CN105934521B - 检测和治疗响应于dot1l抑制的白血病的方法 - Google Patents

Abstract

公开了：(i)用于鉴定没有呈现MLL‑易位、重排或MLL‑部分串联重复但仍然对DOT1L抑制剂的治疗易感的白血病患者(或白血病细胞)的方法；和(ii)使用DOT1L抑制剂治疗没有呈现MLL‑易位、重排或MLL‑部分串联重复的白血病患者，或抑制没有呈现MLL‑易位、重排或MLL‑部分串联重复的白血病细胞的增殖或诱导其凋亡的方法。鉴定为易感的患者和接受治疗的患者(或细胞)呈现HOX簇基因或HOX簇相关基因的表达升高。这些基因的升高表达能够被测量，例如，可以通过定量相关RNA并将其与健康个体(或细胞)的相关RNA或与预定标准进行比较；或该升高表达能够通过确定患者或细胞是否具有与升高的HOX簇基因或HOX簇相关基因表达相关的突变来推断，并且由此推断相关表达将升高。

Description

检测和治疗响应于DOT1L抑制的白血病的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年10月2日提交的美国临时专利申请No.61/885,947和2013年8月2日提交的美国临时专利申请No 61/861,923的优先权，每篇的内容通过引用并入本文。

政府资助的研究或研发

本发明中描述的工作部分由来自国家癌症研究院的拨款(U01CA105423)资助。美国政府在本发明中具有一定的权利。

对序列表的参考

本申请包括2014年8月1日生成的名为“8540231_1.txt”并具有206202字节大小的电子ASCII格式的txt文件的序列表。txt文件“8540231_1.txt”的内容按引用并入本文中。

背景技术

发明领域

本发明总体地涉及癌症的检测和治疗。更具体地，本发明提供：(i)通过检测与升高的HOX簇和/或HOX簇相关的基因表达相关的组织样品或细胞中的一个或多个突变或通过检测升高的HOX簇基因表达或升高的HOX簇相关基因表达，鉴定对使用DOT1L抑制剂的治疗易感的白血病患者的方法；(ii)鉴定白血病患者组织样品或细胞中由于与升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达的相关性而能够预测DOT1L抑制剂的疗效的突变的方法；和(iii)通过施用DOT1L抑制剂治疗白血病患者的方法，包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)患者和/或急性骨髓性白血病(AML)白血病患者，所述患者已经确定呈现出升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达或具有与任一个或两个基因类型的升高基因表达相关的突变。另外，本公开提供用于鉴定处于罹患ALL或AML的高风险中并对使用DOT1L抑制剂的治疗易感的患者的方法。本公开还提供了与另一种治疗剂结合的DOT1L抑制对ALL和AML的治疗，所述另一种治疗剂如FLT3抑制剂、ATR抑制剂或CDK4/CDK6抑制剂，和IDH1/2抑制剂。

相关领域的描述

20多年中针对急性骨髓性白血病(AML)患者的治疗没有什么改变，并且AML存活率对于成人保持显著低于50％，对于儿童大约为60-70％。即使治愈了患者的疾病，也常常有相当数量的患者由于常规的化疗方案和骨髓移植而患病。显然需要更有效的、较低毒性的治疗方法。

对于导致白血病生成的基因和机理的更多理解导致研发了多种靶向负责白血病细胞存活和增殖的基础遗传异常的新治疗方法。参见例如美国专利公开No.2009/026951、2005/048634和2009/061443。这些治疗方法成功的最突出实例是研发了全反式视黄酸(ATRA)(其靶向驱动急性前髓细胞性白血病的遗传异常)以及伊马替尼(Imatinib)(其靶向驱动慢性骨髓性白血病和特定亚型的急性淋巴母细胞性白血病(如费城染色体阳性ALL)的遗传异常)。这些治疗方法显著提高了患有那些疾病的患者的结果，并且毒性明显低于标准化疗和放疗。继续研发新的靶向方法至关重要。

最近鉴定的通过组蛋白和DNA修饰控制基因表达的蛋白质类别正驱动调节染色质结构的新治疗方法的研发。造成白血病生成的遗传突变常常使用那些蛋白质来将正常细胞重编程为癌细胞。最近的实验表明这一过程的抑制剂降低了作为癌细胞标志的分化的阻断，并重新激活驱动细胞分化的基因表达程序。这抑制了癌细胞的生长并最终导致其死亡。靶向组蛋白修饰的药物，如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂伏立诺他(Vorinostat)和罗米地辛(Romidepsin)，最近已经被批准用于皮肤T-细胞淋巴瘤的治疗，这证明了这些方法的可行性。

在＞70％的婴儿白血病(不管是急性骨髓性白血病(AML)或是急性淋巴母细胞性白血病(ALL))和较大儿童的大约10％的AML病例中，发现了涉及混合谱系白血病(MLL)基因的易位。Biondi等，Blood 96(1)：24-33(2000)。在许多成人病例和治疗相关的白血病(B-ALL、T-ALL和AML)中也发现了涉及MLL的易位，并且与婴儿白血病一样，常常与比MLL-种系白血病差的预后相关。与治疗儿童ALL中高的总体成功率(其中5-年存活率已经达到～80-90％)相反，MLL易位ALL的遗传确定的亚型继续预测约50％的差存活率。

在分子水平上，MLL易位白血病显示出特征在于后同源框-A(HOXA)基因簇的高水平表达的特征性基因表达谱。Armstrong等，Nat.Genet.J.Qill：41-47(2002)和Ferrando等，Blood 102(1)：262-268(2003)。

已知几个HOX簇基因受MLL调控(Yu等，Nature 378：505-508(1995))，其已经提出在ALL和AML中HOX基因表达模式的详细比较。HOXA4、HOXA5和HOXA9基因在常规ALL中不表达，或很少表达，但在来自呈现出MLL-易位、MLL重排或MLL-初级串联重复(PTD)的白血病患者的大部分样品中表达(常常是以高水平表达)。HOXC6在MLL-相关白血病中显示出轻度升高水平的表达。MEIS1，HOX蛋白的HOX簇相关辅因子(其可以加速HOXA9-依赖性白血病)(Nakamura等，Nat.Genet.19：149-153(1996))，在MLL-相关白血病中也明显过表达。Rozovskaia等，Oncogene 20：874-878(2001)。

几个小组已经证明了HOXA簇基因表达对于MLL融合驱动的白血病细胞的增殖和存活是必需的，因此抑制HOXA簇基因表达的治疗方法应当能有效对抗MLL易位的白血病。

已经针对表达的嵌合MLL融合蛋白(包括MLL-易位、MLL-重排和MLL-部分串联重复)确定肿瘤形成的统一机理付出了相当大的努力，因为这将促进具有共同白血病生成机理的那些的药物靶向。已经出现了基于控制MLL-靶基因表达的机理的一些广泛模式。最常见的MLL-易位产生带有与通常是核复合物部分的蛋白质融合的MLL的NH3-末端的嵌合融合蛋白，其功能目前正在浮现。发现与核蛋白(如AF4、AF9、ENL、ELL、AFI0、AFI7和AFF4)融合的MLL(其总体占绝大部分的MLL白血病)均直接或间接募集转录延长机制的组分。Bitoun等，Hum.Mol.Genet.16(I)：92-106(2007)；Mueller等，Blood 110(13)：4445-4454(2007)；Mueller等，PLoS Bioi，7(II)：el000249(2009)；Mohan等，Nat.Rev.Cancer 10(10)：721-728(2010)；Yokoyama等，Cancer Cell 17(2)：198-212(2010)；和Lin等，Molecular Cell37(3)：429-437(2010)。

已经报道了许多与转录延长关联的复合物，常常具有重叠的蛋白组分，如ENL-相关蛋白(EAP)复合物(Mueller(2009))、AF4/ENLlP-TEFb(AEP)复合物(Yokoyama(2010))、超级延长复合物(SEC)(Lin(2010))和包含组蛋白3赖氨酸79(H3K79)甲基转移酶DOT1L(DotCom)的复合物(Mohan(2010))。这些数据表明转录延长的异常控制涉及MLL融合介导的肿瘤生成。

野生型MLL蛋白是组蛋白3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶，其将基因启动子附近的H3K4甲基化。这种修饰赋予基因在造血发育过程中被激活的潜能。DOT1L是组蛋白3赖氨酸79(H3K79)甲基转移酶，其修饰身体内的H3K79和转录活跃基因的启动子，包括造血细胞中高度表达的基因。因此，MLL-介导的H3K4甲基化使基因准备表达，所述基因表达被DOT1L-介导的H3K79甲基化促进。

酵母中的研究已经表明两个复合物被相似地同时调控，这表明H3K4和H3K79甲基化在基因转录过程中以高度受控方式协同工作。Lee等，Cell 131：1084-1096(2007)。全基因组研究已经证明MLL易位ALL和AML细胞中MLL靶基因处升高的H3K79甲基化。Krivtsov等，Cancer Cell 15(5)：355-368(2008)；Guenther等，Genes Dev.22(24)：3403-3408(2008)；Bernt等，Cancer Cell 20(1)：66-78(2011)；Copeland等，Oncogene 32：939-946(2013)；Krivtsov等，Nat.Rev.Cancer 1：823-833(2007)；和Monroe等，Exp Hematol 39：77-86e71-75(2011)。

使用条件失能小鼠模型和RNAi方法的几个研究已经正式证明DOT1L在MLL融合驱动的白血病中的关键作用。Bernt(2011)；Jo等，Blood 117(18)：4759-4768(2011)；Nguyen等，Blood 117(25)：6912-6922(2011)；和Chang等，Cancer Res.70(24)：10234-10242(2010)。这些研究证明DOT1L的遗传失活，或DOT1L的小分子介导的抑制，导致MLL融合靶基因表达的降低，包括与抗增殖响应相关的HOX簇基因表达的快速降低。

已经假设MLL的易位表达异常的MLL-融合蛋白，其将DOT1L错误靶向于(mistarget)MLL靶基因，由此破坏H3K79和H3K4甲基化之间的正常相互作用，这导致升高的基因表达，包括升高的HOX簇基因表达。基于这一假设，已经提出DOT1L抑制剂可以在呈现MLL基因异常的那些白血病中阻断DOT1L对MLL-靶基因的错误靶向，由此降低失调的H3K79和H3K4甲基化和所得基因表达升高的水平。

显然，DOT1L的失活不影响HOXA9从逆转录病毒启动子表达时的转化潜能。HOXA9及其杂二聚化伴体MEIS1a(HOX簇-相关基因表达产物的实例)的表达拯救了DOT1L抑制剂对MLL-易位白血病的抗增殖作用。此外，基于微阵列的基因表达研究表明MLL-融合靶基因表达对DOT1L的依赖性比更常见的基因表达高得多(Bernt 2011)。这些研究强调了异常的H3K79甲基化对MLL融合蛋白(包括MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF10和MLL-ENL)的转化活性的重要性，并表明了DOT1L是持续的HOXA簇基因表达所需的。这些结果潜在地具有意义深远的临床意义，因为这些融合存在于绝大部分的MLL-易位白血病中。

以上所述的遗传和小分子抑制剂数据表明DOT1L是MLL-易位、MLL-重排和MLL-部分串联重复相关白血病的潜在治疗靶标。DOT1L作为治疗靶标的验证中的关键下一步是证明小分子抑制剂呈现出与遗传失能模型中发现的相似的响应。

小分子DOT1L抑制剂EPZ004777是s-腺苷甲硫氨酸模拟物，其与其他甲基转移酶相比，对DOT1L具有显著的特异性(图1)。Daigle等，Cancer Cell 20(1)：53-65(2011)。EPZ004777以中等-nM范围抑制MLL-易位白血病细胞系中的H3K79甲基化。EPZ004777显示出MLL融合驱动的基因表达的剂量依赖性抑制，包括HOXA9和MEIS1的抑制(Bernt 2011)。MV4-11白血病细胞和MLL-AF9细胞系Molm-13的生长对DOT1L抑制特别敏感，而MLL-种系Jurkat细胞的生长未受EPZ004777的影响(Daigle，2011)。相反，EPZ004777对MLL种系白血病细胞系不具有抗增殖作用，尽管其抑制了H3K79甲基化。

总之，这些数据提供了继续研发DOT1L作为MLL-易位、MLL-重排和MLL-部分串联重复相关的白血病中的潜在治疗靶标的强大支持，并且已经促进了1期临床试验的启动(美国，NIH，临床试验No.NCT01684150)，其设计为评估DOT1L抑制剂在复发的/难治的血液恶性肿瘤患者中的作用。

然而，上述数据不支持DOT1L作为其他类型的白血病(即没有呈现MLL-易位、MLL-重排和MLL-部分串联重复的白血病)中的潜在靶标。此外，呈现MLL-易位、MLL-重排和MLL-部分串联重复的白血病以外的白血病中提高的HOX簇HOX簇相关基因表达水平尚未与DOT1L的活性相关联。

发明简述

本公开提供了用于鉴定治疗易感患者和用于治疗特定白血病的用途/方法，所述白血病包括不呈现MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-部分串联重复(PTD)但其特征仍然在于一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达(尽管不存在之前的MLL异常)的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。患者可以具有一个或多个已经确定与一个或多个HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高表达相关的突变，并且此类突变的存在可以作为用于评估HOX簇基因或HOX簇相关基因表达水平的替代。如本文中详细描述的，用一种或多种DOT1L抑制剂可以有效地治疗这种白血病。因此，本发明还鉴定对使用DOT1L抑制剂的治疗易感的白血病亚型。

因此，本公开在呈现上述MLL异常的那些之外大大地扩大了通过施用DOT1L抑制剂可以有效治疗的患者的范围。本公开提供用于患有特征在于一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达的疾病或病症(包括白血病)的那些患者的治疗，不管那些患者是否呈现MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-部分串联重复(PTD)。

在一个实施方案内，本公开提供用于确定白血病患者是否对使用DOT1L抑制剂的治疗易感的方法/用途，这与是否已知患者具有MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD以外的突变无关。换言之，如果患者具有与HOX簇基因或HOX簇-相关基因的升高表达相关的突变，则推断为易感性。通过这些方法，测定白血病患者组织样品或细胞中和非白血病供体对照组织样品或细胞(例如，来自已知未呈现升高的HOX簇和/或HOX簇-相关基因表达的健康供体的组织样品或细胞)中的一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的表达水平。通过将患者样品或细胞中的一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的表达水平与对照样品或细胞中相应的基因表达水平(或与预定标准)相比，检测HOX簇和/或HOX簇相关基因表达的升高水平，所述升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达预示DOT1L抑制剂的疗效。

在另一个实施方案中，本公开提供用于鉴定白血病患者中，白血病患者对使用DOT1L抑制剂的治疗的易感性的其他方法/用途。通过这些方法，测试或已经测试了白血病患者组织样品或细胞中MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD以外的已知与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的遗传突变、改变和/或异常的存在，其中此类遗传突变、改变和/或异常的检测预示DOT1L抑制剂的疗效。如果在白血病患者中检测到此类遗传突变、改变和/或异常，可以开始使用DOT1L抑制剂的治疗。

在进一步的实施方案中，本公开提供用于鉴定白血病组织样品或细胞中MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD以外的一个或多个遗传突变、改变和/或异常并测定白血病组织样品或细胞中及已知未呈现升高的HOX簇和/或HOX簇-相关基因表达的非白血病对照组织或细胞中的一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的表达水平的其他方法/用途，其中白血病组织样品或细胞相对于对照组织样品或细胞的一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高水平预示DOT1L抑制剂在呈现出白血病组织样品或细胞中鉴定的一个或多个遗传突变、改变和/或异常的白血病患者中的疗效。

在另一个实施方案内，本公开提供用于抑制白血病细胞的增殖和/或诱导白血病细胞凋亡的方法/用途，所述方法包括接触已知或确定为(i)呈现MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD以外的已知或确定与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的一个或多个遗传突变、改变和/或异常的白血病细胞。该方法包括将这样的白血病细胞暴露于DOT1L抑制剂。

还在其他实施方案内，本公开提供用于治疗不具有MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD但仍然呈现已知或确定为与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的遗传突变、改变和/或异常的白血病患者的方法/用途。基于这些方法，通过施用一种或多种DOT1L抑制剂、包含一种或多种DOT1L抑制剂的组合物或制剂和/或包含与一种或多种在白血病治疗中有效的其他药剂结合的一种或多种DOT1L抑制剂的组合物或制剂来治疗此类白血病患者。

在更多的实施方案中，本公开提供用于治疗白血病患者的方法/用途，包括在来自白血病患者的组织样品或细胞中鉴定MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD以外的已知或确定为与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的一个或多个遗传突变、改变和/或异常，并通过施用一种或多种DOT1L抑制剂、包含一种或多种DOT1L抑制剂的一种或多种组合物或制剂和/或包含与一种或多种在白血病治疗中有效的其他药剂结合的一种或多种DOT1L抑制剂的一种或多种组合物或制剂来治疗白血病患者。

还在其它实施方案中，本公开提供通过向白血病患者施用一种或多种DOT1L抑制剂、包含一种或多种DOT1L抑制剂的一种或多种组合物或制剂和/或包含与一种或多种在白血病治疗中有效的其他药剂结合的一种或多种DOT1L抑制剂的一种或多种组合物或制剂来治疗呈现一个或多个HOX簇和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达的白血病患者的方法/用途。

在进一步的实施方案中，本公开提供降低处于治疗相关性白血病的高风险的患者中治疗相关性白血病风险的方法/用途，所述患者之前没有用DOT1L抑制剂治疗过，该方法包括向所述患者施用治疗有效量的DOT1L抑制剂，其中患者呈现出实际的或推断的HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高表达，且其中患者不具有MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复。

在另一个实施方案中，本公开提供治疗呈现HOX簇基因和/或HOX簇相关基因的升高表达的白血病患者的方法/用途，所述方法包括向所述白血病患者施用一种或多种DOT1L抑制剂、包含一种或多种DOT1L抑制剂的一种或多种组合物或制剂和/或包含与一种或多种在白血病治疗中有效的其他药剂结合的一种或多种DOT1L抑制剂的一种或多种组合物或制剂，其中所述白血病患者没有呈现MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD。

附图说明

图1是放射自显影，显示用DOT1L抑制剂EPZ0044777处理后H3K79me2的组蛋白甲基化。在MLL-F4易位细胞系MV4-11和MLL-AF9易位白血病细胞MOLM-13中用0.048、0.195、0.781、3.12和12.5μM的DOT1L抑制剂EPZ004777处理抑制了H3K79me2(左图；图1A)。与通过其他组蛋白甲基转移酶的甲基化相比，该抑制是H3K79me特异性的(右图；图1B)。

图2是呈现DOT1L抑制剂EPZ004777选择性抑制MLL-易位细胞系增殖的数据的图。显示了六个MLL-易位(MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-ENL)和六个非重排MLL-种系白血病细胞系的IC₅₀。

图3A和3B是生长曲线，显示了10天期间(x轴)的细胞数(y轴)。人MLL-PTD AML细胞系(MUTZ11)的增殖被DOT1L抑制(图3A)，而AML1-ETO(Kasumi)细胞的增殖对DOT1L不敏感(图3B)。用10μM EPZ004777或DSMO(对照)处理所示的细胞系，并且在所示的天数评估细胞计数。

图4是条形图，显示了HOXA9相对于GAPDH(ddCT)的相对表达，并显示了用DOT1L抑制剂EPZ004777处理MLL-PTD AML细胞系MUTZ11细胞后，HOXA9表达降低。用DMSO(对照)或EPZ004777处理MUTZ11细胞，并在第7天和第10天评估HOXA9表达。

图5A和5B显示了EPZ004777在NUP98-NSD1转化的小鼠细胞中的作用，其中图5A是随时间(长达17天)的相对增殖的图，显示了与DMSO处理的对照相比，用各种浓度(0.1、1和10μM)的EPZ004777处理NUP98-NSD1细胞时增殖降低。图5B是柱状图，显示了HOXA7、HOXA9、HOXA10和MEIS1相对于GAPDH(ddCT)的mRNA表达。观察到NUP98-NSD1转化细胞中EPZ004777对HOXA7、HOXA9、HOXA10和MEIS1的mRNA水平的强抑制性作用。

图6A、6B和6C分别是细胞计数相对于暴露于他莫昔芬(4-羟基他莫昔芬；4-OHT)的天数的图、在第0天和第12天细胞的显微照片以及琼脂糖凝胶的照片。这些数据共同显示可诱导的DOT1L失能细胞系的产生。Cre重组酶的他莫昔芬(4-OHT)诱导导致生长停滞(左图；图6A)和分化(右上图；图6B)。条件化DOT1L等位基因(flox)在cre诱导时易位，并且到第12天时没有再出现(右下图；图6C)。

图7A-7D显示DOT1L抑制剂EPZ004777相对于载体对照DMSO对不同白血病细胞系的增殖的作用。图7A-7D是细胞计数vs.呈现白血病相关突变的人细胞系接触DMSO(阴性对照)或DOT1L抑制剂(EPZ004777)时间的图。用10μM EPZ004777或DMSO(对照)处理MLL-AF9易位人细胞系(阳性对照，图7A和7B)；NPM1突变人细胞系(图7C)和AML1-ETO易位人细胞系(阴性对照，图7D)，并且在所示天数(第3、7和10天)进行细胞计数。这些数据证明DOT1L抑制剂显著抑制了呈现NPM1突变的人细胞系的增殖。

图8A和8B分别显示了EPZ004777对MLL-AF9和NUP98-NSD1转化细胞中的H3K79me2和细胞凋亡的作用。图8A是放射自显影，显示了用DOT1L抑制剂EPZ004777(10μM)处理细胞后，H3K79的组蛋白甲基化降低。用EPZ004777(10μM)处理MLL-AF9和NUP98-NSD1转化细胞10天，并且通过Western印迹测定H3K79me2的蛋白质水平。图8B是条形图，显示了DOT1L抑制剂EPZ004777诱导MLL-AF9和NUP98-NSD1转化细胞中的细胞凋亡。用DMSO对照或10μMEPZ004777处理MLL-AF9或NUP98-NSD1转化细胞后10天评估膜联蛋白V染色。显示了膜联蛋白V阳性细胞的百分比。

图9是条形图，显示了各种细胞系中通过定量PCR测定的HOXA9基因表达，所述细胞系包括AML细胞系OCI-AML2和OCI-AML3，其与阴性对照细胞系HL60和阳性对照细胞系Molm-13(其呈现MLL-AF9易位)相比分别呈现DNTM3A和NPM1突变。

图10是相对于处理天数绘制的细胞数的曲线图，证明了具有DNTM3A或NPM1突变的细胞系对DOT1L抑制是敏感的。用DMSO(对照)或10μM DOT1L抑制剂EPZ004777处理细胞系OCI-AML2、OCI-AML3、Molm-13和HL-60。在所示的时间点评估细胞数，并且在每个时间点将EPZ004777处理vs.DMSO(对照)处理条件中存在细胞的百分比作图。OCI-AML2、OCI-AML3和Molm-13细胞系表达高水平的HOXA9和MEIS1，而HL60没有表达高水平的HOXA9或MEIS1。

图11A和11B显示OCI-AML3细胞经历了响应于DOT1L抑制的细胞凋亡和分化。图11A是条形图，显示了用10μM EPZ004777或DMSO(对照)处理4、7或10天的OCI-AML3细胞。通过膜联蛋白V染色来评估凋亡细胞的百分比。图11B是显示了用10μM EPZ004777处理所示天数(4、7和10)的OCI-AML3细胞中表面标志物Cb11表达的流式细胞分析的系列图。Cb11标志物表达的提高表明分化。图12A和12B是从Npm1^cA/+Rosa^SB/+或Npm1^cA/+Flt3^ITD/+小鼠分离的AML细胞的图，在将细胞初次(图12A)和二次(图12B)移植至接受体后，测试其形成克隆的潜能。在将细胞移植至接受体前，在10μM DOT1L抑制剂的存在下将从Npm1^cA/+Rosa^SB/+或Npm1^cA/+Flt3^ITD/+小鼠分离的AML细胞培养6天。初次(图12A)和二次(图12B)移植后，用载体对照(DMSO)或10μM EPZ004777处理Npm1^cA/+Rosa^SB/+和Npm1^cA/+Flt3^ITD/+AML细胞所示天数(对于初次移植，7、14和15天；对于二次移植，1、14和22天)，之后进行克隆形成试验。用10μM DOT1L抑制剂处理AML小鼠细胞系导致了初次和二次移植后克隆形成能力的明显降低。

图13A-13C显示了在体内DOT1L抑制对白血病启始能力的作用。图13A显示了注射之前用DMSO或10μM EPZ004777处理6天的Npm1^cA/+Rosa^SB/+AML细胞的同源C57/BL6小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(％存活vs.过去的天数)。图13A表明用DOT1L抑制剂处理的动物存活延长。图13B是第19天从注射了Npm1^cA/+Rosa^SB/+AML细胞(之前用DMSO或10μM EPZ004777处理6天)的动物分离的并用Wright-Giemsa染料染色的外周血涂片的图像。图13B表明EPZ00477处理的细胞中的分化(并且在仅暴露于DMSO的细胞中没有分化)。图13C是显示第19天从注射用对照(DMSO)或10μM EPZ004777处理6天的Npm1^cA/+Rosa^SB/+AML细胞的小鼠收集的样品的全血细胞计数的系列图。白血球和血小板的数量用每微升(μL)血液的细胞数表示。血红蛋白水平用每分升的克数(g/dl)来表示。

图14A和14B显示用DMSO或10μM EPZ004777处理细胞后，Npm1^cA/+Rosa^SB/+(图14A)和Npm1^cA/+Flt3^ITD/+(图14B)AML细胞中HOXA9、HOXA10、MEIS1、HOX3A、HOXA4和HOXA5相对于GAPDH(ddCT)的相对表达的条形图。图14A和14B显示用10μM EPZ004777处理两个细胞系后，HOXA9、HOXA10、MEIS1、HOX3A、HOXA4和HOXA5的表达降低。

发明详述

本公开是基于呈现与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的一个或多个遗传突变、改变和/或异常(除MLL-易位、MLL-重排和MLL-部分串联重复以外)的白血病对DOT1L抑制剂介导的生长抑制和/或细胞凋亡敏感的发现。此外，呈现：(1)一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达和/或(2)MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复以外的与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的一个或多个白血病相关的遗传突变、改变和/或异常的白血病可以通过施用一种或多种DOT1L抑制剂有效治疗。换言之，尽管很可能存在引起升高的HOX簇或HOX簇相关基因表达的突变并且其(如果存在)可以用作预测HOX簇或HOX簇相关基因的表达将升高的替代，但不需要这样的突变存在。即使升高的表达是一些其他因素的结果，预期使用DOT1L抑制剂的治疗是有效的，因为其将降低升高的HOX簇或HOX簇相关基因表达。

野生型MLL蛋白是将基因启动子附近的H3K4甲基化的组蛋白3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶。这种修饰在造血发育过程中赋予激活的潜能。DOT1L是修饰活跃转录的基因的启动子和基因体上的H3K79的组蛋白3赖氨酸79(H3K79)甲基转移酶。因此，H3K4甲基化使基因“准备”表达，而H3K79允许或促进基因表达。

酵母中的研究已经表明两个复合物被相似地同时调控，导致这两个修饰在基因转录过程中以高度受控的方式一起工作的假设。已经假设MLL的易位导致破坏H3K79和H3K4甲基化之间的这种密切关系的异常蛋白质，使其不可逆并且导致异常的基因表达。

在形成本发明的基础的该发现之前，据认为这种失调的关系是DOT1L抑制剂在MLL-易位、MLL-重排和MLL-PTD白血病中的选择性的原因。然而，如本文中公开的，发现DOT1L对于正常血液发育过程中的HOX基因表达和对于具有高水平HOX基因表达但没有MLL异常的白血病中的HOX基因表达是独立地需要的。因此，根据本公开，DOT1L抑制广泛地适用于与升高的HOX基因表达相关的白血病，不限于呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复的白血病。

基于本文中进一步详细描述的这些和其他发现，本公开提供：

(1)用于预测或确定白血病组织样品或细胞在接触DOT1L抑制剂时是否对生长和/或存活抑制易感的用途/方法；

(2)用于预测或确定组织或细胞(特别是白血病组织或细胞)中新鉴定的遗传突变、改变和/或异常是否使得该组织或细胞在接触DOT1L抑制剂时对生长和/或存活抑制易感的用途/方法；

(3)通过将白血病组织或细胞接触一种或多种DOT1L抑制剂来抑制(i)呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复以外的与HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高表达相关的一个或多个白血病相关的遗传突变、改变和/或异常；或(ii)另外地呈现HOX簇或HOX簇相关基因的升高表达的白血病组织或细胞的生长和/或存活的用途/方法；和

(4)通过向白血病患者施用包含一种或多种DOT1L抑制剂的组合物来治疗(i)呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复以外的与HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高表达相关的一个或多个遗传突变、改变和/或异常；或(ii)另外地呈现HOX簇或HOX簇相关基因的升高表达的白血病患者的用途/方法。

(5)用于抑制满足以上段落(3)和(4)中所列特征的组织或细胞的生长或存活或治疗满足以上段落(3)和(4)中所列特征的白血病患者的用途/方法，包括将组织或细胞接触与FLT3抑制剂结合的一种或多种DOT1L抑制剂或向患者施用与FLT3抑制剂结合的一种或多种DOT1L抑制剂。

如本文中更详细描述的，这些用于鉴定、预测、确定、抑制和治疗的用途/方法全部基于新发现的和本发明公开的(1)组织和/或细胞中一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达；(2)特定白血病相关的遗传突变、改变和/或异常(其不是MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复)；和(3)包括施用一种或多种DOT1L抑制剂的白血病治疗方案的疗效之间的关系。

本文中进一步详细描述本公开的这些和其他方面，包括：(1)用于测定升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达的方法；(2)用于检测人组织样品和/或细胞中MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复以外的与升高的HOX簇或HOX簇相关基因表达相关的细胞遗传突变、改变和/或异常的方法，同时评估或不评估HOX簇基因表达水平或HOX簇相关基因表达水平；(3)可以有利地用于抑制白血病组织或细胞的增殖和/或存活并用于治疗呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复以外的与升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达相关的一个或多个细胞遗传突变、改变和/或异常的白血病患者的示例性DOT1L抑制剂；(4)包括一种或多种DOT1L抑制剂的组合物(包括药物组合物)以及制剂；和(5)通过施用含有一种或多种DOT1L抑制剂的组合物治疗白血病患者的方法，包括施用一种或多种DOT1L抑制剂的方法和使用一种或多种DOT1L抑制剂的施用的合适治疗方案。DOT1L抑制剂可以作为单一治疗或结合其他治疗剂来施用，所述其他治疗剂如FLT3抑制剂、ATR抑制剂、IDH1/2抑制剂或CDK4/CDK6抑制剂。合适的ATR抑制剂的非限制性实例包括以下商业上可购得的化合物AZ20、BEZ235；CDK4/CDK6抑制剂的非限制性实例包括LEE011；IDH1/2抑制剂的非限制性实例包括AGI-6780和AGI-5198。所有都可以从Selleckchem，Boston，MA获得。

定义

“HOX簇基因”和“HOX簇相关基因”如本领域通常那样定义。术语“HOX簇”是指在染色体的基因簇中发现的一组同源框基因(含有180个碱基对长的DNA序列的调控基因类别称为同源框)。HOX簇基因编码作为转录因子的蛋白质并且在胚胎发育和造血作用中起着关键作用。人含有迄今为止鉴定的39个HOX基因的4个簇(A-D)：(1)染色体7上的簇A，其包括HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA12和HOXA13；(2)染色体17上的簇B，其包括HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9和HOXB13；(3)染色体12上的簇C，其包括HOXC4、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXC10、HOXC11、HOXC12和HOXC13；和(4)染色体2上的簇D，其包括HOXD1、HOXD3、HOXD4、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOXD11、HOXD12和HOXD13。HOX基因的DNA结合特异性部分是由于其与用作HOX辅因子并称为HOX簇相关基因的其他蛋白质的相互作用。明确定义的HOX簇相关基因的实例是三氨基酸环延伸(TALE)基因、PBX3和MEIS基因。

如本文中使用的，术语“内部对照”是指通常为但不专门是管家基因的序列的核苷酸序列或其一部分，其编码在大部分组织和细胞中以高水平稳定地和组成型地表达的蛋白质。管家基因选自通常保持不受病理和实验条件影响的那些。可以作为“内部对照”的合适基因包括，例如但不限于，β-肌动蛋白、β-微管蛋白、GAPDH和亲环蛋白。可以测定HOX簇和/或HOX簇相关基因表达和内部对照基因表达(即，非HOX簇和非HOX簇相关基因表达)的水平(例如，通过定量HOX和非HOX转录物的数量)，可以得到HOX和非HOX基因表达的比例，以及可以按照HOX和非HOX基因表达的比例来表示给定的白血病组织样品或细胞内HOX簇和/或HOX簇相关基因表达的水平。

相反，如本文中使用的，术语“外部对照”是指来自非白血病组织或细胞的HOX簇或HOX簇相关基因或基因序列，所述HOX簇或HOX簇相关基因或基因序列在非白血病组织或细胞中没有呈现升高的表达，但在相应的白血病组织或细胞中测试到升高的表达。因此，例如，通过将白血病组织样品或细胞中的表达水平(例如，mRNA转录物的数量)与相应的非白血病组织样品(如来自正常供体的组织样品，或非白血病细胞，如CD34⁺非白血病细胞)进行比较，“外部对照”可以用作用于评价给定的HOX簇基因或给定的HOX簇相关基因是否在白血病组织样品或细胞中呈现升高的表达水平的“阴性对照”。

如本文中使用的，术语“升高的基因表达”，特别是术语“升高的HOX簇基因表达”和“升高的HOX簇相关基因表达”，是指特定基因产物的表达提高，包括HOX簇基因和HOX簇相关基因的转录mRNA的量提高，其与对照(包括内部对照或外部对照)相比，在白血病组织样品或细胞中升高至少约三倍、至少约五倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或更高。

“固体支持物”意思是指在方法的溶剂和温度条件下基本上不溶的材料，所述方法如包括将游离化学基团连接至寡核苷酸或核酸的方法。固体支持物可以共价地偶联设计用来直接或间接结合靶核酸的寡核苷酸。当靶核酸是mRNA时，连接于固体支持物的寡核苷酸优选是聚-T序列。优选的固体支持物是颗粒，如微米或亚微米大小的珠或球。考虑了多种固体支持物材料，如，例如，二氧化硅、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、金属、聚苯乙烯、胶乳、硝基纤维素、聚丙烯、尼龙或其组合。固体支持物可能能够借助磁场吸引到一个位置，如具有磁铁矿核心的固体支持物。示例性的支持物包括单分散的磁球。

如本文中使用的，“组织样品”在其与白血病患者相关时包括但不限于，血液样品、骨髓样品或淋巴结样品，或从患者分离的细胞的集合，如白血病细胞。

如本文中使用的，短语“核酸扩增条件”是指反应条件，包括盐浓度、温度、温度循环的存在或不存在、核酸聚合酶、三磷酸核苷和辅因子的存在，其足以允许使用核酸扩增方法产生靶核酸或其互补链的多个拷贝。

扩增引物的“靶标-结合序列”是决定靶标特异性的部分，因为该部分能够与靶核酸链或其互补链退火，但在相同条件下不会可检测地与非靶核酸链退火。靶标结合序列杂交的互补靶序列称为引物结合序列。

用于检测HOX簇和HOX簇相关基因的升高表达的方法

可以通过本领域公知的一种或多种方法来测定升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达，所述方法包括，例如，微阵列、定量PCR，包括实时PCR(RT-PCR)和直接RNA测序。本文中所述用于检测升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达的每一种方法的共同点是通过由HOX簇基因和/或HOX簇相关基因编码的一个或多个mRNA的扩增、杂交和/或测序来检测白血病特异性多核苷酸。

还可以基于来自白血病患者的给定组织或血液样品中母细胞(blast)(即，白血病细胞)相对于细胞总数的百分比或分数来评价升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达。通过这种方法，例如，可以定量白血病组织样品中HOX簇和HOX簇相关转录物的数量并且将其乘以白血病组织样品中母细胞的反百分比或分数。然后可以评估相对于HOX簇和HOX簇相关基因表达的阈值转录物数量的所得HOX簇和HOX簇相关转录物数量，并且基于该评估，可以预测白血病组织样品从其获得的白血病患者对包括施用DOT1L抑制剂的治疗方案的反应性。更具体地，通过这种方法，高于阈值转录物数量的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达的转录物数量将预示这样的DOT1L抑制剂治疗方案的疗效。

例如，可以通过(1)定量来自白血病患者的组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA(和/或蛋白质)；(2)定量来自非白血病对照供体的组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA(和/或蛋白质)的水平；和(3)将来自白血病患者的组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA(和/或蛋白质)的水平与来自对照供体的组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA(和/或蛋白质)的水平进行比较来评估升高的HOX簇基因或HOX簇相关基因表达。将理解，与对照供体组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA和/或蛋白质的水平相比，白血病患者组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA(和/或蛋白质)的升高水平表明白血病患者对使用DOT1L抑制剂的治疗的易感性。

或者，可以通过(1)定量来自白血病患者的组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA；(2)定量白血病患者组织样品中的非HOX簇/非HOX簇相关RNA的水平，如，例如，GAPDH或肌动蛋白；和(3)将来自白血病患者的组织样品中的HOX簇或HOX簇相关RNA的水平与白血病患者组织样品中的非HOX簇/非HOX簇相关RNA的水平进行比较来评估升高的HOX簇或HOX簇相关基因表达。将理解，与白血病患者组织样品中的非HOX簇/非HOX簇相关RNA相比，白血病患者组织样品中HOX簇或HOX簇相关RNA的升高水平表明白血病患者对使用DOT1L抑制剂的治疗的易感性。

在这些方法的特定方面内，可以通过使用对HOX簇或HOX簇相关RNA特异性的引物对(参见表1)扩增组织样品中的RNA来定量HOX簇或HOX簇相关RNA，不管是白血病组织样品或细胞、来自白血病患者的非白血病组织样品或细胞，或是来自非白血病对照供体的组织样品或细胞。同样地，可以通过使用对非HOX簇或非HOX簇相关RNA特异性的引物对扩增组织样品中的RNA来定量非HOX簇或非HOX簇相关RNA(如管家基因之一(GAPDH、β-肌动蛋白、β-微管蛋白等))，不管是白血病组织样品或细胞、来自白血病患者的非白血病组织样品或细胞，或是来自非白血病对照供体的组织样品或细胞。引物对包括正向引物和反向引物，其中正向引物朝向RNA的5’端杂交，其中所述反向引物朝向RNA的3’端杂交，不管该RNA是HOX簇或HOX簇相关RNA或者非HOX簇或非HOX簇相关RNA。

用于评估白血病组织和细胞中升高表达的HOX簇基因包括，例如，一个或多个HOXA簇基因，其包括HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11和HOXA13中的一个或多个，如，例如，HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9和/或HOXA10中的一个或多个。用于评估白血病样品中升高表达的HOX簇基因还包括，例如，一个或多个HOXB簇基因，其包括HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9和HOXB13中的一个或多个。用于评估白血病样品中升高表达的HOX簇相关基因包括，例如，MEIS1、PBX3和MEIS2A中的一个或多个。

表1示出了由这些HOX簇基因和HOX簇相关基因中的每一个编码的mRNA的核苷酸序列，以及相应的登录号、序列识别号以及对科学文献内特定参考文献的引用，各参考文献都通过引用并入本文。

为了鉴定具有升高的HOX簇基因或HOX簇相关基因表达的白血病组织样品或细胞，可以从白血病组织样品或细胞和从非白血病对照组织样品或细胞分离mRNA，可以测定给定的mRNA的表达水平，并且可以通过比较白血病组织样品或细胞和非白血病对照组织样品或细胞测定的mRNA水平来评估升高的基因表达。

或者，可以通过例如从白血病组织样品或细胞分离mRNA并且随后(i)测定白血病组织样品或细胞中的HOX簇基因或HOX簇相关基因mRNA水平与管家对照基因的mRNA水平的比例；(ii)测定健康组织或细胞中的HOX簇基因或HOX簇相关基因mRNA水平与管家对照基因的mRNA水平的比例；和(iii)将(i)的比例与(ii)的比例进行比较并且如果(i)的比例高于(ii)的比例至少3X则得出存在升高的表达的结论，来鉴定具有升高的HOX簇基因或HOX簇相关基因表达的白血病组织样品或细胞。如这种情况中使用的，管家基因mRNA是指来自在白血病组织或细胞和健康组织或细胞中都具有稳定表达的基因的mRNA。合适的mRNA管家基因包括，例如，β-肌动蛋白、β-微管蛋白、GAPDH和亲环蛋白。评估白血病组织或细胞中HOX簇基因和HOX簇相关基因表达升高的另一种方式是与预定的标准曲线进行比较。例如，该标准可以通过参照HOX RNA/DNA表达(即，正常的而非升高的表达)的qPCR来产生。此外，除了mRNA水平，可以通过测量DNA和/或蛋白质水平来测定HOX簇基因和HOX簇相关基因升高。

合适的白血病组织样品包括，例如，来自白血病患者的血液、淋巴结、骨髓和/或肿瘤活检样品。合适的非白血病对照组织样品包括，例如，来自非白血病供体，如健康无疾病的供体的血液、淋巴结和/或骨髓样品。这种来自非白血病供体的血液、淋巴结和/或骨髓样品通常含有CD34⁺细胞。将理解，与供体组织样品或细胞的精确性质或来源无关，重要的是已知供体组织或细胞不呈现HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高表达。

合适的白血病细胞包括，例如，来自白血病患者的淋巴细胞或髓细胞。合适的非白血病对照细胞，特别是非白血病CD34⁺对照细胞，包括，例如，来自非白血病供体(如健康、无疾病供体)的淋巴细胞或髓细胞，或一个或多个细胞系，如CD34⁺细胞系，包括，例如，Kasumi-1细胞系。与其来源或属性无关，将理解合适的非白血病对照组织样品或细胞将不显示在白血病患者组织样品或细胞中测试为升高表达的特定HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高水平。

已经描述了用于检测HOX簇和HOX簇相关基因表达的升高表达的方法。例如，Armstrong等，Nat.Genet.30(1)：41-47(2002)和美国专利公开No.2009/0324618描述了通过使用对每个HOX簇基因或HOX簇相关基因特异性的引物对从总RNA扩增cDNA来检测和定量HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9和HOXA10以及HOX簇基因相关辅因子MEIS1。Ferrando等，Blood102(1)：262-268(2003)和Ferrando等，Cancer Cell 1：75-87(2002)描述了定量实时逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法来定量致癌转录因子HOX11和HOX11L2的表达。

现在进一步详细描述可以容易地适用于检测HOX簇和HOX簇相关基因的升高表达的定量表达水平的这些和其他方法。

微阵列分析

可以通过从白血病患者和/或对照供体组织样品或细胞分离的RNA的微阵列分析来检测和定量升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达。微阵列是用于同时评估多个HOX簇和HOX簇相关基因的表达水平的有效方法。但，由于其灵敏度有限，微阵列方法不能精确测定低丰度基因的绝对组织分布，或由于信号饱和，可能低估升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达的程度。对于那些通过微阵列表达谱分析显示出升高表达的基因，可以使用一种或多种定量PCR方法进行进一步的分析，所述方法如，例如，基于Tapman^TM探针检测(Invitrogen LifeSciences，Carlsbad，CA)，或荧光染料SYBR Green的RT-PCR，两者都提供更大的灵敏度动态范围。

简言之，微阵列分析包括使用与待检测和/或定量其表达的每个HOX簇和HOX簇相关基因内的编码序列和/或每个非HOX簇和非HOX簇相关基因内的编码序列杂交的引物对来PCR扩增从白血病患者或从对照供体组织样品或细胞提取的RNA。将PCR产物以阵列形式点在载玻片上，每个PCR产物占据阵列中独特的位置。然后将RNA逆转录，产生荧光标记的cDNA探针。扫描用荧光标记的cDNA探针探测的微阵列，并测量荧光强度。荧光强度的水平与杂交强度相关，杂交强度与基因表达的相对水平相关。

可以使用商业上可购得的微阵列(例如，U133A芯片；Affymetrix，Santa Clara，CA)或使用定制微阵列来进行HOX簇和HOX簇相关基因表达分析。或者，可以使用Synteni微阵列(Palo Alto，Calif.)根据制造商的说明和按照Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10614-10619(1996)和Heller等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：2150-2155(1997)所述的，检测升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达。可以根据Abraham等，Blood 105：794-803(2005)中所述的方法来进行微阵列杂交。

可以使用商业算法(例如，Affymetrix Microarray Suite 5.0算法)或定制算法将探针水平数据归一化。可以将HOX簇和HOX簇相关基因表达强度值以及非HOX簇和非HOX簇相关基因表达强度值对数转换、中值居中和/或使用商业上可购得的算法(例如，GeneSpring 7.3.1 GX；Agilent Technologies，Santa Clara，CA)或定制算法来分析。

多种因素可以用于评估HOX簇和HOX簇相关基因表达分析的质量，如，例如，GAPDH3’∶5’比例和肌动蛋白3’∶5’比例。尽管理想的3’∶5’比例为1，但管家基因的该比例不应当超过3。

可以使用Welch’s ANOVA(方差分析)，使用通过应用基于来自GeneSpring内可得的1的偏差的交叉基因误差模型计算的方差来测定升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达。这可以克服与单个样品相关的重复和方差的缺失，并且可以认为原则上与方差过滤相似。可以使用分级凝聚算法进行无监督聚类。Pearson’s相关系数和质心联接可以分别用作相似性和联接方法。

为了检测样品之间可能的差异，可以从个体样品之间具有1.5倍表达差异和/或使用Benjamini-Hochberg多重检验校正通过Student’s t检验在0.05的校正P值下统计学显著的数据集提取基因。可以评估差异表达基因的基因本体(GO)富集(例如，使用GeneSpring)。

定量PCR

根据如白血病组织样品中存在的白血病细胞的相对数量和/或组织样品中各白血病细胞内的HOX簇和HOX簇-相关基因表达水平这样的因素，可以优选进行定量PCR分析以检测和/或定量HOX簇和HOX簇-相关基因表达的水平。

例如，在基于PCR的试验中，可以使用至少两个寡核苷酸引物来扩增源自白血病组织样品或细胞和/或非白血病对照供体组织样品或细胞的至少一部分的HOX簇或HOX簇相关基因mRNA和/或非HOX簇/非HOX簇相关基因mRNA，或相应的cDNA。寡核苷酸引物中的至少一个对于HOX簇和HOX簇相关基因特异性的核酸部分片段是特异性的并与其杂交。扩增的cDNA可以在检测前任选经历片段化步骤，如，例如，凝胶电泳。

RT-PCR是定量PCR方法，其中结合反转录来进行PCR扩增。从组织样品或细胞，如血液、淋巴结、骨髓和/或肿瘤活检样品，提取RNA，并逆转录来产生cDNA分子。使用至少一个特异性引物的PCR扩增来扩增cDNA分子，其可以使用例如凝胶电泳来分离和显现。可以对从患者和作为阴性对照的健康个体获取的组织样品或细胞进行扩增。可以对跨过两个数量级的几个cDNA稀释度进行扩增反应。与非白血病健康对照供体样品的相同稀释度相比，测试白血病患者样品的几个稀释度中至少约三倍、至少约五倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或更高的表达提高通常认为是阳性的。

可以通过使用定量实时PCR方法来进一步表征或可选地初始检测和/或定量HOX簇和HOX簇相关基因表达。Gibson等，Genome Research 6：995-1001(1996)和Heid等，GenomeResearch 6：986-994(1996)。实时PCR是评估扩增过程中PCR产物累积水平的技术。这种技术允许定量评价估多个样品中的mRNA水平。通过这种方法，白血病组织样品或细胞可以与相应的非白血病对照供体样品或细胞和/或一组不相关的正常非白血病组织样品或细胞一起测试。

实时PCR可以例如在ABI 7700 Prism或GeneAmp.RTM.5700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上进行。7700系统结合在一端具有5’荧光报告染料和另一端具有3’淬灭染料的特异性探针(Taqman^TM)使用正向和反向引物。当使用具有5’-3’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶进行实时PCR时，探针被切割并开始发荧光，从而允许通过荧光的增加来监控反应(实时)。5700系统使用只结合双链DNA的

(一种荧光染料)以及与7700仪器相同的正向和反向引物。可以根据引物表达程序(Applied Biosystems，FosterCity，CA)设计匹配的引物和荧光探针。最初通过本领域普通技术人员来确定引物和探针的最佳浓度。对照(例如，β-肌动蛋白-特异性的)引物和探针可以从例如Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)通过商购获得。

为了定量样品中的HOX簇和HOX簇相关基因表达的量，使用含有目标基因的质粒产生标准曲线。使用实时PCR中测定的Ct值产生标准曲线，所述Ct值与试验中使用的初始cDNA浓度相关。范围为10-10⁶拷贝的目标基因的标准稀释通常足够。此外，产生对照样品序列的标准曲线。这允许为了比较的目的将白血病组织样品或细胞的初始RNA含量相对于对照组织样品或细胞的量标准化。

可以按照本文中所述的，使用Trizol试剂从白血病组织样品或细胞和非白血病对照组织样品或细胞分离和提取总RNA。可以使用1-2μg的总RNA，利用SuperScript II逆转录酶(Life Technologies，Carlsbad，CA)在42℃下进行第一链合成一小时以产生全长cDNA。然后通过使用基于表1所示的、表1中引用的参考文献中公开的或本领域技术人员另外已知的和容易得到的HOX簇和HOX簇相关mRNA序列设计的HOX簇和HOX簇相关基因特异性的引物的PCR来扩增cDNA。

为了确保RT-PCR的定量特性，管家基因如β-肌动蛋白可以用作所检查的各白血病患者和非白血病对照供体组织样品和/或细胞的内部对照。制备第一链cDNA的连续稀释，并且使用β-肌动蛋白特异性引物进行RT-PCR试验。然后选择能够实现β-肌动蛋白模板的线性范围扩增并且足够灵敏来反映初始拷贝数差异的稀释度。使用这些条件，测定每个组织的每个逆转录反应的β-肌动蛋白水平。通过DNase处理和通过确认在使用没有添加逆转录酶的情况下制备的第一链cDNA时的阴性PCR结果来最小化DNA污染。

在使用Dynabeads mRNA直接微试剂盒(Invitrogen，Life SciencesTechnologies，Carlsbad，CA)的示例性RT-PCR反应中，在30μl总反应体积中测试了含有10⁵或更少细胞的样品；所述30μl总反应体积含有14.25μl H₂O；1.5μl BSA；6μl第一链缓冲液；0.75mL的10mM dNTP混合物；3μl Rnasin；3μl的0.1M dTT；和1.5μl Superscript II。将所得溶液在42℃下孵育1小时，在H₂O中1∶5稀释，在80℃下加热2min以从珠子分离cDNA，并且将其立即放置在MPS上。将含有cDNA的上清液转移至新的管中，并储存在-20℃。

RNA测序

可以通过白血病患者组织样品或细胞和/或非白血病供体对照组织样品或细胞中的mRNA的直接测序来测定一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达。或者，可以在通过逆转录将mRNA转化成cDNA后测定一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达。

真单分子测序(Ture Single Molecule Sequencing)(tSMS^TM)和/或直接RNA测序(Direct RNA Sequencing)(DRS^TM)是可以容易地适应于检测和定量一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的表达的用于定量基因表达的有用技术。这些边合成边测序技术可以在源自组织样品或细胞的mRNA上进行而不需要在先的逆转录或PCR扩增。

直接RNA测序技术(Helicos BioSciences Corporation，Cambridge，MA)和使用单分子直接RNA测序的转录组谱分析描述于Ozsoolak等，Nature 461(7265)：814-818(2009)以及Ozsolak和Milos，Methods Mol Biol 733：51-61(2011)。真单分子和直接RNA测序技术进一步描述于美国专利公开No.2008/0081330、2009/0163366、2008/0213770、2010/0184045、2010/0173363、2010/0227321、2008/0213770和2008/0103058以及美国专利No.7,666,593；7,767,400；7,501,245和7,593,109中，其每一篇全文通过引用并入本文。

可以通过利用基于HOX簇和HOX簇相关mRNA序列及非HOX簇和非HOX簇相关mRNA序列(例如，如表1所示的、表1中引用的参考文献内公开的或本领域技术人员另外已知和容易得到的)设计的特定测序引物，通过真单分子和直接RNA测序技术将HOX簇和HOX簇相关基因以及非HOX簇和非HOX簇相关基因编码的mRNA直接测序。

用于检测呈现升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达的白血病的方法

通常，可以基于已知与白血病相关的一个或多个基因的存在来检测白血病细胞，所述基因的子集也已知与升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达相关。根据本公开，通过施用一种或多种本文中所述的DOT1L抑制剂合适地治疗呈现MLL易位、MLL重排或MLL部分串联重复以外的已知或确定为与升高的HOX簇和HOX簇相关基因表达相关的一个或多个遗传突变、改变和/或其他异常的白血病患者。

这一章节描述了本领域技术人员公知并且可以容易用来检测组织样品或细胞中的一个或多个遗传突变、改变和/或其他异常的方法。这些方法包括，例如，核酸扩增和测序技术；核酸杂交技术，包括荧光原位杂交(FISH)。

表2和3示出了已知在突变或另外地改变时与患者的白血病相关的示例性基因。表2示出了那些与白血病相关的基因，包括NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1突变，以及NUP98-NSD1和其他NUP98易位，其已知在呈现一个或多个突变、重排和/或易位(除了MLL易位、MLL重排和/或MLL部分串联重复以外)时与细胞中一个或多个HOX簇和/或HOX簇相关基因的升高表达相关，所述升高表达是与正常CD34⁺骨髓细胞中相应的HOX簇和/或HOX簇相关基因的表达水平相比。

根据作为本发明基础的发现，白血病患者组织样品或细胞中来自表2的一个或多个白血病相关基因中的一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常的检测和/或存在预示其增殖和/或存活可以通过接触一种或多种DOT1L抑制剂来抑制、防止或终止的白血病组织样品或细胞。

因此，根据本公开，具有呈现出(1)表2所示的一个或多个白血病相关基因中的一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常和/或(2)确定(例如，根据本文中提供的方法)为与升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达相关的一个或多个白血病相关基因中的一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常的组织或细胞的白血病患者可以通过单独地、作为两种或多种DOT1L抑制剂的组合和/或进一步与另一种合适的治疗剂组合施用一种或多种DOT1L抑制剂(包括包含一种或多种DOT1L抑制剂的组合物或制剂)有利地进行治疗。用于白血病治疗的合适DOT1L抑制剂、组合物、制剂和其他合适的治疗剂在本文中更详细地描述，是本领域技术人员公知的，并描述于本文中引用的其每篇通过引用并入本公开的科学和专利文献中。

表3示出了已知在呈现一个或多个突变、重排和/或易位时与细胞中的HOX簇和/或HOX簇相关基因的升高表达不相关的那些白血病相关基因，所述升高表达是与正常CD34⁺骨髓细胞中相应的HOX簇和/或HOX簇相关基因的表达水平相比。

根据作为本发明基础的发现，白血病患者组织样品或细胞中来自表3的一个或多个白血病相关基因中一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常的检测和/或存在预示其增殖和/或存活不能通过接触一种或多种DOT1L抑制剂来抑制、防止或终止的白血病组织样品或细胞。

因此，根据本公开，具有呈现表3中的一个或多个白血病相关基因中的一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常，但没有同时呈现(1)表2中的一个或多个白血病相关基因中的一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常，(2)一个或多个MLL易位、MLL重排和/或MLL部分串联重复和/或(3)确定(例如，根据本文中提供的方法)为与升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达相关的一个或多个白血病相关基因中的一个或多个突变、重排、易位和/或其他遗传改变或异常的组织或细胞的白血病患者很可能不能通过施用一种或多种DOT1L抑制剂有利地治疗。

可以通过本领域公知的和由本领域技术人员按照需要容易使用的一种或多种基因检测方法来检测表2所示的NMP1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1基因的一个或多个的突变以及NUP98-NSD1和其他NUP98易位。

核酸扩增

可以通过利用基于表2所示的、表2中引用的参考文献内公开的或本领域技术人员另外已知和容易得到的NUP98、NSD1、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1序列设计的特异性引物对，将来自白血病或对照组织样品或细胞的基因组DNA进行PCR扩增。然后分离所得的PCR扩增子并进行测序和/或杂交反应以确定与白血病相关的NMP1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1基因中的任何已知突变及NUP98-NSD1和其他NUP98易位以及升高的HOX簇和/或HOX簇相关基因表达是否存在于相应的白血病患者的基因组DNA中。

如本文中使用的，术语“扩增”是指产生含有至少一部分预定的特异性靶核酸序列的靶核酸的多个拷贝。多个拷贝是指扩增子或扩增产物并可以与其互换使用。在本公开的特定方面中，扩增的靶标含有少于完整的靶mRNA序列(即，外显子和侧翼未翻译序列的剪接转录物)和/或靶基因组序列(包括内含子和/或外显子)。例如，可以通过使用与靶多核苷酸的内部位置杂交并且从靶多核苷酸的内部位置开始聚合的扩增引物扩增一部分靶多核苷酸来产生特异性的扩增子。扩增的部分含有可以使用多种公知方法中的任何一种来检测的可检测靶序列。

许多公知的核酸扩增方法需要热循环以交替地使双链核酸变性和与引物杂交；然而，其他公知的核酸扩增方法是等温的。聚合酶链式反应(PCR；描述于美国专利No.4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188中)使用变性、引物对与相对链的退火和引物延伸的多个循环以按指数增加靶序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变型中，使用逆转录酶(RT)从mRNA制备互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝。

连接酶链式反应(LCR；Weiss，Science254：1292(1991))使用两组互补DNA寡核苷酸(其与靶核酸的邻近区域杂交)。DNA寡核苷酸通过DNA连接酶在热变性、杂交和连接的重复循环中共价连接来产生可检测的双链连接寡核苷酸产物。

链置换扩增(SDA；Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：392-396(1992)；美国专利No.5,270,184和5,455,166)使用将引物序列对与靶序列的相对链退火、在dNTPαS的存在下的产生双链体半硫逐磷酸酯化的引物延伸产物的引物延伸、核酸内切酶介导的半修饰的限制性内切酶识别位点的切开和聚合酶介导的从切口3’端的引物延伸以置换现有的链并产生用于下一轮引物退火、切开和链置换的链的循环，从而获得产物的几何扩增。嗜热SDA(tSDA)在基本上相同的方法中在较高温度下使用嗜热核酸内切酶和聚合酶(EP专利No.0684315)。

其他扩增方法包括：基于核酸序列的扩增(美国专利No.5,130,238)，通常称为NASBA；使用RNA复制酶来扩增探针分子自身的方法(Lizardi等，BioTechnol6：1197-1202(1988))，通常称为Qβ复制酶；基于转录的扩增方法(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173-1177(1989))；自持序列复制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1874-1878(1990))；和转录介导的扩增(美国专利No.5,480,784和5,399,491)，通常称为TMA。对于已知扩增方法的进一步讨论参见Persing，“InVitro Nucleic Acid Amplification Techniques(体外核酸扩增技术)”，在DiagnosticMedical Microbiology：Principles and Applications(诊断医学微生物学：原理和应用)，pp.51-87(Persing等编辑；American Societyfor Microbiology(美国微生物学会)，Washington，D.C.，1993)中。

在逆转录酶和RNA聚合酶存在下，TMA使用RNA聚合酶来产生靶区域的多个RNA转录物和与靶核酸杂交的“启动子-引物”以形成双链启动子，RNA聚合酶从其产生RNA转录物。在能够与RNA转录物杂交的第二引物的存在下，这些转录物变成下一轮TMA的模板。与需要热变性的PCR、LCR或其他方法不同，TMA是等温方法，其利用RNase H活性来消化RNA：DNA杂合体的RNA链，由此使得DNA链可用于与引物或启动子-引物的杂交。通常，使用与用于扩增的逆转录酶相关的RNase H活性。

在说明性的TMA方法中，一个扩增引物是包含位于靶结合序列的5’侧的启动子序列(其在双链时变成功能性的)的寡核苷酸启动子-引物，其能够与待扩增序列3’位置处的靶RNA的结合位点杂交。启动子-引物在对于T7RNA聚合酶识别具有特异性时可以称为“T7-引物”。在特定情况下，可以修饰启动子-引物或此类启动子-引物亚群的3’端以阻断或减少引物延伸。逆转录酶从未修饰的启动子-引物形成靶RNA的cDNA拷贝，同时RNase H活性降解靶RNA。第二扩增引物随后结合cDNA。这个引物可以称为“非-T7引物”以将其与“T7-引物”区分开来。从这一第二扩增引物，逆转录酶形成另一DNA链，产生在一端具有功能性启动子的双链DNA。

当形成双链时，启动子序列能够结合RNA聚合酶来开始与启动子-引物杂交的靶序列的转录。RNA聚合酶使用这个启动子序列来产生多个RNA转录物(即，扩增子)，通常约100至1,000个拷贝。每个新合成的扩增子可以与第二扩增引物退火。逆转录酶随后可以产生DNA拷贝，同时RNase H活性降解这个RNA：DNA双链体的RNA。启动子-引物随后可以结合新合成的DNA，允许逆转录酶形成双链DNA，RNA聚合酶从所述双链DNA产生多个扩增子。因此，使用两个扩增引物可以实现十亿倍的等温扩增。

对于在引物中不需要其他功能性序列的引物或扩增方法(例如，PCR扩增)，引物序列包括靶结合序列，而其他方法(例如，TMA或SDA)包括邻接靶结合序列的另外的专门序列(例如，邻接启动子-引物中的靶结合序列的RNA聚合酶启动子序列或用于SDA引物的限制性核酸内切酶识别序列)。

本领域技术人员将认识到本公开的所有引物和探针序列可以商购或使用标准体外合成方法合成。此外，将认识到本领域技术人员可以使用常规方法修饰本文中公开的引物序列以增加另外的专门序列(例如，启动子或限制性核酸内切酶识别序列)，使得引物易于用于各种扩增方法。相似地，可以通过除去启动子序列来修饰本文所述的启动子-引物序列以产生实质上是易用于不使用这些另外的功能性序列的扩增程序的靶结合序列的扩增引物。

“靶序列”是指核酸链的核苷酸碱基序列，其至少一部分能够用本文所述的方法中的引物和/或探针来检测，如标记的寡核苷酸探针。引物和探针结合靶序列的一部分，其在靶序列是双链核酸时包括任一互补链。

“等同RNA”是指具有与脱氧核糖核酸(DNA)相同的核苷酸碱基序列(其中用合适的U替代T)的核糖核酸(RNA)。相似地，“等同DNA”是具有与RNA相同的核苷酸碱基序列(其中用合适的T替代U)的DNA。本领域技术人员将认识到术语“核酸”和“寡核苷酸”是指具有DNA或RNA碱基序列的分子结构或DNA和RNA碱基序列的合成组合，包括其类似物，其包括“无碱基(abasic)”残基。

“检测”扩增产物或扩增子是指用于测定扩增核酸的存在的多种方法中的任一种，如，例如，将标记探针与扩增产物的一部分杂交。标记探针是特异性结合另一个序列并含有可检测基团的寡核苷酸，所述可检测基团可以为例如荧光部分、化学发光部分、放射性同位素、生物素、抗生物素蛋白、酶、酶底物或其他反应性基团。标记探针可以包括吖啶酯(AE)部分，其可以在合适的条件下通过化学发光来检测(例如，如美国专利No.5,283,174中所述)。

其他公知检测技术包括，例如，扩增子的凝胶过滤、凝胶电泳和显影，以及高效液相色谱(HPLC)。检测步骤可以是定性或定量的。

用于纯化和检测靶多核苷酸的试验常常涉及在固体支持物上捕获靶多核苷酸。固体支持物在靶多核苷酸纯化程序的一个或多个洗涤步骤过程中保留靶多核苷酸。一种技术涉及通过固定于固体支持物上的多核苷酸捕获靶多核苷酸及检测探针与捕获的靶多核苷酸杂交(例如，美国专利No.4,486,539)。未与靶多核苷酸杂交的检测探针容易从固体支持物洗掉。因此，保留的标记与最初存在于样品中的靶多核苷酸相关。

另一种技术使用与靶多核苷酸和固定于固体支持物上的多核苷酸两者杂交的介体多核苷酸，使得介体多核苷酸将靶多核苷酸结合至固体支持物而产生结合的靶标(例如，美国专利No.4,751,177)。标记探针可以与结合的靶标杂交并且未结合的标记探针可以从固体支持物洗掉。

本公开的引物和探针可以用于使用通过多种公知和确定的方法中的任何一种分离的核酸物质的扩增和检测方法中(例如，Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(分子克隆，实验室手册)，第2版，pp.7.37-7.57(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)；Lin等，“Simple and Rapid SamplePreparation Methods for Whole Blood and Blood Plasma(用于全血和血浆的简单快速样品制备方法)”，见Diagnostic Molecular Microbiology，Principles andApplications(诊断分子微生物学，原理和应用)，pp.605-616(Persing等编辑，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.，1993)。

在一个说明性的实例中，可以通过以下程序来制备靶mRNA以产生易用于扩增的mRNA。简言之，通过将细胞悬浮液接触裂解液来裂解组织样品或细胞(例如，外周血或骨髓细胞)，所述裂解液含有至少约150mM可溶性盐如卤化锂、螯合剂和有效量的非离子型去污剂，以裂解细胞的细胞质膜而不引起核DNA或RNA的实质性释放。

将细胞悬浮液和裂解液以约1∶1至1∶3的比例混合。裂解液中的去污剂浓度为约0.5-1.5％(v/v)。多种已知的非离子型去污剂中的任何一种在裂解液中都是有效的(例如，

-型、

-型和NP-型)；通常，裂解液含有辛基苯氧基聚乙氧基乙醇去污剂，优选1％

X-102。

这个程序可以有利地与含有细胞悬浮液的白血病组织样品(例如，血液和骨髓)一起使用，但如果使用标准切碎、筛选和/或蛋白水解方法分离细胞以将细胞单个分开或分成小块而，其对其他组织也同样可以发挥良好作用。

细胞裂解后，释放的总RNA是稳定的，并且可以在没有另外的RNase抑制剂的情况下在室温下存储至少2小时而没有明显的RNA降解。总RNA可以用于扩增而不需要进一步纯化，或mRNA可以使用通常依赖于mRNA的聚A部分的结合亲和性的标准方法来分离。

在本公开的特定方面中，mRNA分离使用捕获颗粒，其包括连接于不溶性颗粒的聚-dT寡核苷酸。将捕获颗粒加入上述裂解混合物中，聚-dT部分与聚-A mRNA退火，并且颗粒通过物理方法从混合物中分离。通常，可以使用超顺磁性颗粒并通过在容器外施加磁场来分离。例如，将约300μg具有以约1至100pmol/mg，或10至100pmol/mg，或10至50pmol/mg的密度连接的dT₁₄或dT₃₀的颗粒(在140mM NaCl的标准磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，pH 7.4)加入约1ml的裂解混合物中。

可以使用任何超顺磁性颗粒，尽管通常颗粒是涂覆胶乳或二氧化硅的磁石核心(例如，可从Serodyn或Dynal商购得)，聚-dT寡核苷酸使用标准程序与其连接(Lund等，Nuc.Acids Res.16：10861-10880(1988))。将含有该颗粒的裂解混合物温和混合并在约22-42℃下孵育约30分钟，之后在试管外施加磁场以将连接有mRNA的颗粒从混合物中分离并除去上清液。使用标准重悬浮方法和如上所述的磁性分离，将颗粒洗涤一次或多次，通常为三次。然后，将颗粒悬浮于缓冲液中并可以立即用于扩增或冷冻储存。

可以改变多种参数而不实质性影响样品制备。例如，可以改变颗粒洗涤步骤的次数或颗粒可以通过其他方式(例如，过滤、沉淀、离心)从上清液分离。固体支持物可以具有固定于其上的与特定靶序列互补的核酸捕获探针，或可以使用非特异性结合靶核酸的任何颗粒或固体支持物(例如，美国专利No.5,599,667中所述的多阳离子支持物)。

为了扩增，分离的RNA使用标准低盐洗脱方法从捕获颗粒释放，或通过使用结合于不涉及与聚-dT的碱基配对或与固相基质的其他相互作用的RNA区域的引物，在保留在颗粒上的同时进行扩增。上述的精确体积和比例不是关键的，而是可以改变，只要不发生明显的核物质释放。对于小规模制备，优选涡旋混合，但其他混合程序也可以替代。然而，重要的是对源自白血病患者组织或非白血病对照供体组织的样品进行处理以防止凝聚，并且裂解液的离子强度为至少约150mM，优选150mM至1M，因为较低的离子强度导致核物质污染(例如，DNA)，其提高粘度并且可能干扰扩增和/或检测步骤而产生假阳性。在裂解液中优选锂盐以防止RNA降解，尽管其他可溶性盐(例如，NaCl)结合一种或多种已知的RNase抑制剂同样有效的。

或者，扩增技术，如上述的那些，可以用于获得一个或多个NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因的至少一部分和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位。一种这样的扩增技术是反向PCR(参见Triglia等，Nucl.Acids.Res.16：8186(1988))，其使用限制性内切酶来产生已知基因区域中的片段。然后通过分子内连接将片段环化，并且将其用作PCR的模板，所述PCR使用源自已知区域的多样化引物。

在替代的方法内，可以通过使用接头序列的引物和对已知区域特异性的引物的扩增获取邻接部分序列的序列。通常使用相同接头引物和对已知区域特异性的第二引物将扩增的序列进行第二轮扩增。使用从已知序列以相反方向开始延伸的两个引物的这一程序的变型描述于PCT专利公开No.WO 1996/038591中。

另一个这样的技术是“cDNA末端的快速扩增(rapid amplification of cDNAends)”或RACE，其使用内部引物和外部引物(其与已知序列的5’或3’的序列杂交)。另外的技术包括捕获PCR(Lagerstrom等，PCR Methods Applic.1：111-119(1991))和步移PCR(Parker等，Nucl.Acids.Res.19：3055-3060(1991))。使用扩增的其他方法也可以用于获得全长cDNA序列。

众多的标记和偶联技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于各种核酸试验中。用于产生用于检测与多核苷酸相关序列的标记杂交或PCR探针的方法包括寡标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，可以将序列或其任何部分克隆至用于产生mRNA探针的载体。这样的载体是本领域已知的，是可商购的，并且可以通过添加合适的RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和标记核苷酸用来在体外合成RNA探针。可以使用各种可商购的试剂盒进行这些程序。可以使用的合适报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光、化学发光或发色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。

核酸测序

链终止方法是由Frederick Sanger首先研发的，可以称为Sanger测序方法。在链终止方法中，进行四个PCR反应，其中每个反应掺入单一双脱氧核苷酸(ddNTP)，所述双脱氧核苷酸是缺乏3’羟基的核苷酸(例如，ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。当ddNTP并入DNA的新链时，新链的合成被停止；这产生了可变长度寡核苷酸的混合物，其可以使用例如平板凝胶或毛细管中的DNA凝胶电泳通过大小来解析。许多检测方法可以用于读取DNA序列，如通过四个反应中的每一个的寡核苷酸的相对长度确定，例如，放射自显影、UV光检测或荧光染料检测。染料终止方法是链终止方法的变型，用不同颜色的荧光染料标记各类型的ddNTP(例如，ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。这使得能够在单个PCR反应中对DNA进行测序。

大规模平行签名测序(MPSS)是可以用于本文公开的方法中的高通量测序方法。其是基于珠子的方法，利用适配子连接，接着适配子解码以产生成千上万个短DNA序列。关于这种技术的更多信息可见于Brenner等，Nat Biotechnol.18(6)：630-34(2000)；Reinartz等，Brief Funct Genomic Proteomic.1(1)：95-104(2002)；和美国专利No.6,013,445。

聚合酶克隆测序是根据本文公开的方法可以使用的另一种高通量测序技术。聚合酶克隆测序结合了乳液PCR、自动化显微镜和基于连接的测序化学。关于这种技术的更多信息可见于美国专利公开No.2009/0318298、2011/0172127、2010/0047876和2009/0099041以及美国专利No.7,425,431。

454焦磷酸测序是可以用于本文公开的方法中的高通量测序方法。在454焦磷酸测序中，DNA在油溶液的小水滴内部扩增(乳液PCR)，每个水滴含有连接于单一引物覆盖的珠子的单一DNA模板，从而形成克隆群体(clonal colony)。测序仪含有许多皮升体积的孔，每个含有单个珠子和测序酶。用荧光素酶产生的光来检测添加到新生DNA的单个核苷酸，将合并的数据用于产生序列读出。关于这种技术的更多信息可见于美国专利No.6,210,891和7,648,824。

在本文公开的方法中有用的高通量测序方法是利用可逆染料终止剂的边合成边测序(SBS)技术(

San Diego，CA)。首先将单链多核苷酸连接于载玻片上的引物并扩增，使得形成局部克隆群体。加入四种不同标记的ddNTP，按照一个碱基对延伸新生多核苷酸，之后洗掉未结合的核苷酸。记录载玻片的图像，并且基于荧光信号的颜色确定每个新生DNA分子的末端核苷酸。然后，通过化学方法从DNA除去染料和末端3’封闭剂，从而允许下一个循环。关于这种技术的更多信息可见于美国专利No.7,985,565；7,115,400；7,972,820和7,790,418以及美国专利公开No.2008/0286795、2002/0055100和2007/0015200。

SOLiD(通过寡核苷酸连接和检测的测序)测序是另一种可以用于本文公开的方法中的高通量测序方法(Applied Biosystems)。这种方法涉及多轮通过连接的测序，其中每个连接探针的长度为八个碱基，并且在两个连接反应中有效探测每个碱基。基于通过相机捕获的荧光数据进行碱基判定(base call)。关于这种技术的更多信息可见于美国专利公开No.2009/0181860和美国专利No.7,851,158。

离子半导体测序可以是根据本文中公开的方法有用的高通量测序技术。在离子半导体测序中，检测在DNA聚合过程中释放的氢离子。用单一多核苷酸充满含有单个模板DNA链的微孔，所述单一多核苷酸如果与模板链的前导核苷酸互补则并入DNA的新链中。所检测的氢水平可以用于检测超过一个核苷酸的插入，例如，在多核苷酸重复的区域中。关于这种技术的更多信息可见于美国专利No.7,242,241；7,888,015；7,649,358；7,686,929和8,114,591以及美国专利公开No.2010/0159461。

DNA纳米球测序是可以用于本文公开的方法中的另一种有用的高通量测序技术。在这种技术中，使用滚环复制从DNA片段产生DNA纳米球。然后，可以将DNA纳米球锚定在微阵列流动池中，其中使用称为通过连接的解链测序的过程来产生以长度计约10的阅读片段(Complete Genomics)。更多信息可见于美国专利公开No.2009/0011943、2009/0270273、2011/0268347和2009/0264299。

根据本文中公开的方法，可以从源自组织样品的多核苷酸(例如，DNA、RNA、mRNA、cDNA等)构建双端标签文库，并用于高通量测序技术以提高序列组装的速度和/或准确性。核苷酸可以利用基于捕获的技术测序；或者，核苷酸可以在PCR扩增后测序。在测序前，可以用硫酸氢盐处理核苷酸以鉴别甲基化序列。在测序前，可以利用甲基化特异性的PCR确定特定基因座是否被甲基化。可以使用双端全外显子组测序(WES)、浅配对全基因组测序(shallow mate-pair whole genome sequencing)(sMP-WGS)和/或双端RNA测序(RNAseq)对源自白血病样品的多核苷酸测序。可以使用

测序对源自白血病样品的多核苷酸测序。

荧光原位杂交

可以通过荧光原位杂交(FISH)检测白血病组织样品或细胞内NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列中一个或多个的突变和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位。

FISH是可以用于检测和定位染色体上特定DNA序列的存在或不存在的细胞遗传学技术。FISH使用荧光标记的核酸探针，其只结合对于它们显示出高度序列互补性的染色体的那些部分。因此，FISH可以用于定位组织或细胞内(例如，特定染色体上或特定细胞内)的特定核苷酸序列。因此，可以利用FISH来进行核型分析以及通过包括一个或多个NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位的染色体材料的增加或损失来检测易位、重排、重复和拷贝数变化。FISH还可以用于检测和定位白血病组织和细胞中的特定RNA靶标，包括mRNA，并可以用于确定白血病组织和细胞内基因表达的空间-时间模式。

FISH可以用于定位组织或细胞内的mRNA，由此检测基因的表达，如携带与白血病相关的突变(包括NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列的一个或多个的突变和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位)的基因。

可以设计易于与FISH技术一起使用的探针来检测NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列的一个或多个的一个或多个突变和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位和/或使白血病组织或细胞中由NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列的一个或多个和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位编码的mRNA可见。

合适的探针含有NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列中的一个或多个和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位的至少约20个连续核苷酸的双链体并且可以源自通过那些基因组序列的一个或多个内的区域的扩增产生的PCR扩增子。探针必须足够大以与其靶序列特异性地杂交，但不能太大以致妨碍杂交过程或非特异性地结合非靶标序列。沿着整个染色体杂交的探针序列的混合物可以用于检测基因易位或鉴定染色质的染色体外片段。可以通过使用带标签的核苷酸的PCR利用切口平移来获得探针的荧光标记。

将福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)或冷冻的组织切片固定，然后渗透以获得靶标访问。制备间期或中期染色体，将其连接至固体基质，如玻璃载玻片。然后将探针应用于染色体DNA，并孵育大约12小时以允许靶标特异性探针与靶mRNA和/或基因组DNA杂交。几个洗涤步骤除去了未杂交的或部分杂交的探针。然后通过荧光显微镜观察和/或定量靶标特异性的杂交，所述荧光显微镜使用激发荧光染料和记录图像的技术。

对DNA的特定区域(基因座)特异性的较小探针的混合物可以用于检测缺失突变。当与特定颜色结合时，基因座特异性探针混合物用于检测非常特定的易位。

QuantiGene ViewRNA FISH是用于检测和定量福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织样品和细胞中的RNA分子的技术。ViewRNA FISH探针允许单分子RNA灵敏度而几乎没有背景。每个寡核苷酸对使用分支DNA(bDNA)信号扩增技术形成用于通过一系列顺序杂交步骤装配信号扩增结构(树)的平台。每个完全装配的结构涵盖靶核酸的40-50bit/s的空间，并且具有用于400倍信号扩增的能力。

Stellaris FISH(也称为单分子RNA FISH)是一种检测和定量薄组织样品中的mRNA和其他长RNA分子的方法。通过应用多个短的单一标记的寡核苷酸探针，可以将靶标容易地成像。多达48个荧光标记的寡核苷酸与单个mRNA分子的结合提供了足够的荧光以在宽视场荧光显微镜图像中准确地检测和定位每个靶mRNA。未结合预期核苷酸序列的探针没有获得足够的定位荧光以与背景区分开。单分子RNA FISH分析可以单一地或多重地进行，并且可以用作定量PCR的后续实验或与荧光抗体分析同时成像。

纤维FISH是其中将间期染色体连接于载玻片以使得它们以直线延伸而不是如常规FISH中那样紧密卷曲或如间期FISH中那样采取随机构象的技术。这通过沿着载玻片的长度施加机械剪切力(例如，通过染色体梳理)于固定于载玻片的细胞然后裂解，或施加于纯化DNA的溶液来完成。染色体的伸展构象允许明显更高的分辨率，即使降至几千碱基。

以下是本文中描述的技术以及本领域已知和可用于检测基因组序列内的突变的其他技术的示例性应用。特别地，以下描述了本文中公开的MLL-易位和MLL-部分串联重复以及NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因组序列的一个或多个内的多种突变和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位的检测。本领域技术人员将认识到，通过调整本文中描述和举例说明的技术，本文中所述的各种技术可以广泛地用于其他基因和其他突变。

MLL-易位和MLL-部分串联重复(PTD)

具有MLL-易位和MLL-部分串联重复(PTD)的淋巴母细胞性白血病的基因表达谱具有显著的一致性，与其他白血病的那些明显不同，并且认为是称为MLL(“混合谱系白血病”)的截然不同的疾病。用于检测MLL-易位的方法描述于美国专利公开No.2006/0057630。使用主成分分析的表达谱的评估将MLL与常规ALL以及AML区分开来。具有明确不利预后的人急性白血病的子集具有涉及染色体区段11q23上的混合谱系白血病(MLL、HRX、AU-1)基因的染色体易位。跨过人MLL-基因易位断裂点的DNA区段如SEQ ID NO：25所示。

用于检测MLL-初级串联重复(PTD)的方法描述于美国专利公开No.2007012687；Whitman等，Blood 106：345-352(2005)和Caligiuri等，Cancer Res.58：55-59(1998)。这样的PTD已经描述于，例如，Strout，M.P.等，PNAS(USA)95：2390-2395，(1998)，其通过引用并入。用于筛选MLL-PTD的方法包括巢式RT-PCR和Southern印迹。可以按照Caligiuri等，Cancer Res.56(6)：1418-1425，(1996)之前所述的进行常规巢式逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。然后将克隆的PCR产物测序。

MLL-PTD也可以通过定量实时RT-PCR(QRT-PCR)来检测。设计引物对和双重标记的探针组来扩增对于MLL-PTD独特的或MLL PTD和MLL WT转录物共有的位点。可以设计引物和探针组来扩增2个最常见的MLL PTD形式特异性的“独特扩增子”外显子11至外显子5或外显子12至外显子5融合体，以及扩增存在于MLL-PTD和MLL WT转录物中的“共有扩增子”外显子11至外显子12、外显子13至外显子14和外显子26至外显子27接合体。可以构建标准曲线以允许测量靶扩增子拷贝数。然后可以使用ABI Prism 7700序列检测系统(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)收集QRT-PCR数据。

可以按照Nakamura等，Mol.Cell.10：1119-1128(2002)所述的，进行检测p300-kDaMLL WT和p420-kDa MLL PTD N-末端片段的免疫印迹分析。简言之，将核提取物在4.9％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中进行大小分级。转移后，用抗-MLL 170抗体探测膜，所述抗体是针对N-末端p300MLL WT翻译后切割产物的亲和性纯化的抗-MLL抗体。蛋白质可以使用增强的化学发光Plus(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)来观察。

可以使用http：//www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/中描述的算法和MLL基因组序列(NCBI GenBank登录号NT033899.6)来鉴定MLL 5，-CpG岛。可以按照之前所述的，通过基因组DNA的亚硫酸氢盐PCR测序(BS-PCR)来评估甲基化状态。Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1992)。可以优化PCR以最小化偏向非甲基化序列扩增的偏差的可能。然后可以从琼脂糖凝胶纯化单一PCR产物，将其克隆至pCR2.1克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。在本实例中，每个PCR将评估最少10个克隆。

设计MLL-特异性引物对来扩增MLL转录启动位点上游的区域(核苷酸-168至-2)。为了归一化，可以使用之前Barlev等，Mol Cell.8：1243-1254(2001)中所述的GAPDH启动子特异性引物进行管家基因(如GAPDH)的ChIP分析。可以优化PCR条件以使得在扩增的指数期检测产物。可以使用SybrGreen染料和实时PCR进行相对定量。可以使用比较实时PCR(2^-ΔΔCT)方法，首先归一化至输入DNA，接着归一化至相对于对照水平的缩酚肽处理的水平。

NPM1突变

核仁磷酸蛋白NPM1中的突变是急性骨髓性白血病(AML)中最常获得的分子异常。在大约35％的原发性AML病例中，突变存在于编码NPM1基因的外显子12中，并且通常包括四个核苷酸插入，其导致移码，最后使NPM1蛋白的7个C-末端氨基酸被11个不同的残基替代。已经表明2个C-末端色氨酸残基中的1个和最终9个氨基酸(即，AVEEVSLRK)中的最后5个残基(即，VSLRK)的破坏对于NPM1突变体功能是重要的。Falini等，N.Engl.J.Med.352：254-266(2005)和Verhaak等，Blood 106(12)：3747-3754(2005)。

可以通过本领域公知的多种方法来检测NPM1中的突变，例如Verhaak等，Blood106(12)：3747-3754(2005)中所述的那些方法。可以从白血病细胞分离RNA，并且按照之前所述的进行cDNA合成。Valk等，N.Engl.J.Med.350：1617-1628(2004)以及Van der Reijden和van der Poel等，Hematol.J.2：206-209(2001)。

例如，在含有25mM三磷酸脱氧核糖核苷[dNTP]、15pmol引物、2mM MgCl₂、Taq聚合酶和10×缓冲液[InVitrogen Life Technologies，Breda，The Netherlands]的反应中，使用引物NPM1-FOR 5’-CTTCCGGATGACTGACCAAGAG-3’和引物NPM1-REV 5’-CCTGGACAACATTTATCAAACACG-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来确定外显子12中的NPM1突变。用于NPM1突变检测的循环条件可以包括1个循环，94℃5分钟；30个循环，94℃1分钟，58℃1分钟和72℃1分钟；和1个循环，72℃7分钟。

使用Transgenomics(Omaha，NE)WAVE dHPLC系统(Choy等，Ann.Hum.Genet.63(pt 5)：383-391(1999))使PCR产物进行dHPLC，并且样品在56℃和58℃下运行。可以针对显示出异常高效液相色谱(dHPLC)图谱的样品确认精确的NPM1突变体序列，并且可以使用Multiscreen-PCR 96孔系统(Millipore，Bedford，MA)纯化PCR产物，接着使用ABI-PRISM3100遗传分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)用NPM1-REV直接测序。每个NPM1突变的变体揭示特定的dHPLC WAVE谱。因此，可以基于特定的dHPLC WAVE谱预测各个类型的NPM1突变。

基因表达谱测定是将患有AML的个体全面归类并进一步解析AML的异源性质的强有力方式。Valk等，Curr.Opin.Hematol.12：76-81(2005)。已经使用基因表达谱测定研究了突变体NPM1的影响，并且揭示了NPM1突变的独特特征。Alcalay等，Blood 106：899-902(2005)。在具有之前确定的基因表达印记的AML特定亚型中具有NPM1突变簇的AML病例与同源框基因特异性表达特征高度相关，并且可以高准确性预测。在这个特征中起作用的是同源框(HOX)转录因子的几个含同源域的家族成员。

还可以通过使用Affymetrix HGU133A GeneChips(Affymetrix，Santa Clara，CA)的基因表达谱测定和非监督聚类分析来分析白血病细胞。Valk等，N Engl J Med.350：1617-1628(2004)。可以使用OmniViz(Maynard，MA)的相关性观察工具(版本3.6)来进行基于基因表达谱的非监督聚类分析。可以将OmniViz中计算的Pearson相关性值输入MicroArray Data Explorer(MADEx)中并用于观察OmniViz非监督聚类结果和其他参数(如，来自白血病患者的细胞的临床和分子特征)之间的关系。MADEx是以安全和可扩展方式储存、挖掘和显现微阵列数据的数据库系统。

主要的同源框(HOX)基因特异性的特征与携带NPM1突变的AML强烈相关。此外，HOXA和HOXB基因家族的成员，以及HOX基因相关的三氨基酸环延伸(TALE)基因，PBX3和MEIS1的表达升高。

可以使用PAM算法进行NPM1突变预测分析。Tibshirani等，Proc Natl Acad SciUSA.99：6567-6572(2002)。将AML样品随机分配给由没有NPM1突变的样品和具有NPM1突变的样品组成的训练组和由缺乏NPM1突变的样品和具有NPM1突变的样品组成的验证系列。可以使用交叉验证来预测具有独特特征的训练组NPM1突变AML病例的NPM1突变状态，因此预测具有高准确性。具有突变NPM1的AML病例呈现出强的HOX基因特异性的SAM和PAM特征。之前的研究已经证明对于许多HOX基因，持续的过表达以及与蛋白结合伴体MEIS1的共表达导致白血病。Daser和Rabbitts，Semin.Cancer Biol.15：175-188(2005)。

NUP98-NSD1易位

在AML中，再现的t(5；11)(q35；p15.5)易位将含核受体-结合SET结构域的蛋白1(NSD1)与核孔蛋白98(NUP98)融合。Cerveira等，Leukemia 17：2244-2247(2003)。NUP98-NSD1在体内诱导AML并且在体外维持骨髓干细胞的自我更新。Wang等，Nat Cell Biol 9：804-812(2007)。

机械地，NUP98-NSD1复合物结合HOXA7和HOXA9附近的基因组元件，并且在分化过程中通过调控组蛋白H3Lys 36(H3K36)甲基化和组蛋白乙酰化维持EZH2-介导的HOXA基因座的转录抑制。Wang等，Nat Cell Biol 9：804-812(2007)。导致甲基转移酶活性失活的NUP98FG-重复结构域的缺失或NSD1中的突变阻止了HOXA基因激活和髓样祖细胞的无限增殖，表明NSD1的甲基转移酶活性很可能在肿瘤发生中起着关键作用。

在NUP98-NSD1易位中，NUP98和NSC1 mRNA框内融合，将NUP98的核苷酸1552连接至NSD1的核苷酸3506。互反的转录物将NSD1和NUP98 mRNA框内融合，使NSD1的核苷酸3505连接至NUP98的核苷酸1533。

可以在含有25mM三磷酸脱氧核糖核苷[dNTP]、15pmol引物、2mM MgCl₂、Taq聚合酶和10×缓冲液[InVitrogen Life Technologies，Breda，The Netherlands]的反应中，使用正义NUP98-5(5’-TCTTGGTACAGGAGCCTTTG-3’)和反义NSD1-1(5’TCCAAAAGCCACTTGCTTGGC-3’)引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来检测NUP98-NSD1易位。用于NPM1突变检测的循环条件可以包括1个循环，94℃5分钟；30个循环，94℃1分钟，58℃1分钟和72℃1分钟；和1个循环，72℃7分钟。

DOT1L抑制剂

适合用于本公开的使用DOT1L抑制剂治疗白血病患者的方法中的DOT1L抑制剂一般地公开于美国专利公开No.2012/0142625和PCT专利公开No.WO2012/075381；WO 2012/075492；WO 2012/075500；和WO 2012/082436；Yu等，Nat.Commun.3：1288(2013)；Yu等，Nat.Commun.4：1893(2013)；Yu等，Bioorg.Med.Chem.21(7)：1787-1794(2013)；Yao等，J.Am.Chem.Soc.133(42)：16746-16749(2011)；Basavapathruni等，Chem.Biol.DrugDes.80(6)：971-980(2012)；和Daigle等，Cancer Cell 20(1)：53-65(2011)。这些参考文献中的每一篇以及本文中公开的所有其他参考文献全部通过引用并入本文。几种DOT1L抑制剂是可商购的，包括EPZ005676；EPZ004777；SGC-0946；SYC-522；SYC-534；SYC-687和其他例如可从Selleckchem，Boston，Ma或从Otava Chemicals，Inc.Vaughan，Ontario商购的。

易于用于本文公开的方法中的DOT1L抑制剂以约100nM至约10μM或约250nM至约5μM或约500nM至约1μM的IC50抑制DOT1L，并且包括本文中描述的嘌呤、7-去氮杂嘌呤和碳环取代的嘌呤化合物，其以EPZ004777(1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔-丁基)苯基)脲)和EPZ005676(9H-嘌呤-6-胺，9-[5-脱氧-5-[[顺-3-[2-[6-(1，1-二甲基乙基)-1H-苯并咪唑-2-基]乙基]环丁基](1-甲基乙基)氨基]-β-D-呋核亚硝脲-]来举例说明。

适合用于本公开的用于抑制细胞增殖和/或存活和用于治疗白血病患者的方法中的DOT1L抑制剂包括如WO 2012/075500和WO/2012/082436中所述的由式I表示的7-去氮杂嘌呤化合物：

式I

适合用于本公开的方法中用于抑制细胞的增殖和/或存活和用于治疗白血病患者的DOT1L抑制剂包括如WO 2012/075492中所述的由式II表示的碳环-取代的嘌呤和7-去氮杂嘌呤化合物：

式II

适合用于本公开的方法中用于抑制细胞的增殖和/或存活和用于治疗白血病患者的DOT1L抑制剂包括如WO 2012/0142625和WO 2012/075381中所述的由式III表示的嘌呤和7-去氮杂嘌呤化合物：

式III

包括在式I、II和III限定的化合物范围内的化合物以及用于合成那些化合物的方法呈现于美国专利公开No.2012/0142625和PCT专利公开No.WO 2012/075381；WO 2012/075492；WO 2012/075500；和WO 2012/082436中。两个示例性的此类化合物是EPZ004777和EPZ005676，其与从容易获得的起始材料(例如，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)合成那些化合物的方法的描述一起呈现于以下章节中。

EPZ004777

小分子DOT1L抑制剂EPZ04777是s-腺苷甲硫氨酸模拟物，其与其他甲基转移酶相比，对于DOT1L是高度特异性的。Daigle等，Cancer Cell 20(1)：53-65(2011)和Yu等，Nat.Commun.3：1288(2013)。EPZ004777结合在人DOT1L的催化结构域中的S-(5’-腺苷)-1-甲硫氨酸(SAM)结合位点内。

EPZ004777以0.3nM的K_i值结合DOT1L并且与测试的其他甲基转移酶相比，呈现出＞1,000倍的针对DOT1L的选择性，如在体外和细胞中通过生物化学方式测量的。Daigle进一步证实了EPZ004777对带有MLL融合的白血病细胞的高度选择性的抗增殖、分化和细胞凋亡活性，所述MLL融合与关键的白血病生成MLL融合靶基因HOXA9和MEIS1的转录抑制相关。缺乏MLL融合的白血病细胞对EPZ004777的灵敏度大约低100倍。这种体外选择性在混合谱系白血病的小鼠模型中转变成白血病细胞的靶向，其导致存活延长。

EPZ004777(1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔-丁基)苯基)脲)的化学结构如式IV所示：

式IV

EPZ004777(1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔-丁基)苯基)脲)的合成描述于PCT专利公开No.WO 2012/075500。

步骤1：(2R，3R，4S，SR)-2-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧 啶-7-基)-S-(羟甲基)四氢呋喃-3，4-二醇的合成

用N，N-二异丙基乙胺(1.22ml，7.01mmol)和1-(2，4-二甲氧基苯基)甲胺(1.05ml，7.01mmol)处理7-氯杀结核菌素(1.67g，5.84mmol)的1-丁醇(16.0ml)悬浮液，并且在100-110℃下加热过夜。20h后，LCMS显示新的产物形式并且起始材料被消耗。将混合物冷却至室温并且在高真空下除去溶剂。通过快速色谱(200g硅胶；5-10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化材料以产生泡沫状标题化合物(2.19g，90％)：C20H24N4O6的MS(ES1+)m/z 417.1(M+H)+；C20H24N4O6的(ESI-)m/z 415.2(M-H)^-；HPLC纯度97％(保留时间，2.41min)。

步骤2：((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲醇

将丙酮(76.5mL)和2，2-二甲氧基丙烷(16.5mL，134mmol)中的(2R，3R，4S，5R)-2-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3，4-二醇(3.30g，7.45mmol)溶液一次性用10-樟脑磺酸(1.73g，7.44mmol)处理，并使该反应在室温下搅拌。1h后，HPLC显示SM全部被消耗。所述反应通过添加碳酸氢钠(1.88g，22.3mmol)淬灭，并将反应混合物搅拌30分钟，在此期间形成沉淀。反应混合物在200mLCHCl₃和75mL H₂O之间分层。所述混合物用15mL盐水稀释，萃取并相分离。水相用50mL份的CHCl₃洗涤两次，合并的有机相用Na₂SO₄干燥。将所述溶液过滤并浓缩以产生泡沫。粗产物收集在甲醇(130mL，3200mmol)中，然后一次性用对甲苯磺酸一水合物(1.27g，6.70mmol)处理。所述混合物在室温下搅拌2h，之后用碳酸氢钠(1.88g，22.3mmol)淬灭反应混合物，并搅拌所述混合物30分钟。真空去除溶剂，并使残留物在50mL H₂O和150mL CH₂Cl₂之间分层并萃取。有机相用50mL饱和NaHCO₃洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩以产生泡沫。产物通过快速色谱(120g硅胶，60-80％EA/庚烷)分离以产生浅黄色硬泡沫状的标题化合物(2.83g，83％)：C23H28N4O6的MS(ESI+)m/z 457.4(M+H)⁺；C23H28N4O6的(ESI-)m/z 455.2(M-H)；HPLC纯度99％(保留时间，3.08min)。

步骤3：7-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(叠氮基甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d] [1，3]二氧杂环戊-4-基)-N-(2，4-二甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺

将干燥四氢呋喃(32ml)中的((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲醇(2.83g，6.20mmol)和三苯基膦(2.28g，8.68mmol)的溶液在冰/水浴中于0℃下冷却。逐滴添加偶氮二羧酸二异丙酯(1.71ml，8.68mmol)，然后添加叠氮磷酸二苯酯(1.87ml，8.68mmol)的四氢呋喃(5.3ml，66mmol)溶液。加入DPPA溶液后，形成白色乳状沉淀。约30分钟后，将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。24h后，HPLC显示已消耗全部起始材料。将该反应混合物浓缩至原始体积的约1/2，然后通过快速色谱(175g硅胶，10-55％EA/庚烷)纯化以产生浅黄色硬泡沫状的标题化合物(2.49g，83％)：C23H27N7O5的MS(ESI+)m/z 482.2(M+H)⁺；C23H27N7O5的(ESI-)m/z 480.1(M+H)-，m/z 526.1(M+CO₂H)-；HPLC纯度97％(保留时间，3.64min)。

步骤4：7-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1， 3]二氧杂环戊-4-基)-N-(2，4-二甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺

用1.0M三甲基膦的四氢呋喃(7.24mL，7.24mmol)溶液逐滴处理((3aR，4R，6R，6aR)-6-(叠氮基甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)-N-(2，4-二甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(2.49g，5.17mmol)的四氢呋喃(50mL，600mmol)溶液，且将混合物在室温下搅拌过夜。20h后，HPLC显示起始材料全部消耗。用水(1.80mL，99.9mmol)处理该反应混合物，然后在室温下搅拌2h。浓缩该反应混合物，粗产物收集在90mL CH₂Cl₂中，然后用四个30mL份的H₂O和15mL盐水洗涤。所述溶液用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩以产生油状物，其在施加高真空下变为泡沫。粗材料通过快速色谱(120g硅胶，CH₃OH/CH₂Cl₂中的3-10％7N NH₃)纯化以生成泡沫状的标题化合物(1.76g，75％)：C23H29NO5的MS(ESI+)m/z 456.2(M+Ht)；C26H3SNsOs的(ES1-)m/z 454.1(M-HY)；HPLC纯度92％，(保留时间，2.65min)。

步骤5：N-(2，4-二甲氧基苄基)-7-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((异丙基氨基)甲基)-2， 2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺

逐滴用丙酮(0.31ml，4.2mmol)和乙酸(0.22ml，3.9mmol)处理((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)-N-(2，4-二甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(1.76g，3.86mmol)的1，2-二氯乙烷(34ml)溶液，然后用三乙酰氧基硼氢化钠(0.98g，4.6mmol)处理，且将混合物在室温下搅拌直至完全。1h后，HPLC显示起始材料已被消耗且反应完成。所述反应混合物用60mL CH₂Cb稀释，然后用50mL饱和NaHCO₃洗涤。水相用30mL CH₂Cb洗涤，合并的有机相用40mL盐水洗涤然后用Na₂SO₄干燥。将所述溶液过滤并浓缩以产生玻璃状标题化合物(1.76g，92％)，其直接用于下一步骤中：C26H3SNsOs的MS(ESI+)m/z 498.3(M+Ht)；HPLC纯度90％(保留时间，2.74min)。

步骤6：2-(3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙 基)氨基)丙基)异二氢吲哚-1，3-二酮

将y-溴丙基邻苯二甲酰亚胺(2.37g，8.85mmol)、四-n-丁基碘化铵(0.234g，0.632mmol)、N，N-二异丙基乙胺(1.40ml，8.04mmol)和N-(2，4-二甲氧基苄基)-7-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((异丙基氨基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(3.42g，6.32mmol)的混合物收集在丙腈(25mL)中并在95℃下加热。在95℃下48小时后，HPLC显示该反应接近完成。将反应混合物冷却至室温，用200mL乙酸乙酯稀释混合物，并用两个100ml份H₂O和100ml盐水洗涤。有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩以产生玻璃状物。粗材料通过快速色谱(250g硅胶，CH₃OH/CH₂Cb中的2-4％7NNH₃)纯化以生成泡沫状的标题化合物(3.12g，72％)：C37H44N6O7的MS(ESI+)m/z 685.2，(M+Ht)，C37H44N6O7的(ESI-)m/z 729(M+HC02Y)；HPLC纯度99％(保留时间，3.17min)。

步骤7：N1-(((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)-N1-异丙 基丙烷-1，3-二胺

将2-(3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)异二氢吲哚-1，3-二酮(1.37g，2.00mmol)溶解于2M甲胺的甲醇(30mL，60mmol)中。所述溶液在室温下搅拌5分钟，然后在55-60℃下加热。1h后，HPLC显示SM消耗。将所述反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将所得茶色油收集在20mL MeOH中并浓缩。对油状物重复该程序。将该材料置于高真空下以产生固体，所述固体包含标题化合物和N-甲基邻苯二甲酰亚胺并原样用于下一步骤：C29H42N60S的MS(ESI+)m/z 555.4(M+Ht)；HPLC保留时间2.57min。

步骤8：1-(4-(叔丁基)苯基)-3-(3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基 苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂 环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)脲

将N1-(((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)-N1-异丙基丙烷-1，3-二胺(1.11g，2.00mmol，来自步骤6的粗制物)的二氯甲烷(40mL)悬浮液用1-叔丁基-4-异氰酸基苯(0.36mL，2.0mmol)的二氯甲烷(3.5mL)溶液逐滴处理，然后在室温下搅拌。1h后，HPLC显示该反应完成。将该反应混合物浓缩以产生玻璃状物。所得粗材料通过快速色谱(100g硅胶，CH30H/CH2Cb中的2-4％7N NH₃)纯化以产生泡沫状的标题化合物(1.07g，73％)：C4oHssN706的MS(ESI+)m/z 730.4(M+Ht)；C4oHssN706的(ESI-)m/z 728.5(M-HY)；HPLC纯度，89％(保留时间，3.78分钟)。

步骤9：1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4- 二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲

将1-(4-(叔丁基)苯基)-3-(3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(4-((2，4-二甲氧基苄基)氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)脲(1.07g，1.39mmol)溶解于已经在0℃下冷却的三氟乙酸(25ml)和水(2.5ml)的混合物中，将所得溶液在0℃下搅拌30分钟，然后温热至室温。4h后，HPLC证实反应完成。真空浓缩该反应混合物，将所得残留物收集在25mL MeOH(白色浆液)中并浓缩。重复该过程三次，将所得残余物置于高真空下。所得材料收集在100mL10％MeOH/CH₂Cb中，并用两个75mL份的饱和NaHCO₃和50mL 1％水性Na₂CO₃洗涤。有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩以产生玻璃/固体。所得粗材料通过快速色谱(100g硅胶，CH30H/CH2Cb中的5-10％7N NH₃)纯化以生成无色玻璃状的标题化合物(0.35g，46％)：C28H41N7O4的MS(ES1+)m/z 540.3(M+Ht)；C28H41N7O4的(ESI-)m/z 538.3(M-Hr)，m/z 584.4(M+HC02Y)；HPLC纯度98％(保留时间，2.86min)；IH NMR(400MHz，d4-MeOH)ppm 8.05(s，1H)，7.27(d，J＝3.73Hz，1H)，7.24(m，2H)，7.18(m，2H)，6.63(d，1＝3.73Hz，1H)，6.15(d，1＝4.77Hz，1H)，4.46(t，J＝5.08Hz，1H)，4.18(t，1＝5.39Hz，1H)，4.11(m，1H)，3.22(m，2H)，3.07(m，1H)，2.85(m，1H)，2.72(m，1H)，2.60(t，1＝6.43Hz，2H)，1.68(m，2H)，1.28(s，9H)，1.05(d，1＝6.63Hz，3H)，1.01(d，1＝6.43Hz，3H)。

步骤10：1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3， 4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)盐酸脲

1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲(1.64g，3.04mmol)的50ml 50％含水甲醇溶液用1.0N氯化氢的水(3.87mL，3.04mmol)溶液处理。将所述溶液浓缩以去除大部分甲醇并冻干过夜。所得浑浊混合物通过细玻璃料过滤，将所得滤液真空浓缩以去除MeOH。将所得溶液冻干过夜以产生固体的标题化合物(1.70g，97％)：C28H41N7O4的MS(ESI+)m/z 540.4(M+Ht)；C28H41N7O4的MS(ES1+)m/z 538.4(M+Ht)，m/z 574.4(M+C1Y)；HPLC纯度97％(保留时间，2.88min)；IH NMR(400MHz，d₄-MeOH)ppm 8.12(s，1H)，7.29(m，2H)，7.23(m，3H)，6.68(m，1H)，6.09(br.s.，1H)，4.57(m，1H)，4.35(m，2H)，3.79(br.s.，1H)，3.55(m，2H)，3.26(br.s.，4H)，1.94(m，2H)，1.35(m，6H)，1.29(s，9H)。IC_so＜10nM。

体内施用EPZ004777导致小鼠MLL异种移植模型存活延长并且支持EPZ004777用于治疗MLL易位白血病的功效。

EPZ005676

EPZ005676是DOT1L甲基转移酶活性的小分子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争性抑制剂，其呈现出80pM的Ki值和＞24小时的药物-靶标停留时间。Daigle等，Blood Epub Aheadof Print(2013)。化合物对DOT1L是高选择性的，显示相对于测试的所有其他甲基转移酶＞37,000-倍的选择性。

EPZ005676的化学结构(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((((1r，3S)-3-(2-(5-(叔丁基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)四氢呋喃-3，4-二醇如式V所示：

式V

EPZ005676(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((((1r，3S)-3-(2-(5-(叔丁基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)四氢呋喃-3，4-二醇的合成描述于美国专利公开No.2002/0142625。

步骤1：顺式和反式3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲 基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]-二氧杂环戊-4-基)甲基)氨基)环丁烷羧酸甲酯的合成

将3-氧代环丁烷基羧酸甲酯(4.60g，35.94mmol)、9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(11.0g，35.94mmol)和Ti(iPrO)₄(4.0g，14.08mmol)的MeOH(80ml)溶液在45℃下搅拌2h，然后添加NaCNBH₃(4.5g，71.87mmol)。该反应在室温下搅拌过夜。用饱和NaHCO₃水溶液(40ml)淬灭该反应，过滤，用DCM(80ml×3)萃取，通过Na₂SO₄干燥并浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化以获得标题化合物(6.2g，产率41％)。NMR(500MHz，CDCl3)：On 8.38-8.34(m，1H)，7.90(s，1H)，5.98(d，J＝3.0Hz，1H)，5.75(br s，2H)，5.48-5.46(m，1H)，5.03-5.01(m，1H)，4.35-4.33(m，1H)，3.69-3.66(m，3H)，3.50-3.17(m，1H)，3.05-2.73(m，3H)，2.48-2.44(m，2H)，1.95-1.91(m，2H)，1.62(s，3H)，1.39(s，3H)ppm；ESI-MS(m/z)：419.2[M+1]⁺。将3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)氨基)环丁烷基羧酸甲酯的顺式/反式混合物(6.2g)通过手性HPLC(CHIRALCELAD-H 20*250mm，5um(Daicel)，柱温：35℃，流动相：CO₂/甲醇(0.1％DEA)＝70/30，流速：50g/分钟)分离以生成纯顺式产物(3.5g)和纯反式产物(1.7g)。

步骤2：(1S，3s)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基 四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁烷羧酸甲酯的合成

向顺式3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)氨基)环丁烷羧酸甲酯(2.0g，4.78mmol)的CH₃CN(15ml)溶液中添加2-碘代丙烷(4.0g，23.92mmol)和K₂CO₃(1.0g，7.18mmol)。在密封试管中加热该反应至95℃过夜。过滤该混合物，将滤液浓缩并通过SGC(DCM∶MeOH＝12∶1)纯化以获得标题化合物(1.9g，产率86％)。1H NMR(500MHz，CDCl₃)：ΔH 8.37(s，1H)，7.89(s，1H)，6.03(d，J＝1.5Hz，1H)，5.53-5.48(m，3H)，5.00(brs，1H)，4.25(brs，1H)，3.66(s，3H)，3.19-3.18(m，1H)，2.96(brs，1H)，2.80-2.78(m，1H)，2.67-2.58(m，2H)，2.20-2.12(m，4H)，1.62(s，3H)，1.39(s，3H)，1.00(d，J＝6.0Hz，3H)，0.84(d，J＝6.0Hz，3H)ppm；ESI-MS(m/z)：461.4[M+1]⁺。

步骤3：(1S，3s)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基 四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基甲醛的合成

在-78℃下向(1S，3s)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁烷羧酸甲酯(1.2g，2.60mmol)的DCM(50ml)溶液中逐滴加入DIBAL-H，直至通过TLC测定所有起始材料被消耗。加入MeOH(2ml)并将该混合物搅拌至室温30min，之后加入水(50ml)，并用DCM(50ml×2)萃取该混合物。将有机层通过Na₂SO₄干燥并浓缩以获得直接用于下一步骤中的粗制标题化合物(使用1.0g)。1H NMR(500MHz，CDCl₃)：ΔH 9.56(d，J＝2.5Hz，1H)，8.36(s，1H)，7.88(s，1H)，6.03(d，J＝2.5Hz，1H)，5.66(brs，2H)，5.50(dd，J＝2.0，6.5Hz，1H)，5.01(dd，J＝3.5，6.5Hz，1H)，3.331-3.337(m，1H)，2.96-2.97(m，1H)，2.77-2.59(m，3H)，2.14-2.05(m，4H)，1.60(s，3H)，1.39(s，3H)，1.01(d，J＝6.5Hz，3H)，0.85(d，J＝6.0Hz，3H)ppm。

步骤4：(E)-3-((1S，3s)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2， 2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙烯酸 乙酯的合成

向(1S，3s)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基甲醛(930mg，2.16mmol)的CH₃CN∶DCM＝5∶1(50ml)溶液中加入2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(484mg，2.16mmol)、DBU(328mg，2.16mmol)和LiCl(91mg，2.16＝01)。将混合物在RT下搅拌1h，然后浓缩。加入水(20ml)，且用DCM(25ml×3)萃取混合物。合并的有机层通过Na₂SO₄干燥，浓缩，并将残余物通过SGC(DCM∶MeOH＝30∶1)纯化以获得标题化合物(900mg，产率83％)。1H NMR(500MHz，CDCl₃)：ΔH 8.36(s，1H)，7.89(s，1H)，6.94-6.90(m，1H)，6.03(s，1H)，5.72-5.89(m，1H)，5.57(s，2H)，5.52(d，J＝4.5Hz，1H)，5.00(dd，J＝3.5，6.0Hz，1H)，4.25(d，J＝3.0Hz，1H)，4.21-4.17(m，2H)，3.14(brs，1H)，2.961-2.936(m，1H)，2.74-2.52(m，3H)，2.22-2.14(m，2H)，1.79-1.76(m，2H)，1.60(s，3H)，1.40(s，3H)，1.30-1.27(m，3H)，1.00(d，J＝7.0Hz，3H)，0.82(d，J＝6.5Hz，3H)ppm；ESI-MS(m/z)：501.4[M+1]⁺。

步骤5：3-((1S，3r)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二 甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙酸乙酯的 合成

向(E)-3-((1S，3s)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙烯酸乙酯(900mg，1.8mmol)的MeOH(50ml)溶液中添加Pd/C(20mg)。于氢气气氛下将混合物在RT搅拌过夜。过滤混合物，并浓缩滤液以获得标题化合物(700mg，产率78％)。1H NMR(500MHz，CDCl₃)：ΔH 8.36(s，1H)，7.89(s，1H)，6.03(d，J＝2.5Hz，1H)，5.69(s，2H)，5.51(dd，J＝2.5，8.0Hz，1H)，4.99(dd，J＝4.0，7.5Hz，1H)，4.26(brs，1H)，4.13-4.08(m，2H)，2.99-2.92(m，2H)，2.706-2.655(m，1H)，2.539-2.486(m，1H)，2.18-2.02(m，4H)，1.76(brs，1H)，1.65-1.60(m，5H)，1.43-1.37(m，5H)，1.26-1.23(m，2H)，0.97(d，J＝9.0Hz，3H)，0.79(d，J＝8.5Hz，3H)ppm；ESI-MS(m/z)：503.4[M+1]⁺。

步骤6：3-((1S，3r)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二 甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙酸的合成

向3-((1S，3r)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙酸乙酯(650mg，1.29mmol)的THF∶MeOH＝5∶1(30ml)溶液中添加LiOH.H₂O(543mg，1.29mmol)。混合物在RT下搅拌过夜，浓缩，然后收集到MeOH(10ml)中。在0℃下逐滴加入1M HCl溶液，直至pH＝7。浓缩该混合物并用制备型HPLC纯化以获得标题化合物(170mg)。

步骤7：N-(2-氨基-4-(叔丁基)苯基)-3-((1S，3r)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6- 氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙 基)氨基)环丁基)丙酰胺的合成

向3-((1S，3r)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙酸(170mg，0.36mmol)的DCM(15ml)溶液中添加4-叔丁基苯-1，2-二胺(117mg，0.72mmol)、EDCI(137mg，0.72mmol)、HOBT(97mg，0.72mmol)和TEA(217mg，2.15mmol)。混合物在RT下搅拌过夜，并浓缩。加入饱和的NaHCO₃溶液(20ml)，并用DCM(20ml×3)萃取混合物。有机层通过Na₂SO₄干燥，并浓缩。粗制物用制备型TLC(DCM∶MeOH＝12∶1)纯化以获得标题化合物(110mg粗制物)。

步骤8：9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((((1r，3S)-3-(2-(5-(叔丁基)-1H-苯并[d]咪 唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂 环戊-4-基)-9H-嘌呤-6-胺的合成

将N-(2-氨基-4-(叔丁基)苯基)-3-((1S，3r)-3-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)甲基)(异丙基)氨基)环丁基)丙酰胺(110mg)的AcOH(10ml)溶液加热至65℃过夜。浓缩该混合物，加入饱和的NaHCO₃溶液(20ml)，用DCM(20ml×3)萃取混合物。合并的有机层通过Na₂SO₄干燥并浓缩以获得标题化合物(105mg粗制物)。1H NMR(500MHz，CDCl₃)：ΔH 8.36(s，1H)，7.89(s，1H)，7.48-7.24(m，3H)，6.01(d，J＝1.5Hz，1H)，5.60-5.53(m，3H)，4.98(dd，J＝3.0，6.5Hz，1H)，4.22(brs，1H)，2.97(brs，1H)，2.874-2.847(m，1H)，2.56-2.50(m，3H)，1.87-1.78(m，2H)，1.70-1.54(m，7H)，1.35-1.17(m，14H)，0.90(d，J＝6.5Hz，3H)，0.80(d，J＝6.5Hz，3H)ppm；ESI-MS(m/z)：603.5[M+1]⁺。

步骤9：(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((((1r，3S)-3-(2-(5-(叔 丁基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)四氢呋喃-3，4-二醇的合 成

将9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((((1r，3S)-3-(2-(5-(叔丁基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)-2，2-二甲基四氢呋喃并[3，4-d][1，3]二氧杂环戊-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(105mg)的HCl/MeOH(2.5mol/L)(10mL)溶液在RT下搅拌2h，然后浓缩至干。加入K₂CO₃(96mg)的水溶液(0.5mL)和MeOH(5mL)，并将所得混合物在RT下再搅拌10min，然后过滤。浓缩滤液，且残余物通过制备型HPLC(xbridge 30mm*150mm，流动相：A：水(10mM NH₄HCO₃)，B：CAN，梯度：10min内35-45％B，6min内45-45％B，20min时停止，流速：50ml/min)纯化以获得白色固体的化合物2(50mg，产率：51％)。1H NMR(500MHz，MeOD)：ΔH8.29(s，1H)，8.20(s，1H)，7.47-7.39(m，3H)，5.96(d，J＝4.0Hz，1H)，4.70-4.75(m，1H)，4.26-4.27(m，1H)，4.05-4.06(m，1H)，3.140-3.155(m，1H)，3.00-2.76(m，5H)，2.18-2.16(m，2H)，1.87-1.85(m，2H)，1.57-1.55(m，2H)，1.36(s，9H)，1.01(d，J＝6.5Hz，3H)，0.94(d，J＝6.5Hz，3H)ppm；ESI-MS(m/z)：563.4[M+1]⁺。

EPZ005676可溶于水溶液中，并且可以配制用于静脉内施用。EPZ005676在体循环中的有效药代动力学半衰期在大鼠中为0.25h，而在狗中为1.5h。

在MLL-重排白血病的裸大鼠皮下异种移植模型中EPZ005676持续静脉内输注21天提供了剂量依赖性的抗肿瘤活性。在最高剂量下，实现了完全的肿瘤衰退，在停止治疗后长达32天没有再生长。在用EPZ005676治疗的大鼠中，没有观察到明显的体重减轻或明显的毒性。因此，EPZ005676是有效的、选择性DOT1L抑制剂，其显示在MLL重排白血病的大鼠异种移植模型中具有强功效。

EPZ005676目前在患有涉及11q23处的MLL基因易位的复发性/难治愈白血病或其他晚期血液癌症的人患者的I期研究中进行评估。EPZ005676通过21天的持续静脉内输注来施用。

包含DOT1L抑制剂的组合物和制剂

本发明提供了用于治疗白血病，如ALL或AML的包含一种或多种DOT1L抑制剂和/或一种或多种EZH2抑制剂的组合物，包括治疗组合物。可以将一种或多种DOT1L抑制剂和/或一种或多种EZH2抑制剂单独或在药物组合物中施用于人患者，在所述药物组合物中，它们以治疗或缓解如本文中所述的疾病或病症的剂量与合适的载体或赋形剂混合。这些抑制剂的混合物也可以作为单一混合物或在适当配制的药物组合物中向患者施用。

本公开范围内的组合物包括其中治疗剂是有效抑制患者中的白血病细胞增殖的量的DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物。确定每种组分的有效量的最佳范围在本领域技术人员的能力范围之内。有效剂量随多种因素变化，所述因素包括特定的抑制剂、前药的存在、患者和患者的临床状态。

可以肠胃外施用包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物。如本文中使用的，术语“肠胃外施用”是指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。可选地或同时地，可以口服施用。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，伴随治疗的种类(如果有的话)，治疗的频率和所需效果的性质。

包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物可以例如肠胃外施用，如通过静脉内推注或浓注的静脉内施用。或者，包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物可以通过静脉内输注施用。如本文中使用的，术语“肠胃外施用”是指除了肠道和局部施用以外的给药方式，通常通过注射，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物静脉内输注的合适剂量包括至少约2mg抑制剂/m²/天或至少约10mg抑制剂/m²/天或至少约20mg抑制剂/m²/天或至少约50mg抑制剂/m²/天或至少约100mg抑制剂/m²/天或至少约200mg抑制剂/m²/天或至少约500mg抑制剂/m²/天的剂量。

包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物通常包括治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。如本文中使用的，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他通常公认的用于动物并且更特别用于人的药典中。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。组合物可以使用传统的粘合剂和载体，如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这样的组合物将含有治疗有效量的抑制剂(优选纯化形式)及合适量的载体以提供适合向患者施用的形式。制剂应当适合施用方式。

可以根据常规程序将组合物配制成适用于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在需要的情况下，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，单独或在单位剂型中混合在一起提供成分，例如，作为标明活性剂量的密封容器(如安瓿或sachette)中的冻干粉或无水浓缩物。在通过输注施用组合物的情况下，其可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶配制。在组合物通过注射施用的情况下，可以提供一安瓿无菌注射用水或盐水使得成分可以在施用前混合。

本文中公开的抑制剂可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，如源自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与阳离子形成的那些，如源自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

本公开的许多抑制剂可以作为与药学上相容的反离子的盐(即，药学上可接受的盐)来提供。“药学上可接受的盐”是指向接受者施用时能够直接或间接地提供本发明的化合物或化合物前药的任何无毒盐。“药学上可接受的反离子”是向受试者施用后从盐释放的无毒的盐的离子部分。药学上相容的盐可以用许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。在水或其他质子溶剂中，盐倾向于比其相应的游离碱形式更可溶。本发明包括这样的盐。

用于抑制细胞的生长和/或存活以及用于治疗白血病患者的方法，所述细胞和白 血病患者呈现与HOX簇基因和/或HOX簇相关基因的升高表达相关的遗传突变、改变和/或异 常

本公开进一步提供用于治疗白血病的治疗方法，包括向人患者施用包含一种或多种DOT1L抑制剂和一种或多种EZH2抑制剂的组合物，其中所述白血病呈现一个或多个HOXA簇基因的高水平表达，但不具有MLL-易位。

可以通过标准临床技术来确定有效地治疗、抑制和/或预防特征在于一个或多个HOX簇基因的高水平表达但不具有MLL-易位的白血病的DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的量。可以任选地用体外试验来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。

在用于人体之前，可以在体外随后在体内测试本发明的化合物或药物组合物的所需治疗或预防活性。例如，用于证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外试验包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。可以利用本领域技术人员已知的技术测定化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用，所述技术包括，但不限于增殖和细胞凋亡试验。根据本公开，可以用于确定是否施用所示特定化合物的体外试验包括体外细胞培养试验，其中将患者组织样品在培养物中生长，并暴露于或另外地施用化合物，并且观察这样的化合物对组织样品的作用。

本公开提供通过向受试者施用有效量的如本文中所述的DOT1L和/或EZH2抑制剂化合物或药物组合物的治疗和抑制方法。在一个方面中，化合物基本上是纯化的，使得化合物基本上不含限制其作用或产生不良副作用的物质。

各种递送系统是已知的并且可以用于施用本公开的组合物，例如，本领域技术人员已知的脂质体包封、微粒、微胶囊、受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))等等。

施用方法包括，但不限于，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径来施用抑制剂或组合物，例如，通过输注或浓注注射，通过经上皮或皮肤粘膜内衬(例如，口腔粘膜、肾和肠粘膜等)的吸收和可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。此外，可能需要将抑制剂或组合物通过任何合适的途径引入中枢神经系统，所述途径包括心室内或鞘内注射。可以通过心室内导管来帮助心室内注射，所述导管例如连接贮液器，如Ommaya贮液器。也可以使用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器以及含雾化剂的制剂。

可能需要将抑制剂或组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如外科手术过程中的局部输注、局部应用、通过注射、借助导管、通过栓剂或通过植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔或的凝胶状材料，包括膜如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。

抑制剂可以在囊泡(如脂质体(Langer，Science249：1527-1533(1990))中或在受控释放系统中递送。受控释放系统可以设置在治疗靶标附近，由此只需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson，见Medical Applications of Controlled Release(受控释放的医学应用)，Vol.2，pp.115-138(1984))。

包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物的静脉内输注可以持续至少约一天，或至少约三天，或至少约七天，或至少约14天，或至少约21天，或至少约28天，或至少约42天，或至少约56天，或至少约84天，或至少约112天的时间段。

包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物的连续静脉内输注可以持续特定的时间段，接着是另一段持续时间的休息期。例如，连续输注的持续时间可以为约1天至约7天，至约14天，至约21天，至约28天，至约42天，至约56天，至约84天，或至约112天。连续输注可以随后接着约1天至约2天，至约3天，至约7天，至约14天，或至约28天的休息期。然后可以如上重复连续输注，并接着另一个休息期。

与采用的精确连续输注方案无关，应理解包含DOT1L抑制剂和/或EZH2抑制剂的组合物的连续输注将持续直至获得所需功效或不可接受的毒性水平变得明显。

用于检测HOXA簇基因表达的试剂盒

本公开还提供用于测试患者样品的HOX簇基因或HOX簇相关基因的升高表达和/或遗传突变的存在的试剂盒，所述突变如NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1基因的一个或多个中的突变和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位和/或表2所示的任一个基因中的突变、改变和/或异常，其与升高的HOX簇基因和/或HOX簇相关基因表达有关。

诊断试剂盒包括用于扩增HOX簇基因和/或HOX簇相关基因和/或表2所示的任一基因的引物对，和用于检测和/或测序从使用该引物对的扩增反应产生的扩增子的探针。

FLT3抑制剂

在特定实施方案内，本公开提供了与一种或多种FLT3抑制剂组合或结合使用一种或多种DOT1L抑制剂的方法，由此通过进一步抑制呈现HOX簇基因和/或HOX簇相关基因的升高表达的细胞的增殖和/或存活来提供所需的治疗益处及用于治疗其白血病与HOX簇基因和/或HOX簇相关基因的升高表达相关的白血病患者。

FMS-样酪氨酸激酶3(FLT3)基因编码影响造血作用而导致血液系统失调和恶性肿瘤的膜结合受体酪氨酸激酶。参见，例如，Drexler等，Leukemia10：588-599(1996)；Gilliland和Griffin，Blood100：1532-1542(2002)；和Stirewalt和Radich，Nat.Rev.Cancer3：650-665(2003)。通过FLT3配体(FLT3L)与FLT3受体的结合，启动FLT3受体酪氨酸激酶的激活，所述FLT3受体在造血祖细胞和干细胞上表达。

FLT3是血液恶性肿瘤中常常突变的基因，在大约30％的成人急性骨髓性白血病(AML)中存在。Nakao等，Leukemia10：1911-1918(1996)；Kiyoi等，Leukemia12：1333-1337(1998)；Kottaridis等，Blood98：1742-1759(2001)；Yamamoto等，Blood97：2434-2439(2001)；和Thiede等，Blood99：4326-4335(2002)。

最常见的FLT3突变是内部串联重复(ITD)，其导致FLT3受体的近膜结构域内的框内插入。已经在15-35％的成人AML患者中报告了FLT3-ITD突变。Nakao等，Leukemia10：1911-1918(1996)；Kiyoi等，Leukemia12：1333-1337(1998)；Kiyoi等，Leukemia11：1447-1452(1997)；和Schnittger等，Blood100：59-66(2002)。FLT3-ITD突变是差的患者预后的独立预测剂并且与标准化疗后提高的复发风险以及降低的无疾病和整体存活有关。AbuDuhier等，British J.Hematol.11：190-195(2000)；Kiyoi等，Blood93：3074-3080(1999)。频率较低的是在FLT3受体的激活环中产生的FLT3点突变。最常见的受影响密码子是天冬氨酸835(D835)。在大约5-10％成人急性骨髓性白血病患者中发生了D835残基的核苷酸置换。Stirewalt和Radish，Nature Rev.Cancer3：650-665(2003)；Yamamoto等，Blood97：2434-2439(2001)；Thiede等，Blood99：4326-4335(2002)；和Bacher等，Blood111：2527-2537(2008)。

成人AML中高频率的组成型激活的突变FLT3使得FLT3基因成为这种白血病中非常有吸引力的药物靶标。对靶标具有不同程度的功效和选择性的几种FLT3抑制剂已经或当前正在AML患者中研究和检验。Kindler等，Blood116：5089-102(2010)。

FLT3抑制剂分为I型或II型抑制剂。这两种明显不同的分类是基于与磷酸化和非磷酸化受体位点结合的相对亲和性和机理。I型抑制剂识别激酶的活性构象。这种构象有助于磷酸转移。I型抑制剂通常由杂环环系统构成。Liu和Gray，Nat.Chem.Biol.2：358-354(2006)。I型FLT3抑制剂的实例包括Grenolanib苯磺酸盐和Midodtaurin。Muralidhara等，Cancer Res.72 8Supp.：3683(2012)；和Cools等，Cancer Res.64：6385-6389(2004)。造成FLT3受体酪氨酸激酶组成型磷酸化的突变对I型抑制剂也可能是敏感的。

II型抑制剂结合通常称为’DFG-out’的无活性FLT3构象，其涉及基序重排。Zhang等，Nature Rev.Cancer9：28-39(2009)。抑制剂如伊马替尼、索拉非尼和尼罗替尼(也称为AMN107或

)结合II型构象。Manley等，Biochim.Biophys.Acta.1754：3-13(2005)；Van等，Cell116：855-867(2004)。赋予对II型抑制剂的抗性的突变使得FLT3受体酪氨酸激酶的激酶结构域组成型地磷酸化。靶向磷酸化激酶的I型抑制剂可以克服II型抑制剂处理产生的抗性，因此在治疗带有这些抗性突变的疾病中具有潜在用途。

可以结合一种或多种DOTL1抑制剂合适地用于本发明公开的方法(包括用于治疗白血病患者的方法)中的FLT3抑制剂概括地综述于Leung等，Leukemia27：260-268(2013)；Grunwald和Levis，Int.J.Hematol.97：683-694(2013)；Wiernik，Clin.Adv.Hem.&Onc.8 (6)：429(2010)并在美国专利No.8,557,847和7,977,338(苯乙酰胺类)；美国专利公开No.2003/0219827；PCT专利公开No.WO2014/027199；WO 2013/142382；WO 2008/067280；WO2006/020145；以及在Sato等，Blood117(12)：3286-3293(2011)；Levis，Hematology，pp.220-226(Am.Soc.Hematol.Educ.Prog.，Washington DC，2013)；Fischer等，J.Clin.Oncol.28(28)：4339-4345(2010)；Fischer，Blood117(12)：3247-3248(2011)；Kindler等，Blood116(24)：5089-5102(2010)；以及Fathi和Chabner，Oncologist16：1161-1174(2011)中的科学文献内进一步地详细公开。

其他FLT3抑制剂公开于PCT专利公开No.WO 2002/032861、WO 2002/092599、WO2003/035009、WO 2003/024931、WO 2003/037347、WO 2003/057690、WO 2003/099771、WO2004/005281、WO 2004/016597、WO 2004/018419、WO 2004/039782、WO 2004/043389、WO2004/046120、WO 2004/058749、WO 2004/058749、WO 2003/024969；美国专利公开No.2004/0049302；和Levis等，Blood98(3)：885-887(2001)；Tse等，Leukemia15(7)：1001-1010(2001)；Smith等，Blood103：3669-3676(2004)；Griswold等，Blood104(9)：2912-2918(2004)；Yee等，Blood100(8)：2941-2949(2002)；O’Farrell等，Blood101(9)：3597-3605(2003)；Stone等，Ann.Hematol.83supp1：S89-90(2004)；Murata等，J.Biol.Chem.278(35)：32892-32898(2003)；和Levis等，Curr.Pharm.Design10：1183-1193(2004)中。用于药物靶标的药理学验证的候选激酶抑制剂的选择描述于Uitdehaag等，Br.J.Pharmacol.166(3)：858-76(2012)中。这些参考文献中的每一篇以及本文中公开的所有其他参考文献的全文通过引用并入本文。

可以用于这些方法中的FLT3抑制剂包括小分子酪氨酸激酶抑制剂化合物，包括2-苯基氨基嘧啶化合物；咪唑并噻唑化合物；2，4，5-取代的嘧啶和吡啶并嘧啶化合物；吡咯取代的2-吲哚酮化合物；和取代的吲哚并咔唑化合物，其是本领域公知的并且通过已经表明显示FLT3抑制活性并正在研究或已经研究用于各种疾病(特别是血液恶性肿瘤ALL和AML)的治疗的特定化合物来举例说明。

多种小分子FLT3酪氨酸激酶抑制剂(TKI)常规地用于ALL管理且用于研发FLT3突变的AML的治疗，包括，例如，坦度替尼(Tandutinib)(也称为MLN-518或CT53518，CORTherapeutics Inc.和Millennium Pharmaceuticals Inc.)、CHIR-258(Chiron Corp.)；EB1O和IMC-EB1O(ImClone Systems Inc.)；XL 999(Exelixis USA and SymphonyEvolution，Inc.)；GTP 14564(Merck Biosciences UK)；AG 1295和AG 1296；CEP-5214和CEP-7055(Cephalon)；尼罗替尼(也称为AMN107或

)、索拉非尼、舒尼替尼(也称为SUI 1248，Pfizer USA)、米哚妥林(Midostaurin)(也称为PKC412，Novartis AG)、Lestarrtinib(也称为CEP 701或KT-555，Cephalon)、KW-2449，Quizartinib(也称为AC220，Ambit Biosciences)和Crenolanib。在这些FLT3抑制剂中，Lestaurtinib、米哚妥林、索拉非尼、KW-2449和AC220已经或正在临床试验中评估。此外，小分子化合物PLX3397和AC220已经研发用于治疗与FLT3内部串联重复(ITD)相关的AML患者的特定目的。

可以结合一种或多种DOTL1抑制剂合适地用于本公开的方法(包括用于治疗白血病患者的方法)中的FLT3抑制剂包括2-苯基氨基嘧啶化合物，其描述于美国专利No.5,521,184中；通过小分子FLT3酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼[N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺甲磺酸]来举例说明，如式VI所示：

式VI

伊马替尼(也称为STI-571)在加拿大、南非和美国以名称

或在澳大利亚、欧洲和拉丁美洲以名称

可商购。除了伊马替尼外，美国专利No.5,521,184中公开了多种2-苯基氨基嘧啶化合物的合成。

可以结合一种或多种DOTL1抑制剂合适地用于本公开的方法(包括用于治疗白血病患者的方法)中的FLT3抑制剂包括描述于U.S.2007/0232604中的咪唑并噻唑化合物，如式VII所示：

式VII

式VII的咪唑并噻唑化合物在本文中通过Quizartinib(也称为AC220)来举例说明，其由Ambit Biosciences(San Diego，CA)研发用于治疗急性骨髓性白血病。Quizartinib具有化学结构1-(5-(叔丁基)异噁唑-3-基)-3-(4-(7-(2-吗啉代乙氧基)苯并[d]咪唑并[2，1-b]噻唑-2-基)苯基)脲，其如式VIIa所示：

式VIIa

Quizartinib是对FLT3具有高亲和性的Flt3(ITD/WT)的第二代FLT3抑制剂，Flt3-ITD具有1.6nM的K_d值和1.1nM的IC50，WT FLT3的IC50为4.2nM，比相关的酪氨酸激酶受体KIT、PDGFRα、PDGFRβ、RET和CSF-1R的IC50高约10倍。Quizartinib的合成描述于美国专利No.7,820,657和PCT专利公开No.WO 2007/109120、WO 2011/056939和WO 2009/038757中。

可以结合一种或多种DOTL1抑制剂合适地用于本公开的方法(包括用于治疗白血病患者的方法)中的FLT3抑制剂包括如PCT专利公开No.WO2014/027199中公开的2，4，5-取代的嘧啶化合物，如式VIII所示：

式VIII

可以结合一种或多种DOTL1抑制剂合适地用于本公开的方法(包括用于治疗白血病患者的方法)中的FLT3抑制剂包括如PCT专利公开No.WO2013/142382中公开的吡啶并嘧啶化合物，如式IX所示：

式IX

可以合适地用于本公开的用于抑制细胞的增殖和/或存活和用于治疗白血病患者的方法中的FLT3抑制剂包括PLX3397(Plexxikon Inc.，Berkeley，CA)。PLX3397和相关化合物的合成描述于Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(14)：5689-94(2013)中。

可以合适地用于本公开的用于抑制细胞的增殖和/或存活和用于治疗白血病患者的方法中的FLT3抑制剂包括坦度替尼(MLN518；N-(4-异丙氧基苯基)-4-(6-甲氧基-7-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)喹唑啉-4-基)哌嗪-1-氨甲酰)，如式X所示：

式X

坦度替尼(MLN518、CT3518)是有效的FLT3拮抗剂，具有0.22μM的IC50，其也抑制PDGFR和c-Kit，对FLT3的效能比CSF-1R高15至20倍，并且对于相同靶标的选择性比FGFR、EGFR和KDR＞100倍。坦度替尼已经描述用于AML的治疗。DeAngelo等，Blood 108：3674-81(2006)。

索拉非尼(2-吡啶氨甲酰，4-[4-[[[[4-氯-3-三氟甲基)苯基]氨基]羰基]氨基]苯氧基]-N-甲基-4-(4-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)苯氧基)吡啶-2-羧酸甲基酰胺-4-甲基苯磺酸甲苯磺酸酯(也称为4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基}苯氧基)N2甲基吡啶-2-氨甲酰4-甲基苯磺酸酯)，如以下式XI所示：

式XI

索拉非尼由Bayer和Onyx Pharmaceuticals作为Nexavar共同研发和共同销售。索拉非尼(Sofafenib)的合成公开于美国专利公开No.2008/0262236中。

吡咯取代的2-吲哚啉酮(indolionone)蛋白激酶抑制剂公开于美国专利No.7,119,090；6,395,734；6,575,293和7,125,905中，如以下式XII所示：

式XII

舒尼替尼(N-(2-二乙基氨基乙基)-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-氨甲酰)；之前称为SU11248)可以名称

从Pfizer(New York，NY)商购。舒尼替尼的合成公开于美国专利No.6,573,293(化合物80)中，如以下式XIII所示：

式XIII

取代的吲哚并咔唑化合物通过米哚妥林(PKC412；(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲基氨基)-9，13-环氧基-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3’，2’，1’-1m]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并diamzonine-1-酮)，其是多靶标蛋白激酶抑制剂，正研究用于AML的治疗(Levis，Best Pract Res Clin Haematol 23(4)：489-494(2010))，如以下式XIV所示：

式XIV

KW-2449是多靶标抑制剂，主要对于Flt3具有6.6nM的IC50(Shiotsu等，Blood 114 (8)：(2009))，其如以下式XV所示：

式XV

使用DOT1L抑制剂和FLT3抑制剂的联合治疗

在特定实施方案内，本公开提供在施用如本文中公开的FLT3抑制剂之前、同时或之后施用DOT1L抑制剂的组合的方法，包括治疗方法。这些用于抑制细胞的生长和/或存活和用于治疗患者(特别是白血病患者)(所述细胞和患者呈现升高水平的HOX簇基因和/或HOX簇相关基因表达)的方法使用化合物(包括治疗化合物)的组合，包括用于白血病的治疗，如ALL或AML的一种或多种DOT1L抑制剂和一种或多种Flt3抑制剂的组合。

通过这些方法，向人患者单独施用或在药物组合物中施用一种或多种LFT3抑制剂和一种或多种DOT1L抑制剂，在所述药物组合物中，它们按剂量与合适的载体或赋形剂混合以治疗或改善本文中所述的疾病或病症。也可以将这些抑制剂的混合物作为单一混合物或作为药物组合物向患者施用。

本公开范围内的组合物包括其中第一治疗剂是DOT1L抑制剂和第二治疗剂是FLT3抑制剂的组合物，其中第一治疗剂和第二治疗剂以有效抑制患者中白血病细胞增殖的量和时间至少基本上同时或按序施用。第一和第二治疗剂有效量的最佳范围的确定在本领域技术人员的能力范围内。有效剂量随多种因素变化，包括特定抑制剂和患者的临床状态。

包含与DOT1L抑制剂组合的FLT3抑制剂的组合物可以肠胃外施用。如本文中使用的，术语“肠胃外施用”是指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

或者，包含FLT3抑制剂的组合物可以在DOT1L抑制剂施用之前、同时或之后施用。例如，可以在包括FLT3抑制剂施用的第一治疗方案完成后施用DOT1L抑制剂。相反，可以在包括DOT1L抑制剂施用的第一治疗方案完成后施用FLT3抑制剂。

施用的每种抑制剂的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，伴随治疗的性质，治疗频率和所需效果的性质。

用于静脉内输注包含FLT3抑制剂和DOT1L抑制剂的组合物的合适剂量将取决于施用的每种抑制剂的疗效，并且可以包括例如至少约2mg第一抑制剂/m²/天或至少约10mg第一抑制剂/m²/天或至少约20mg第一抑制剂/m²/天或至少约50mg第一抑制剂/m²/天或至少约100mg第一抑制剂/m²/天或至少约200mg第一抑制剂/m²/天或至少约500mg第一抑制剂/m²/天的剂量，其中第一抑制剂可以是FLT3抑制剂或DOT1L抑制剂。同样，第二抑制剂可以以至少约2mg第二抑制剂/m²/天或至少约10mg第二抑制剂/m²/天或至少约20mg第二抑制剂/m²/天或至少约50mg第二抑制剂/m²/天或至少约100mg第二抑制剂/m²/天或至少约200mg第二抑制剂/m²/天或至少约500mg第二抑制剂/m²/天的剂量来施用。将理解，如果第一抑制剂是FLT3抑制剂，那么第二抑制剂是DOT1L抑制剂。相反，如果第一抑制剂是DOT1L抑制剂，那么第二抑制剂是FLT3抑制剂。

包含FLT3抑制剂的组合物、包含DOT1L抑制剂的组合物和包含FLT3抑制剂和DOT1L抑制剂的组合的组合物通常包括治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。因为两种抑制剂组合使用，一种或另一种可以以阈下水平使用，并且仍然认为是治疗有效量。如本文中使用的，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他通常公认的用于动物并且更特别用于人的药典中。术语“载体”是指治疗剂与其一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

这些FLT3抑制剂和/或DOT1L抑制剂组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等的形式。组合物可以使用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这样的组合物将含有治疗有效量的抑制剂(优选纯化形式)和合适量的载体以提供合适向患者施用的形式。制剂应当适合施用方式。

组合物可以根据常规程序配制成适用于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在需要的情况下，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，单独或在单位剂型中混合在一起提供成分，例如，作为标明活性剂的量的密封容器(如安瓿或sachette)中的冻干粉末或无水浓缩物。在通过输注施用组合物的情况下，它可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶配置。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供一安瓿无菌注射用水或盐水以使得成分可以在施用前混合。

本文中公开的抑制剂可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，如源自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与阳离子形成的那些，如源自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

本公开的许多抑制剂可以作为与药学上相容的反离子的盐(即，药学上可接受的盐)来提供。“药学上可接受的盐”是指向接受者施用时能够直接或间接地提供本公开的化合物或化合物前药的任何无毒的盐。“药学上可接受的反离子”是在向受试者施用后从盐释放的无毒的盐的离子部分。药学上相容的盐可以与许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。在水或其他质子溶剂中，盐比其相应的游离碱形式倾向于更可溶。本公开包括这样的盐。

可以通过标准临床技术来确定有效治疗、抑制和/或预防特征在于一个或多个HOX簇基因或HOX簇相关基因的高水平表达但不具有MLL-易位的白血病的FLT3抑制剂、DOT1L抑制剂和这两者组合的量。可以任选地使用体外试验来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重性。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。

在用于人体之前，可以在体外随后在体内测试FLT3和DOT1L抑制剂化合物或包含FLT3和/或DOT1L化合物的组合物的所需的治疗或预防活性。例如，用于证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外试验包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。可以利用本领域技术人员已知的技术测定化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用，所述技术包括，但不限于增殖和细胞凋亡试验。根据本公开，可以用于确定是否施用所示特定化合物的体外试验包括体外细胞培养试验，其中将患者组织样品在培养物中生长，并暴露于或另外地施用化合物，并且观察这样的化合物对组织样品的作用。

本公开提供了通过在第二治疗剂或其组合物施用之前、同时或组合地或之后向受试者施用有效量的第一抑制剂或其组合物的治疗和抑制方法，其中第一抑制剂或其组合物可以包括FLT3抑制剂，而第二抑制剂或其组合物可以包括DOT1L抑制剂。或者，第一抑制剂或其组合物可以包括DOT1L抑制剂，而第二抑制剂或其组合物可以包括FLT3抑制剂。在一个方面中，化合物基本上是纯化的，使得化合物基本上不含限制其作用或产生不良副作用的物质。

各种递送系统是已知的并且可以用于施用本公开的组合物，例如，本领域技术人员已知的脂质体包封、微粒、微胶囊、受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))等等。

施用方法包括，但不限于，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径来施用抑制剂或组合物，例如，通过输注或浓注，通过经上皮或皮肤粘膜内衬(例如，口腔粘膜、肾和肠粘膜等)的吸收和可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。此外，可能需要将抑制剂或组合物通过任何合适的途径引入中枢神经系统中，所述途径包括心室内或鞘内注射。可以通过心室内导管来帮助心室内注射，例如所述导管连接于贮液器，如Ommaya贮液器。也可以使用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器以及含有雾化剂的制剂。

FLT3和DOT1L抑制剂可以单独或一起在囊泡(如脂质体(Langer，Science 249：1527-1533(1990))中或在受控释放系统中递送。受控释放系统可以布置在治疗靶标附近，由此只需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson，见Medical Applications ofControlled Release(受控释放的医学应用)，Vol.2，pp.115-138(1984))。

包含FLT3抑制剂、DOT1L抑制剂或两者的组合物的静脉内输注可以持续至少约一天，或至少约三天，或至少约七天，或至少约14天，或至少约21天，或至少约28天，或至少约42天，或至少约56天，或至少约84天或至少约112天的时间段。

包含FLT3抑制剂、DOT1L抑制剂的组合物的连续静脉内输注可以持续特定的时间段，接着是另一段持续时间的休息期。例如，连续输注的持续时间可以为约1天至约7天，至约14天，至约21天，至约28天，至约42天，至约56天，至约84天或至约112天。连续输注随后可以接着约1天，至约2天，至约3天，至约7天，至约14天或至约28天的休息期。然后可以如上重复连续输注，并接着另一个休息期。

与采用的确切持续输注方案无关，将理解包含FLT3抑制剂、DOT1L抑制剂的组合物的连续输注将持续直至获得所需功效或不可接受的毒性水平变得明显。

DOT1L抑制剂在产生治疗相关性白血病并呈现与HOX基因簇过表达或HOX簇相关基 因过表达有关突变的高风险患者中的用途

治疗相关的AML(t-AML)和治疗相关的ALL(t-ALL)是公知的临床综合征，其被认为是由用于治疗预先存在的病症(如血液和实体恶性肿瘤)的细胞毒性化疗和/或放疗诱发的突变的直接结果。大约所有治疗癌症的患者中的8-10％将在治疗后平均5年产生t-AML。已经报道了在各种原发性癌症(包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、乳癌和肺癌)的治疗后t-AML的产生。Larson RA，Haematologica，2000年4月；94(4)：454-9。特别地，已经表明烷化化疗剂(其结合DNA并阻止其复制)提高了治疗相关的白血病的风险。此外，使用拓扑异构酶II抑制剂治疗特定类型的癌症如肺癌的用途也已经与产生治疗相关的AML的更高风险相关联。Bhatia S.Semin Oncol.2013年12月；40(6)：666-75。

在t-AML和t-ALL中观察到的细胞遗传异常与原发AML和ALL中发现的那些类似。例如，与原发AML相似，MLL重排是治疗相关的AML的共同特征(Schoch，Blood.2003年10月1日；102(7)：2395-402)。另外，已经在t-AML患者中鉴定出已知的NUP90易位中的几个(Lam DH，Leukemia，15(11)：1689-95(2001))。相似地，已经表明IDH1和IDH1突变是相同类型的并且在t-AML和原发AML中以相同的发病率产生(Westman，MK，Leukemia(2013)27，957-959)。总之，所引用的证据强烈地表明原发AML和t-AML共有共同的生物学特征，包括与升高的HOX簇基因表达相关的突变的存在。因此，当个体呈现一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的过表达时，DOT1L抑制剂在治疗上述类型的高风险个体中是有用的。替代测量这样的过表达，如果他们显示出具有MLL-易位、MLL-重排和/或MLL-PTD以外的已知或确定为与一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达相关的遗传突变、改变和/或异常，也可以鉴定这样的个体。治疗的目的是降低这样的过表达，从而降低这些个体产生t-ALL和t-AML的风险。

将理解，除非表明相反，术语意欲是“开放式的”(例如，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当解释为“至少具有”，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”等)。如“至少一个”和“一个或多个”这样的短语以及如“一(a)”或“一个(an)”这样的术语包括单数和复数两者。

将进一步理解，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本公开还意欲根据马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述。相似地，本文中公开的所有范围还包括所有可能的子范围和子范围的组合，并且如“之间”、“多达”、“至少”、“大于”、“少于”等这样的语言包括范围中列举的数字并包括各单个成员。

此外，之前涉及包含DOT1L抑制剂的方法、试剂盒、组合物的所有章节视为适用于组合或联合的DOT1L抑制剂和FLT3抑制剂。

本文中引用的所有参考文献，不管是上文的或是下文的，包括但不限于，专利、专利申请和专利公开(不管是美国的、PCT或非美国的外国)，以及所有技术和/或科学出版物的全文通过引用并入本文。

尽管本文中已经公开了各种实施方案，但其他实施方案将是本领域技术人员显而易见的。本文中公开的各种不同实施方案用于说明的目的而不是限制性的，真实的范围和精神由权利要求来表示。

将参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。本文中引用的所有专利、专利申请和所有其他出版物的教导通过引用并入本文。

具体实施方式

实施例1

对DOT1L的抑制抑制呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL部分串联重复的白血病细胞的 生长(现有技术)

按照本领域通常理解的，这个实施例证实了呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复和一个或多个HOX簇基因或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达的白血病对DOT1L抑制敏感。

在多种白血病生成的融合致癌蛋白诱导发育的白细胞中不适当的基因表达，从而将这些细胞重新编程并阻断其分化的机制中，DOT1L是至关重要的组蛋白甲基转移酶。DOT1L的抑制阻止了白血病相关的基因表达特征并且诱导MLL-融合驱动的白血病的分化。

已经证明了HOX簇基因对于白血病细胞的持续增殖和存活是重要的(Faber等，HOXA9 is required for Surviva1 in Human MLL-rearranged Acute Leukemias(HOXA9是人MLL-重排急性白血病存活所需的)，Blood 113(11)：2375-85(2009))，并且已经表明AML中升高的HOX簇基因表达可能与不良结果相关。还已经表明，在MLL-易位的白血病中，对DOT1L组蛋白甲基转移酶的抑制引起HOX簇基因表达的降低和细胞增殖的相应降低。

基于这些发现，假定DOT1L为用于MLL-易位白血病的潜在治疗靶标，所述MLL-易位白血病依赖于DOT1L来持续增殖和存活并呈现升高的HOX簇基因表达。

进行了研究来确定六个具有MLL-易位的白血病细胞系和六个不具有MLL-易位的细胞系中细胞增殖的IC50。MLL-易位细胞系的IC50为：MV4-11(

CRL-9591；Manassas，VA)，170nM；SEMK2(S，Armstrong，MSKCC)，1.7mM；KOPN-8(Creative Bioarray，Shirley，NY)，620nM；Molm-13(Creative Bioarray，Shirley，NY)，720nM；和THP-1(

TIB-202)，3mM。相反，非MLL-易位的细胞系的IC50为：Jurkat(

CRL-2898)，＞50mM；Kasumi-1(

CRL-2724)，33mM；697(Creative Bioarray，Shirley，NY)，35mM；REH(

CRL-8286)，14mM；和HL-60(

CCL-240)，＞50mM(图2)。

在鼠MLL-AF9转化的细胞系中，对DOT1L和H3K79甲基化的依赖性是相同的，不管DOT1L是否使用条件敲除模型遗传失活或用小分子EPZ004777进行抑制。具体地，HOXA9/MEIS1转化的细胞对DOT1L抑制不敏感，而MLL-AF9转化的细胞作为DOT1L抑制结果经历细胞周期停滞和细胞凋亡。

在选择性小分子氨基核苷DOT1L抑制剂EPZ004777的存在下，测试了两个人白血病细胞系，MUTZ-11(H.Drexler，DSMZ，Braunschweig，DE)和EOL-1(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(其呈现升高的HOX簇基因表达并具有MLL-部分串联重复(AMLL-PTD))，的增殖(Daigle等，Cancer Cell 20(1)：53-65，2011)。MUTZ11和EOL1细胞系用10μM EPZ004777(该浓度不影响没有显示出升高的HOXA基因表达的细胞系的增殖)处理(图2)。EPZ004777在10天时间段内明显抑制所测试的两个MLL-PTD细胞系的增殖。

在处理MLL-PTD细胞系MUTZ11后七天和10天时评估HOXA基因表达。HOXA簇基因表达显著降低(图4)，表明MLL-PTD白血病细胞中DOT1L是持续增殖和升高的HOXA簇基因表达所需要的。

实施例2

对DOT1L的抑制抑制呈现出不是MLL-易位、MLL-重排或MLL部分串联重复但与升高 的HOX簇基因表达相关的遗传突变的白血病细胞的生长

这个实施例证明呈现：(1)MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复(MLL-PTD)以外的一个或多个白血病相关的基因突变和(2)一个或多个HOX簇基因和/或一个或多个HOX簇相关基因的升高表达的特定白血病组织和细胞对DOT1L抑制是敏感的，因此可以通过施用DOT1L抑制剂来有利地治疗。

除了与MLL-易位、MLL-重排和MLL-PTD相关的白血病外，其他白血病，例如具有NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1基因的任一个中的一个或多个突变和/或NUP98-NSD1和/或其他NUP98易位的白血病，也呈现升高的HOX簇基因和/或HOX簇相关基因表达(参见表2和3，其公开了与升高的HOX簇基因和/或HOX簇相关基因表达相关(表2)和不相关(表3)的白血病相关基因)。

作为本公开的部分，在呈现了NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1基因中的突变以及NUP98-NSD1和其他NUP98易位的代表性白血病中评估了DOT1L在调节HOX簇基因表达和HOX簇相关基因表达以及维持细胞增殖和存活中的作用，所述白血病没有再呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-PTD。

通过NUP98-NSD1融合蛋白驱动的白血病细胞也呈现出升高的HOX簇基因表达，假定是异常H3K36甲基化的结果，因为NSD 1是H3K36甲基转移酶。Wang等，NUP98-NSD1LinksH3K36Methylation to HOX-A Gene Activation and Leukaemogenesis(NUP98-NSD1将H3K36甲基化与HOX-A基因激活和白血病生成联系起来)，Nature Cell Biology 9(7)：804-12(2007)。

如本文中公开的，表达NUP98-NSD1基因融合的白血病细胞的增殖被EPZ004777DOT1L抑制。因为NSD1驱动异常H3K36甲基化，这些数据进一步表明NSD1对组蛋白K36的甲基化和DOT1L对K79的甲基化之间重要的且之前未认识到的关联(图5)。

NPM1突变的人AML细胞系，OCI-AML3(DSMZ、ACC-582；Braunschweig，DE)，也用DOT1L抑制剂EPZ004777处理，并且将那些EPZ004777处理的OCI-AML3细胞的增殖与EPZ004777存在下EPZ004777敏感的MLL-易位细胞系和EPZ004777-不敏感的AML1-ETO-易位细胞系的增殖进行比较。OCI-AML3细胞对EPZ004777的生长抑制与MLL易位细胞系一样敏感，而AML 1-ETO易位细胞系对EPZ004777介导的生长抑制不敏感(图7A-D)。

这个实施例中所示的数据证明呈现升高的HOX簇基因或HOX簇相关基因表达但不具有MLL-易位、MLL-重排或MLL-PTD的白血病对DOT1L抑制有反应，并且当表达升高的HOX簇基因的细胞接触DOT1L抑制剂如EPZ004777时，这样的白血病细胞的增殖降低。

此外，并且不受理论限制，本文中所示的数据表明，DOT1L对H3K79的甲基化对于正常的造血细胞中HOX基因表达的维持是重要的，并且支持DOT1L抑制剂用于治疗呈现升高的HOX簇基因表达的患者中白血病的临床功效，无论那些白血病是否具有MLL-易位、MLL-重排或MLL-PTD。

实施例3

用于确定表观遗传调节剂在白血病中的作用的小鼠模型系统

为了研发NUP98-NSD1驱动的白血病的小鼠模型系统，将编码NUP98-NSD1融合蛋白的cDNA引入富含造血干细胞(HSC)的Lin-、Sca1+、c-Kit+(LSK)小鼠骨髓细胞中。这些细胞在培养物中无限增殖并且在小鼠中诱导白血病。因此，可以评估NUP98-NSD1转化的富含HSC的LSK细胞的DOT1L抑制。

NUP98-NSD1转化的富含HSC的LSK细胞用DOT1L抑制剂EPZ004777处理，并且发现对EPZ004777非常敏感，如通过将细胞暴露于各种浓度的DOT1L抑制剂时的增殖缺陷所证明的(图5A)。此外，用10μM DOT1L抑制剂处理NUP98-NSD1转化的小鼠细胞7天显著降低了HOX启动子相关的H3K79甲基化，这伴随着HOXa7、HOXa9、HOXa10和Meis1簇基因表达的实质性降低(图5B)。

为了开始确定DOT1L在正常造血干细胞(HSC)中的作用，将条件性DOT1L敲除小鼠与Mx1-CRE小鼠杂交以产生其中在用聚次黄嘌呤核苷-聚胞苷酸(pIpC)处理时可以条件性使HSC DOT1L表达失活的小鼠。

DOT1L的失活导致HSC的数量和功能逐渐降低。在这种数量和功能的降低之前，评估总体基因表达以确定哪些基因表达程序在HSC中是DOT1L依赖性的。DOT1L的失活导致对于HSC生物学重要的多种基因的表达以及HOXA簇和MEIS1基因表达的降低。实际上，正常HSC中DOT1L失活时，许多MLL-融合靶基因的表达降低。正常HSC中DOT1L并且因此H3K79甲基化控制HOXA簇基因表达这一事实进一步证明了呈现升高的HOXA簇基因表达的其他白血病(除了具有MLL-易位、MLL-重排或MLL-PTD的那些以外)也对DOT1L抑制敏感。

实施例4

DOT1L抑制剂在与NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1、NUP98-NSD1和其 他NUP98易位相关的白血病中的功效

进行使用DOT1L抑制剂的实验来进一步限定DOT1L在与NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1基因中的突变以及NUP98-NSD1和其他NUP98易位相关的白血病中的作用。

为了确定NUP98-NSD1转化小鼠细胞是否呈现与之前描述的MLL-AF9细胞相似水平的对DOT1L抑制的敏感性，监测DOT1L抑制剂EPZ004777降低H3K79甲基化的能力。用10μMEPZ004777处理10天后，通过Western印迹测定NUP98-NSD1和MLL-AF9细胞中的总体H3K79水平。尽管NUP98-NSD1细胞呈现较高水平的内源性H3K79me2，EPZ004777处理完全消除了两种细胞类型中的H3K79me2(图8A)。此外，为了测试DOT1L抑制剂是否诱导了NUP98-NSD1转化细胞中的细胞凋亡，用10μM DOT1L抑制剂EPZ004777或媒介对照处理细胞。在处理10天后，通过用膜联蛋白V将细胞染色来评估细胞凋亡。将细胞凋亡的程度与以相似方式处理的MLL-AF9转化细胞中发现的进行比较。发现DOT1L抑制剂在NUP98-NSD1转化细胞中比在MLL-AF9转化细胞中诱导更多的细胞凋亡(图8B)。为了进一步测试表达高水平的HOXA9和MEIS1基因的细胞系对使用DOT1L抑制剂的处理敏感而与MLL突变的存在与否无关这一假设，用10μMDOT1L抑制剂EPZ004777或媒介对照处理分别呈现DNTM3A和NPM1突变并且呈现高水平的HOXA9表达但不具有MLL突变的两个细胞系OCI-AML2和OCI-AML3。同时，不表达HOXA9的HL60细胞(阴性对照)和呈现高水平的HOXA9表达并具有MLL-易位的Molm-13细胞(阳性对照)也用10μM的DOT1L抑制剂EPZ004777或媒介对照进行处理。

在处理开始后的多个时间点评估细胞数量。OCI-AML2和OCI-AML3细胞对DOT1L抑制剂同等敏感(如果不是更敏感)，然后是MLL-重排的细胞系Molm-13(图9和10)。接着，我们评估了DOT1L抑制剂是否诱导OCI-AML3细胞中的细胞凋亡，并且发现其确实在培养物中诱导极大增加的凋亡细胞(图11A)。通过流式细胞仪测定的细胞周期状态表明接触DOT1L抑制剂的细胞呈现出表示细胞凋亡的Sub G1累积。通过细胞表面标志物表达如CD11b和CD15表达(这两者都在骨髓单核细胞性白血病细胞分化时诱导)的表征，在DOT1L抑制后评估分化的证据，。通过测量细胞表面分化标志物CD11b的表达，用EPZ004777处理OCI-AML3细胞以提高的分化为标志的(图11B)。

用最高10μM的递增浓度的DOT1L抑制剂EPZ00477处理分别呈现DNTM3A和NPM1突变的OCI-AML2和OCI-AML3人细胞。在第11天进行MTT试验。OCI-AML2和OCI-AML3细胞系的IC50均测定为0.15μM，其低于MLL-融合细胞系的历史IC50值。

评估了DOT1L抑制对来自从小鼠分离的造血干细胞(Lin-c-kit+ Sca-1+ CD150+CD48-)和来自人脐血的CD34+/CD38-细胞的克隆生长的影响以确定DOT1L抑制剂对正常干细胞和祖细胞的作用。使用DOT1L抑制剂EPZ005676(其正在1期临床试验中测试)的临床前研究以有效对抗人和鼠MLL-易位的白血病细胞的剂量在小鼠或大鼠中没有显示出造血毒性。

实施例5

小鼠研究

进行使用小鼠模型的实验以了解体内DOT1L抑制的后果。使用AML的小鼠模型来测试DOT1L抑制剂EPZ004777的体内功效。工程化以包含NPM1c突变和其他突变(如Npm1^cA/+Rosa^SB/+(Vassiliou G，Nature Genetics，2011)或Npm1^cA/-Flt3^ITD/+(Mupo A，Leukemia，2013))的动物分别在1年和68天内产生了AML。测试将从Npm1^cA/+Rosa^SB/+或Npm1^cA/-Flt3^ITD/+小鼠分离并在10μM DOT1L抑制剂存在下培养6天的AML细胞移植至接受者后，测试所述细胞的克隆生成潜能。初次和二次移植后，用媒介对照(DMSO)或10μM EPZ00477处理Npm1^cA/+Rosa^SB/+和Npm1^cA/-Flt3^ITD/+AML细胞所示天数(如所写明的7、14、15或22天)(图12A和B)，之后进行克隆形成分析。初次和二次移植后在DOT1L抑制剂存在下AML小鼠细胞系的培养均导致了克隆形成潜能的显著降低(图12A和B)。DOT1L抑制对克隆形成的作用在较后的时间点更明显(第14、15和22天)。

为了评估DOT1L抑制对白血病启动潜能的作用，向同源C57/BL6小鼠注射之前用DMSO或10μM EPZ00477处理6天的Npm1^cA/+Rosa^SB/+细胞。两组(DMSO和EPZ004777)的Kaplan-Meier存活曲线如图13A所示，显示注射了接受DOT1L抑制剂的细胞的动物的存活时间延长。此外，用Wright-Giemsa染料染色的外周血涂片显示EPZ00477处理的细胞的分化(而在只暴露于DMSO的细胞中没有分化)(图13B)。最后，分析了全血计数，表明白细胞数量的显著降低，其伴随着血红蛋白和血小板计数水平的平行的轻微增加(图13C)。共同地，这些结果证明DOT1L抑制剂在体内降低了由NPM1驱动而不是由MLL突变、易位或重复驱动的AML小鼠模型中的白血病生成。

使用qPCR评估了DOT1L抑制对各种HOX基因和HOX相关基因的水平的作用。用EPZ00477处理Npm1^cA/+Rosa^SB/+和Npm1^cA/-Flt3^ITD/+鼠AML细胞导致HOXA9、HOXA10、MEIS1、HOXB3、HOXB4和HOXB5mRNA水平的显著降低(图14A和B，其中显示了HOXA9、HOXA10、MEIS1、HOXB3、HOXB4和HOXB5各自的RNA水平)，进一步表明HOX基因和HOX相关基因表达很大程度上依赖于DOT1L活性。

实施例6

小鼠研究(预测性的)

这个实施例描述了白血病异种移植的小鼠的产生，包括与NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1基因的一个或多个中的一个或多个突变和/或NUP98-NSD1或其他NUP98易位相关的白血病，以及测试所得小鼠模型中DOT1L抑制剂的体内功效。

用NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1突变，以及NUP98-NSD1和其他NUP98易位来表征白血病样品(儿科和成人)。已知EPZ00477的输注(包括连续输注)抑制小鼠中MLL-易位白血病细胞的生长。使用NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和ASXL1细胞系以及呈现NUP98-NSD1或其他NUP98易位的细胞系(以及MLL-易位和/或MLL-PTD细胞系作为对照)进行相似实验以测定小分子抑制剂的体内活性。

初始实验使用其中生长动力学和药物响应特征已知的细胞系。Armstrong等，Inhibition of FLT3in MLL：Validation of a Therapeutic Target Identified byGene Expression based Classification(MLL中的FLT3抑制：通过基于基因表达的分类鉴定的治疗靶标的验证)，Cancer Cell 3(2)：173-83(2003)。如上所述的，在相同的细胞系研究中在体外确定定生物标志物评估，如H3K79me2的抑制，并对体内处理的细胞进行相似分析。

可以根据Daigle等，Blood(2013年6月25日)[Epub在印刷前]中(其描述了DOT1L抑制剂EPZ005676在MLL-易位细胞系MV4-11异种移植的免疫缺陷大鼠中的体内功效)所述的方法，在异种移植NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1细胞系和/或呈现NUP98-NSD1或其他NUP98易位的细胞系的免疫缺陷大鼠中测试DOT1L抑制剂的体内功效。

可以根据Wang等，NUP98-NSD1 Links H3K36 Methylation to HOX-A GeneActivation and Leukaemogenesis(NUP98-NSD 1将H3K36甲基化与HOX-A基因激活和白血病生成联系起来)，Nature Cell Biology 9(7)：804-12(2007)(其描述了植入NUP98-NSD1鼠白血病的免疫缺陷NSG小鼠的产生)描述的方法，在异种移植NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1细胞系和/或呈现NUP98-NSD1或其他NUP98易位的细胞系的免疫缺陷小鼠中测试DOT1L抑制剂的体内功效。然后在那些白血病移植的免疫缺陷小鼠中针对NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1白血病和/或呈现NUP98-NSD1或其他NUP98易位的白血病评估DOT1L抑制剂。

结合生物标志物评估策略来评估H3K79ME2的抑制程度。这些生物标志物评估研究将酶抑制与患者中与小分子DOT1L抑制剂的临床试验评估相关的反应关联起来。n＝9的组大小足以使用α＝0.05的双侧检验检测肿瘤负荷中30％的差异，能力≥80％。因此，将n＝9-10只动物的组大小用于体内功效研究。

这些实验将提供更多的对于DOT1L抑制剂对抗NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1介导的白血病和/或由NUP98-NSD1或其他NUP98易位介导的白血病的疗效的支持。

实施例7

鉴定调节NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2和/或ASXL1介导的白血病和/或由 NUP98-NSD1或其他NUP98易位介导的白血病中对DOT1L抑制的敏感性的基因(预测性的)

考虑到DOT1L似乎对NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1，以及NUP98-NSD1细胞增殖是关键的，还鉴定了作为这种途径的增强子或遏制子的其他基因。DOT1L复合物的调节子全部是潜在的治疗靶标。此外，抑制或增强DOT1L抑制剂介导的生长抑制的基因的鉴定阐明了抑制剂以及NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1基因两者的作用机理。

之前的研究证明了作为其诱导HOX基因表达和转化的机理的一部分，NUP98-NSD1影响H3K36甲基化，但不清楚H3K79甲基化如何在这种白血病中起作用。ChIP-Seq研究进一步确定了在DOT1L抑制后发生的组蛋白修饰中的改变。本文中定义的筛选阐明了DOT1L在这些白血病中起的作用。

高通量、基因组规模的shRNA筛选(HT-shRNA)导致药物敏感性/抗性的新靶标的鉴定。使用小分子或哺乳动物系统中遗传失能模型进行与遗传增强子/遏制子筛选类似的实验。

在存在或不存在DOT1L抑制剂的情况下进行全基因组池的RNAi筛选。已经产生了MLL-AF9转化的鼠白血病系，其中DOT1L可以通过用他莫昔芬处理细胞和Cre重组酶的激活条件性地抑制。Cre诱导后大约6天，细胞系分化、停止增殖并开始经历细胞凋亡(图6)。此外，重组效率使得在未切除DOT1L基因的情况下很少看到细胞生长。可以通过重新引入DOT1L或通过MLL-AF9靶基因HOXA9和MEIS1的表达来拯救细胞的生长。

针对NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1转化的细胞研发了相似的细胞系。这些细胞系理想地适用于shRNA筛选来鉴定选择用于或对抗不存在DOT1L下的生长的shRNA。

用10μM EPZ004777或DMSO处理NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1转化的细胞。对于每个细胞系，使用5个未处理细胞的生物重复和他莫昔芬处理的细胞的重复进行实验。在诱导cre重组酶后0、3、6、9和12天收获细胞用于分离基因组DNA。将shRNA扩增、条码编码，并使用Illumina测序进行测序。

鉴定在DOT1L抑制剂存在而非不存在的情况下耗尽或富集的shRNA，表明这些基因的敲低对DOT1L抑制致敏或赋予对DOT1L抑制的抗性。将两个shRNA评分显著不同的基因指定为候选基因。对于候选基因，通过定量PCR和Western印迹验证shRNA的敲低，并且分析另外的细胞系。通过表达非可靶定形式的基因拯救表型来验证shRNA筛选中鉴定的基因。在没有包括在初步筛选中的其他细胞系中特别是在MLL-易位的细胞系中研究这些基因以证实相似的效果。对于具有可利用的小分子抑制剂的候选蛋白质，测定DOT1L抑制剂在每个细胞系中对存活力、细胞周期和细胞凋亡的表型结果。

实施例8

DOT1L的分子作用以及DOT1L和EZH2抑制剂的临床前活性(预测性的)

最近的研究已经证明了DOT1L抑制剂对抗MLL-易位人白血病细胞系和鼠模型的显著活性，并且初步证据表明其他AML亚型依赖于DOT1L酶活性。

评估NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1白血病细胞的DOT1L抑制剂处理后发生的组蛋白甲基化的变化。NUP98-NSD1诱导HOX基因的H3K36me3，因为NSD1是H3K36甲基转移酶。Wang等，Nature Cell Biology9(7)：804-12(2007)。迄今为止，不清楚为什么H3K79的二甲基化在这种白血病亚型中是重要的。因此，非常感兴趣的是检验DOT1L抑制后特定的H3K79修饰怎样变化。

已经确定了MLL-融合靶基因。与更广泛的基因表达相比，靶基因表达更依赖于DOT1L。为了对NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1白血病使用相同的方法，与对于MLL-AF9所描述的测定NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1靶基因。产生在NH₃-末端具有生物素化序列并在小鼠HSC中表达的NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1蛋白。细胞转化时，细胞用细菌BirA(其将NH₃-末端序列生物素化)共转染。

使用抗生物素蛋白链菌素珠进行ChIPseq，并且测定NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1的结合位点。用抑制剂处理MLL-PTD、MLL-AF9、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1小鼠或人白血病细胞系，并且在处理后24、48和72小时评估基因表达的变化。将MLL-PTD和MLL-AF9细胞中使用DOT1L抑制剂的表达变化与其他细胞系中的变化进行比较。

使用标准基因表达算法如基因集合富集分析来确定MLL-融合靶基因以及NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1靶基因的基因表达变化中的重叠程度。这确认了NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1驱动的基因表达程序在DOT1L抑制剂处理时是否逆转。

按照之前所述[12]，进行H3K79me2的ChIP-seq来评估组蛋白甲基化。评估NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1转化细胞中的H3K36me3以确定H3K36me3谱在这些细胞中是否异常。在DOT1L抑制剂处理后测定H3K79me2和H3K36me3的变化以确定这些修饰相对于彼此怎样改变。这些实验证实DOT1L抑制逆转白血病生成程序，如MLL-融合依赖性白血病中那样。

实施例9

DOT1L抑制剂结合EZH2抑制剂在体外和体内的抗白血病作用(预测性的)

如本文中公开的，DOT1L抑制剂在NUP98-NSD1和NPM1白血病中呈现显著的活性。评估联合方法以在小鼠模型系统中使用靶向疗法有效治疗白血病。

许多不同的染色质修饰酶和复合物已经显示对MLL-易位AML和其他亚型的AML是重要的。特别地，组蛋白H3K27甲基转移酶EZH2是MLL-AF9白血病细胞的自我更新所需要的。Neff等，Polycomb Repressive Complex 2 is Required for MLL-AL9 Leukemia(Polycomb抑制复合物2是MLL-AL9白血病所需要的)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109 (13)：5028-33(2012)。EZH2通过对多个亚型的AML重要的机制，即对p16/p19的抑制和Myc-驱动的基因表达程序的维持来起作用。Wang等，Nature Cell Biology9(7)：804-12(2007)。

最近已经表明组蛋白脱甲基酶LSD1对持续的AML细胞增殖是重要的并且进行了测试，因为LSD1抑制剂变为可得的。Harri等，The Histone Demethylase KDM1A Sustainsthe Oncogenic Potential of MLL-AF9 Leukemia Stem Cells(组蛋白脱甲基酶KDM1A支持MLL-AF9白血病干细胞的肿瘤生成潜能)，Cancer Cell21(4)：473-87(2012)。在白血病模型中测试了DOT1L抑制剂和EZH2抑制剂的组合，包括NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1白血病模型。结合DOT1L抑制评估其他抑制剂。

在体外评估DOT1L和EZH2抑制剂的组合。评估在MLL-易位和MLL-种系细胞中的体外协同作用。在NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1白血病细胞中进行相似的实验。已经建立了机器人控制系统(robotic pinning system)，其允许滴定多个浓度的两种不同化合物。这为用于评估DOT1L和EZH2抑制剂的体外协同作用提供详细评价。

机器人液体操作和有效的文库平板设计允许将两种化合物的组合快速、自动化地转移至培养细胞的384-孔平板中。产生了两种化合物的5×5剂量阵列，八个重复，两翼为剂量反应形式的每种药剂的四个重复。孵育7-10天后，测定ATP含量作为用于多标记平板阅读器上细胞存活力的替代。进行这些实验以使得在评估细胞数量之前将细胞系暴露于DOT1L和EZH2抑制剂化合物7-10天。需要延长的孵育期，因为EZH2和DOT1L抑制剂需要长达一周来抑制增殖。

根据Chou和Talalay的方法，在CompuSyn程序包中将结果作图。所得的剂量-效应曲线和等效线图(isobologram)表明是否存在累加或协同作用。获得组合指数并且进行比较以确定是否存在显著协同作用。由于化合物诱导分化，使用微阵列分析测定单个药剂和分子组合的作用，以确定分化的程度和是否检测到如基于之前使用DOT1L和EZH2失能模型的研究所预期的预期基因表达改变的组合。

体内测试抑制剂的组合。在小鼠模型系统中评价DOT1L抑制剂，从所述模型确定针对每种化合物的合适剂量和方案。EZH2抑制剂的剂量和方案已经被发表。McCabe等，EZH2Inhibition as a Therapeutic Strategy for Lymphoma with EZH2-activatingMutations(EZH2抑制作为用于EZH2-激活突变的淋巴瘤的治疗策略)，Nature492(7427)：108-12(2012)。通过监控体内表达人和小鼠MLL-融合驱动的和MLL-PTD白血病以及NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1白血病细胞的荧光素酶的生物发光，进行组合研究来评估抗白血病活性。Bernt等，MLL-rearranged Leukemia is Dependenton Aberrant H3K79 Methylation by DOT1L(MLL-重排白血病取决于DOT1L引起的异常H3K79甲基化)，Cancer Cell20(1)：66-78(2011)和Stubbs等，MLL-AF9和FLT3 Cooperationin Acute Myelogenous Leukemia：Development of a Model for Rapid TherapeuticAssessment(急性骨髓性白血病中的MLL-AF9和FLT3合作：用于快速治疗评价的模型的研发)，Leukemia22(1)：66-77(2008)。

每日用媒介、单种抑制剂或抑制剂的组合处理小鼠直至对照动物达到设立的限制(即，恶化开始或肿瘤体积限度)。初级终点包括肿瘤负荷(如通过外周血GFP阳性率、外周血中的％人CD45和/或发光成像评估)。牺牲时间和二级终点包括完全组织病理学检查。

针对原发性人MLL易位AML评估功效，其样品植入NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1白血病。这些研究为这些化合物提供支持这种组合的临床解释的重要临床前评价。实施例10

ALM的小鼠模型中NPM1和FLT3的双重抑制(预测性的)

在白血病生成中，疾病的完全发展常常需要超过一个基因突变。AML中存在的遗传改变的组合是患者预后和对治疗的反应的主要决定因素。FLT3和NPM1基因中的突变代表AML中最常见的遗传异常并且用作重要的预后指示剂。尽管FLT3发现于三分之一的AML病例中(Thiede C，Blood.2002年6月15日；99(12)：4326-35)并且与差的预后和结果相关，NPM1突变存在于50-60％的AML患者中并且通常赋予对化疗的增强反应和有利的预后(SchlenkRF，N Engl J Med 2008；358：1909-1918)。然而，大约40％的NPM1突变阳性患者也携带FLT3突变，其中FLT3突变的存在抵消了只携带NPM1突变的患者的有利结果(Gale，RE.Blood，2008年3月1日；111(5)：2776-84)。此外，已经表明FLT3受体激酶与NUP98-HOX融合合作，从而诱导高度侵袭性的AML。最后，在特征为高HOX基因表达的AML亚型中已经观察到了升高的FLT3水平(Palmqvist，L.Blood.2006年8月1日；108(3))。令人感兴趣地，目前的研究表明FLT3突变最可能不与高HOX簇基因表达有因果联系，进一步证实对引起白血病生成的两个独立途径的双重抑制的重要性(Andreeff M，Leukemia 2008，22，2041-2047)。总之，这些观察表明在伴随高FLT3表达和/或突变的HOX诱发的AML和ALL中使用FLT3抑制剂可以为使用DOT1L抑制剂治疗的患者提供另外的益处。

为了在体内测试DOT1L抑制结合FLT3抑制的功效，将DOT1L抑制剂EPZ00477与FLT3抑制剂Quizartinib(AC220)一起施用于AML的小鼠模型。工程化以含有FLT3突变和NPM1c突变的动物，Npm1^cA/+Flt3^ITD/+(Mupo A，Leukemia 2013年9月；27(9)：1917-1920)产生了AML并且在68天内死亡。为了评gu双重联合治疗(DOT1L和FLT3两者的抑制)是否降低用该组合处理的细胞的白血病生成潜能并且与使用任一种单独蛋白质的抑制相比为移植了预先处理的细胞的小鼠提供另外的存活益处，平行评估EPZ004777和AC220的功效。由于将小鼠接受连续输注的技术困难，在DOT1L抑制剂EPZ004777或FLT3抑制剂AC220或两者的存在下，以剂量依赖性的方式将从Npm1^cA/+Flt3^ITD/+小鼠分离的AML细胞培养6天，并在将细胞移植至接受小鼠中后以与实施例5平行的方式测试其克隆生成潜能。进行初次和二次移植。每次移植后，收获Npm1^cA/+Flt3^ITD/+AML细胞并用媒介对照(DMSO)、或EPZ00477、或AC220或EPZ00477和C220两者处理7、14和22天，此后进行克隆形成分析。已经表明在DOT1L抑制剂的存在下培养AML小鼠细胞(Npm1^cA/+Flt3^ITD/+)降低初次和二次移植后的克隆形成潜能(图12A和B及实施例5)。因此，将双重抑制(DOT1L抑制与FLT3抑制)抑制克隆形成潜能的能力与单独的DOT1L抑制和单独的FLT3抑制的能力进行比较。预期用该组合处理的细胞的克隆生成潜能将显著低于用任一药剂单独处理的克隆生成潜能。

为了进一步评估双重DOT1L和FLT3抑制对白血病启动潜能的作用，向同源C57/BL6小鼠注射之前用DMSO，或DOT1L抑制剂EPZ004777，或FLT3抑制剂AC220或两者以剂量依赖性方式使用0.1、1和10μM的每种化合物处理6天的Npm1^cA/+Flt3^ITD/+细胞。已经证明用DOT1L抑制剂处理Npm1^cA/+Flt3^ITD/+AML细胞导致延长的存活时间。尽管注射了用DMSO处理的细胞的小鼠在第19天死亡，注射了用EPZ00477(10μM)处理的细胞的动物在第31天开始死亡(图13A)。因此，评估包含DOT1L和FLT3抑制剂两者的处理延迟死亡开始的能力(注射后超过31天)。另外，剂量反应曲线提供双重抑制实验(EPZ004777和AC220)相对于任一单独抑制剂的最小所需剂量的信息。预期这些结果将表明使用DOT1L和FLT3抑制剂两者的组合在延长由NPM1和FLT3突变驱动的AML小鼠模型的存活中的增强功效，其对人的治疗具有启示作用。FLT3抑制剂正在用作或目前研发为用于AML的一线治疗。作为二线治疗的药物组合的可利用性将实质性地提高对抗白血病的可用的武器。

Claims (15)

1.用于定量扩增HOX簇基因RNA或HOX簇相关基因RNA的引物对在制备用于确定白血病患者是否对使用DOT1L抑制剂的治疗易感的诊断试剂盒中的用途，所述确定包括：

将来自所述白血病患者的组织样品中的HOX簇基因RNA和/或HOX簇相关基因RNA的定量水平与来自健康受试者的组织样品中的HOX簇基因RNA和/或HOX簇相关基因RNA的定量水平进行比较，其中所述定量通过使用所述用于定量扩增HOX簇基因RNA或HOX簇相关基因RNA的引物对扩增所述组织样品中的RNA来进行，

其中所述白血病患者包含NPM1突变且不含MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复；并且

其中所述HOX簇相关基因是MEIS1、PBX3或MEIS2A；

其中所述HOX簇基因RNA选自HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9和HOXB13；

其中，如果与所述健康受试者组织样品中的所述HOX簇基因RNA和/或HOX簇相关基因RNA相比，所述白血病患者组织样品中存在所述HOX簇基因RNA和/或HOX簇相关基因RNA的升高水平，则该升高水平表明所述患者对使用DOT1L抑制剂的治疗易感。

2.权利要求1的用途，其中所述引物对包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物朝向所述HOX簇基因RNA或HOX簇相关基因RNA的5’端杂交和其中所述反向引物朝向所述HOX簇基因RNA或HOX簇相关基因RNA的3’端杂交。

3.权利要求1的用途，其中所述组织样品是血液样品、骨髓样品或淋巴结样品。

4.DOT1L抑制剂在制备用于抑制白血病细胞增殖或增强白血病的细胞凋亡的药物中的用途，其中与非白血病细胞相比，所述白血病细胞呈现升高的HOX簇基因或HOX簇相关基因的表达水平，

其中所述白血病细胞包含NPM1突变且不呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复，

其中所述HOX簇基因选自HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9和HOXB13，且

其中所述HOX簇相关基因是MEIS1、PBX3或MEIS2A。

5.权利要求4的用途，其中所述白血病细胞选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞和急性骨髓性白血病(AML)细胞。

6.权利要求4的用途，其中所述白血病细胞在选自DNMT3A、IDH1、IDH2、RUNX1、TET2、ASXL1和NUP98-NSD1的一个或多个基因组序列中呈现突变。

7.权利要求4的用途，其中所述DOT1L抑制剂以100nM至10μM的IC50抑制DOT1L。

8.权利要求4的用途，其中所述DOT1L抑制剂以250nM至5μM的IC50抑制DOT1L。

9.权利要求4的用途，其中所述DOT1L抑制剂以500nM至1μM的IC50抑制DOT1L。

10.权利要求7-9任一项的用途，其中所述DOT1L抑制剂选自嘌呤、碳环取代的嘌呤和7-去氮杂嘌呤。

11.权利要求10的用途，其中所述DOT1L抑制剂是选自EPZ004777和EPZ005676的7-去氮杂嘌呤。

12.权利要求4的用途，其中所述DOT1L抑制剂选自SGC-0946、SYC-522、SYC-534和SYC-687。

13.DOT1L抑制剂在制备用于治疗白血病患者的药物中的用途

其中所述白血病患者表现出高于对照组织样品或细胞中的所述HOX簇基因表达或HOX簇相关基因的表达水平至少3倍的相应基因的表达水平；

其中所述白血病患者包含NPM1突变且不呈现MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复；

其中所述HOX簇基因选自HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9和HOXB13，且

其中所述HOX簇相关基因是MEIS1、PBX3或MEIS2A。

14.DOT1L抑制剂和至少一种其他药剂在制备用于治疗白血病患者的药物中的用途，

其中所述白血病患者呈现与HOX簇基因和/或HOX簇相关基因的升高表达相关的遗传突变；其中所述白血病患者包含NPM1突变且不MLL-易位、MLL-重排或MLL-部分串联重复；

其中所述HOX簇基因选自HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9和HOXB13，且

其中所述HOX簇相关基因是MEIS1、PBX3或MEIS2A。

15.权利要求14的用途，其中所述至少一种其他药剂是FLT3抑制剂，并且所述患者具有FLT3突变。

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