CN105900841B - 通过组织培养获得忍冬再生植株的方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过组织培养获得忍冬再生植株的方法及其培养基。本发提供了一种用于获得忍冬再生植株的培养基，由下述质量份的营养成分组成：大量元素以NH4NO3计1650份、微量元素以KI计0.83份、铁盐以FeSO4·7H2O计37.3份、有机成分以烟酸计0.5份、6‑苄基腺嘌呤2.0份‑3.0份、激动素0.5份‑1.5份、吲哚丁酸0.1份‑0.5份、蔗糖30000份。本发明所提供的用于获得忍冬的再生植株的分化培养基针对性强，适用性好，能应用于生产上的大规模育苗，也为忍冬的分子育种奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种通过组织培养获得忍冬再生植株的方法及其培养基。
背景技术
忍冬(Lonicera japonica Thunb.)是忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物，主供药用，亦作观赏植物。忍冬作为金银花药材的植物来源，具有悠久的药用历史。金银花是清热解毒的良药。研究证明，金银花含有丰富的绿原酸、木犀草苷等药理活性成分。金银花性甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花对金黄葡萄球菌、溶血性链球菌、以及上呼吸道感染致病病毒等均有较强的抑制力。它既能宣散风热，还可清解血毒，故常用于身热、发疹、咽喉肿痛、热毒疮痈等各种热性病症。此外，它还可增强免疫力、抗肿瘤、抑制肠道吸收胆固醇，其临床用途非常广泛，并可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、急性泌尿系统感染、高血压等多种病症。中国目前有超过500个中药处方中均包含金银花成分。2005版《中国药典》将忍冬规定为药材金银花的唯一植物来源，忍冬就面临着重大的市场需求量以及供给不足的现象。随着金银花开发利用的不断扩展，产业链的不断完善和市场需求不断扩张，对金银花数量和质量的要求也不断增强。
目前忍冬的繁殖多以扦插、嫁接、分株等繁殖方式为主，但是繁殖系数小、成活率低；且易传染病菌、品种退化快，根本不能满足市场需求。此外，忍冬作为重要的中药材，由于缺乏再生体系，目前相关的分子生物学研究基础还很薄弱。通过组织培养的无性繁殖不但能够保持母株的优良性状，还可以在短时间内实现种苗产业化，并为转基因技术提供了一定的基础。因此，需要研究并推广一套忍冬的再生技术。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于获得忍冬再生植株的培养基。
本发明所提供的用于获得忍冬再生植株的培养基，是作为分化培养基，由下述质量份的营养成分组成：
大量元素以NH4NO3计1650份、微量元素以KI计0.83份、铁盐以FeSO4·7H2O计37.3份、有机成分以烟酸计0.5份、6-苄基腺嘌呤2.0份-3.0份、激动素0.5份-1.5份、吲哚丁酸0.1份-0.5份、蔗糖30000份；
所述大量元素由下述质量份的物质组成：
NH4NO3 1650份、KNO3 1900份、KH2PO4 170份、CaCl2·2H2O 440份和MgSO4·7H2O370份；
所述微量元素由下述质量份的物质组成：
KI 0.83份、Na2MoO4·2H2O 0.25份、H3BO3 6.2份、CuSO4·5H2O 0.025份、MnSO4·H2O 16.9份、CoCl2·6H2O 0.025份和ZnSO4·7H2O 8.6份；
所述铁盐由下述质量份的物质组成：
Na2EDTA·2H2O 27.8份和FeSO4·7H2O 37.3份；
所述有机成分由下述质量份的物质组成：
烟酸0.5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆醇0.5份和甘氨酸2.0份。
所述培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖和水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0mg/L-3.0mg/L、激动素0.5mg/L-1.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L-0.5mg/L、蔗糖30g/L。
本发明的另一个目的是提供一种用于获得忍冬再生植株的固体培养基。
本发明所提供的用于获得忍冬再生植株的固体培养基，是由凝固剂和所述用于获得忍冬再生植株的培养基配成的固体培养基。
所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为6g/L-8g/L；
所述凝固剂为琼脂。
所述培养基的pH值为5.8-6.2。
本发明的又一个目的是提供一种获得忍冬再生植株的方法。
本发明所提供的获得忍冬再生植株的方法包括如下步骤：
将忍冬愈伤组织接种到所述用于获得忍冬再生植株的固体培养基上进行分化培养，得到忍冬再生芽；将所述忍冬再生芽接种到生根培养基上进行生根培养，即得到忍冬再生植株。
所述忍冬愈伤组织是通过包括如下步骤的方法得到的：
将忍冬外植体接种到愈伤诱导培养基上进行诱导培养，得到忍冬愈伤组织；
所述诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、琼脂6g/L-8g/L、蔗糖30g/L；
所述诱导培养基的pH值为5.8-6.2。
所述生根培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：
NH4NO3 0.825g/L、KNO3 0.95g/L、KH2PO4 0.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L-0.5mg/L、琼脂6g/L-8g/L、蔗糖10g/L；
所述生根培养基的pH值为5.8-6.2。
所述生根培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：
NH4NO3 0.825g/L、KNO3 0.95g/L、KH2PO4 0.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L-0.5mg/L、琼脂6g/L-8g/L、蔗糖10g/L；
所述生根培养基的pH值为5.8-6.2。
所述忍冬外植体为忍冬新生嫩叶或忍冬新生茎段。
本发明所提供的用于获得忍冬再生植株的分化培养基针对性强，适用性好。本发明所提供的通过组织培养获得忍冬再生植株的方法，具有不受地区，气候与季节限制，便于大规模生产具有优良性状的单株。且目前通过转基因鉴定忍冬中基因功能的途径往往要依赖于拟南芥或者烟草等模式植物来进行，很大程度上局限了其分子机理研究。忍冬组培再生技术为解决了这一问题提供了希望。
附图说明
图1为新鲜材料作为外植体经愈伤诱导培养得到的愈伤；其中A为忍冬的愈伤形成；B为忍冬的愈伤扩繁。
图2为忍冬愈伤经分化培养得到的丛芽及丛芽经生根培养后的生根状况；其中A为愈伤经分化培养得到的丛芽；B为丛芽经生根培养后的生根状况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、通过组织培养获得忍冬再生植株
方法Ⅰ
一、外植体消毒
取忍冬(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：向增旭，高山林(2007)忍冬组织培养体系的建立和优化.中国中药杂志,32(24)，2662-2663.)新生嫩叶为外植体，清水冲洗干净后，浸泡于流水悬冲1h，在无菌条件下，用无菌水冲洗1次，用70％的酒精消毒15s后再用2％的次氯酸钠溶液消毒4min，再转于1％的次氯酸钠溶液消毒4min，然后用无菌水冲洗3-5次，剪切成约0.5cm3片状于无菌滤纸上吸干水分。
二、愈伤诱导培养
将步骤一灭菌后的叶片接种在愈伤诱导培养基上，在温度为20℃，光强2000Lux，光周期为12小时光照/12小时黑暗，湿度为50％的条件下培养20天，诱导出愈伤(图1中A)，中间可继代2-5次至形成膨大的愈伤(图1中B)。愈伤组织以紧致有小芽点较好。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个外植体。
愈伤诱导率(％)＝诱导形成愈伤数/接种外植体数×100％。
结果：愈伤诱导率(％)为100％。
所述诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L；
所述诱导培养基的pH值为6.0。
三、分化培养
将步骤二得到的愈伤转接种于分化培养基中，在温度为20℃，光强2000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为50％的条件下培养20天，继代2-3次至分化形成芽长2～3cm的丛芽(图2中A)。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个愈伤。
分化率(％)＝分化形成丛芽数/接种愈伤数×100％。
结果：分化率(％)为100％。
所述分化培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述分化培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0mg/L、激动素0.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L；
所述分化培养基的pH值为6.0。
四、生根培养
将上述步骤三分化培养后的丛芽接种到生根培养基中，在温度为20℃，光强2000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为50％的条件下培养20天，至长出10～20条根(图2中B)。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个丛芽。
生根率(％)＝生根的丛芽数/接种的丛芽数。
结果：生根率为100％。
所述生根培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：
NH4NO3 0.825g/L、KNO3 0.95g/L、KH2PO4 0.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、琼脂6g/L和蔗糖10g/L；
所述生根培养基的pH值为6.0。
方法Ⅱ
一、外植体消毒
取忍冬新生茎段为外植体，清水冲洗干净后，在无菌条件下，用无菌水冲洗1次，用70％的酒精消毒30s后再用2％的次氯酸钠溶液消毒8min，然后用无菌水冲洗3-5次，剪切成1～2cm，并且去掉带腋芽的茎段于无菌滤纸上吸干水分。
二、愈伤诱导培养
将步骤一灭菌后的新生芽茎段接种在诱导培养基上，在温度为20℃，光强3000Lux，光周期为12小时光照/12小时黑暗，湿度为60％的条件下培养20天，中间可继代2-3次至诱导出愈伤。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个外植体。
愈伤诱导率(％)＝诱导形成愈伤数/接种外植体数×100％。
结果：愈伤诱导率(％)为100％。
所述诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L；
所述诱导培养基的pH值为5.8。
三、分化培养
将步骤二得到的愈伤转接种于分化培养基中，在温度为20℃，光强3000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为60％的条件下培养33天，继代2-3次至分化形成丛芽。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个愈伤。
分化率(％)＝分化形成丛芽数/接种愈伤数×100％。
结果：分化率(％)为100％。
所述分化培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
以上成分在所述增殖培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、6-苄基腺嘌呤2.5mg/L、激动素1mg/L、吲哚丁酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L；
所述分化培养基的pH值为5.8。
四、生根培养
将上述步骤三分化培养后的丛芽接种到生根培养基中，在温度为20℃，光强3000Lux，光周期为16小时光照/16小时黑暗，湿度为60％的条件下培养20天，至长出10～20条根。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个丛芽。
生根率(％)＝生根的丛芽数/接种的丛芽数。
结果：生根率为100％。
所述生根培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水。
以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：
NH4NO3 0.825g/L、KNO3 0.95g/L、KH2PO4 0.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.2mg/L、琼脂7g/L和蔗糖10g/L；
所述生根培养基的pH值为5.8。
方法Ⅲ
一、外植体消毒
取忍冬新生的顶芽嫩叶为外植体，浸泡流水悬冲2h后，在无菌条件下，用无菌水冲洗2次用2％的次氯酸钠溶液消毒8min，然后用无菌水冲洗5次，剪切成0.5cm3叶片于无菌滤纸上吸干水分。
二、愈伤诱导培养
将步骤一灭菌后的叶片接种在愈伤诱导培养基上，在温度为25℃，光强4000Lux，光周期为12小时光照/12小时黑暗，湿度为70％的条件下培养15天，中间可继代2-3次至诱导出愈伤。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个外植体。
愈伤诱导率(％)＝诱导形成愈伤数/接种外植体数×100％。
结果：愈伤诱导率(％)为100％。
所述诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂8g/L；
所述诱导培养基的pH值为6.2。
三、分化培养
将步骤二得到的愈伤接种于分化培养基中，在温度为25℃，光强4000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为70％的条件下培养15天，继代2-3次至分化形成丛芽。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个愈伤。
分化率(％)＝分化形成丛芽数/接种愈伤数×100％。
结果：分化率(％)为100％。
所述分化培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述分化培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、6-苄基腺嘌呤3.0mg/L、激动素1.5mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L；
所述分化培养基的pH值为6.2。
四、生根培养
将上述步骤三分化培养后的丛芽接种到生根培养基中，在温度为25℃，光强4000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为70％的条件下培养20-30天，至长出10～20条根。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个丛芽。
生根率(％)＝生根的丛芽数/接种的丛芽数。
结果：生根率为100％。
所述生根培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：
NH4NO3 0.825g/L、KNO3 0.95g/L、KH2PO4 0.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、琼脂8g/L和蔗糖10g/L；
所述生根培养基的pH值为6.2。
Claims (2)
1.一种获得忍冬再生植株的方法，包括如下步骤：
将忍冬外植体接种到愈伤诱导培养基上进行诱导培养，得到忍冬愈伤组织；将忍冬愈伤组织接种到分化培养基上进行分化培养，得到忍冬再生芽；将所述忍冬再生芽接种到生根培养基上进行生根培养，即得到忍冬再生植株；
所述忍冬外植体为忍冬新生嫩叶或忍冬新生茎段；
所述愈伤诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述愈伤诱导培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、琼脂6g/L-8g/L、蔗糖30g/L；
所述愈伤诱导培养基的pH值为5.8-6.2；
所述分化培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述分化培养基中浓度分别为：
NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0mg/L-3.0mg/L、激动素0.5mg/L-1.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L-0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L-8g/L；
所述分化培养基的pH值为5.8-6.2；
所述生根培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：
NH4NO3 0.825g/L、KNO3 0.95g/L、KH2PO4 0.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L-0.5mg/L、琼脂6g/L-8g/L、蔗糖10g/L；
所述生根培养基的pH值为5.8-6.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述诱导培养是在温度为20℃-25℃、光强2000Lux-4000Lux、光周期为12小时光照/12小时黑暗、湿度为50％-70％的条件下培养15天-20天；
所述分化培养是在温度为20℃-25℃、光强2000Lux-4000Lux、光周期为16小时光照/8小时黑暗、湿度为50％-70％的条件下培养15天-20天；
所述生根培养是在温度为20℃-25℃、光强2000Lux-4000Lux、光周期为16小时光照/8小时黑暗、湿度为50％-70％的条件下培养20天-30天。
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| 良种金银花的组培快繁技术研究;李景刚等;《山东林业科技》;20041231(第6期);35-37 * |
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