CN105911272B - 一种3‑氨基‑2‑恶唑烷酮免疫检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3‑氨基‑2‑恶唑烷酮免疫检测方法，呋喃唑酮在动物体内迅速代谢为3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(AOZ)，检测呋喃唑酮的残留实际上是检测AOZ的残留。本发明的检测方法是将待检物中的3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(AOZ)提取后改用3‑醛基苯甲酸甲酯进行衍生化，得到3‑醛基苯甲酸甲酯‑3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(PCPME‑AOZ)，然后再测定该衍生物的含量。以NP‑AOZ和PCPME‑AOZ为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)，结果证明用本发明的检测方法能够显著提高呋喃唑酮残留即3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(AOZ)免疫检测的灵敏度。

Description

一种3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法
技术领域
本发明涉及含有呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法及其应用。
背景技术
呋喃唑酮(痢特灵)是一种硝基呋喃类抗生素，为广谱抗菌药。3-氨基-2-恶唑烷酮(3-Amino-2-oxazolidinon,AOZ)是呋喃唑酮在动物体内的代谢物。呋喃唑酮可用于治疗细菌和原虫引起的痢疾、肠炎、胃溃疡等胃肠道疾患。对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制作用。对毛滴虫、贾第鞭毛虫也有一定的活性。其作用机制为干扰细菌氧化还原酶从而阻断细菌的正常代谢。
人口服呋喃唑酮吸收率低，通过血液循环主要停留在肠道内。但该药物对肝、肾刺激大、易充血及发生体内糖代谢及神经病变作用，并可在体内残留。过量使用呋喃唑酮可能会导致胃肠道反应；溶血性贫血、皮疹、药热等过敏反应；多发性神经炎；新生儿和G-6-PH缺乏可致溶血性贫血。实验证明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌和致突变的特性。
由于呋喃唑酮的毒副作用，各国政府都采取了相关管制政策。美国在1975年和1993年分别禁止了呋喃唑酮作为医药和兽药使用。日本在1977年禁止了呋喃唑酮的使用。2002年，中华人民共和国农业部将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检出。中华人民共和国食品药品监督总局也于2002年禁止了硝基呋喃类(包括呋喃唑酮)在动物性食品中的使用。
但是，硝基呋喃类药物药效显著、价格低廉，能在动物体内迅速代谢从而难以检测。我国的养殖业中，仍有一些不法分子在利益的驱使下滥用了呋喃唑酮药物，对消费者的健康带来了极大的隐患，同时也严重损害了农产品进出口贸易。因此市场上急需一种高效快速灵敏的呋喃唑酮药物残留的检测方法。
由于酶联免疫吸附检测(ELISA)是一种具有突出优势的检测方法。该方法具有快速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得它成为一种理想的市场监查检测方法。国家标准(GB/T 20752-2006，猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定)等的文献报道，把AOZ提取出来，在提取后用邻硝基苯甲醛作为衍生剂，与AOZ发生成肟反应从而生成NP-AOZ，但是NP-AOZ的酶联免疫吸附检测不够灵敏。
本发明创新地运用了一种呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法，使得相应的ELISA检测灵敏度大幅度提高。因此，本发明建立的酶联免疫吸附检测方法可以大大提高检测准确性，为各层监督单位提供快速、高效、准确的检测方法，具有不可估量的市场价值。
发明内容
为了使得用于检测如动物源性食品及其加工产品等样品中AOZ残留的icELISA具有更高的灵敏度，本发明创新了一种3-氨基-2-恶唑烷酮的处理方法，使得icELISA更加高效更适宜于实际样品的检测。
本发明所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法如下，将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量。
本发明中用3-醛基苯甲酸甲酯与待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮发生肟反应。
本发明所述的酶联免疫吸附检测为间接竞争酶联免疫吸附(icELISA)测定。
本发明的待测样品的获取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后的沉淀物为待测样品。
本发明的待测样品肟反应的操作方法步骤包括：1)将沉淀物与盐酸溶液混合研匀；2)再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干；3)再加入1,4-二氧六环在氮气保护条件下加热回流，减压旋转蒸发得到固体粉末；4)向步骤(3)的固体粉末中加入乙醇溶解；5)抽滤获取白色固体为含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮的物质。
本发明所述的酶联免疫吸附检测中用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA免疫动物体获得抗血清。所述的酶联免疫吸附检测为基于上述抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮间接竞争酶联免疫吸附反应。
本发明所述的酶联免疫吸附检测中以完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-OVA作为固相抗原。
本发明所述的酶联免疫吸附检测中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮为竞争性抑制物，以抗血清为一抗，以IgG-HRP为酶标二抗。
本发明所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法的应用，尤其在于将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测在3-氨基-2-恶唑烷酮快速检测试剂盒方面的应用。
以上检测方法及其应用具有快速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得它成为一种理想的市场监查检测方法。
附图说明
图1为3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的化学式；
图2为3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)的化学式；
图3为邻硝基苯甲醛-3-氨基-2-恶唑烷酮(NP-AOZ)的化学式；
图4为以PCPME-AOZ为标准抑制物的抗血清icELISA标准曲线；
图5为以NP-AOZ为标准抑制物的抗血清icELISA标准曲线
具体实施方式
本发明中出现的技术术语及相关试剂配方如下：
AOZ:3-氨基2-恶唑烷酮(3-Amino-2-oxazolidinon)；
BSA：牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)，分子量约为66.43kDa；
OVA：卵白蛋白(Albumin,from chicken egg white)，分子量约为44kDa；
Tween-20:吐温20；
Gelatin：明胶；
DMEM:Dulbecco’s modified Eagle’s medium,细胞培养液；
PEG:聚乙二醇2000；
HAT:hypoxanthine(次黄嘌呤),aminopterin(氨基喋呤),thymidine(胸腺嘧啶)；
PBS:磷酸盐缓冲液(NaCl 137mM,KH2PO4 1.5mM,Na2HPO4·12H2O 8.3mM,pH7.5)；
PBST:PBS溶液中加入0.1％的Tween-20；
PBSTG:PBST溶液中加入0.1％的明胶；
包被缓冲液：1.5g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于1000mL水，pH 9.6；
底物缓冲液：5.1g一水合柠檬酸、18.43g Na2HPO4·12H2O、1.0mL Tween-20溶于1000mL水，pH 5.0；
文中出现的所有试剂及仪器设备均可配制或市购获得，本发明具体实施例中所使用的试剂均购买于Sigma公司。
试验例1：
待检物中3-氨基2-恶唑烷酮的获取及其衍生物3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)的获取。
可参考国家标准(GB/T 20752-2006)的文献报告，用文献中的方法把3-氨基2-恶唑烷酮提取出来，方法可以是(1)收集市场中或实验室制备的待检物，置于棕色离心管中，加入甲醇-水混合溶液(甲醇与水的混合体积比为2：1)，研均，再用甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并后离心，吸取上清液弃掉。
(2)向上述离心管中加入盐酸溶液，研均，用盐酸溶液洗涤均质刀头，二者合并。
(3)把步骤(2)中的混合液中加入3-醛基苯甲酸甲酯,混匀后旋干。加入干燥的1,4-二氧六环(1,4-dioxane)到反应瓶中，在氮气保护条件下，加热回流。
(4)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到固体粉末。
(5)向步骤(4)的固体粉末中加入乙醇，在超声波水浴槽中促溶解。
(6)直接通过抽滤除掉3-醛基苯甲酸甲酯得到白色固体。
(7)干燥处理后得到白色粉末3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)。
经过上述处理方案，若待检物提取的待测样品中含有3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)，其将与3-醛基苯甲酸甲酯发生成肟反应，衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)。
具体的：
(1)待测样品的获取。收集市场中或实验室制备的待检物，称取2.0g(±0.01g)，分别置于50mL棕色离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液(甲醇与水的混合体积比为2：1)，均质2min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并5000r/min离心10min，吸取上清液弃掉。向3个离心管中分别加入适量AOZ，使最终测定浓度为10.0ng/mL。
(2)向上述每个离心管中加入10mL 0.2mol/L盐酸溶液，研均2min，用10mL0.2mol/L的盐酸溶液洗涤均质刀头，二者合并。
(3)向步骤(2)的混合液中加入0.4mL3-醛基苯甲酸甲酯,混匀后悬干。加入干燥的1,4-二氧六环(1,4-dioxane)到25mL单口反应瓶中，在氮气保护条件下，加热回流1.5至2.5小时。
(4)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到固体粉末。
(5)向步骤(4)的固体粉末中加入乙醇，混匀溶解。
(6)直接通过抽滤除掉3-醛基苯甲酸甲酯。
(7)干燥上述混合液，处理后得到白色粉末。
以上化学反应使得待测样品中可能含有的3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)与3-醛基苯甲酸甲酯发生成肟反应，衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)。
试验例2：
合成AOZ的半抗原和完全抗原，并用完全抗原免疫实验小鼠获得抗血清：
参考Kevin M等的文献报道(Kevin M.Cooper,Anthony Caddell,ChristopherT.Elliott,D.Glenn Kennedy.Production and characterisation of polyclonalantibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone,a metabolite of thenitrofuran furazolidone.Analytica Chimica Acta,2004,520,79-86.)，合成AOZ的半抗原和完全抗原。用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA(按蛋白的量计量，1.0mg/mL)与弗氏佐剂按1:1(v/v)混合乳化，乳化完全后注射到小鼠体内。免疫Balb/c雌性小鼠,每只小鼠每次分别在背部和腹腔各注射。四次免疫之后，取小鼠血液，离心之后得到抗血清。
具体的，制备了AOZ半抗原的方法步骤如下：
(1)依次取AOZ盐酸盐固体粉末38.0mg(1.0equiv.),3-醛基苯甲酸41.6mg(1.0equiv.)，干燥的1,4-二氧六环(1,4-dioxane)8mL共同加入到25mL单口反应瓶中，在氮气保护条件下，加热回流2小时。
(2)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到白色固体粉末。
(3)向步骤(2)的固体粉末中加入8mL乙醇，在超声波水浴槽中溶解1min。
(4)由于AOZ-3-醛基苯甲酸在乙醇中的溶解性很差，而3-醛基苯甲酸在乙醇中溶解性很好，直接通过抽滤除掉3-醛基苯甲酸得到白色固体。
(5)干燥步骤(4)中的白色固体得到半抗原AOZ-3-醛基苯甲酸。
具体的，制备了AOZ完全抗原的方法步骤如下：
(1)取半抗原AOZ-3-醛基苯甲酸2.13mg(30.0equiv.)溶于0.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),搅拌溶解。加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1.57mg(45.0equiv.)搅拌30min，再加入N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)2.813mg(45.0equiv.)4℃搅拌过夜。
(2)称取牛血清蛋白(BSA)20mg(1.0equiv.)装入10mL玻璃反应瓶中，再加入2mLPBS搅拌溶解。
(3)把步骤(1)中的混合物缓慢逐滴加入到步骤(2)的溶液中，4℃搅拌过夜。
(4)把步骤(3)中混合物转移到透析袋中，用PBS透析2天，每天换液3次。最后按蛋白质的量用PBS配成1.0mg/mL，分装到1.0mL/管，-40℃长期冻存。此过程就完成了半抗原与蛋白质的偶联(即得到完全抗原)。
半抗原与卵清白蛋白(OVA)的偶联方法同上。
具体的，用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA免疫Balb/c雌性小鼠获得抗血清的方法步骤如下：取上述制备好的完全抗原一管(1.0mL)与弗氏佐剂按1:1(v/v)混合乳化，乳化完全后注射到小鼠体内。
免疫Balb/c雌性小鼠的免疫方案见表1。
表1完全抗原免疫小鼠的免疫方案
将第四次免疫(四免)之后的小鼠进行眼眶取血，离心取血清，从而制备得到抗血清。
试验例3：
以抗血清和PCPME-AOZ、NP-AOZ分别建立了间接竞争酶联免疫吸附反应(icELISA)进行对照及建立标准曲线的方法如下：
(1)取完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-OVA(1.0mg/mL)用包被缓冲液稀释1:320000倍，加到酶标板中200uL/孔。放入37℃培养箱中温育3h。
(2)用PBST洗板4次，甩干。
(3)将标准品PCPME-AOZ用PBSTG稀释成系列梯度(2；1；0.5；0.25；0.125；0.0625；0.03125；0ng/mL)。或将标准品NP-AOZ用PBSTG稀释成系列梯度(300；150；75；37.5；18.75；9.375；0ng/mL)。用PBSTG把抗血清稀释120000倍。在酶标板孔中依次加入100uL浓度为标准品和100uL抗血清稀释液。37℃温育30min。
(4)用PBST洗板4次，甩干。
(5)每孔加入200uL用PBSTG稀释的IgG-HRP。
(6)用PBST洗板4次，甩干。
(7)每孔加入200uL底物缓冲液，显色到一定程度再加入50uL硫酸(2M)终止反应。
(8)在492nm波长测吸光值。
测得相应数据后，用分析软件OriginPro 8.0建立标准曲线，见图4(PCPME-AOZ为标准品)，图5(NP-AOZ为标准品)。
利用本发明的检测方法，可以成功地使待检物中可能残留的AOZ经过一系列的衍生化反应，最终得到了PCPME-AOZ。并利用制备得到的抗血清，以PCPME-AOZ作为标准抑制物建立了icELISA，其标准曲线见图4。同时，利用以已报道的衍生方法得到的NP-AOZ作为标准抑制物建立了icELISA，其标准曲线见图5。以NP-AOZ为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)，得到的IC50和检测范围分别为46.63ng/mL，11.02～187.43ng/mL。而以PCPME-AOZ为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)，得到的IC50和检测范围分别为0.37ng/mL，0.08～1.31ng/mL。结果证明以PCPME-AOZ为标准抑制物时，其icELISA的灵敏度更高。实验证明以本发明的AOZ检测方法能大幅度提升icELISA灵敏度。
将待检物中可能残留的AOZ经过一系列的衍生化反应，最终得到了PCPME-AOZ，以PCPME-AOZ作为标准抑制物建立了icELISA，得到的吸光值与标准曲线比对，从而知悉AOZ的含量，其能提高icELISA灵敏度，可以快速推广市场应用，在市场监测过程中具有更深远的意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (6)

1.一种3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮与3-醛基苯甲酸甲酯通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行间接竞争酶联免疫吸附检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量，所述的肟反应的操作方法步骤包括：
1 )将沉淀物与盐酸溶液混合研匀；
2 )再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干；
3 )再加入1 ,4-二氧六环在氮气保护条件下加热回流，减压旋转蒸发得到固体粉末；
4 )向步骤3)的固体粉末中加入乙醇溶解；
5 )抽滤获取白色固体为含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮的物质。
2.如权利要求1所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：待测样品的获取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后的沉淀物为待测样品。
3.如权利要求1或2所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：酶联免疫吸附检测中用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA免疫动物体获得抗血清。
4.如权利要求3所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：酶联免疫吸附检测为基于抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮间接竞争酶联免疫吸附反应。
5.如权利要求4所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：酶联免疫吸附检测中以完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-OVA作为固相抗原。
6.如权利要求5所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：酶联免疫吸附检测中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮为竞争性抑制物，以抗血清为一抗，以IgG-HRP为酶标二抗。
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