CN105884609A

CN105884609A - 一种用于四溴联苯醚快速检测的酶联免疫吸附分析方法

Info

Publication number: CN105884609A
Application number: CN201410630814.3A
Authority: CN
Inventors: 孙红文; 刘婧婷; 张彦峰
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2016-08-24

Abstract

本发明公开了一种2，2’，4，4’-四溴联苯醚(BDE-47)的酶联免疫检测方法，改造BDE-47分子结构，设计合成半抗原C₁₅H₉Br₃O₃和C₁₁H₁₃Br₂O₃N，分别与牛血清白蛋白、卵清白蛋白偶联得到免疫原和包被原。对新西兰大白兔进行7次免疫后取得特异性抗血清。ELISA法测定抗体效价为1∶400000，检出限为0.01mg/L，定量限为0.023mg/L，IC₅₀为0.108mg/L。所建立的对BDE-47的间接竞争抑制ELISA方法，具有灵敏、快速、特异性强等优点，在对大量环境样品的进行初期筛选时很有优势，可大幅提高监测工作效率，降低监测成本，为仪器检测提供有效依据。

Description

一种用于四溴联苯醚快速检测的酶联免疫吸附分析方法

技术领域

本发明涉及一种可用于BDE-47的快速检测的ELISA方法，属于免疫化学和残留分析的检验技术领域，建立的间接竞争抑制ELISA检测方法可以用于研制BDE-47免疫速测试剂盒。

背景技术

多溴联苯醚(polybrominateddiphenyl ethers，PBDEs)，是一类含溴原子的芳香族化合物，属于溴系阻燃剂，其化学通式为C₁₂H_(0～9)Br_(1～10)O，依据苯环上溴原子取代数目和取代位置的不同，可分为10个不同组分，共有209种同系物。BDE-47全称2，2’，4，4’-四溴联苯醚，为多溴联苯醚中使用和环境分布最为广泛的同系物质。分子式为C₁₂H₆Br₄O，分子量为485.79，熔点-107℃，沸点98-99℃。化学结构和化学性质稳定，亲脂疏水性极强，具有生物积累性。

多溴联苯醚多用于阻燃剂的生产，属于溴代阻燃剂的一种，被广泛应用于电子、电器、纺织、家居建材等多个工业领域中。市场上现行使用的PBDEs商用阻燃剂主要可分为三种：五溴联苯醚混合物、八溴联苯醚混合物以及十溴联苯醚，BDE-47主要应用于五溴联苯醚，另外高溴代化合物也可脱溴成为低溴代化合物。在多溴联苯醚的生产、使用和处置过程中都会对环境造成不同程度的污染，根据目前已有的相关研究，PBDEs会对人体产生肝脏毒性，甲状腺激素毒性，神经毒性，生殖系统毒性等方面的危害。多溴联苯醚的严重危害问题已经引起人们的高度重视，美国、加拿大等国已开始限制其生产和使用，因此必须建立快速、灵敏的检测分析方法，以确保环境安全和人类健康。

BDE-47测定最常采用的是气相色谱-质谱联用法。但是这些仪器方法前处理费事、成本高、不适合现场检测，而ELISA具有灵敏度高、选择性好等优点，避免了经典仪器测试手段的不足，能够用于现场快速监测和大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于BDE-47间接竞争抑制ELISA快速检测。

本发明的技术方案概述如下：

一种用于BDE-47快速检测的间接竞争抑制ELISA方法，具体步骤如下：

1.半抗原的合成

半抗原C₁₅H₉O₃Br₃的合成：称取1201.2mg(5mmol)的磷酰基乙酸三乙酯于250ml锥形瓶，加入10mlTHF，另加入280mg氢化钠，在冰浴器中搅动反应20min；称取3-溴-4-氟苯甲醛3.24g(16mmol)，再称取2，4-二溴苯酚4g，(16mmol)溶于20ml二甲基乙酰胺中，反应2h；称取已制得的3-溴-4-(2，4-二溴苯氧基)苯甲醛2000mg(4.6mmol)，与上步骤冷却过后的混合物进行反应3-4h；秤取1570mg(37.5mmol)的LiOH·H₂O加入1，4-二氧六环与水的混合液50ml(体积比1∶1)中，将合成物质水解24h；分离纯化后得到白色晶体态半抗原C₁₅H₉O₃Br₃为573mg，产率为61％。

半抗原C₁₁H₁₃O₃NBr₂的合成：称取3，5-二溴-2-羟基吡啶200mg(0.79mmol)，加入6-溴己酸乙酯352.53mg(1.58mmol)以及适量无水K₂CO₃，混合溶于2mL二甲基甲酰胺中，100℃下反应5h；秤取1570mg(37.5mmol)的LiOH·H₂O加入1，4-二氧六环与水的混合液50ml(体积比1∶1)中，将合成物质水解24h；分离纯化后得到淡黄色晶体态的半抗原C₁₁H₁₃O₃NBr₂为138mg，产率为93％。

2.全抗原的合成

免疫原C₁₅H₉O₃Br₃-BSA的合成：取半抗原C₁₅H₉O₃Br₃0.50mmol(0.239g)置于溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺；取N-羟基琥珀酰亚胺0.50mmol(0.0584g)，N，N’-二环己基碳0.55mmol0.1035g)，溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌下逐滴加到溶有半抗原的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应8h，4℃过夜；将反应产物以9000r/min离心15min，上层清液为活性酯；将适量的牛血清白蛋白溶解于pH为9.6的碳酸盐缓冲液配制成15mg/mL的溶液10mL；4℃搅拌下，取10mL活性酯缓慢地滴加入10mL的蛋白溶液中，继续搅拌4h；反应后的溶液用0.9％生理盐水透析5d；将透析完成后，将最后透析液冷冻干燥后保存于-20℃。

包被原C₁₁H₁₃O₃NBr₂-OVA的合成：除蛋白使用卵白蛋白外，步骤与免疫原合成相同。

3.抗血清的合成

选取体型均一，健康状况良好的两制新西兰大白兔作为免疫对象，用生理盐水稀释适量免疫原C₁₅H₉O₃Br₃-BSA，并将免疫原溶液与弗氏完全佐剂混合，使免疫原充分乳化。取弗氏完全佐剂乳化后的免疫原溶液对兔子进行皮下注射，注射后轻柔免疫部位使免疫原被充分吸收，避免皮下局部组织硬化。在第3次加强免疫后，通常将兔耳缘静脉取血部位周围的兔毛拔净，摩擦刺激局部，使兔耳发热，静脉充血，手术刀割小口后取约2～3mL血液，静置离心后，取上清液用(测试效价的具体方法)对现有抗血清进行效价检测。待效价达到预期后，在颈动脉进行大量采血。

表1 人工抗原生物免疫实施方案

4.间接竞争抑制ELISA检测BDE-47方法的建立

以每孔100μL的5μg/mL的包被原稀释液包被96孔酶标板，4℃静置过夜；将包被液倒净，向每孔加入350μL洗涤液，浸泡1min，吸去洗涤液，此步骤重复3次；以每孔200μL封闭液进行封闭，37℃振荡温育30min后，将封闭液倒净，如上洗涤3次；加入50μLBDE-47标准系列浓度溶液(0，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5，10，20，50，100，200，500，1000ug/L，)和50μL抗血清溶液，震荡30s后，37℃振荡温育60min；如上封闭后洗涤，加入100μL羊抗兔IgG-HRP溶液，37℃振荡温育60min；如上封闭后洗涤，加入100μL底物液，37℃避光振荡温育15min；加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应；酶标仪在450nm波长下测定各板孔中溶液的吸光度。

本发明的有益效果：间接竞争抑制ELISA用于BDE-47的检测方法具有较高的灵敏度，通过实际样品加标回收分析，间接竞争抑制ELISA方法表现出较高的稳定性和精确度，该方法相比传统气相色谱-质谱检测(GC-MS)方法相比更简单快速。

附图说明

图1半抗原C₁₅H₉O₃Br₃合成路线

图2半抗原C₁₁H₁₃O₃NBr₂合成路线

图3免疫原合成路线

图4包被原合成路线

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。

间接竞争抑制ELISA检测方法的建立与评估

一、方法的灵敏度

表2 K1-BSA抗血清ELISA法测定BDE-47标样数据

以每孔100μL的5μg/mL的包被原稀释液包被96孔酶标板，4℃静置过夜；将包被液倒净，向每孔加入350μL洗涤液，浸泡1min，吸去洗涤液，此步骤重复3次；以每孔200μL封闭液进行封闭，37℃振荡温育30min后，将封闭液倒净，如上洗涤3次；加入50μL的BDE-47标准系列浓度溶液(0，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5，10，20，50，100，200，500，1000ug/L，)和50μL抗血清溶液，震荡30s后，37℃振荡温育60min；如上封闭后洗涤，加入100μL羊抗兔IgG-HRP溶液，37℃振荡温育60min；如上封闭后洗涤，加入100μL底物液，37℃避光振荡温育15min；加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应；酶标仪在450nm波长下测定各板孔中溶液的吸光度。计算可得间接竞争抑制ELISA检测BDE-47的IC₅₀值为0.108mg/L，检出限为0.01mg/L，定量限为0.023mg/L，在0.01～0.5mg/L范围内检测结果准确。

二、实际样品添加回收试验

选择水、底泥和鲈鱼肌肉三种环境样品进行添加回收分析，比较间接竞争抑制ELISA检测和传统GC-MS检测结果。样品前处理过程如下：水样经过0.7μm的Watman GF/F玻璃纤维滤纸过滤后，加入50％(体积比)的甲醇后在超声清洗器上超声10min，静置30min，离心后取上层清液即可进行ELISA检测。底泥(鱼样)经过充分干燥、研磨、筛选后与无水硫酸1∶1.2(质量比)充分混合；加入合适比例的正己烷与二氯甲烷混合溶剂(V/V＝2∶1)，超声萃取30min，重复萃取两次；高纯氮气吹干萃取溶剂后用正己烷作替换溶剂，并用浓硫酸纯化至无色；再用高纯氮气吹干后溶于1mL的甲醇中进行ELISA分析。

表3 ELISA方法检测各加标环境样品中BDE-47

对水样、底泥及鲈鱼肌肉样品进行平行样品提取(n≥4)、纯化和分析，数据处理结果见表3。水样的相对标准偏差为4.8～11.8％，底泥相对标准偏差结果为4.04～15.57％，鱼样为3.74～8.24％。该检测方法中各样品加标回收率处分别在66.20～88.57％，78.32～84.15％，75.23～80.20％，基本满足针对于复杂基质中微量或是痕量目标物的回收率要求，证明该方法具有较好的准确度和稳定性，可以满足对富集后环境样品中PBDEs的检测要求。

Claims

1.一种2，2’，4，4’-四溴联苯醚(BDE-47)半抗原及其合成方法，其特征在于：选择C₁₅H₉O₃Br₃为半抗原，其合成步骤为：

(1)称取1201.2mg(5mmol)的磷酰基乙酸三乙酯于250ml锥形瓶，加入10mlTHF，另加入280mg氢化钠，在冰浴器中搅动反应20min；

(2)称取3-溴-4-氟苯甲醛3.24g(16mmol)，再称取2，4-二溴苯酚4g，(16mmol)溶于20ml二甲基乙酰胺中，反应2h；

(3)称取已制得的3-溴-4-(2，4-二溴苯氧基)苯甲醛2000mg(4.6mmol)，与上步骤冷却过后的混合物进行反应3-4h；

(4)秤取1570mg(37.5mmol)的LiOH·H2O加入1，4-二氧六环与水的混合液50ml(体积比1∶1)中，将合成物质水解24h；分离纯化后得到白色晶体态半抗原C₁₅H₉O₃Br₃。

2.一种2，2’，4，4’-四溴联苯醚(BDE-47)半抗原及其合成方法，其特征在于：选择C₁₁H₁₃O₃NBr₂为半抗原，其合成步骤为：

(1)称取3，5-二溴-2-羟基吡啶200mg(0.79mmol)，加入6-溴己酸乙酯52.53mg(1.58mmol)以及适量无水K₂CO₃，混合溶于2mL二甲基甲酰胺中，100℃下反应5h；

(2)秤取1570mg(37.5mmol)的LiOH·H₂O加入1，4-二氧六环与水的混合液50ml(体积比1∶1)中，将合成物质水解24h；

(3)分离纯化后得到淡黄色晶体态的半抗原C₁₁H₁₃O₃NBr₂。

3.一种2，2’，4，4’-四溴联苯醚(BDE-47)的全抗原及其合成方法，其特征在于：以C₁₅H₉O₃Br₃与BSA偶联，C₁₁H₁₃O₃NBr₂与OVA偶联得到两种抗原，其合成步骤为：

(1)C₁₅H₉O₃Br₃-BSA的合成：取半抗原C₁₅H₉O₃Br₃ 0.50mmol(0.239g)溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺；取N-羟基琥珀酰亚胺0.50mmol(0.0584g)，N，N’-二环己基碳0.55mmol(0.1035g)，溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌下逐滴加到溶有半抗原的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应8h，4℃过夜；

(2)将反应产物以9000r/min离心15min，上层清液为活性酯；

(3)将适量的牛血清白蛋白溶解于pH为9.6的碳酸盐缓冲液配制成15mg/mL的溶液10mL；4℃搅拌下，取10mL活性酯缓慢地滴加入10mL的蛋白溶液中，继续搅拌4h；

(4)反应后的溶液用0.9％生理盐水透析5d；将透析完成后，将最后透析液冷冻干燥后保存于-20℃。

(5)C₁₁H₁₃O₃NBr₂-OVA的合成：除蛋白使用卵白蛋白外，步骤与免疫原合成相同。

4.一种2，2’，4，4’-四溴联苯醚(BDE-47)的抗血清及其制备，其特征在于：以C₁₅H₉O₃Br₃-BSA作为免疫原，新西兰大白兔作为免疫对象，进行多次免疫，免疫方法为：

(1)选取体型均一，健康状况良好的两制新西兰大白兔作为免疫对象，用生理盐水稀释适量免疫原C₁₅H₉O₃Br₃-BSA，并将免疫原溶液与弗氏完全佐剂混合，使免疫原充分乳化。

(2)取弗氏完全佐剂乳化后的免疫原溶液对兔子进行皮下注射，注射后轻柔免疫部位使免疫原被充分吸收，避免皮下局部组织硬化。

(3)在第3次加强免疫后，通常将兔耳缘静脉取血部位周围的兔毛拔净，摩擦刺激局部，使兔耳发热，静脉充血，手术刀割小口后取约2～3mL血液，静置离心后，取上清液对现有抗血清进行效价检测。待效价达到预期后，在颈动脉进行大量采血。

表1 人工抗原生物免疫实施方案

5.一种间接竞争抑制ELISA检测BDE-47方法的建立，其特征在于：将权利要求1、2、3、4中所述的BDE-47的半抗原、抗原及抗体应用于免疫分析，具体方法为：

(1)以C₁₁H₁₃O₃NBr₂-OVA作为包被原，以每孔100μL的5μg/mL的包被原稀释液包被96孔酶标板，4℃静置过夜；

(2)将包被液倒净，向每孔加入350μL洗涤液，浸泡1min，吸去洗涤液，此步骤重复3次；

(3)以每孔200μL封闭液进行封闭，37℃振荡温育30min后，将封闭液倒净，如上洗涤3次；

(4)加入50μLBDE-47标准系列浓度溶液(0，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，5，10，20，50，100，200，500，1000ug/L，)和50μL抗血清溶液，震荡30s后，37℃振荡温育60min；

(5)如上封闭后洗涤，加入100μL羊抗兔IgG-HRP溶液，37℃振荡温育60min；

(6)如上封闭后洗涤，加入100μL底物液，37℃避光振荡温育15min；

(7)加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应；

(8)酶标仪在450nm波长下测定各板孔中溶液的吸光度。

6.一种使用权利要求5中建立的检测方法进行实际样品添加回收实验的方法，其特征在于：选择水、底泥和鲈鱼肌肉三种环境样品进行添加回收分析，比较间接竞争抑制ELISA检测和传统GC-MS检测的结果，具体方法如下：

(1)水样经过0.7μm的Watman GF/F玻璃纤维滤纸过滤后，加入50％(体积比)的甲醇后在超声清洗器上超声10min，静置30min，离心后取上层清液，进行ELISA检测；

(2)底泥(鱼样)经过充分干燥、研磨、筛选后与无水硫酸1∶1.2(质量比)充分混合；加入合适比例的正己烷与二氯甲烷混合溶剂(V/V＝2∶1)，超声萃取30min，重复萃取两次；高纯氮气吹干萃取溶剂后用正己烷作替换溶剂，并用浓硫酸纯化至无色；再用高纯氮气吹干后溶于1mL的甲醇中进行ELISA检测。