CN105907751A - 基于fta卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于FTA卡提取DNA的方法，具体涉及一种基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法。提取步骤如下：收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，获得隐孢子虫卵囊，定量污染粪便；将奶牛粪便涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡，打孔获得FTA圆片；将获得的FTA圆片分别放入离心管内，去污并清洗，加入FTA卡清洗液，室温孵育后加入1×TE溶液，室温孵育，将清洗后的FTA圆片完全干燥，完成粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取。本发明只需携带FTA卡到养殖场采集粪便样本，经FTA洗脱液和其他有机溶液清洗后，可将FTA卡片用作DNA模板进行PCR扩增，成本低廉，方便快捷。

Description

基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于FTA卡提取DNA的方法，具体涉及一种基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法。
背景技术
隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的新发人兽共患传染病，被世界卫生组织列为全球六大腹泻病之一。隐孢子虫可以感染包括人在内的280多种动物，其卵囊广泛存在于动物和环境中，常通过水或食物传播造成大规模暴发流行。隐孢子虫病可在奶牛群中广泛传播流行，引起奶牛的体重下降，产奶量减少，给奶牛业的发展造成严重的经济损失，同时能传播多种人畜共患病，存在较高的公共卫生风险，对人和动物健康造成严重威胁。因此快速、简便、准确的发现隐孢子虫是该病防治的关键。
目前，隐孢子虫的检测方法有粪便学、免疫学、分子生物学等方法。
隐孢子虫的粪便学检查方法，主要有染色法和漂浮法，由于隐孢子虫体积微小，直径在4.5μm-5.5μm，在显微镜下很难辨别，检出率低且易导致误判。目前，国内外已建立了对隐孢子虫病的多种免疫学检测方法，现有的检测方法主要有：酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫荧光法(IFA)、免疫印迹技术(Western blotting)等。随着分子生物学的发展，国内外一些学者相继利用聚合酶链式反应(PCR)、基因芯片等分子生物学技术，对隐孢子虫核酸分子进行了大量的研究，并取得重要进展，且在隐孢子虫卵囊检测、隐孢子虫病的诊断、流行病学调查及虫种鉴定和虫株分型中得到广泛应用。
隐孢子虫卵囊DNA的提取量与纯度，直接影响着下游PCR的扩增效果，其DNA的提取主要受卵囊裂解程度和杂质洗脱能力两方面的影响。而奶牛粪便中存在大量肠道脱落上皮细胞、食物残渣、腐殖酸、蛋白质等PCR抑制因子。因此权衡一种最佳的奶牛粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取方法，对粪便隐孢子虫检测有着十分重要的作用。目前国内外主要通过商业化粪便DNA提取试剂盒，来获得奶牛粪便中隐孢子虫卵囊DNA，然而，这种方法提取DNA步骤繁琐，耗时较长，在DNA提取过程中易形成交叉污染，从而影响到检测准确性。此外，使用大量化学试剂，对环境造成污染。
FTA(Flinders Technology Associates)是一种经化学特殊处理的棉纤维卡片，目前被广泛应用于目前国内外分子生物学研究的DNA模板制备中。FTA滤膜是将变性剂和螯合剂渗透在纤维基质上，当捕捉到微生物或者细胞后能自动将其裂解，样品DNA吸附在FTA卡上，通过缓冲液洗涤，去除样品中的其他成分，而吸附了DNA的FTA卡可直接作为模板用于PCR反应。而且样品中的传染性病原体在FTA卡上5秒钟内就可完全失活，具有较高的生物安全性。
近年来，国内外关于FTA/PCR法检测隐孢子虫卵囊的应用研究仅局限于饮料、地表水等水源性隐孢子虫卵囊，而粪便样品中含有的大量的腐殖酸、食物残渣、脱落的肠道上皮细胞、蛋白质等杂质严重抑制了以FTA卡为DNA模板的PCR扩增。依据Whatman公司推荐的常规洗脱方法无法清洗掉上述PCR抑制因子，无法基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA。
发明内容
本发明要解决的技术问题是按照常规洗脱方法，无法基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA，提供一种清洗载有隐孢子虫DNA的FTA卡片，具体为基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，提取步骤如下：
(1)收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，粪便经纯化沉淀后，获得隐孢子虫卵囊，经血细胞计数板计数，记录卵囊浓度；
(2)定量污染粪便，将步骤(1)获得的卵囊倍比稀释成1×10-1/mL-1×105/mL个卵囊，取倍比稀释后的卵囊悬液1mL，均匀混入1g经检测后为隐孢子虫阴性的奶牛粪便中；
(3)将步骤(2)中的奶牛粪便涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡，用单孔打孔器，在载有隐孢子虫阳性粪便样品的FTA卡上打孔，取得直径2mm的FTA圆片；
(4)将步骤(3)中获得的FTA圆片分别放入2mL离心管内，加去污剂煮沸5min，除去污剂溶液后加无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后除去无水乙醇；
(5)加入300μL FTA卡清洗液，室温孵育5min，加入500μL1×TE溶液，室温孵育5min；
(6)重复步骤(5)一次；
(7)将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56℃温箱中10min，至FTA圆片完全干燥，完成粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取。
所述步骤(4)中去污剂为质量分数10％的SDS溶液，加入无水乙醇的体积为500μL。
所述隐孢子虫为常见牛源隐孢子虫，如C.parvum、C.andersoni、C.bovis、C.rynane。
本发明的有益效果为：
①经本发明中的纯化方法清洗后，提高检测敏感度，与巢氏PCR结合后最低检测量可达到1×101个卵囊/克粪便。
②操作简便，只需携带FTA卡到养殖场采集粪便样本后，经FTA洗脱液和其他有机溶液清洗后，即可将FTA卡片用作DNA模板进行PCR扩增。
③具有较高的生物安全性，FTA卡特有的螯合剂和裂解剂可以短时间迅速使微生物和寄生虫卵囊失去活性，降低了有害病原的传播机会，保护了实验操作人员的安全，具有较高的公共卫生意义。
④FTA卡的常规洗脱方法，无法清洗粪便中的PCR抑制因子，本发明通过添加不同的有机溶剂，改进FTA卡使用说明书中的清洗办法，清洗掉了粪便中的PCR抑制因子，使清洗后载有隐孢子虫DNA的FTA卡片可直接用作DNA模板，进行后续的PCR扩增等分子生物学研究，本发明代替了传统商业化粪便DNA提取试剂盒提取DNA时繁琐的步骤和高昂的价格，具有成本低廉，方便快捷的优点。
附图说明
图1为隐孢子虫巢式PCR反应条件。
图2为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫:阳性粪便样品的敏感性试验电泳图；其中，M表示DNA Marker(DL2000)；泳道1-7：1×105-1×10-1个卵囊/g隐孢子虫阳性粪便样品；P：阳性对照；N：阴性对照。
图3为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫:阳性粪便样品的特异性试验电泳图；其中，M表示DNA Marker(DL2000)；泳道1：微小隐孢子虫阳性粪便样品；泳道2：安氏隐孢子虫阳性粪便样品；泳道3：贾第虫阳性粪便样品；泳道4：微孢子虫阳性粪便样品；泳道5：球虫阳性粪便样品；泳道6：含双蒸水粪便样品；P：阳性对照；N：阴性对照。
图4为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫:阳性粪便样品的重复性试验电泳图；其中，M表示DNA Marker(DL2000)；泳道1-5：巢式PCR第一套产物电泳图；泳道6-N：巢式PCR第二套产物电泳图；泳道1-3、6-8：隐孢子虫阳性粪便样品；4、P：阳性对照；9、N：阴性对照。
图5为奶牛粪便样品检测图；其中泳道1-20为待检测样品，M表示DL2000Marker，P：阳性对照；N：阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规试验。如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例所用试剂均为市售，所用材料本申请人实验室均有保存。
主要试剂：FTA卡(FTATM Classic Card WhatmanTM，lot No.3983740，UK)；FTA洗脱液(FTA purification Reagent，WhatmanTM，lot No.9611474，UK)；BSA(Bovine SerumAlbumin，SIGMATM，lot No.SLBN1377V，USA)；无水乙醇(Ethanol absolute，天津市永大化学试剂有限公司)；SDS(十二烷基磺酸钠，C12H25O4SNa，GENVIEWTM，lot No.4803010120)；打孔器(打孔直径2mm)；DL2000DNA Marker、6×Loading buffer，TaKaRa生物合成公司；DNAGreen，TIANDZ；KOD-plus、dNTPS，TOYOBO。
主要仪器：PCR仪，Gene Company Limited，型号9700；稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂，型号DYY-5；紫外成像仪，SYNGENE，型号InGenius LHR；数码照相机，佳能公司，型号IXUS115HS；快速混匀器，GENIE，型号VORTEX-2；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；双重纯水蒸馏仪，上海亚荣生化仪器厂，型号SZ-93；移液器，BRAND。
基于FTA卡提取DNA进行PCR检测奶牛粪便中隐孢子虫卵囊的方法，包括敏感性试验、特异性试验、重复性试验，具体步骤如下：
(1)敏感性试验：
①隐孢子虫卵囊的纯化，收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，粪便经乙醚除脂、饱和蔗糖漂浮、不连续浓度蔗糖梯度离心沉淀、氯化铯离心沉淀后获得较为纯净的隐孢子虫卵囊，经麦克马斯特平板卵囊计数法记得卵囊浓度为1×105/mL个卵囊。
②定量污染粪便，将步骤①获得的卵囊倍比稀释成1×105/mL-1×10-1/mL个卵囊，取倍比稀释后的卵囊液1mL均匀混入1g经检测后为隐孢子虫阴性的奶牛粪便中。
③将经隐孢子虫卵囊污染后的奶牛粪便样品涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡。用单孔打孔器在载有隐孢子虫阳性粪便样品的FTA卡上打孔取得直径2mm的FTA圆片。
④将步骤③中获得的FTA圆片分别放入2mL离心管内，用10％SDS溶液煮沸5min，弃去SDS溶液，加500μL无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后弃去无水乙醇。
⑤加入300μL Whatman公司的FTA卡清洗液，室温孵育5min。
⑥加入500μL1×TE溶液，室温孵育5min。
⑦重复步骤⑤-⑥一次。
⑧将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56℃温箱中10min，至FTA圆片完全干燥。
⑨将步骤⑧得到的FTA卡片作为DNA模板，直接至于0.2mmEP管中，进行巢式PCR扩增。PCR引物序列参照严若峰基于隐孢子虫18SrRNA设计的引物序列如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；对于所有样品，两轮PCR反应均使用50μL体系，PCR反应体系见表1。在第一轮反应体系中，加入牛血清白蛋白(BSA)用以中和PCR抑制因子，在第二轮反应中无需添加。PCR反应条件，见图1。
⑩分别取5μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳液中，以110V电压进行电泳，然后在紫外凝胶成像分析系统中成像并观察结果。
PCR扩增产物送至测序公司测序，并分析测序结果。
表1：隐孢子虫巢式PCR反应体系
特异性试验：
将上述(1)纯化的微小隐孢子虫卵囊和本发明人实验室存放的安氏隐孢子虫卵囊、贾第虫卵囊、微孢子虫卵囊、球虫卵囊和灭菌双蒸水分别加入粪便样品中混合均匀，然后涂抹在FTA卡上，接下来的处理步骤与上述(1)中③-⑩步骤相同，PCR引物序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示，PCR反应体系见表1，PCR反应条件见图1。
重复性试验：
以上述(1)中的步骤处理好的FTA卡片为DNA模板，基于隐孢子虫18S基因位点进行三次巢式PCR扩增，每次扩增每个样本平行重复三次，以检测FTA/PCR法的重复性或稳定性。试验步骤与上述(1)中③-⑩步骤相同，PCR引物序列见表1，PCR反应体系见表1，PCR反应条件见图1。
敏感性试验、特异性试验、重复性试验结果分析：
FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐孢子虫卵囊敏感性试验，是基于隐孢子虫18S rRNA基因位点，以FTA卡为DNA模板进行的巢式PCR试验。试验将隐孢子虫卵囊以10倍倍比稀释成105-10-17个梯度范围，通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析的结果显示泳道1-5均出现250bp左右的目的条带，证明FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐孢子虫卵囊最低检测量可达到1×101个卵囊/g粪便，结果符合试验预期，满足检测要求。结果见附件图2。
通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析的结果显示，FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐孢子虫卵囊特异性试验中，微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫泳道均出现250bp左右的目的条带，而其他虫株均未出现条带，证明FTA/PCR法特异性较好，结果见附件图3。试验结果符合试验预期，满足检测要求。
通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析的结果显示，FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐孢子虫卵囊重复性试验中，泳道均出现250bp左右的目的条带，证明FTA/PCR法重复性较好，结果见附件图4。实验结果符合试验预期，满足检测要求。
用本试验建立的方法对四川拜耳公司送检至本发明人实验室的20份奶牛粪便样品进行检测，检测的隐孢子虫阳性率为10％(2/20)，以商业化粪便核酸提取试剂盒提取的DNA为模板的PCR扩增隐孢子虫阳性率为10％(2/20)。
二者检测结果相同(如图5所示)，但简化了商业化粪便核酸提取试剂盒提取DNA的繁琐步骤，并且减少了在提取DNA过程中产生的交叉污染，具有省时、便捷的优点。

Claims (3)

1.基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于：所述提取步骤如下：
（1）收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，粪便经纯化沉淀后，获得隐孢子虫卵囊，经血细胞计数板计数，记录卵囊浓度；
（2）定量污染粪便，将步骤（1）获得的卵囊倍比稀释成1×10-1/mL-1×105/mL个卵囊，取倍比稀释后的卵囊悬液1mL，均匀混入1g经检测后为隐孢子虫阴性的奶牛粪便中；
（3）将步骤（2）中的奶牛粪便涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡，用单孔打孔器，在载有隐孢子虫阳性粪便样品的FTA卡上打孔，取得直径2mm的FTA圆片；
（4）将步骤（3）中获得的FTA圆片分别放入2mL离心管内，加去污剂煮沸5min，除去污剂溶液后加无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后除去无水乙醇；
（5）加入300μL FTA卡清洗液，室温孵育5min，加入500μL1×TE溶液，室温孵育5min；
（6）重复步骤（5）一次；
（7）将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56oC温箱中10min，至FTA圆片完全干燥，完成粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取。
2. 如权利要求1所述的基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于：所述步骤（4）中去污剂为质量分数10%的SDS溶液，加入无水乙醇的体积为500μL。
3. 如权利要求1所述的基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于：所述隐孢子虫为常见牛源隐孢子虫，如C. parvum、C. andersoni、C. bovis、C. rynane。
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