PD10，得自Pharmacia)来替换。木聚糖酶组分的纯化采用Source15S树脂进行，之后用线性递增盐梯度(NaCl，在20mM柠檬酸钠缓冲液中，pH 3.4)进行洗脱。

Econase为内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，其由菌株里氏木霉RF5427(CBS 114044)产生，购自ABVista。

蛋白质浓度通过测量280nm处吸光度来测定。由氨基酸序列来估计消光系数。对于Econase XT(1mg/ml)，吸光度在280nm处计算为2.84AU。

实施例18

具有木聚糖酶的生面团的评估

采用表11所列成分制备缓冲的生面团。商标名为MINSA的经蒸煮浸泡的玉米面粉购自墨西哥超市(Mexican Supermarket)。CMC MAS 550可购自DuPont。

表11

*)除木聚糖酶A1之外，所有成分浓度均列为g/100g面粉

在临用前，在40℃下对所有成分进行平衡。使用配有K搅拌器的Kenwood kitchenChef混合器进行混合。将干燥成分添加至混合转筒中并以速度1进行短暂混合。添加液体成分并使混合以速度1进行30秒并以速度3进行30秒。在最终混合后，生面团用手模压10秒以形成圆形生面团块。使生面团在40℃静置30分钟。在静置30分钟后，取出5g的生面团块并冷冻于液氮中。在储存(任选的，在-18℃下)后，将生面团样品添加10g的冰冷去离子水中，并在5-10000rpm下用Ultra Turrax匀化混合物20秒，之后在25000rpm下匀化40秒。记录管(已称重)加上浆液的重量以估计用于离心的均匀浆液的实际量。在4700rpm下使浆液于10℃离心15分钟。从粒料滗出上清液并通过玻璃过滤器进行过滤。如下实施例19所述测定可溶性戊糖含量。记录粒料和管(已称重)的总重量。

水分保持能力(WHC)计算为基于生面团重量的粒料的量，并根据下式按照WAI计算(L.C.Platt-Lucero等人：Journal of Food Process Engineering 2013,36,179-186)，这里修正为使用生面团而非面粉干物质作为基料。

WHC值为1将意味着没有额外吸收的水。低于1的数值将意指在生面团制备期间添加的一些水在匀化和离心期间从生面团消除。高于1的值意指当在过量水中匀化时生面团相较于配方吸收额外的水。

结果示于表12，其中“ppm”意指mg木聚糖酶/kg面粉。可以看出，表12中的结果示出相较于未加入酶的对照，水分保持能力增大6％。

表12

实施例19

C5糖(戊聚糖酶)的量化

采用连续流动注入装置使用Rouau and Surget,Carbohydrate Polymers,1994,24,123-32方法来测量在生面团液体中引入溶液的戊糖总量。上清液用酸处理以将多糖水解为单糖。添加间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)以与单戊糖和单己糖反应，形成有色复合物。

通过测量550nm处相较于510nm处的吸光度的差值，用标准曲线计算溶液中戊糖的量。不同于戊糖-间苯三酚复合物，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。将葡萄糖添加至间苯三酚溶液中以创建恒定葡萄糖信号并进一步确保无己糖的干涉作用。量表示为以ppm计的戊糖。结果在表13中示出。

表13

生面团配方	可溶性戊糖(ppm)T＝30min
		对照物，具有CMC	528
CMC+木聚糖酶A1(0.04ppm)	555
		CMC+木聚糖酶A1(0.08ppm)	615
CMC+木聚糖酶A1(0.16ppm)	647
		CMC+木聚糖酶A1(0.32ppm)	1100
CMC+木聚糖酶A1(0.64ppm)	1253

上面说明书中提及的所有出版物均以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和实质的条件下对所描述的本发明方法和系统作出各种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施方案进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施方案。实际上，生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的对所描述的本发明实施方式的各种修改旨在落入如下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于制备玉米基食品的方法，所述方法包括使玉米基面粉与木聚糖酶接触的步骤，使得所述玉米天然具有的含木聚糖的材料降解；

其中所述木聚糖酶选自：

(B)如SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19中所示的多肽，或其与SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19具有至少85％(适当地至少90％或至少95％)同一性的变体、片段、同源物或衍生物，或由本文示为SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ IDNo.22的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22的互补序列杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22具有至少80％(适当地至少85％或至少90％或至少95％)同一性的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ ID No.22的核苷酸序列编码；或

(A1)本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列，或其与SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3以及至少一个氨基酸的保守置换的多肽序列，或由本文示为SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ IDNo.6具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、97.7％、至少98％、98.5％或99％同一性)的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6的核苷酸序列编码；或

(A2)本文示为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的多肽序列，或其与SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物，或包含SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9以及至少一个氨基酸的保守置换的多肽序列，或由本文示为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码，或由在高度严格条件下能与SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16杂交的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.11、SEQID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16具有至少75％同一性(诸如至少80％、85％、90％、95％或98％同一性)的核苷酸序列编码，或由因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列编码。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述玉米基面粉至少部分地包括碱法烹制的玉米面粉。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述木聚糖酶如(A1)中所定义。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述木聚糖酶如(B)中所定义。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述木聚糖酶如(A2)中所定义。

6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述木聚糖酶如(C)中所定义。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中除所述玉米基面粉与木聚糖酶的混合物之外，还存在另外的酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中除所述玉米基面粉与木聚糖酶的混合物之外，还存在水性胶体。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述水性胶体作为所述面粉的初始组分存在。

10.根据权利要求8所述的方法，其中将所述水性胶体添加至所述面粉。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述水性胶体以按所述面粉的重量计0.2至2％的量存在。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述水性胶体为羧甲基纤维素。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将水添加至所述玉米基面粉与木聚糖酶的混合物中以形成湿润粉糊。

14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括将所述湿润粉糊加工成湿润粉糊食品。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述湿润粉糊食品选自玉米粉圆饼、软玉米粉圆饼、玉米片、未经发酵的玉米片、玉米面豆卷壳、包馅玉米团、以及它们的衍生物和混合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述湿润粉糊食品是玉米粉圆饼。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在碱性条件下制备所述玉米粉圆饼。

18.根据权利要求16所述的方法，其中在酸性条件下制备所述玉米粉圆饼。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述木聚糖酶如(A1)中所定义并且剂量为0.08至1.28mg/kg玉米面粉。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述木聚糖酶如(A1)中所定义并且剂量为0.04至0.64mg/kg玉米面粉。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述木聚糖酶如(B)中所定义并且剂量为0.08至1.2mg/kg玉米面粉。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述木聚糖酶如(B)中所定义并且剂量为0.04至0.60mg/kg玉米面粉。

23.一种包含木聚糖酶的玉米基面粉，其中所述木聚糖酶选自：

24.根据权利要求23所述的面粉，所述面粉至少部分地包括碱法烹制的玉米面粉。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的面粉，其中所述木聚糖酶如(A1)中所定义。

26.根据权利要求23或权利要求24所述的面粉，其中所述木聚糖酶如(B)中所定义。

27.根据权利要求23或权利要求24所述的面粉，其中所述木聚糖酶如(A2)中所定义。

28.根据权利要求23或权利要求24所述的面粉，其中所述木聚糖酶如(C)中所定义。

29.根据权利要求23至28中任一项所述的面粉，其中除所述玉米基面粉与木聚糖酶的混合物之外，还存在另外的酶。

30.根据权利要求23至29中任一项所述的面粉，所述面粉还包含水性胶体。

31.根据权利要求30所述的面粉，其中所述水性胶体作为所述面粉的初始组分存在。

32.根据权利要求30所述的面粉，其中将所述水性胶体添加至所述面粉。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的面粉，其中所述水性胶体以按所述面粉的重量计0.2至2％的量存在。

34.根据权利要求30至33中任一项所述的面粉，其中所述水性胶体为羧甲基纤维素。

35.一种能够通过如权利要求1至22中任一项所定义的方法获得的或者通过所述方法获得的玉米基食品。

36.根据权利要求35所述的玉米基食品，所述玉米基食品选自玉米薄片、玉米妙脆角和玉米面包。

37.一种能够从根据权利要求23至34中任一项所述的玉米基面粉获得的或者从所述玉米基面粉获得的玉米基食品。

38.根据权利要求37所述的玉米基食品，所述玉米基食品选自玉米薄片、玉米妙脆角和玉米面包。

39.一种能够通过以下方法获得的或者通过以下方法获得的湿润粉糊，所述方法包括：

(a)制备根据权利要求23至34中任一项所述的玉米基面粉；以及

(b)添加水以形成湿润粉糊。

40.一种能够通过以下方法获得的或者通过以下方法获得的湿润粉糊食品：

(a)制备如权利要求39所定义的湿润粉糊；以及

(b)对所述湿润粉糊进行加工以形成所述湿润粉糊食品。

41.根据权利要求40所述的湿润粉糊食品，所述湿润粉糊食品选自玉米粉圆饼、软玉米粉圆饼、玉米片、未经发酵的玉米片、玉米面豆卷壳、包馅玉米团、以及它们的衍生物和混合物。

42.根据权利要求41所述的湿润粉糊食品，所述湿润粉糊食品是玉米粉圆饼。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的湿润粉糊食品，所述湿润粉糊食品还包含水性胶体。

44.根据权利要求43所述的湿润粉糊食品，其中所述水性胶体以按所述食品的重量计0.2至2％的量存在。

45.根据权利要求43或权利要求44所述的湿润粉糊食品，其中所述水性胶体为羧甲基纤维素。

46.一种用于制备湿润粉糊食品的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在碱性溶液中蒸煮玉米；

(ii)在蒸煮期间或蒸煮之后，使木聚糖酶与所述玉米接触，

使得所述玉米天然具有的含木聚糖的材料降解；

其中所述木聚糖酶选自：

47.木聚糖酶用于改善湿润粉糊食品的质地的用途，其中所述木聚糖酶选自：

48.根据权利要求47所述的用途，其中除所述木聚糖酶之外，还存在另外的酶。

49.木聚糖酶用于改善湿润粉糊食品的耐受性的用途，其中所述木聚糖酶选自：

50.根据权利要求49所述的用途，其中除所述木聚糖酶之外，还存在另外的酶。

51.木聚糖酶用于改善湿润粉糊食品的可折叠性的用途，其中所述木聚糖酶选自：

52.根据权利要求51所述的用途，其中除所述木聚糖酶之外，还存在另外的酶。

53.木聚糖酶用于改进湿润粉糊食品的粘度的用途，其中所述木聚糖酶选自：

54.根据权利要求53所述的用途，其中除所述木聚糖酶之外，还存在另外的酶。