CN105874059B

CN105874059B - 用于产生哺乳动物多能干细胞衍生之内胚层细胞的改良方法

Info

Publication number: CN105874059B
Application number: CN201380062204.1A
Authority: CN
Inventors: 芭芭拉·屈珀斯-蒙特; 何塞菲娜·埃德斯巴格
Original assignee: Takara Bio Europe AB
Current assignee: Takara Bio Europe AB
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: EP2925861B1; JP2015536662A; US10202579B2; EP2925861A1; JP2019050824A; CN105874059A; JP6444883B2; US20160304834A1; WO2014083133A1; JP6728541B2; US20190218512A1

Abstract

本发明涉及哺乳动物多能干细胞，特别是人多能干(hPS)细胞向内胚层细胞的定向分化。特别地，本发明涉及在哺乳动物多能干细胞，特别是hPS细胞分化成内胚层时，用DNA去甲基化剂处理哺乳动物多能干细胞特别是hPS细胞。如本文公开的，本发明人发现，使分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于DNA去甲基化剂中，导致内胚层细胞形态改善并且产量提高。用DNA去甲基化剂处理还导致干细胞标志物Oct4表达的显著下调以及内胚层特异性标志物特别是sox17、cxcr4和hhex的表达提高。

Description

用于产生哺乳动物多能干细胞衍生之内胚层细胞的改良方法

技术领域

本发明涉及哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干(hPS)细胞)向定形内胚层细胞的定向分化。特别地，本发明涉及在哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)分化成内胚层时，用DNA去甲基化剂处理哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)。如本文公开的，本发明人发现，将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于DNA去甲基化剂，导致内胚层细胞形态改善并且产量提高。用DNA去甲基化剂的处理还导致干细胞标志物Oct4表达的显著下调以及内胚层特异性标志物(特别是sox17、cxcr4和hhex)的表达提高。

背景技术

人多能干细胞有望彻底改变多种人细胞类型的可接近性(accessibility)，因为其具有在适当条件下自我更新的能力以及形成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)之任何类型的特化细胞(specialized cell)的能力。主要感兴趣的是内胚层，因为其产生肠、胰腺、肝和肺，即，其衰竭或损伤与如今所见的大多数疾病状态和临床病症相关的人体器官。因此，很大的前景在于用于替代治疗的器官特异性组织的体外开发。

由于在三个胚层之中，内胚层发育为上述器官的独特能力，内胚层(更特别地为定形内胚层)在器官特异性组织的产生中起着关键作用。因此，持续需要改善体外衍生之内胚层细胞的特征，其最终影响器官特异性细胞和组织的质与量。然而，没有很好地了解早期内胚层发育，到目前为止只鉴定了驱动人多能干细胞向内胚层分化的几个因素。因此，还发现，尚未鉴定的对内胚层发育有影响的因素是重要的并且将有助于来优化用于体外产生内胚层器官之细胞和组织的培养条件。

早已猜测DNA甲基化在正常胚胎发生和发育中的重要性并且DNA去甲基化剂的应用可引起基因组中基因大条带(large swath)的再激活。先前的工作已经示出，推测通过激活心肌生成所需之通常为甲基化和沉默的基因可将DNA去甲基化用于hES细胞向心脏命运的定向分化(Yoon等2006)。

发明内容

本发明描述了改良方法，通过其使哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干(hPS)细胞)分化成定形内胚层细胞，与通过目前可用的现有技术方法获得的内胚层细胞相比，其具有改善的特征。

在第一方面中，本发明提供了用于产生哺乳动物多能干细胞衍生的定形内胚层细胞(DE细胞)，特别是人多能干(hPS)细胞衍生的定形内胚层细胞(DE细胞)的方法，其中将哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)暴露于DNA去甲基化剂。

因此，提供了用于产生哺乳动物多能干细胞衍生的DE细胞的方法，其包括：

在分化条件下培养哺乳动物多能干细胞以获得DE细胞，以及

将分化中的哺乳动物多能干细胞暴露于DNA去甲基化剂。

特别地，提供了用于产生人多能干(hPS)细胞衍生的DE细胞的方法，其包括：

在分化条件下培养人多能干细胞以获得DE细胞，以及

将分化中的人多能干细胞暴露于DNA去甲基化剂。

在哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)分化成定形内胚层细胞期间，将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于DNA去甲基化剂(例如5-氮杂-2-脱氧胞苷或5-氮杂胞苷)以使基因组的部分去甲基化并使基因转录激活。

向所述DNA去甲基化剂的暴露可发生在哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)向DE细胞分化期间的任意时间。

作为根据本发明方法的结果，获得了具有改善特征的定形内胚层细胞及包含所述内胚层细胞的细胞组合物。因此，在另一些方面中，本发明涉及通过本发明的方法获得的定形内胚层细胞以及涉及包含所述内胚层细胞或由所述内胚层细胞组成的细胞组合物。

在另一个方面中，本发明涉及本发明之定形内胚层细胞或细胞组合物用于产生肠、胰腺、肝和/或肺的细胞和组织的另外用途。例如，本发明的定形内胚层细胞或细胞组合物可用于产生肝祖细胞或完全成熟的肝细胞样细胞，包括肝组织。本发明的定形内胚层细胞或细胞组合物还可用于产生胰腺前体细胞或完全成熟的胰腺细胞，例如胰腺星状细胞或郎格汉斯(Langerhans)细胞或者胰腺组织。

在另一些方面中，本发明提供了本发明的定形内胚层细胞或细胞组合物在药物和毒理学筛选(例如药物开发过程或毒性测试)中的另外用途。

在另一个方面中，本发明提供了DNA去甲基化剂在从哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)产生定形内胚层细胞中的用途。

在再一个方面中，本发明涉及用于实施本发明方法的试剂盒。在该方面中包括包含至少一种DNA去甲基化的试剂盒。应理解，本文给出的关于在本发明方法中使用的组分之细节也适用于本发明试剂盒所包含的组分。

在又一个方面中，本发明涉及组合物。这样的组合物特别地用于从哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)产生定形内胚层细胞。在该方面中包括包含至少一种DNA去甲基化剂和激活素(例如激活素A或激活素B)的组合物。应理解，本文给出的关于在本发明方法中使用的组分之细节也适用于本发明组合物所包含的组分。

发明详述

本发明提供了用于使哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)分化成定形内胚层细胞的方法，所述方法包括在支持性培养基和包含DNA去甲基化剂的分化培养基中培养所述哺乳动物多能干细胞，特别是hPS细胞。因此，在哺乳动物干细胞(特别是hPS细胞)分化成内胚层期间，使其暴露于DNA去甲基化剂。

因此，本发明提供了用于从哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)产生定形内胚层细胞的方法，其特征在于在哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)分化成内胚层期间，暴露于DNA去甲基化剂。

可将用于产生哺乳动物多能干细胞衍生的定形内胚层细胞，特别是hPS细胞衍生之定形内胚层细胞的方法描述为包括：

在分化条件下培养哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)以获得定形内胚层细胞，以及

将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)暴露于DNA去甲基化剂。

在根据本发明的方法中使用的DNA去甲基化剂可以是干扰DNA甲基转移酶酶活性的任何化合物。合适的DNA去甲基化剂是核苷类似物型和非核苷型的DNA去甲基化剂，所述核苷类似物型例如胞苷类似物，例如，5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)或泽布拉林(zebularine)，所述非核苷型，例如普鲁卡因(Procaine)、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epogallocatechingallate)、盐酸肼苯哒嗪、盐酸普鲁卡因胺或Psammaplin A。

因此，在本发明的方法中使用的DNA去甲基化剂可以是核苷类似物型的DNA去甲基化剂。或者，在本发明的方法中使用的DNA去甲基化剂可以是非核苷型的DNA去甲基化剂。在本发明的方法中使用的DNA去甲基化剂还可以是这两种类型的混合物。

可在本发明方法中使用的核苷类似物型的DNA去甲基化剂的非限制性实例是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)和泽布拉林。非核苷型的非限制性实例是普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐酸肼苯哒嗪、盐酸普鲁卡因胺或Psammaplin A。

因此，在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是选自以下的一种：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、泽布拉林、普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐酸肼苯哒嗪、盐酸普鲁卡因胺、Psammaplin A及其组合。

在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是胞苷类似物，例如，5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、泽布拉林、伪异胞苷(Pseudoisocytidine)、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷、2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(arabinofurasonide)。

因此，在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是选自以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。

因此，在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是选自以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)和5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。或者，在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是胞苷类似物，其不是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。因此，在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是选自以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。

因此，在本发明方法中使用的DNA去甲基化剂可以是5-氮杂-2-脱氧胞苷。DNA去甲基化剂还可以是5-氮杂胞苷。DNA去甲基化剂还可以是泽布拉林。DNA去甲基化剂还可以是伪异胞苷。DNA去甲基化剂还可以是5-氟-2-脱氧胞苷。DNA去甲基化剂还可以是5,6-二氢-5-氮杂胞苷。DNA去甲基化剂还可以是2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷。DNA去甲基化剂还可以是6-氮杂胞苷。DNA去甲基化剂还可以是2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。DNA去甲基化剂还可以是胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷。DNA去甲基化剂还可以是普鲁卡因。DNA去甲基化剂还可以是RG108。DNA去甲基化剂还可以是S-5-腺苷-L-高半胱氨酸。DNA去甲基化剂还可以是咖啡酸。DNA去甲基化剂还可以是绿原酸。DNA去甲基化剂还可以是表没食子儿茶素没食子酸酯。DNA去甲基化剂还可以是盐酸肼苯哒嗪。DNA去甲基化剂还可以是盐酸普鲁卡因胺。DNA去甲基化剂还可以是PsammaplinA。

不仅可将分化中的hPS细胞暴露于一种DNA去甲基化剂，而且还可将其暴露于一种或更多种另外的DNA去甲基化剂，例如，暴露于两种、三种、四种、五种、六种或七种上述那些的组合。

例如，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于两种上述DNA去甲基化剂。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)与5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)的组合或者暴露于5-氮杂胞苷与泽布拉林的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)与5,6-二氢-5-氮杂胞苷的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)与5,6-二氢-5-氮杂胞苷的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)与2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)与2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)与6-氮杂胞苷的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)与6-氮杂胞苷的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)与2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)的组合。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)与2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)的组合。

还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于核苷类似物型的DNA去甲基化剂与非核苷型的DNA去甲基化剂的组合，例如，5-氮杂-2-脱氧胞苷与普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐酸肼苯哒嗪、盐酸普鲁卡因胺和PsammaplinA之一的组合。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于三种上述DNA去甲基化剂。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)和泽布拉林的组合。

通常，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约10μΜ(例如约1nM至约5μΜ)的DNA去甲基化剂。

例如，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约1μΜ的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约500nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约250nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约100nM的DNA去甲基化剂。因此，还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约50nM的DNA去甲基化剂。因此，还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约25nM的DNA去甲基化剂。因此，还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约15nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约10nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约500nM的DNA去甲基化剂。因此，还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约250nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约100nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约50nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约25nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约15nM(例如在约10nM)的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约250nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约100nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约50nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约25nM的DNA去甲基化剂。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约12.5nM的DNA去甲基化剂。

在例如5-氮杂-2-脱氧胞苷用作DNA去甲基化剂的情况下，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为1nM至约1μΜ的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约500nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约250nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约100nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约50nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约25nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约15nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约1nM至约10nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约500nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此，可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约250nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约100nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约50nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约25nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约5nM至约15nM(例如在约10nM)的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约250nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约100nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约50nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约25nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。还可将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于浓度为约7.5nM至约12.5nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。

可将类似的浓度用于5-氮杂胞苷或泽布拉林用作DNA去甲基化剂的情况中。还可将类似的浓度用于其他胞苷类似物的情况中，例如，伪异胞苷、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷、2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷，特别是5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷或2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。

可在多能干细胞阶段与内胚层阶段之间的任何阶段，将分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)暴露于所述试剂(或用所述试剂处理)。因此，向所述DNA去甲基化剂的暴露可发生在哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)分化成DE细胞期间。

当分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)表现出最强的增殖能力时，所述增殖能力通过细胞倍增时间(例如分化的第2天至第7天之间)所证明，通常将它们暴露于核苷类似物型的DNA去甲基化剂(例如，5氮杂-2脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、泽布拉林)。因此，可在分化的第2天将DNA去甲基化剂添加至分化培养基。还可在分化的第3天将DNA去甲基化剂添加至分化培养基。还可在分化的第4天将DNA去甲基化剂添加至分化培养基。还可在分化的第5天将DNA去甲基化剂添加至分化培养基。还可在分化的第6天将DNA去甲基化剂添加至分化培养基。在分化方案中可在任何时间添加非核苷型的DNA去甲基化剂(例如，普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸)，因为其不需要细胞增殖来起作用。

出乎意料地发现，用DNA去甲基化剂处理分化中的哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)导致定形内胚层细胞形态改善并且产量提高。此外，用去甲基化剂处理提供了更纯且更同质的内胚层细胞群(图1A至1B)。此外，用DNA去甲基化剂处理还出乎意料地导致内胚层细胞中干细胞标志物Oct4表达的显著下调(图1C和1D)以及DE特异性标志物sox17、cxcr4和hhex之提高的蛋白质和基因表达(图1D)。这被认为是第一次示出DNA去甲基化和应用参与哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)向定形内胚层分化之生长因子的这样的作用。不受理论的束缚，认为甲基化的普遍不存在增强了在基因组水平下参与的生长因子的作用。

本发明中的起始材料可以是任意类型的哺乳动物多能干细胞，例如，哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞。

例如，用于本发明的哺乳动物多能干细胞可以是人多能干细胞、灵长类动物多能干细胞、小鼠多能干细胞、大鼠多能干细胞、犬多能干细胞、猫多能干细胞、猪(procine)多能干细胞、牛多能干细胞或马多能干细胞。

特别地，本发明中的起始材料可以是任意类型的人多能干细胞，例如，人胚胎干(hES)细胞或人诱导多能干(hiPS)细胞。

因此，用作获得DE细胞的起始材料的人多能干细胞可以是获得自已建立的hES细胞系的人胚胎干细胞。例如，所使用的合适的hES细胞系是细胞系SA167、SA181、SA461(Cellartis AB,

Sweden)，其列于NIH干细胞登记处(NIH stem cellregistry)、UK干细胞库(UK Stem Cell bank)和欧洲hESC登记处(European hESCregistry)并且可依要求获得。所使用的另一些合适的细胞系是由Klimanskaya等(2006)建立的那些，例如，细胞系MA01和MA09，以及由Chung等(2008)建立的那些，例如细胞系MA126、MA127、MA128和MA129，其均列于国际干细胞登记处(International Stem Cell Registry)(归于Advanced Cell Technology,Inc.Worcester,MA,USA)。本文所述的人胚胎干细胞的最终来源为从未经体内发育的受精14天以内的人类胚胎中分离或者获取的。

或者，可用作获得内胚层细胞和/或肝祖细胞的起始材料的人多能干细胞可以是人诱导多能干细胞。获得这样的hiPS细胞的多种技术已经描述于科学文献中，并且因此是技术人员已知的[参见，例如，Takahashi等(2007)；Zhou等(2009)；Yu和Thomson在Essentials of Stem Cell Biology第2版]。

本发明中的起始材料可以是任意类型的哺乳动物多能干细胞，例如，哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞，其中哺乳动物多能干细胞不是人多能干细胞。

用于将哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)分化成DE细胞的合适条件是已知的(参见，例如，Hay 2008、Brolen 2010和Duan 2010)。例如，WO 2009/013254 A1描述了从hPS细胞获得定形内胚层细胞的合适方案(实施方案1至4)。

通常，为了获得内胚层细胞，在包含激活素(例如，激活素A或激活素B)的分化培养基中培养哺乳动物多能干细胞，特别是hPS细胞。所述分化培养基还可包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，例如，丁酸钠(NaB)、丁酸苯酯(PB)、丙戊酸盐/酯(valproate)、曲古抑菌素A、恩替司他(Entinostat)或帕比司他(Panobinstat)。所述分化培养基还可包含一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2和FGF4和/或血清，例如FBS或FCS。所述分化培养基可包含GSK3抑制剂，例如CHIR99021或者Wnt信号传导激活剂，例如Wnt3A。所述分化培养基还可包含PI3K(磷酸肌醇3-激酶)抑制剂，例如LY294002。

激活素的浓度通常为约50ng/ml至约150ng/ml，例如约80ng/ml至约120ng/ml。例如，激活素可以以约50ng/ml或约100ng/m的浓度存在于分化培养基中。HDAC抑制剂的浓度通常为约0.5mM至约2mM。例如，HDAC抑制剂可以以约0.5mM或约1mM的浓度存在于分化培养基中。一种或更多种生长因子的浓度可根据所使用的具体化合物而不同。例如，FGF2的浓度通常为约2ng/ml至约50ng/ml，例如约2ng/ml至约10ng/ml。例如，FGF2可以以约4ng/ml或约5ng/ml的浓度存在于分化培养基中。例如，FGF1的浓度通常为约50ng/ml至约200ng/ml，例如约80ng/ml至约120ng/ml。例如，FGF1可以以约100ng/ml的浓度存在于分化培养基中。例如，FGF4的浓度通常为约20ng/ml至约40ng/ml。例如，FGF4可以以约30ng/ml的浓度存在于分化培养基中。如果存在的话，那么血清的浓度通常为约0.1％v/v至约2％v/v，例如约0.1％至约0.5％、约0.2％v/v至约1.5％v/v、约0.2％v/v至约1％v/v、约0.5％v/v至1％v/v或约0.5％v/v至约1.5％v/v。例如，血清可以以约0.2％v/v、约0.5％v/v或约1％v/v的浓度存在于分化培养基中。如果存在的话，那么GSK3的浓度通常为约0.1μΜ至约10μΜ，例如约0.05μΜ至约5μΜ。如果存在的话，那么Wnt信号传导激活剂的浓度通常为约0.05ng/ml至约10ng/ml，例如约0.5μΜ至约5μΜ。例如，PI3K抑制剂的浓度通常为约0.1μΜ至10μΜ，例如约1μΜ至5μΜ。

分化培养基还可包含另一些补充剂，例如PEST和/或GlutaMAX。所述分化培养基还可包含ROCK抑制剂。PEST的浓度通常为约0.1％v/v至约0.5％v/v，例如约0.1％v/v至约0.25％v/v。GlutaMAX的浓度通常为约0.5％v/v至约1.5％v/v，例如约0.75％v/v至1.25％v/v，例如约1％v/v。所述分化培养基还可包含ROCK抑制剂。ROCK抑制剂的浓度通常为约1μΜ至约10μΜ，例如约2.5μΜ至约7.5μΜ，例如约5μΜ。

形成所述分化培养基之基础的培养基可以是适于培养哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)的任何培养基，例如，RPMI 1640或高级RPMI1640培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、HCM培养基、HBM培养基或基于Williams E的培养基。因此，所述分化培养基可以是包含或补充有上述组分的RPMI 1640或高级RPMI 1640培养基。或者，所述分化培养基可以是包含或补充有上述组分的DMEM。因此，所述分化培养基还可以是包含或补充有上述组分的HCM培养基。因此，所述分化培养基还可以是包含或补充有上述组分的HBM培养基。因此，所述分化培养基还可以是包含或补充有上述组分的基于Williams E的培养基。

为了内胚层分化，通常在如上所述的含激活素的分化培养基中将哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)培养至多10天。例如，可在所述分化培养基中将哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)培养约4天至约10天，例如约4天至约9天、约4天至约7天或约7天至约9天。

在本文实施例2中提供了用于从哺乳动物多能干细胞(特别是hPS细胞)获得定形内胚层细胞的基础、非限制性培养条件。

此外，可在无异源(xeno-free)的条件下获得本发明的内胚层细胞。因此，本发明方法采用的起始材料可因而是无异源的，例如，无异源的hPS细胞或细胞系，所述细胞或细胞系在无动物的条件下获得或建立。此外，贯穿本发明方法，细胞可完全地在无异源的条件下培养，从而产生真正无异源的内胚层细胞。可通过在有异源的细胞(non-xeno freecells)中非人唾液酸Neu5Gc或其他非人标志物的存在来区分这样的细胞或细胞系与有异源的组合物(Martin等2005)。

与目前可用的现有技术方法相比，作为本发明方法的结果，获得了具有改善特征的内胚层细胞，例如，DE细胞。

与未用DNA去甲基化剂处理所获得的细胞群或细胞组合物相比，根据本发明获得的定形内胚层细胞群或细胞组合物表现出干细胞标志物(如Oct4)改善的较低表达。此外，定形内胚层细胞群或细胞组合物表现出许多定形内胚层细胞特征标志物(特别是sox17、cxcr4和hhex)提高的基因表达。此外，与未用DNA去甲基化剂处理所获得的细胞群或细胞组合物相比，所获得的定形内胚层细胞群或细胞组合物更纯且更同质。

本发明细胞组合物的特征还可在于至少70％(例如75％、80％、90％或95％)的细胞是本发明的内胚层细胞。

一旦获得，则还可将本发明的内胚层细胞或细胞组合物用于产生肠、胰腺、肝和/或肺的细胞或组织。例如，可将本发明的内胚层细胞或细胞组合物用于产生肝祖细胞或完全成熟的肝细胞样细胞，包括肝组织。还可将本发明的内胚层细胞或细胞组合物用于产生胰腺前体细胞或完全成熟的胰腺细胞，例如胰腺星状细胞或郎格汉斯细胞，或者胰腺组织。

还可将本发明的定形内胚层细胞或细胞组合物进一步用于药物和毒理学筛选(例如药物开发过程或毒性测试)中。

本发明还提供了试剂盒。这样的试剂盒特别地可用于实施本发明的方法，即，用于从哺乳动物多能干细胞(例如人多能干细胞)产生定形内胚层细胞。根据本发明的试剂盒包含至少一种DNA去甲基化剂。

如上所述，应理解，本文给出的关于在本发明方法中使用的组分之细节也适用于本发明试剂盒所包含的组分。

因此，本发明的试剂盒所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是例如，胞苷类似物，例如，5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨),5-氮杂胞苷(阿扎胞苷),泽布拉林,伪异胞苷,5-氟-2-脱氧胞苷,5,6-二氢-5-氮杂胞苷,2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷,6-氮杂胞苷,2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷。

例如，本发明的试剂盒所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是选择以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。

例如，本发明的试剂盒所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。或者，例如，本发明的试剂盒所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是胞苷类似物，其不是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。

本发明的试剂盒还可包含哺乳动物多能干细胞，特别是人多能干细胞。因此，本发明的试剂盒可包含哺乳动物胚胎干细胞，特别是人胚胎干细胞和/或哺乳动物诱导多能干细胞(特别是人诱导多能干细胞)。哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)，可适当地作为细胞悬液提供，并且可以以冷冻状态提供。

本发明的试剂盒还包含激活素，例如激活素A或激活素B。

本发明的试剂盒还可包含一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2和FGF4，和/或血清，例如FBS或FCS。

本发明的试剂盒可包含5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)和哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)，例如人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

本发明的试剂盒可包含5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、激活素(例如激活素A或激活素B)和哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)，例如人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

可在相同或分开的容器中提供本发明试剂盒的组分。例如，可在相同容器中提供至少一种DNA去甲基化剂和激活素。如果试剂盒包含哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)，则通常在与包含其他组分的容器不同的容器中提供哺乳动物多能干细胞，例如人多能干细胞。

本发明还提供了组合物。这样的组合物特别可用于从哺乳动物多能干细胞(特别是人多能干细胞)产生定形内胚层细胞。本发明的组合物包含至少一种DNA去甲基化剂和激活素(例如激活素A或激活素B)。

如上所述，应理解，本文给出的关于在本发明方法中使用的组分之细节也适用于本发明组合物所包含的组分。

因此，例如，本发明的组合物所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是胞苷类似物，例如，5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、泽布拉林、伪异胞苷、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷、2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷。

例如，本发明的组合物所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是选自以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氟-2-脱氧胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷、2'-脱氧-5,6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2',2'-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。

例如，本发明的组合物所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。或者，例如，本发明的组合物所包含的至少一种DNA去甲基化剂可以是胞苷类似物，其不是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。

本发明的组合物还可包含一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2和FGF4，和/或血清，例如FBS或FCS。

因此，本发明的组合物可包含5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)和激活素(例如激活素A或激活素B)。

本发明的组合物可包含5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)和激活素(例如激活素A或激活素B)。

定义

如本文所使用的，“多能”或“多能性”是指形成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)之所有类型特化细胞的潜能；并且区别于“全能”或“全能性”，其是形成能够产生后代之完整胚胎的能力。

如本文所使用的，“人多能干细胞”(hPS)是指具有在适当条件下自我更新的能力以及形成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)之任何类型特化细胞的能力的人细胞。hPS细胞可具有在8周大至12周大的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层之可鉴定细胞的能力。人多能干细胞的定义包括多种类型的胚胎细胞，包括人胚胎干(hES)细胞(参见，例如，Thomson等(1998),Heins等(2004))以及诱导多能干细胞[参见，例如，Takahashi等,(2007)；Zhou等(2009)；Yu和Thomson在Essentials of Stem CellBiology第2版]。本文所述的多种方法可利用来自多种来源的hPS细胞。例如，适于使用的hPS细胞可通过使用非破坏性技术从发育中的胚胎获得，所述非破坏性技术例如通过使用单卵裂球移除技术，其描述于例如Chung等(2008)，还由Mercader等在Essential StemCell Methods(第1版,2009)中描述。另外地或可替代地，合适的hPS细胞可从建立的细胞系获得或者可以是成体干细胞。

如本文所使用的，“hiPS细胞”是指人诱导多能干细胞。hiPS细胞是通过诱导与多能性相关的基因(例如，SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28)的表达从非多能细胞(通常为成年体细胞)衍生的多能干细胞类型。

如本文所使用的，“定形内胚层(DE)”、“定形内胚层细胞”和“定形内胚层细胞(DE细胞)”是指表现出定形内胚层细胞的典型蛋白质和/或基因表达以及形态的细胞或者包含大量类似于定形内胚层细胞之细胞的组合物。定形细胞层是产生肠、胰腺、肝和肺之细胞的胚细胞层。DE细胞通常可通过内胚层标志物FOXA2、CXCR4、HHEX、SOX17、GATA4和GATA6的阳性基因和蛋白质表达来表征并由此鉴定。两个标志物SOX17和CXCR4是特异于DE并且未在hPS细胞中检测出的。最后，DE细胞未表现出未分化的细胞标志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81的基因和蛋白质表达，但是可示出低的Nanog表达。

如本文所使用的，“肝祖细胞(hepatic progenitor)”或“肝祖细胞(hepaticprogenitor cell)”是指已经进入肝细胞途径并产生肝细胞的细胞。因此，“肝祖细胞”与“内胚层细胞”的区别在于其丧失了发育为肠、胰腺和肺之细胞的潜能。“肝祖细胞”通常可通过早期肝标志物EpCAM、c-Met(HGF受体)、AFP、CK19、HNF6、C/EBPα和C/EBPβ的阳性基因和蛋白质表达来表征并且由此鉴定。它们未表现出DE标志物CXCR4和SOX17的基因和蛋白质表达。最后，“肝祖细胞”未表现出未分化的细胞标志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81以及成熟的肝标志物CYP1A2、CYP2C9、CYP19、CYP3A4、CYP2B6和PXR的基因和蛋白质表达。

如本文所使用的，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”是指完全分化的肝细胞。“肝细胞”或“肝细胞样细胞”通常可通过成熟的肝标志物CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、GSTA1-1、OATP-2、NTCP、白蛋白、PXR、CAR和HNF4a(同工型1+2)等的阳性基因和蛋白质表达来描述并由此鉴定。此外，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”未表现出未分化的细胞标志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的基因和蛋白质表达。与DE细胞相比，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”未表现出DE细胞标志物SOX17和CXCR4的基因和蛋白质表达。与“肝祖细胞”相比，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”未表现出肝祖细胞标志物细胞角蛋白19和AFP的基因和蛋白质表达。

如本文所指，如果在测量基因或蛋白质之表达水平的实验中，所测定的表达水平高于测定标准偏差的三倍，其中表达水平和标准偏差是在10次独立的表达水平测定中测定的，则所述基因或蛋白质应理解为“表达的”。在10次单独测定中测定的表达水平优选地用背景信号校正。

如本文所使用的，HDAC抑制剂是指组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如，丁酸钠(“NaB”)、丁酸苯酯(“PB”)、曲古抑菌素A和丙戊酸盐/酯(“VA”)。

如本文所使用的，“GSK抑制剂”是指抑制糖原合酶激酶(特别是GSK3，包括GSK3α或GSK3β)的化合物。

如本文所使用的，“Wnt信号传导激活剂”是指激活Wnt信号传导的化合物。

如本文所使用的，DNA去甲基化剂旨在表示干扰DNA甲基转移酶酶活性的化合物，例如核苷类似物(如胞苷类似物)，特别是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)和泽布拉林，以及非-核苷型，例如RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸和普鲁卡因。

如本文所使用的，术语“FGF”表示成纤维细胞生长因子，优选人和/或重组来源的成纤维细胞生长因子，并且属于其的亚型为例如“bFGF”(意指碱性成纤维细胞生长因子，有时也称为FGF2)和FGF4。“aFGF”意指酸性成纤维细胞生长因子(有时也称为FGF1)。

如本文所使用的，术语“激活素”旨在表示表现出包括调节细胞增殖和分化之广泛生物活性的TGF-β家族成员，例如“激活素A”或“激活素B”。激活素属于配体的常见TGF-β超家族。

如本文所使用的，术语“ROCK抑制剂”旨在表示ROCK Rho-相关蛋白激酶活性的抑制剂。

如本文所使用的，术语“无异源”旨在表示完全避免(circumvention)直接或间接地暴露于非人动物组分。

附图说明

图1.

在hPS分化期间，用和不用5-氮杂-脱氧胞苷处理之hESC衍生的和hiPSC衍生的定形内胚层细胞(用基本方案A和B衍生)的表征。

图2.

在hPS分化期间，用5-氮杂-脱氧胞苷处理的衍生自27个不同hESC和hiPSC系的定形内胚层细胞(分别用基本方案A和B衍生)的表征。

图3.

在hPS分化期间，用或不用5-氮杂-脱氧胞苷或5-氮杂胞苷处理的衍生自3个hESC和hiPSC系的定形内胚层细胞(分别用基本方案A和B衍生)的表征。

实施例

在申请WO2004/099394、WO2003/055992、WO/2007/042225、WO2007/140968和WO2011116930中公开了一般的培养和传代技术的实例。

如以下实施例所列的，起始材料是人多能干细胞，特别是人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞。

实施例1：hPS细胞类型的维持

所有hPS细胞(如上所定义的)均可用作本发明的起始材料。对于以下实施例，具体地，定形内胚层是从在mEF饲养细胞上建立(Heins等2004)并维持在无饲养条件下之未分化的人胚胎干细胞(hESC)体外衍生的。用于该实验的细胞系是例如hES细胞系SA167、SA181、和SA461(Cellartis AB,

Sweden)并且它们可如Heins等2004所述进行繁殖。这些细胞系列于NIH干细胞登记处、UK干细胞库和欧洲hESC登记处并且可依要求获得。

连同从hESC获得的hPS一起，还可将hiPS(人诱导多能干)细胞用于本发明的实施例之肝细胞的衍生。

如下得到用于本发明的hiPSC系：在37℃下，在5％CO₂潮湿气氛的空气中，将人真皮成纤维细胞(CRL2429，ATCC)维持在补充有10％胎牛血清、1×glutamax、5U/ml青霉素和5μg/ml链霉素的DMEM中。用编码小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-myc的重组慢病毒转导成纤维细胞并且将其培养5天。然后，用胰蛋白酶分散所转导的细胞并在其正常生长培养基中以5×10³个细胞/cm²的密度接种到丝裂霉素C处理的人真皮成纤维细胞饲养细胞上。24小时之后，在37℃下，在5％CO₂潮湿气氛的空气中，用补充有20％knockout血清替换物、1×非必需氨基酸、1×glutamax、5U/ml青霉素、5μg/ml链霉素、100μΜ2-巯基乙醇和30ng/ml bFGF的knockout DMEM来替换培养基。每天替换一半体积的培养基，在大约30天之后出现iPS细胞的群落。挑选iPS群落，在DEF-CS^TM中扩增并制备细胞库。然后，表征建库的细胞(bankedcell)以检查内源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达、转基因的沉默、体外分化成表示所有三个胚层的细胞类型的潜能，并且通过STR谱和与亲本成纤维细胞细胞系(ATCC)进行比较确认其真实性。除了使用慢病毒重编程之外，还可使用逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、附加型质粒载体、蛋白质和mRNA或其他技术对hiPSC系进行重编程。使用的另一些合适的细胞系是由Chung等(2008)建立的那些，例如细胞系MA126、MA127、MA128和MA129(Advanced CellTechnology,Inc.Worcester,MA,USA)，其均列于国际干细胞登记处。这些细胞系是通过使用单卵裂球移除技术在不破坏人胚胎的情况下衍生(或获得)的。

实施例2：分化hPS细胞类型以产生肝细胞样细胞

肝细胞样细胞可通过使用以下示例性基本方案A和B从hPS细胞衍生：

方案A：

解离未分化的hPS细胞并将其直接接种到新鲜制备的第0天培养基中。在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第7天新鲜制备并添加不同的培养基。预处理培养基购自Cellectis AB(Arvid Wallgrens Backe 20,41356Gothenburg,Sweden)。

第0天

预处理培养基

3μΜ CHIR99021

5μΜ ROCK抑制剂

第1天

预处理培养基

3μΜ CHIR99021

第2天

RPMI 1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)

1×B27

50ng/ml激活素A

3μΜ CHIR99021

5μΜ LY294002

第3天

RPMI 1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)

1×B27

50ng/ml激活素A

5μΜ LY294002

第4天至第7天

RPMI 1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)

1×B27

50ng/ml激活素A

在第7天，将细胞进行传代。在37℃下，用TrypLE Select孵育细胞3分钟至7分钟，添加相同体积的VitroHES并将细胞悬液在200g至300g下离心5分钟至6分钟。之后，以50000个细胞/cm²至350 000个细胞/cm²(例如，100 000个细胞/cm²至300 000个细胞/cm²，优选150 000个细胞/cm²)的密度将细胞重铺板于基于纤连蛋白的包被上。

方案B:

第0天

预处理培养基

3μΜ CHIR99021

5μΜ ROCK抑制剂

第1天

RPMI 1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)

1×B27

50ng/ml激活素A

3μΜ CHIR99021

5μΜ LY294002

第2天

RPMI 1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)

1×B27

50ng/ml激活素A

5μΜ LY294002

第3天至第7天

RPMI 1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)

1×B27

50ng/ml激活素A

对于传代d7，参见方案A。

实施例3：证实在用DNA去甲基化处理的hESC和hiPS细胞中之改善的定形内胚层表型

过程：

根据基本方案A(对于hESC衍生的和hiPSC衍生的定形内胚层两者)，在前内胚层期(pre-endodermal phase)期间，在不同的时间点用10nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞并保持不同的持续时间，例如在所述方案的第2天至第3天、第2天至第4天、第3天至第4天和第4天至第6天(hESC-DE：无5azadC n＝4、5azadC d2-3 n＝4、d3-4 n＝1、d2-4 n＝1、d4-6 n＝1；hiPSC-DE：无5azadC n＝5、5azadC d2-3 n＝5、d3-4 n＝2、d2-4n＝1、d4-6 n＝1；其中n是各实验的次数)。

为了分析mRNA表达，在所述方案的第7天收获hESC衍生的和hiPSC衍生的DE细胞并使用qRT-PCR分析基因表达，归一化至管家基因CREBBP，并且结果表示为归一化至校准物(calibrator)的相对定量。

结果：

图1A：

与未处理的对照DE相比(图1A1)相比，在第2天至第3天用10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的hESC衍生的DE(图1A2)更同质并且具有更明显的细胞-细胞接触。注意，在对照DE(图1A1)中未分化细胞的存在与对照DE中Oct4 mRNA和Nanog mRNA表达的较高表达一致(比较图1D)。当在第2天至第4天、第3天至第4天和第4天至第6天用100nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞时，获得了类似结果。1nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷具有较小的作用(数据未示出)。

图1B：

与对照DE(图1B1)相比，在第2天至第3天用10nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的HiPSC衍生的DE(图1B2)更汇合并且具有更明显的细胞-细胞接触。当在第2天至第4天、第3天至第4天和第4天至第6天用100nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞时，获得了类似结果。1nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷具有较小的作用(数据未示出)。

图1C：

与未处理的对照相比，在第2天至第3天用10nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的HiPSC衍生的DE在第7天具有少得多的Oct4免疫阳性细胞，即，在用去甲基化剂处理之后，留下较少的未分化细胞并且DE是更加同质的。

图1D：

与在未处理的对照中的表达相比，在第2天至第3天、第3天至第4天、第2天至第4天和第4天至第6天，在用10nM 5azadC处理的hESC衍生的和hiPSC衍生的DE中之干细胞标志物Oct4的表达低得多(图1D1)。在5azadC处理的hESC衍生的DE中，干细胞标志物Nanog的mRNA表达是强烈降低的，而其在hiPSC衍生的DE中保持基本不受影响(图1D1)。与未处理的对照相比，在5azadC处理的hESC衍生的和hiPSC衍生的DE中，DE标志物Sox17、Cxcr4、FoxA2和hHex的表达是上调的，而在hESC衍生的DE中的作用强于在hiPSC衍生的DE中的作用(图1D3至D6)。在对照以及5azadC处理的hESC衍生的和hiPSC衍生的DE两者中，胚胎外标志物Sox7的表达均非常低，除了在第2天至第4天和第4天至第6天的5azadC处理之外，其提高了Sox7mRNA水平。

总之，在hESC衍生的和hiPSC衍生的细胞两者中，在内胚层发育期间用DNA去甲基化剂处理细胞均导致改善的DE形态和DE细胞产量(图1A至1B)。此外，这导致干细胞标志物Oct4更强烈的降低，如通过免疫细胞化学所检测的(图1C)，导致明确的DE标志物SOX17、CXCR4、HEX、Foxa2表达的提高以及胚胎外内胚层标志物Sox7和干细胞标志物Oct4和Nanog的降低(图1D)。因此，技术人员期望产生更同质的定形内胚层细胞群，可在多能干细胞类型分化期间在例如第2天至第3天或第3天至第4天选择一种或更多种DNA去甲基化剂并使用它们。

实施例4：在DE分化期间，通过用DNA去甲基化剂处理从27个hPSC系的组衍生的高度同质定形内胚层

过程：

根据基本方案A或B，在hPS分化成定形内胚层期间，在第2天至第3天用10nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷处理衍生自27个hPSC系的细胞(方案A：ChiPSC14、ChiPSC19、ChiPSC22、P11015、SA167、SA181、SA461和Val9；方案B：ChiPSC4、ChiPSC6b、ChiPSC7、ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10、ChiPSC11、ChiPSC13、ChiPSC15、ChiPSC17、ChiPSC18、ChiPSC19、ChiPSC20、ChiPSC21、ChiPSC23、ChiPSC24、P11012、P11021、P11025和SA121)。

用方案A和B两者测试27个hPSC系中的23个。在这些23个系中，只有4个细胞系(ChiPSC14、ChiPSC23、P11015和P11032)仅可用两个方案之一进行分化。4个hPSC系(ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10和ChiPSC11)仅用方案B测试。

为了分析mRNA表达，在所述方案的第7天收获hESC衍生的和hiPSC衍生的DE细胞并使用qRT-PCR分析基因表达，归一化至管家基因CREBBP，并且结果表示为归一化至校准物的相对定量。

结果：

图2A至2D:

使用基本方案A或B(其包括在hPS分化成定形内胚层期间，在第2天至第3天的DNA去甲基化处理)，可将来自27个不同hPSC系的未分化干细胞分化成高度同质的DE，与未分化的hESC(SA181)和hiPSC(ChiPSC4)相比，其表现出干细胞标志物Oct-4和Nanog的低mRNA表达水平(图2A、2B)和DE标志物Sox17和Cxcr4的高水平(图2C、2D)。

总之，在hPS分化成定形内胚层期间，用DNA去甲基化剂处理细胞使得从测试的所有hPSC系衍生出同质DE，所述DE具有干细胞标志物的低表达水平和DE标志物的高表达水平。同质DE的衍生对于可从测试的所有系获得同质肝细胞培养物的衍生是重要的(数据未示出)。

因此，技术人员期望从任何给定的hPSC系产生同质的定形内胚层细胞群，可包括例如在hPS细胞分化成定形内胚层期间在第2天至第3天用DNA去甲基化剂处理。

实施例5：DNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷和5-氮杂胞苷两者均改善hESC衍生的和hiPSC衍生之DE中的定形内胚层表型

过程：

根据基本方案A(hPSC系P11032和SA181)或B(hPSC系P11012)，在hPS分化成定形内胚层期间，在第2天至第3天用10nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷或者1μΜ5-氮杂胞苷处理衍生自3个不同hPSC系的细胞。

结果：

图3：

A，B)在不用去甲基化剂处理的情况下，3个hPSC系P11032、SA181和P11012产生具有干细胞标志物Oct4和Nanog之相对高mRNA表达的异质DE(图3A、3B)。用DNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5azadC)和5-氮杂胞苷(5azaC)处理显著降低了Oct4和Nanog mRNA(图3A、3B)并且由此使得从这3个hPSC系衍生同质DE群。

C，D)在用10nM 5-氮杂-2-脱氧胞苷或1μΜ5-氮杂胞苷处理后，未观察到DE标志物Sox17和Cxcr4 mRNA表达中的显著改变(图3C、3D)。

总之，用DNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5azadC)和5-氮杂胞苷(5azaC)两者处理使得从hPSC系衍生同质DE，而如果未处理，则产生异质DE。

因此，技术人员期望产生同质定形内胚层细胞群，可在多能干细胞类型分化成定形内胚层期间，例如在第2天至第3天选择一种或更多种DNA去甲基化剂并使用它们。

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Claims

1.用于产生人多能干（hPS）细胞衍生的定形内胚层细胞（DE细胞）的方法，所述方法包括：

在分化条件下培养人多能干细胞以获得所述DE细胞，以及

将分化中的人多能干细胞暴露于核苷类似物型的DNA去甲基化剂，所述DNA去甲基化剂选自5-氮杂-2-脱氧胞苷（地西他滨）、5-氮杂胞苷（阿扎胞苷）及其组合；

其中所述hPS细胞是获得自已建立的hES细胞系的人胚胎干（hES）细胞，或者是人诱导多能干（hiPS）细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是获得自已建立的hES细胞系的人胚胎干（hES）细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是人诱导多能干（hiPS）细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化剂是5-氮杂-2-脱氧胞苷。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化剂是5-氮杂胞苷。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将所述分化中的人多能干细胞暴露于浓度为1 nM至10 μM的所述DNA去甲基化剂。

7.核苷类似物型的DNA去甲基化剂在从人多能干细胞产生定形内胚层细胞中的用途，所述DNA去甲基化剂选自5-氮杂-2-脱氧胞苷（地西他滨）、5-氮杂胞苷（阿扎胞苷）及其组合；其中所述hPS细胞是获得自已建立的hES细胞系的人胚胎干（hES）细胞，或者是人诱导多能干（hiPS）细胞。

8.用于从人多能干细胞产生定形内胚层细胞的组合物，其包含1 nM至1 μM的至少一种核苷类似物型的DNA去甲基化剂以及激活素，所述DNA去甲基化剂选自5-氮杂-2-脱氧胞苷（地西他滨）、5-氮杂胞苷（阿扎胞苷）及其组合。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述DNA去甲基化剂是5-氮杂-2-脱氧胞苷（地西他滨）。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述DNA去甲基化剂是5-氮杂胞苷（阿扎胞苷）。

11.根据权利要求8所述的组合物，其中所述核苷类似物型的DNA去甲基化剂的浓度为1nM至500 nM。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中所述核苷类似物型的DNA去甲基化剂的浓度为1nM至100 nM。

13.根据权利要求8所述的组合物，其中所述核苷类似物型的DNA去甲基化剂的浓度为5nM至50 nM。

14.根据权利要求8所述的组合物，其中所述核苷类似物型的DNA去甲基化剂的浓度为5nM至15 nM。

15.根据权利要求8所述的组合物，其中所述核苷类似物型的DNA去甲基化剂的浓度为7.5 nM至12.5 nM。