CN105873621A - 图案化的膜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于改善伤口愈合的包括纳米纤丝多糖的图案化的膜、装置和组合物，以及它们的制造和治疗用途。

Description

图案化的膜

技术领域

本发明涉及纳米纤维素技术和生物医学的领域。具体地，本发明涉及包括纳米纤丝多糖的新型图案化的膜、它们的制造方法以及它们在各种应用诸如在伤口治疗中的使用。

背景技术

皮肤伤口的治疗，特别是严重的伤口和烧伤的治疗往往是困难的。皮肤的伤口愈合包括一系列细胞和分子过程，这些细胞和分子过程用于修复受损组织并重建皮肤的屏障功能。在损伤之后，最初反应是形成防止失血和感染的纤维蛋白凝块。所释放的纤维蛋白和趋化因子吸引用于防止感染的嗜中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞，分别形成新的血管并合成胞外基质。随后，凝块屏障由迁移的角质细胞替代，迁移的角质细胞修复伤口表面并重构新的功能上皮。

愈合过程在损伤之后大约24小时开始并且持续到伤口恢复。一旦建立新的上皮，在伤口区域中的血管密度就降低并且真皮的重塑持续几个月的时间。在像严重烧伤或高温热液损伤一类的严重损伤情况下，皮肤可受损以至于其不能够修复伤口，并且有时患者不能存活。在一些其他情况下，正常的伤口愈合过程可失效并且陷入持续的炎症状态。如果患者已经得了损害正常愈合过程的慢性疾病诸如糖尿病，则此类问题经常出现。

在成年哺乳动物中的愈合过程的重要组成部分是成纤维细胞的刺激以产生胞外基质。胞外基质包含发育以修复伤口区域的结缔组织的主要成分。然而，修复过程并不是完美的，并且结缔组织通常是纤维状的且经常形成结缔组织疤痕(纤维变性)。疤痕由结缔组织组成，结缔组织主要为1型胶原蛋白和3型胶原蛋白以及纤连蛋白的基质。疤痕可由处于异常组织的胶原纤维组成(如在皮肤的疤痕中所见)，或者它可以是结缔组织的异常累积(如在中枢神经系统的疤痕中所见)。大多数疤痕由异常组织的胶原蛋白和过量的胶原蛋白组成。

与伤口愈合相关的另一个困难是收缩，收缩通常被认为是伤口愈合的自然且基本的因素。然而，在许多情况下，在导致收缩诱导的纤维变性的愈合过程期间可观察到过度且不受控制的伤口收缩，这可导致例如关节或肢体的缺陷和受损的移动性。

在现有技术中已经提出各种试剂、伤口敷料和复合材料来改善皮肤伤口愈合并防止发炎、纤维变性和结疤。伤口敷料和软膏纱布通常用作针对到达真皮上层的皮肤缺陷诸如表面真皮烧伤的疗法。当皮肤缺陷到达真皮的下层时，诸如深度真皮烧伤、至少二级的真皮烧伤或褥疮，皮肤组织通过表皮细胞增殖进行自我重构成为问题。通常通过清创脱落组织或异常肉芽组织，通过利用同种异体皮肤、异种皮肤、人造硅皮肤、皮肤替代产品、伤口敷料等覆盖缺陷重构正常肉芽组织，并且然后通过执行自体分裂厚度皮肤移植(STSG)或利用整体皮肤移植重构皮肤来治疗这些缺陷。

虽然上面的考虑主要适用于人的伤口愈合和炎症，但是将意识到的是，相同的问题也可发生在动物身上，特别是兽类动物或家养动物(例如，马、牛、狗、猫等)。

WO01/03750公开了包括人胞外基质与框架的材料，其中间质细胞可附着到框架。

EP06742940公开了利用脂肪组织衍生的基质干细胞对伤口诸如瘘的治疗。利用注射器将分离的细胞递送到治疗部位。

用于在纳米纤丝纤维素上形成微观尺度纹理的方法已经使用静电纺丝纤维素支架和激光烧蚀来制作扁平的纤维素膜，该纤维素膜在原本光滑的膜中具有规则排列的孔(Rodriguez K.等人，具有受控微架构的静电纺丝纤维素支架(Electrospun nanofibrous cellulose scaffolds with controlled microarchitecture)，碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)，2013)。

Jones、Currie以及Martin以他们的观点报道了用于伤口愈合的几个系统(生物皮肤替代物指南(A guideto biologicalskin substitutes)，英国整形外科杂志(British Journal of Plastic Surgery)(2002)，55，185-193)，其中一个为激光皮肤，一种由酯化透明质酸的激光穿孔衍生物形成的倒置式膜递送系统，其中角化细胞在体外接种到该系统上以填充激光钻孔而成的孔。然后，细胞群落生长在膜的上方和下方。该系统已经用于白癜风的治疗以及用于使Integra重构表面。

发明内容

尽管在本领域中有一些进展，但仍需在伤口部位上提供治疗性细胞的受控且容易的递送，以在伤口愈合和组织修复期间实现增强的伤口愈合和炎症的预防。

本发明的目的是提供一种包括纳米纤丝多糖的新型图案化的膜用于医学应用。

本发明的另一个目的是提供新型组合物、装置和方法，用于在皮肤伤口愈合期间防止炎症或至少部分改善炎症。

本发明的另一个目的是开发一种治疗皮肤伤口的装置。优选地，该装置为生物医学装置。

发明人已经惊奇地开发出一种新型方法来制造包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的图案化的膜，所述图案化的膜具有微观尺度形貌并且在膜的至少一侧上包括凹部和/或凸部。本发明的膜作为包括本发明的膜和干细胞的装置中的组分令人惊奇地有用。所示的所述装置在伤口愈合和组织修复期间显著地增强伤口愈合并且预防炎症。

发现微观图案对制造用于伤口治疗的装置特别有用。通过使用本发明的图案化的膜，治疗性细胞可均匀地散步在膜的图案化结构上并且运输到伤口部位，其中处于存活状态的细胞从膜中分离。当应用到伤口治疗部位时，该装置显著地增强伤口愈合。

包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的本发明的图案化的膜可通过包括以下步骤的方法进行制造：

a.在图案化过滤器上提供纳米纤丝多糖分散体，所述图案化过滤器具有包括凹部和/或凸部的微观尺度形貌。

b.通过改变穿过图案化过滤器的压力的作用将液体从纳米纤丝多糖分散体中排出而增加多糖分散体的干物质含量，所述图案化过滤器基本上不能透过纳米纤丝多糖的纤丝但能透过液体，从而在图案化过滤器上形成膜片，

c.任选地干燥膜，同时继续从纳米纤丝多糖分散体中去除液体，以及

d.任选地从图案化过滤器中去除膜；

由此获得包括纳米纤丝多糖的膜，所述膜具有与带有微观尺度凹部和/或凸部的图案化过滤器相比处于相反布置的微观尺度凹部和/或凸部。

此外，本发明的膜可通过一种方法制造，其中所述膜包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖，并且在膜的至少一侧上具有包括微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域，所述方法包括提供纳米纤丝多糖分散体的步骤；以及选自由以下各项组成的组的步骤：

a.将纳米纤丝多糖分散体浇铸在包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域的浇铸支撑件上，干燥并且去除成形的膜，所述成形的膜与浇铸支撑件相比包括具有处于相反布置的微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域；以及

b.在膜中形成纳米纤丝多糖分散体，蚀刻所述膜的至少一个区域以提供包括微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域。

包括纳米纤丝多糖的本发明的图案化的膜可用作装置中的组分，诸如在生物医学装置中。该装置包括细胞和膜，所述膜包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖，膜的至少一侧包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域。具体地，该装置包括在治疗上有用的细胞，包括纳米纤丝多糖的图案化的膜和水介质。

本发明的膜可用于治疗，用于伤口的治疗，优选地用于皮肤伤口或皮肤烧伤的治疗，用于在从真皮组织损伤恢复期间预防炎症、免疫排斥和/或疤痕的形成。

该装置通过以下步骤进行制造：提供细胞，优选地提供在治疗上有用的细胞；吸收图案化的膜，所述膜包括纳米纤丝多糖并且具有包括带水介质的凹部和/或凸部的微观尺度形貌；将细胞转移到膜上；以及在允许细胞附着在膜上并且维持或者未分化生长或分化生长的条件下培养细胞。当制造生物医学装置时，在治疗上有用的细胞散布在图案化的膜上，使得细胞可沉淀在包括凹部和/或凸部的图案化表面上，或者甚至沉底在膜上的凹部内。

所述装置通过以下步骤进行制造：提供细胞，优选地提供在治疗上有用的细胞；吸收包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜，所述膜的至少一侧包括具有带水介质的微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域；将细胞转移到膜上；以及在允许细胞附着在膜上并且允许细胞的维持或未分化生长或分化生长的条件下孵育细胞。

原核细胞的典型尺寸为大约1μm至5μm，而真核细胞的典型尺寸为大约10μm至100μm。包括以连续结构进行布置的纳米纤丝多糖和图案化区域的膜特别适用于容纳细胞和有利于细胞的粘附、增殖和对准，其中图案化区域包括微观尺度的凹部和/或凸部。包括纳米纤丝多糖和微观尺度凹部和/或凸部的膜能够使例如在治疗上有用的细胞最佳地附着到膜，从而有利于细胞实际递送到治疗部位，而不会将细胞过紧结合，以有利于细胞与部位之间完全接触，并且甚至有利于细胞在必要时与部位脱离。如果仅使用纳米尺度或宏观尺度图案，即，在不存在微观尺度凹部和/或凸部的情况下，则不会提供必要的微环境。纳米纤丝多糖也可提供与细胞受体而非整个细胞相同的尺寸尺度的纳米尺度形貌。纳米纤丝多糖也为膜提供优异的吸水性，从而有利于水培养基和任何附加试剂的结合，以有益于细胞递送和部位的治疗。微观尺度形貌有利于保持膜的表面湿润。其中凹部并未延伸通过膜的整个厚度的膜具有附加效果，即，当在装置中使用时，细胞基本上停留在表面上并且因此更多细胞可与治疗部位接触并且转移到治疗部位。通孔也可降低膜的机械性能，诸如撕裂强度。

根据本发明实施例的膜可用于一种装置，所述装置用于治疗、用于伤口的治疗、用于皮肤伤口或皮肤烧伤的治疗，或者在从真皮组织损伤恢复期间用于预防炎症、免疫排斥和/或疤痕的形成。

本发明的其他方面进一步涉及本发明的图案化的膜和/或本发明的装置在组织工程学、微流体学和微电子学中的使用。

本发明的其他方面进一步试剂盒，所述试剂盒包括本发明的图案化的膜，任选地包括水介质以及用于组织工程学、微流体学和微电子学的使用说明

在另一方面，本发明涉及通过将具有治疗性细胞的本发明的图案化的膜应用在伤口治疗部位诸如具有皮肤伤口的患者的伤口部位上来治疗伤口的方法。

附图说明

图1示出根据一个实施例的制造图案化的膜的方法。

图2示出根据另一个实施例的制造图案化的膜的方法。

图3示出根据制造图案化的膜的方法的第二实施例的按压步骤。

图4示出根据制造图案化的膜的方法的第三实施例的干燥步骤。

图5示出用1μm过滤布制作的微图案化NFC膜的SEM图像。放大倍率：×100，A；×400B和×1200C。在生产中使用的滤布(×400，D)。

图6示出用10μm过滤布制作的微图案化NFC膜的SEM图像。放大倍率：×100，A；×400B和×1200C。在生产中使用的滤布(×400，D)。

图7示出10μm过滤布(A)的SEM图像和对应的NFC膜(B)的部分重叠的倒转SEM图像。

图8示出具有不同倾角的用1μm过滤布制作的NFC膜的SEM图像。倾角0°，×100A；倾角0°，×300B；倾角45°，×100C；倾角45°，×200D。

图9示出在细胞递送到用于治疗的伤口之前用于分离和制备细胞的整体方案。

图10示出扫描电子显微照片，其显示表面图案结构和hASC细胞上的差异。700×放大倍率。

(A)示出试图附着在表面上的hASC的膜的光滑侧。参见形成球状体的细胞形态。

(B)图案化的膜的粗糙侧。单层hASC在纳米纤维素膜上生长的详细视图。

图11示出在不同涂层条件下在塑料(A-C)和在纳米纤维素膜(D-F)上培养的hASC细胞的透射电子显微镜检查。

A-C.在塑料上培养的细胞显示出hASC的典型的成纤维细胞样形态。细胞核受压缩并且我们可看到脂滴在细胞质中偏心。这些表明，在培养一周之后，细胞中的一些已经开始分化。直接接种在NFC膜上的细胞显示出与在塑料上生长的细胞相似的特征。细胞核越来越呈椭圆形并且线粒体显示出正常的嵴。E.细胞显示出细长的细胞核以及轮廓分明的线粒体。F.在涂层一开始具有细胞的情况下，细胞并不呈现任何细胞核变化。在细胞质层面，可在培养中观察到增加量的脂滴。

图12呈现出琼脂糖凝胶电泳，其示出来自QRT_PCR的未分化间叶细胞标记的结果。在不同条件下在NFC膜上培养1天、3天和7天后，hASC细胞在与塑料上培养的其对应物相同的层面中持续表达间叶细胞未分化标记。

图13呈现出X光曝光胶片-其示出在纳米纤维素膜和塑料上使用不同涂层培养的hASC细胞之间的细胞因子表达方面的差异。

图14示出在进行纳米纤维素膜和细胞治疗之后的5天对对照动物和治疗动物的病理学研究。

(A).未治疗的损伤。该损伤呈现创伤区域。在边界处的粉红色线是纤维蛋白线。该纤维蛋白合成是损伤后伤口愈合反应的第一信号的特征。在表皮中检测到许多炎症细胞。这表明，损伤处于伤口愈合恢复的初始步骤中。在更深部分中(表皮和初始真皮之下)，检测到嵌入有许多纤维原细胞的胞外基质，这意味着伤口处于恢复的未成熟期(在初始阶段)。

(B).良好地恢复且成熟的表皮。真皮更不成熟并且有水肿和炎症细胞的迹象。在治疗细胞中伤口愈合更快，尤其是在表面中并且与细胞适当接触的层中。需要跟进真皮在该过程中的演变。毛囊发育和组织良好。真皮正在重构中并且肌肉还未进行良好组织。

具体实施方式

除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所使用的术语通常用于细胞培养或纳米纤维素技术领域中的含义。具体地，以下术语具有如下所示的含义。

如本文所用，术语“多糖”理解为涵盖由配糖键结合起来的重复性单体单元的长的线性或支链碳水化合物分子，以及由配糖键结合起来的单糖链组成的复合碳水化合物。根据本发明实施例的多糖的非限制性示例为纤维素、半纤维素、壳多糖、壳聚糖、藻朊酸盐、果胶、阿拉伯糖基木聚糖、纳米纤丝纤维素或它们的衍生物。

术语“纳米纤丝”是指从多糖原料中分离出的现有子结构。在此，纳米纤丝并非是指通过破坏多糖原料的子结构而获得的结构，例如，通过溶解并且然后产生新结构，诸如，静电纺丝多糖。因此，术语“纳米纤丝多糖”是指多糖纳米纤丝或纳米纤丝束的集合。作为非限制性示例，术语“纳米纤丝多糖”包括“纳米纤丝纤维素”或“NFC”，“纳米纤丝纤维素”或“NFC”是指所有微纤化纤维素(MFC)和纳米纤维素。进一步地，NFC具有多个其他广泛使用的同义词，例如，纤丝纤维素、纤维素纳米纤维、纳米原纤化纤维素(CNF)、纳米尺度原纤化纤维素、微纤丝纤维素或纤维素微纤丝。

纳米纤丝纤维素包括分离的纤维素微纤丝或源自纤维素原料的微纤丝束。纳米纤丝纤维素基于自然中尤其是植物中和某些细菌中丰富的天然多糖聚合物。

纳米纤丝纤维素的生产技术基于通过研磨进行的机械处理或者纸浆纤维的水分散体的均化。纳米纤丝纤维素在分散体中的浓度通常非常低，经常大约为1w％至5w％。在研磨或者均化过程之后，所获得的纳米纤丝纤维素材料为稀释的粘弹性水凝胶。

由于水通过许多个氢键结合到纤丝，所以纳米纤丝纤维素通常具有强保水性。因此，要达到膜的典型干物质含量需要长的干燥时间和有效的水去除。常规方法诸如真空过滤可花费数小时来获得干燥产物。纤维多糖分散体的低稠度有利于在膜的表面上形成克重变化较小的薄膜。另一方面，这将增加在干燥期间必须去除的水的量。

在一些纳米纤丝纤维素等级的情况下，诸如含阴离子基团的纳米纤丝纤维素(带阴离子电荷的纳米纤丝纤维素)，较高的粘度是导致较长脱水时间的额外问题。此类带阴离子电荷的纳米纤丝化纤维素可以为例如化学改性纤维素，化学改性纤维素包含由于改性而产生的羧基。通过N-氧基介导的催化氧化(例如，通过2,2,6,6-四甲基-1-哌啶-N-氧化物)得到的纤维素或羧甲基纤维素为带阴离子电荷的纳米纤丝纤维素的示例，其中阴离子电荷应归于解离的羧酸部分。

术语“连续布置”是指结构或布置，其中纳米纤丝多糖作为连续结构存在于膜中。换言之，纳米纤丝多糖沿整个膜布置。

术语“水介质”是指选自包括以下项的组：水、无菌水、纯净水、生理盐水、生理缓冲液、培养基、营养剂和/或生物活性剂，以及它们的组合。水介质可以为适用于细胞或组织的保持、运输、分离、培养、繁殖、传代或分化的任何水介质，诸如水、去离子水、缓冲溶液或营养培养基。

术语“互连的”或“互连”是指一种布置，其中包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜可包括作为连续互连单元的具有微观尺度的凹部和/或凸部的图案化区域。换言之，微观尺度的凹部和/或凸部彼此接触。所述接触可以为凹部和/或凸部之间的直接连接，或者它们可松散地连接。在本发明的一个方面，图案化区域可包括使用公共壁互连的重复图案单元。

术语“微观尺度的凹部和/或凸部”是指具有凹部和/或凸部的形貌，其中凹部不延伸穿过膜的整个厚度。微观尺度的凹部和/或凸部提供了典型细胞尺寸尺度的形貌，从而促进细胞的粘附、增殖和对齐。微观尺度形貌有利于保持膜表面的湿润。微观尺度的凹部和/或凸部提供必要的微环境，如果单独使用纳米尺度或宏观尺度的图案，即，在不存在微观尺度的凹部和/或凸部的情况下，则无法提供所述微环境。

为获得纳米纤丝纤维素，利用合适的设备诸如精磨机、研磨机、均化器、胶化器、摩擦研磨机、超声仪、流化器诸如微观流化器、宏观流化器或流化器类型的均化器进行纤维素纸浆或氧化纤维素原料的机械分解。优选地，使用机械分解获得纤丝纤维素。

已经使用各种生产技术开发出几种不同等级的纳米纤丝纤维素。根据制造方法、原纤化程度和化学组合物，各等级具有不同的性质。各等级的化学组合物也有所改变。根据原料来源，例如，HW浆对比SW浆，在最终的纤维素纳米纤丝产品中存在不同的多糖组合物。通常，非离子等级或天然等级具有更宽的纤丝直径，而化学改性等级则薄得多并且具有连续的网络。纤维素纳米纤丝的数均纤丝直径适当地为从1nm至200nm，优选地，天然等级的数均纤丝直径为从1nm至100nm，而化学改性等级的数均纤丝直径为从1nm至20nm。改性等级的尺寸分布也较窄。天然离子交换的纤维素纳米纤丝表现出部分非均匀的不连续结构。在本发明的实施例中，纳米纤丝纤维素优选地无毒且无菌。

纳米纤丝纤维素的衍生物可以为适用于本发明(例如，在细胞培养和伤口治疗中)的纤维素的任何化学或物理改性衍生物。化学改性可基于例如纤维素分子羧甲基化、氧化、酯化或醚化反应。改性也可通过在纤维素表面上物理吸附阴离子、阳离子，或非离子化物质或者上述这些的任意组合来实现。所述改性可在生产纳米纤丝纤维素之前、之后或期间进行。某些改性可导致在人体内可降解的材料。

根据本发明实施例的纳米纤丝纤维素和纤维素膜可使用增强伤口愈合、防止结疤或者改善受伤区域血管化的试剂进行合成或补充。

化学衍生过程中的饱和度可有很大变化。例如，通常进行TEMPO或N-氧基介导的氧化以将数值从300micromol/g增加到1500micromol/g，优选地为从600micromol/g增加到1200micromol/g，最优选地为从700micromol/g增加到1100micromol/g。氧化NFC也可包含醛官能团，通常在0micromol/g到250micromol/g之间。通常在原纤化之前经由羧甲基化将纤维素纸浆衍生至在0.05至0.3之间，优选地在0.08至0.25之间，最优选地在0.10至0.2之间的ds水平。如果通过阳离子化进行衍生，则ds水平通常在0.05至0.4之间，优选地在0.15至0.3之间。

膜的起始材料

用作起始材料的纳米纤丝多糖包括任何合适的多糖，优选地为植物源纳米纤丝纤维素，其中图案化的膜由纳米纤丝多糖制成。优选地，纳米纤丝纤维素至少部分地由纳米纤丝纤维素、半纤维素、壳多糖、壳聚糖、藻朊酸盐、果胶、阿拉伯糖基木聚糖、纳米纤丝纤维素或它们的衍生物组成，最优选地，纳米纤丝纤维素为植物源纳米纤丝纤维素。

在一个实施例中，纳米纤丝多糖包括纤丝直径在亚微米范围内的纳米纤丝纤维素。具有此纤丝直径的纳米纤丝纤维素即使在低浓度下仍形成自组装水凝胶网络。这些凝胶具有高剪切稀化和触变的性质。

在一个实施例中，纳米纤丝多糖为具有1型晶体结构的天然或未氧化纤维素，或者至少部分地具有1型晶体结构的羧甲基纤维素。

在另一个实施例中，纳米纤丝多糖包括磨碎的微纤丝细菌纤维素。

纳米纤丝多糖可由植物衍生的纤维素原料制备。原料可基于包含纤维素的任何植物材料。植物材料可以为木材。木材可来自于软木树诸如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或者来自于硬木树诸如桦树、山杨、白杨、桤木、桉树或金合欢树，或者来自软木和硬木的混合物。非木质材料可来自于农业废弃物、草或其他植物物质，诸如来自棉花、谷物、小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、亚麻、大麻、马尼拉麻、剑麻、黄麻、苎麻、红麻、甘蔗渣、竹或芦苇的秸秆、叶子、茎皮、种子、外壳、花、蔬菜或果实。纤维素原料还可衍生自生产纤维素的微生物。

术语“纳米纤丝多糖”和“纤丝纤维素”是指衍生自例如纤维素原料的分离微纤丝或微纤丝束的集合。微纤丝通常具有高长径比：长度可超过1μm，而数均直径通常小于200nm。微纤丝束的直径也可较大但通常小于1μm。最小的微纤丝类似于所谓的原纤丝，其直径通常为2nm至12nm。纤丝或纤丝束的尺寸取决于原料和分解方法。纳米纤丝纤维素还可包含一些半纤维素；量取决于植物源。来自于纤维素原料、纤维素纸浆或精炼纸浆的纳米纤丝纤维素的机械分解使用合适的设备进行，诸如精磨机、研磨机、均化器、胶化器、摩擦研磨机、超声仪和流化器诸如微观流化器、宏观流化器或流化器类型的均化器。

纳米纤丝多糖或纳米纤丝纤维素优选地由植物材料制成。一种替代方案是从非实质植物材料中获得纤丝，其中纤丝从次生细胞壁中获得。纤维素纤丝的一个丰富来源是木质纤维。纳米原纤化纤维素由均质木源纤维原料制成，均质木源纤维原料可以为化学纸浆。在上述设备中的一些中进行的分解产生直径仅为几纳米的纤丝，所述纤丝直径至多为50nm，并且在水中得到纤丝的分散体。纤丝可减小到大部分纤丝的直径仅在2nm至20nm范围内的尺寸。源自次生细胞壁的纤丝基本上为结晶度至少为55％的结晶体。

用于本发明实施例中的图案化的膜制备的起始材料通常为纳米纤丝纤维素，纳米纤丝纤维素直接从上述纤维原料中的一些的分解中获得，并且由于分解条件而以均匀地分布于水中的相对低的浓度存在。起始材料可为浓度为0.05w％至5w％的水凝胶。因此，这种类型的凝胶含有大量要去除的水，使得形成膜主体并导致膜的结构完整性和强度性质的纤维素纤丝网络被留下。该网络也可包含最初分散于水凝胶中的其他固体，但是纤维素纤丝为膜的主要成分。

纳米纤丝多糖可包括由所述纳米纤丝形成的分离纳米纤丝和/或纳米纤丝束。最小的纳米纤丝类似于所谓的原纤丝，其直径通常为2nm至12nm。纳米纤丝或纳米纤丝束的尺寸取决于原料和分解方法。

纳米纤丝多糖或纳米纤丝多糖束的数均直径的范围可在1nm至500nm之间，根据一个合适的实施例其可在2nm至200nm之间，根据另一个合适的实施例其可在2nm至100nm之间，并且根据进一步合适的实施例其可在2nm至20nm之间。

天然的或非衍生的纳米纤丝纤维素的数均直径在2nm至500nm之间变化，优选地在7nm至100nm之间变化，而最优选地在7nm至50nm之间变化。通过Cryo-TEM图像以及束结构可看出：天然等级通常为7nm原纤丝和20nm至50nm纤丝束的混合物。衍生的NFC通常较薄，其中数均直径在2nm至200nm之间变化，优选地在2nm至20nm之间变化，最优选地在2nm至6nm之间变化。

准确地测量纳米纤丝纤维素的长度有些挑战性，但是天然等级长度的粗略估计在1μm至100μm之间，优选地在1μm至50μm之间，最优选地在5μm至20μm之间。衍生的NFC有些较短；长度在0.3μm至50μm之间变化，优选地在0.3μm至20μm之间变化，最优选地在0.5μm至10μm之间变化。这些值由CRYO-TEM图像、SEM图像或AFM图像进行估计。最准确的估计基于Cryo-TEM图像。

原纤化程度可由纤维分析进行估计，其中估计较大的、部分原纤化的实体的数量。例如，在衍生的纳米纤丝纤维素的情况下，每毫克干样品的那些颗粒的数量从0至10000变化，优选地在0至5000之间变化，最优选地在0至1000之间变化。然而，在非衍生的NFC中，每毫克非原纤化颗粒的数量通常稍微较高，其在0至20000之间变化，优选地在0至10000之间变化，最优选地在0至5000之间变化。可使用如下所述的FiberLab方法进行纤维分析。

纤维分析–FiberLab方法描述

可使用商业纤维分析器，并且合适的装置为例如纤维分析器Kajaani FiberLab或FS-300。样品制备和测量依照指示进行，用于典型的纤维粗度测量，其中例外情况如下：通过称量最低8g的样品质量用于干物质含量确定、进行加热直到重量恒定来确定干物质含量(DMC)。

如下进行样品稀释：待稀释到5升水的容器中的样品的量：

8g，如果DMC为大约2％；

16g，如果DMC为大约1％。

应用纸浆混合器直到所有可见纤丝束都已经消失。

禁用块体去除功能。

从5升的容器中取50ml的样品进行测量。基于测量计算“每毫克纤维”：

FPM＝ADF/(Mw*DMC/100*Vp/Vv)，其中

FPM＝每毫克纤维[pcs/mg]

ADF＝检测到的纤维的量[pcs]

*这是所检测到的颗粒的数量

Mw＝待稀释到5升水的容器中的样品的量[mg]

DMC＝未稀释样品的干物质含量[％]

Vp＝用于分析器的移液量

Vv＝稀释容器的体积

纳米纤丝多糖水凝胶的硬度可由凝胶的粘弹性测量进行估计。通常，在25℃下，pH值为7的纯水中的0.5％(按重量计)纳米纤丝纤维素水凝胶的存储模量在1Pa至50Pa之间，优选地在3Pa至20Pa之间。通常，衍生的NFC建立较硬的水凝胶，但是这些等级的大量原纤化也可导致较低的存储模量。

纳米纤丝多糖水凝胶的流变性质也可通过根据剪切应力或剪切速率监测粘度进行估计。纳米纤丝多糖水凝胶显示出塑性行为，这意味着在材料开始容易地流动之前，需要一定的剪切应力(力)。该临界剪切应力通常被称为屈服应力。屈服应力可由使用应力控制流变仪进行测量的稳态流动曲线进行确定。当作为所施加的剪切应力的函数绘出粘度时，在超过临界剪切应力后可看到粘度急剧下降。在0.5wt％浓度的水中，零剪切粘度值通常在1000Pa s至100 000Pa s之间变化，优选地在5000Pa s至50000Pa s之间变化。对于非衍生的NFC而言，优选的范围在1000Pa s至10 000Pa s之间。在0.5wt％浓度的水中，屈服应力通常在1Pa s至50Pa s之间变化，优选地在2Pa s至15Pa s之间变化。纳米纤丝壳多糖和壳聚糖水凝胶的粘弹性性质类似于具有纤维素纳米纤维水凝胶的情况。

NFC水凝胶的流变测量适于使用配备有四叶叶片几何结构机构的应力控制旋转流变仪(AR-G2，TA仪器，英国)在pH值为7的情况下在室温下进行。圆柱形样品杯和叶片的直径分别为30mm和28mm。叶片的长度为42mm。水凝胶的粘弹性性质通过流变仪的动态振荡模式中的频率扫描和时间扫描在0.1wt％的应变率下进行确定。所有样品在测量前适于通过Waring搅拌器进行混合(3*10s)。

根据本发明一个实施例的纳米纤丝多糖膜的微生物纯度对细胞培养和医学应用是必不可少的。因此，可在细胞培养或医学用途之前对图案化的膜进行消毒。除此之外，重要的是在原纤化之前和期间使产品的微生物污染最小化。在原纤化之前，有利的是在漂白阶段后纸浆仍然无菌时立即从纸浆厂无菌地收集纤维素纸浆。抗微生物剂可具有根据本发明的纳米纤丝多糖，以防止微生物生长。

液体去除和图案形成

包括纳米纤丝多糖的本发明的图案化的膜可通过同时从分散体去除液体并且形成图案化表面的方法来制造，并且所述方法包括以下步骤：

a.在图案化过滤器上提供纳米纤丝化多糖分散体，所述图案化过滤器具有包括凹部和/或凸部的微观尺度形貌；

b.通过减小穿过图案化过滤器的压力的作用将液体从纳米纤丝多糖分散体中排出，所述图案化过滤器不能透过纳米纤丝多糖的纤丝但能透过液体，从而在图案化过滤器上形成膜网；

c.任选地，在膜网的相对侧施加热量，同时继续经由图案化过滤器上的压差通过图案化过滤器排出液体；以及

d.任选地，从图案化过滤器上去除膜网，作为独立的纳米纤丝多糖膜，或者可选地，将过滤层作为膜产品的组成层保留在膜中，所述膜产品包括过滤层和纳米纤丝多糖膜；

由此获得包括纳米纤丝多糖的膜，所述膜具有微观尺度的形貌，所述形貌包括处于与图案化过滤器的微观尺度形貌相反布置中的凹部和/或凸部。在上述方法中，通过将水从分散体中去除直到膜几乎干燥来实现图案形成，由此水-纤丝键被形成聚合结构的纤丝-纤丝键取代，所述聚合结构足够强韧，从而即使在润湿干燥的图案化的膜时仍然保持基本不变。聚合效应对天然纳米纤丝纤维素来说尤其显著。优选的是纤丝不可逆地聚集成大聚集物，即角质化。角质化可在微纤丝多糖的水悬浮液的干燥过程期间发生。其可由相邻纳米纤丝的羟基之间形成的大量氢键进行说明。

任选的加热步骤c可用于增强水从分散体中的去除，但其对于形成图案来说不是必需的。在步骤c中，可通过与加热表面直接接触(传导)或者通过照射膜片的表面(辐射热)，或者它们的组合向通过排水而形成的膜片的相对侧施加热量。在施加热量的同时，水通过图案化过滤器的相对侧上存在的压差排出。这可通过减压、增压，或者通过使用加热表面机械地按压膜片的来实现。

在本发明的一方面，通过将纳米纤丝多糖膜与任选地涂覆有非粘合层的加热表面接触来施加热量。

可向形成的膜片施加热量以将其温度升高到低于液体沸点的范围，从而促进液体状态的液体的去除。

当压差通过使用加热表面抵靠图案化过滤器按压膜片来实现时，可通过抵靠图案化过滤器的自由侧放置一个吸收片以吸收排出液体来增强液体自膜片的最终排出。合适的吸收剂的示例包括吸收性纸浆片、吸水纸与干毛毡。此类吸收片可放置在抵靠图案化过滤器的自由侧的层中。此类吸收片或多个吸收片通过吸收从图案化的膜中去除液体，所述膜包括形成的纳米纤丝纤维素片。

在本发明的一方面，加热表面和/或非粘合剂层是图案化的，并且在加热表面经按压与膜直接接触时，图案的反图像转移到膜的面向加热表面的一侧。

在一方面，热量通过在加热表面与纳米纤丝多糖膜之间的任选的图案化的层诸如纳米纤丝多糖膜将要层压到其上的图案化过滤器或结构层，从加热表面施加到纳米纤丝多糖膜。

在一方面，纳米纤丝多糖分散体作为连续层设置在移动的图案化过滤器上，并且通过不同处理步骤转移在移动的图案化过滤器上的连续层而产生连续图案化的膜，并且图案化的膜与图案化过滤器分离。

某些等级的纳米纤丝多糖由于它们的保水能力而特别难以干燥，并且干燥所花费的时间可比正常的“天然”等级长的多。含有阴离子基团的纳米纤丝纤维素为特别难以干燥的纳米纤丝多糖分散体的示例。通过N-氧基介导的催化氧化(例如，通过2,2,6,6-四甲基-1-哌啶-N-氧化物)获得的纤维素或者羧甲基纤维素为阴离子纳米纤丝纤维素的具体示例，其中阴离子电荷应归于解离的羧酸部分。因为高质量的纳米纤丝多糖分散体容易由化学改性纸浆制成，所以这些阴离子纳米纤丝纤维素等级为潜在的制备膜的起始原料。为增强包括纳米纤丝阴离子纤维素的膜的干燥，可通过降低分散体的pH对所述纤维素进行预处理。在一方面，可通过添加合适的酸降低pH。这种预处理降低了阴离子纤维素的保水能力。在一方面，通过将纳米纤丝多糖分散体的pH降至3pH单位以下，可以减少使用上述方法进行干燥的时间。在制备医学用途的图案化的膜的情况下，适当地使用在治疗上相容的酸。

长度的高长径比有利于将纳米纤丝保留在过滤织物上。然而，如果多糖纳米纤丝的尺寸非常小，则它们可与待去除的液体一起流过过滤织物，即使使用最小可能孔径的过滤织物。根据本发明的一方面，通过在过滤织物上提供第一纤维状多糖分散体层并且通过过滤织物排出液体形成纤丝网络来防止多糖纳米纤丝流过过滤织物，所述纤丝网络不能透过第一纤维状多糖分散体的纤丝。此纤维网络作为随后涂敷的第二纤丝多糖分散体的附加过滤器，其中第二纤维素分散体中的纤丝尺寸小于第一纤维状多糖分散体中的纤丝尺寸。在涂敷第二纳米纤丝多糖分散体后，与在上面一个步骤中涂敷的纤维状多糖分散体一样进行排水操作。

选择第二纤维状多糖分散体的纤丝尺寸，使得与过滤织物的孔径相比，它们可与从分散体中排出的液体(滤液)一起穿透织物。第二纳米纤丝多糖分散体的数量可大于第一纳米纤丝多糖分散体的数量，并且因此，它可构成干燥的膜的重量的绝大部分。

适于使用与纤丝尺寸有关的孔径足够小的图案化过滤织物，以确保有效地过滤来自纳米纤丝多糖的渗透物，而不允许纳米纤丝多糖通过过滤布大量转移。过滤织物孔径适当地在微米范围内。通常网孔/孔隙率为从0.1μm至50μm，优选地为从1μm至10μm。过滤布的丝径为1μm至200μm，优选地为10μm至100μm。过滤织物可由优选地不粘附到过滤后的纳米纤丝多糖膜片的材料制成，诸如塑料和其他合成聚合物诸如PET、聚酰胺和氟聚合物。合适织物的另一个非限制性示例为具有各种孔径尺寸的密织聚酰胺-6,6织物，孔径尺寸可根据所选择的纳米纤丝纤维素的粒度进行选择。

过滤织物的表面可进行改性，使得其在膜的制造过程期间在纳米纤丝多糖膜的表面上产生所选择的图案。

用于提供热量到纳米纤丝多糖中的加热表面适当地不粘附到过滤后的纳米纤丝多糖膜片。可使用涂覆有防水耐热涂层诸如PTFE的金属板。在一方面，加热表面可形成与纳米纤丝多糖膜上的一侧上待形成的期望图案相反的图案。当抵靠膜按压加热表面时形成该图案。

上述本发明的方法可用于通过在过滤织物上涂敷纳米纤丝多糖分散体并且根据预定顺序执行连续的工作阶段在片材模具上一个接一个地依次制造分离的单个膜。可选地，上述本发明的方法可用于通过在移动的过滤织物上涂敷纳米纤丝多糖分散体而以连续的过程制造连续的膜，所述移动的过滤织物承载通过连续工作阶段形成的膜片。

涂敷在过滤织物上的纳米纤丝多糖分散体的起始浓度通常不高于5wt％，例如，在0.5wt％至5.0wt％的范围内。这通常是纳米纤丝多糖在离开制造过程时的初始浓度，其中纳米纤丝多糖通过分解纤维原料进行制造。然而，纳米纤丝多糖分散体使用液体可从初始浓度(来自制造过程的产品的浓度)稀释到合适的起始浓度，以确保其在过滤织物上均匀地分布，从而避免在膜结构中的变化。根据纳米纤丝多糖等级的特性粘度，起始浓度可较低或较高，并且它可在0.1w％至10w％之间变化。用于根据本发明实施例的纳米纤丝多糖分散体的合适起始浓度的示例为0.1w％、0.2w％、0.3w％、0.4w％、0.5w％、0.6w％、0.7w％、0.8w％、0.9w％、1w％、2w％、3w％、4w％、5w％、6w％、7w％、8w％、9w％、和10w％。低粘度等级可使用较高的浓度，尽管它们的浓度很高但其可均匀地散布在过滤织物上。

当水为待排放的液体时，优选地以使纳米纤丝多糖的温度升高到至少70℃但低于100℃(例如在70℃至95℃的范围内)的强度将热量施加到在过滤织物上提供的纳米纤丝多糖。与可预期的情况相反，将温度升高到100℃以上并不改善干燥结果，因为只要膜片含有大量水并且所述水在干燥的初始阶段通过压力差去除，就必须不允许使水沸腾，因为这将会对薄膜产生不利影响。当膜片足够干燥并且通过压力差不能够进一步从片材中提取水时，仍结合到最终形成的纤丝网络片的残留水可通过蒸发去除。在这种情况下，也可使用高于100℃的温度。

然而，出于与过滤织物相同目的，可使用过滤层，所述过滤层保留纤维素纤丝同时允许液体通过，但仍然粘附在膜片上并且将形成膜产品的一部分。在这种情况下，过滤层可由粘附到膜片的纤维素纤丝的材料组成，并且它可由例如纤维素纤维组成。

在纳米纤丝多糖分散体中可包括用于改进制造过程或者改善或调节膜的性质的助剂。此类助剂可溶于分散体或固体的液相中。在纳米纤丝多糖分散体的制造期间，可已将助剂添加到原料，或者在将纤维多糖分散体涂敷到过滤织物之前将助剂添加到纤维多糖分散体中。对于细胞治疗应用，助剂可包括支持细胞生长、粘附的试剂。

为形成结实的独立的图案化的膜，必须将液体从分散体中去除，在所述图案化的膜中纤丝布置在网络上。液体可通过包括一个或两个步骤的示例性方法从纳米纤丝多糖中去除。在第一步骤中，液体通过纳米纤丝多糖分散体/膜两侧之间的压力梯度排出。

在一方面，在纳米纤丝多糖分散体的过滤侧形成负压。

在另一方面，可在纳米纤丝多糖分散体的与过滤布相对的一侧上任选地与如上的纳米纤丝多糖分散体的过滤侧上的负压一起使用增压。

如果使用两步方法，则在第二步骤中将热量施加到膜上同时在过滤织物上保持压力差，从而导致从膜片中进一步的排出。

图1和2示出为制造根据本发明的图案化的膜的实施例，其中使用修改的实验室片材模具1。在说明本发明方法的图1以及其他的图2至图4中，没有按比例画出各种元件。水性纳米纤丝多糖分散体4涂敷在图案化的过滤织物3的顶部，所述图案化过滤织物3具有微米范围内的孔并且具有微观尺度形貌，所述微观尺度形貌包括以与将要在膜上形成的图案相比相反的布置进行布置的凹部和/或凸部。图案化的过滤织物3由片材模具1的线2适当地支撑。在图1中所示的第一步骤中，由在图案化过滤织物3的自由侧(未被纳米纤丝多糖分散体4覆盖的一侧)上有效的减压p1(真空)引起通过图案化过滤织物3和线2从从多糖分散体4中进行脱水。因此，水流过图案化过滤织物和线，并且多糖分散体4的干物质含量随着水的去除而逐渐增加。

通过脱水在图案化过滤织物上形成湿膜片4并且通过图案化过滤织物3进行脱水已经停止之后，可开始图2所示的第二步骤。将加热主体5的表面放置在膜片4的顶部上，并且抵靠图案化过滤织物3使用加热主体5的整个表面按压膜片与主体5接触，并且保持减压p1(真空)。由加热主体5引起的压力标记为p2(箭头)。脱水通过压力p2和减压p1的联合作用而继续进行，这在过滤织物上引起压差并且通过过滤织物从膜片去除更多水。同时，在脱水继续时，纳米纤丝多糖膜紧紧地抵靠图案化过滤器的微观结构安置，并且纤维充满图案化过滤器的微观尺度凹部，而抵靠主体5的膜4的一侧保持光滑。

主体5的表面将热传递到膜片4，这使脱水增强，因为膜片4的温度升高，尤其是其中所含的水的温度升高。主体5的温度可以为例如90℃。主体5可以为金属。金属主体的接触表面可任选地涂覆有薄涂层，所述薄涂层防止膜片4的粘附，例如PTEE，其耐受加热膜片4所用的温度。任选地，主体5和/或涂层形成图案，使得抵靠主体5的膜片4的表面形成的图案与主体5和/或涂层上的图案相反。这能够制造在两个侧面上均具有图案的膜。在图2中，主体5为未图案化的金属板。

主体5优选地预先加热，使得膜片4的温度在主体已经抵靠膜片4放置后开始立即升高。在按压过程期间主体5在外部加热，使得温度保持恒定水平。

在脱水已经进行到合适的干物质含量后，将膜片4与过滤织物3脱离并且从模具2中去除，所述膜片4由于成形的纤维素纤丝网络而为自支撑的膜。其后，模具2可用于制造下一个膜。

在图1和图2的实施例中，所有步骤均在同一个片材模具2中执行。图3示出一个实施例，其中通过图案化过滤织物3和线2从分散体4进行脱水最初由根据图1的减压p1引起。图3示出进一步的步骤，其中湿膜片4与图案化过滤织物3一起从片材模具1中去除并且转移到压机7，其中湿膜片与过滤织物一起放置在一个或多个吸收片6上，使得图案化过滤织物3的自由表面与吸收片6的表面接触。吸收片6可由纤维材料制成，并且能够将水容纳在其体积中。片材6可以为吸收性纸浆片、吸水纸或一片干毛毡。如图3所示，片材6可堆叠以增加容水体积。

将具有与图2类似的结构和功能的加热主体5放置在湿膜片4的自由表面上。借助于主体5向膜片4施加机械压力p2。通过仅受机械压力p2影响的压差引起脱水，并且从膜片2挤出的水流过过滤织物3进入吸收片6或多个吸收片，在其中水通过一个或多个吸收片6的体积保持。如在图1和图2的实施例中一样，热量从主体5传递到膜片4。在一个或多个吸收片6下方存在冷金属表面，冷金属表面保持在相对低的温度下，使得穿过湿膜片4和一个或多个吸收片6形成温度梯度，以推动水从高温朝向低温。可调节金属表面的温度例如低于25℃，优选地低于20℃。在主体5的接触表面上的非粘附涂层标记为5a。在脱水已经进行到适当的干物质含量后，将膜片4和过滤织物3与压机7脱离，并且将膜片4与过滤织物3脱离，膜片4由于成形的纤维素纤丝维网络而为自支撑的膜。然后，过滤织物3可用于片材模具1以形成新的膜片4。将一个或多个吸收片6与压机7脱离，干燥，并且它们可再用于压机7。

在一个实施例中，所提供的主体5和/或非粘附涂层5a具有包括微观尺度的凹部和/或凸部的图案。当施加压力并形成膜时，所述图案可用于在膜的原本光滑侧上形成相反的图案。

也可通过在连续网过程中使用图案压光或者在非连续过程中使用静态压印机进行的图案转移来修饰本体层表面(即，图案化侧的相对侧)。

在图3的实施例中，当膜的目标克重为每平方米20克时，第一步骤(通过真空脱水)耗时少于60秒。第二步骤(按压+加热)耗时少于5分钟。从纳米纤丝多糖分散体开始并且以干膜结束的总制备时间少于10分钟，而在常规方法中，制备时间可以为几个小时。

图4示出其中第一步骤如图1一样通过减压p1(真空)进行的实施例。施加在所形成的膜片4的相对侧上的热量不是如图2和图3一样通过与加热表面5的接触(传导)实现，而是通过距膜片4一段距离放置的红外线加热装置8照射膜片的自由表面(辐射热)实现。不施加机械压力，而通过仅由减压p1引起的压差的作用通过过滤织物3将水从膜片4排出。在与过滤织物3接触的膜的一侧上形成微观尺度图案。

为形成图案化表面，选择或修改过滤膜使得其具有带图案的表面，当在干燥期间抵靠纳米纤丝多糖膜按压所述表面时，所述图案在纳米纤丝多糖膜的上产生包括凹部和/或凸部的所选择的图案化表面。过于过滤膜上的图案相比，滤布上的图案是相反的。如对本领域技术人员所明显的那样，通过使用根据本发明实施例的方法可在纳米纤丝多糖膜上形成任何图案。例如，可在纳米纤丝多糖膜上形成典型过滤布图案的相反图案。可选地，可使用本领域已知的方法在过滤布上制得所需图案的相反图案。

与其中多糖为天然纤维素的纳米纤丝多糖分散体的脱水相比，其中多糖为阴离子纤维素的纳米纤丝多糖分散体的脱水更耗时，因为水强结合到纤维素。含有阴离子基团的纳米纤丝纤维素可以为例如化学改性纤维素，化学改性纤维素由于改性而含有羧基基团。通过N-氧基介导的催化氧化(例如，通过公知缩写为“TEMPO”的2,2,6,6-四甲基-1-哌啶-N-氧化物)获得的纤维素或羧甲基纤维素为阴离子纳米纤丝纤维素的示例，其中，阴离子电荷应归于解离的羧酸部分。总的干燥时间预期为其中纤维素未改性的纳米纤丝纤维素的总干燥时间的多倍，这主要是由于阴离子纳米纤丝纤维素的较高的保水能力和较高的粘度。例如，当目标为每平方米膜20克时，在第一步骤中对未改性的纳米纤丝纤维素进行脱水耗时少于60s(时间是从开始真空直到膜片上无可见水为止)，然而，对于具有相同目标克重的膜来说，在类似条件下对阴离子纳米纤丝纤维素进行脱水可甚至耗时60min到120min。

这些阴离子纳米纤丝纤维素等级的脱水性质可通过利用酸对纳米纤丝多糖分散体进行预处理而得到显著提高。当纳米纤丝纤维素包含充当碱的阴离子基团(酸部分呈解离形式)时，与使用氧化纤维素和羧甲基纤维素的情况一样，使用酸来降低pH将这些基团转化成非解离形式，纤丝之间的静电斥力不再起作用，并且水-纤丝之间的相互作用以有利于分散体脱水的方式改变(分散体的保水能力降低)。阴离子纳米纤丝纤维素分散体的pH降低到4以下，优选降低到3以下，以改善脱水性质。

当膜的目标克重为每平方米20克时，由“TEMPO”氧化纸浆获得的阴离子纳米纤丝纤维素分散体在真空下原(未经调节的)pH的情况下需要大约100min的脱水时间。当在脱水前使用HCL将分散体的pH降低到2时，在相同条件下的脱水时间大约为30秒，换言之，所述时间降低到原来的0.5％。当pH降低时，分散体变得可视地聚集(形成纤丝絮凝物)，这被认为是更快脱水的一个原因，因为水更容易在聚集物之间流动。通过在降低pH的情况下对分散体进行脱水而在第一步骤中形成的膜片可在第二步骤中被干燥到其最终干燥度。通过中断干燥可消除在干燥的最终阶段期间的膜撕裂的趋势，这可能是由于分散体在低pH下的最初聚集结构而造成。然后允许膜片处于自由状态，并且从任何支撑结构(诸如，过滤织物)脱离以解除应力。其后可继续干燥。干燥的最终阶段可在高于100℃的温度(例如，在105℃)的情况下在两片吸收片(例如，吸水纸)之间执行，以去除剩余的水分。

如果阴离子纳米纤丝纤维素的纤丝尺寸相对于过滤织物的过滤能力(截止尺寸)太小，这通常是使用由氧化纸浆制成的纳米纤丝纤维素的情况，则在添加预处理的纳米纤丝多糖分散体之前，可基于与以上解释相同的原理首先由具有较大纤丝尺寸的纤维多糖分散体形成辅助过滤层。辅助过滤层可由例如未经化学改性的(天然的)纤维多糖分散体组成，诸如纤维素，其中纤丝尺寸较大。

当将纳米纤丝多糖分散体涂敷到过滤织物上时，它们可通过倾倒或一些其他涂敷方法进行涂敷，用于最初制成具有最小厚度差异的分散体的均匀层。分散体可以例如喷涂在过滤织物上。如果必要的话，可使用水来稀释分散体以降低粘度并且改善分散体的均匀散布。

所得图案化纳米纤丝多糖膜可根据膜的期望特征制成各种厚度。可制备具有均匀克重分布(在膜的区域上的小的克重差异)的薄膜。所选择的图案对所得膜的机械性质具有影响，并且通常，与相同厚度的未图案化的膜相比，当膜被图案化时获得更加刚性的结构。膜的总厚度优选地不高于150μm。如果制备独立式膜，则厚度优选地在10μm至100μm的范围内，并且还更优选在30μm至70μm的范围内，以提供足够的强度，然而，当在膜产品中形成膜层时(粘附到过滤层或者单独层压到支撑件中)，其厚度可较小，诸如在5μm至40μm的范围内。然而，这些数值不应当被视为限制性的。根据本发明的实施例的膜厚度的非限制性示例为1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、135μm、140μm、145μm和150μm。沿图案化的膜的截面(垂直于膜的平面)，在连续结构中的两个结构层可命名为：本体层和图案化的层。本体层基本上包括图案化的膜的主要体积，而图案化的层对应于包括微观尺度形貌的图案化的膜的部分。如在例如图7中可见，图案化的层的厚度至少部分地由过滤器的性质确定，即，纳米纤丝多糖可在过滤器内部渗透多深。

优选地，图案化纳米纤丝多糖膜为干燥的，并且具有＜10w％的残留水分含量。优选地，残留水分含量为大约9w％、8w％、7w％、6w％、5w％、4w％、3w％、2w％或1w％。在视觉上，干燥到这种干度的膜为半透明且刚性的片状膜。当使用未图案化的加热表面制备膜时，面向加热表面的膜的上侧非常光滑，其具有最小的表面粗糙度。底部具有由过滤织物的形貌引起的独特表面结构，参见图5至图8。

在本申请中，当水为要从纳米纤丝多糖分散体中去除的分散介质时，描述了液体去除。当除水以外的其他液体为分散介质时，可类似地执行这些操作。

图案化的膜的结构

图案化的膜为包括纳米纤丝多糖诸如纳米纤丝纤维素的连续结构。在本发明的实施例中，在图案化的膜中可看到两层：本体层和图案化的层。应当理解，对本体层和图案化的层的上述参考并非旨在意味着所述层本身为物理分开的层，但所述术语仅用于易于描述本发明，并且因此，其意味着图案化的膜的结构上不同的部分，即，形成图案的连续膜的部分，和未形成图案的部分。

装置

本发明的方面涉及开发一种作为接种支架的微观尺度图案化纳米纤丝多糖膜，或者一种包括本发明的膜的装置以将在治疗上有用的细胞诸如干细胞直接应用到伤口部位来改善皮肤伤口愈合，终止和/或减少伤口部位上的炎症。通过使用包括图案化纳米纤丝多糖膜和由细胞分泌的胞外基质的运载工具管理治疗性细胞，本发明允许将治疗性细胞受控地递送到治疗部位。

在一方面，所述装置使其膜的至少一侧涂覆有试剂或者与试剂化学结合，所述试剂增强细胞到膜的粘附。这些试剂包括所有类型的胞外基质蛋白，诸如层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白或IV型胶原蛋白或者它们的组合或级分或者复杂混合物。在其他方面，当膜在两侧上均形成图案时，则膜的不同侧可涂覆有相同或不同的试剂或者与所述试剂化学结合。一种或多种合适的试剂选自以下各项组成的组：蛋白质、肽类、碳水化合物、脂类、核酸及其片段、抗病毒化合物、抗炎性化合物、抗生素化合物诸如抗真菌和抗细菌化合物、细胞分化剂、止痛剂、用于医学诊断成像的造影剂、酶类、细胞因子、麻醉药、抗阻胺药、作用于免疫系统的试剂、免疫刺激剂、止血剂、激素、血管生成剂或抗血管生成剂、神经递质、治疗性寡核苷酸、病毒颗粒、载体、生长因子、类维生素A、细胞粘附因子、成骨因子、抗体、抗原、肽类、细胞以及它们的衍生物(包括无细胞基质)。

在一方面，所述装置可另外地包括在所述装置的至少部分诸如所述装置的中心或周边区域上延伸的一层或多层，所述一层或多层选自支撑层、背衬层、保湿层、水分吸收层、防潮层、阻气层、气味吸收层、含药层、粘合层和/或粘膜粘合层。

在一方面，所述装置包括选自以下各项组成的水介质：水、无菌水、纯净水、生理盐水、生理缓冲液、培养基、营养剂和/或生物活性剂，或者它们的组合。

在一方面，在治疗上有用的细胞包括自体细胞、同种异体细胞、干细胞、祖细胞、前体细胞、结缔组织细胞、上皮细胞、肌细胞、神经元细胞、内皮细胞、纤维母细胞、角质细胞、平滑肌细胞、基质细胞、间充质细胞、脐血细胞、胚胎干细胞、诱导多能细胞、胎盘细胞、骨髓衍生细胞、免疫系统细胞、造血细胞、树突细胞、毛囊细胞、软骨细胞、杂交瘤细胞，以及它们的组合。

在一方面，所述装置包括用于伤口愈合的细胞，优选地为间充质干细胞，脂肪衍生干细胞或骨髓衍生干细胞。

伤口治疗

本发明的方面涉及在用于伤口治疗的装置中使用根据本发明实施例的膜。当纳米纤丝多糖膜在所述装置中使用时，其优选地从非动物材料诸如植物中获得。对于生物医学应用，源自植物的材料是优选的。在一方面，在所述装置中使用的细胞可以为人源细胞。在另一方面，细胞可以为非人源细胞。细胞可以为自体细胞或异种细胞。

在一方面，hASC在治疗前通过吸脂或从待治疗受试者(当自体细胞可以被分离时)或从供体(Escobedo-Lucea等人，2013年7月9，公共科学图书馆，临床应用的人体脂肪干细胞的分离和扩增的无异种协议(A Xenogeneic-Free Protocol for Isolation and Expansion of Human Adipose Stem Cells for ClinicalUses))中获得。根据本实施例，分离的hASC在NFC培养基质上培养直到达到期望的细胞密度。

如本文所用，术语“伤口”用于泛指位于皮肤的所有层、表皮、真皮和皮下组织中，以不同的方式引发并且具有不同特征的伤口。

术语“试剂盒”是指有利于根据本发明实施例的方法、测定或组合物操控的制品或容器的组合。试剂盒可任选地包括描述如何使用试剂盒(例如，描述本发明方法的用法说明)、盒、搅拌站、化学试剂室以及其他组分的说明书。试剂盒组分可以一起包装在一个容器中(例如，盒子、包装纸等)用于运送、储存或使用，或者可以包装在两个或更多个容器中。

尽管任何细胞均可在图案化的纳米纤丝多糖膜中培养，但对于伤口治疗，适合的细胞为自体或非自体哺乳动物的脂肪衍生干细胞。

使用本多糖膜基质培养的细胞在运输之前或在运输过程中无需冷冻细胞。在一方面，培养的细胞可在培养后(例如，处于+37℃)直接运输到治疗部位而无需附加步骤。培养的干细胞系也可被基因工程化，以在培养系统中产生所选择的蛋白质，诸如生长因子、免疫调节蛋白或其他试剂，从而改善伤口愈合。

在另一方面，纳米纤丝多糖膜在至少一个侧面涂覆有层粘连蛋白以增强细胞到膜的粘附。

在方面1，本发明提供一种包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜，其中所述膜包括至少一个图案化区域，所述图案化区域包括在所述膜的至少一侧上的微观尺度凹部和/或凸部。

方面2提供根据方面1的膜，其中所述纳米纤丝多糖包括植物衍生的纳米纤丝纤维素。

方面3提供根据方面1至2中任一项的膜，其中所述图案化区域包括单元的重复图案，其中单元沿所述膜的所述平面的至少一个尺寸为从1μm至500μm。

方面4提供根据方面1至3中任一项的膜，其中所述膜的至少一侧包括图案化区域，所述图案化区域具有作为连续互连单元的微观尺度的凹部和/或凸部。

方面5提供根据方面1至4中任一项的膜，其中所述图案化区域的数均厚度为100nm至100μm，优选地为200nm至10μm，而最优选地为1μm至10μm。

方面6提供根据方面1至5中任一项所述的膜，其中所述图案化区域包括与公共壁互连的单元的重复图案，所述公共壁的宽度为从10nm至10μm，优选地为从100nm至1μm，最优选地为从200nm至1μm。

方面7提供根据方面1至6中任一项所述的膜，其中所述膜的厚度为1μm至300μm，优选地为10μm至100μm，最优选地为20μm至60μm。

方面8提供根据方面1至7中任一项所述的膜，其中所述膜包括90％干重至100％干重的纳米纤丝多糖，优选地包括95％干重至100％干重的纳米纤丝多糖，更优选地包括99％干重至100％干重的纳米纤丝多糖。

方面9提供根据方面1至8中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖至少由纤维素、半纤维素、壳多糖、壳聚糖、藻朊酸盐、果胶、阿拉伯糖基木聚糖、纳米纤丝纤维素或它们的衍生物组成，其中所述纳米纤丝多糖包括植物衍生的纳米纤丝纤维素，并且所述纳米纤丝多糖进一步包括半纤维素、壳多糖、壳聚糖、藻朊酸盐、果胶、阿拉伯糖基木聚糖或它们的衍生物。

方面10提供根据方面1至9中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖包括植物衍生的纳米纤丝纤维素的衍生物。

方面11提供根据方面1至10中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖被机械地分解。

方面12提供根据方面1至11中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖包含多糖纳米纤丝和/或纳米纤丝束，所述多糖纳米纤丝和/或纳米纤丝束的数均直径在1nm至500nm之间，优选地在2nm至200nm之间。

方面13提供根据方面1至12中任一项所述的膜，其中所述膜的所述两侧均被图案化。

方面14提供一种制造包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜的方法，所述膜的至少一侧包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域，其中所述方法包括提供纳米纤丝多糖分散体的步骤；以及选自由以下各项组成的组的步骤：

a.将所述纳米纤丝多糖分散体浇铸在包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域的浇铸支撑件上，干燥并且去除所述成形的膜，所述成形的膜与所述浇铸支撑件相比包括具有处于相反布置的微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域；以及

b.在所述膜中形成所述纳米纤丝多糖分散体，蚀刻所述膜的至少一个区域以提供包括微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域。

方面15提供一种制造包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜的方法，所述膜的至少一侧包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域，其中所述方法包括以下步骤：

a.在包括微观尺度凹部和/或凸部的图案化过滤器上，优选地在图案化的过滤织物上提供纳米纤丝多糖分散体；

b.通过改变穿过所述图案化过滤器的压力的作用将液体从所述纳米纤丝多糖分散体中排出，所述图案化过滤器基本上不能透过所述纳米纤丝多糖的所述纤丝但能透过所述液体，从而在所述图案化过滤器上形成膜；

c.任选地干燥所述膜，同时继续从所述纳米纤丝多糖分散体中去除所述液体；以及

d.任选地从所述图案化过滤器中去除所述膜；

由此获得包括纳米纤丝多糖的膜，所述膜具有与带有微观尺度凹部和/或凸部的所述图案化过滤器相比处于相反布置的微观尺度凹部和/或凸部。

方面16提供根据方面14或15所述的方法，其中所述纳米纤丝多糖分散体通过多糖的分解，任选地通过多糖的机械分解而获得。

方面17提供根据方面15所述的方法，其中步骤d.可选地包括将所述图案化过滤器保持为膜产品的组成部分的步骤，所述膜产品包括所述图案化过滤器和纳米纤丝多糖膜。

方面18提供根据方面15至17中任一项所述的方法，其中所述膜片通过在步骤c.中将所述纳米纤丝多糖膜与任选地涂覆有非粘合层的加热表面接触而在所述膜上施加热量进行干燥。

方面19提供根据方面18所述的方法，其中抵靠所述膜按压所述加热表面，以向所述膜片提供压力，从而在所述图案化过滤器上至少部分地产生所述压力差。

方面20提供根据方面16至19中任一项所述的方法，其中所述加热表面和/或非粘合层被图案化，并且当抵靠所述膜按压所述加热表面时，所述相反图案转移到所述膜面向所述加热表面和/或非粘合层的所述侧。

方面21提供根据方面16至20中任一项所述的方法，其中热量通过插入在所述加热表面与所述纳米纤丝多糖膜之间的层诸如所述纳米纤丝多糖膜层压到其上的图案化过滤器或结构层，从所述加热表面施加到所述纳米纤丝多糖膜。

方面22提供根据方面16至21中任一项所述的方法，其中所述纳米纤丝多糖分散体作为连续网设置在移动的图案化过滤器，并且通过不同处理步骤转移在所述移动的图案化过滤器上的所述连续网而产生连续图案化的膜，并且所述图案化的膜与所述图案化过滤器分离。

方面23提供根据方面14至22中任一项所述的方法，其中纳米纤丝多糖在0.5wt％浓度的水分散体中的存储模量在1Pa至50Pa之间，优选地在3Pa至20Pa之间。

方面24提供一种可通过根据方面14至22中任一项所述的方法获得的膜。

根据本发明的所述膜可在装置中使用并且在制造根据方面25至43所述的此类装置中使用。

方面25提供一种包括细胞和膜的装置，所述膜包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖，所述膜的至少一侧包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域。

方面26提供根据方面25所述的装置，其中所述膜为根据方面1至13中任一项所述的膜。

方面27提供根据方面25至26中任一项所述的装置，其中所述细胞被冻干。

方面28提供根据方面24至26中任一项所述的装置，其中所述装置呈干燥形式。

方面29提供根据方面25至28中任一项所述的装置，其中所述微观尺度凹部和/或凸部的尺寸允许所述细胞容纳所述膜的所述凹部并且/或者允许所述细胞本质上附着在所述膜的所述凸部上。

方面30提供根据方面25至29中任一项所述的装置，其包括被吸收在所述膜内部的水介质，其中所述水介质包括水、无菌水、纯净水、生理盐水、生理缓冲溶液、培养基、营养剂和/或生物活性剂，或者它们的组合。

方面31提供根据方面30中任一项所述的装置，其中所述生物活性剂选自由以下各项组成的组：蛋白质、肽类、碳水化合物、脂类、核酸及其片段、抗病毒化合物、抗炎性化合物、抗生素化合物诸如抗真菌和抗细菌药化合物、细胞分化剂、止痛剂、用于医学诊断成像的造影剂、酶类、细胞因子、麻醉药、抗组胺药、作用于免疫系统的试剂、免疫刺激剂、止血剂、激素、血管生成剂或抗血管生成剂、神经递质、治疗剂寡核苷酸、病毒颗粒、载体、生长因子、类维生素A、细胞粘附因子、成骨因子、抗体、抗原、肽类、细胞以及它们的衍生物(包括无细胞基质)。

方面32提供根据方面25至31中任一项所述的装置，其中所述膜的所述至少一侧的至少部分涂覆有试剂或者与试剂化学结合用于增强细胞粘附，所述试剂选自由以下所有种类的胞外基质蛋白质组成的组：诸如层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和IV型胶原蛋白和/或它们的组合或级分或者复杂混合物。

方面33提供根据方面25至32中任一项所述的装置，其另外包括在所述装置的至少部分诸如所述装置的所述中心或周边区域上延伸的一层或多层，所述一层或多层选自支撑层、背衬层、保湿层、水分吸收层、防潮层、阻气层、气味吸收层、含药层、粘合层和/或粘膜粘合层。

方面34提供根据方面25至33中任一项所述的装置，其中所述细胞包括自体细胞、同种异体细胞、干细胞、祖细胞、前体细胞、结缔组织细胞、上皮细胞、肌细胞、神经元细胞、内皮细胞、纤维母细胞、角质细胞、平滑肌细胞、基质细胞、间充质细胞、脐血细胞、胚胎干细胞、诱导多能细胞、胎盘细胞、骨髓衍生细胞、免疫系统细胞、造血细胞、树突细胞、毛囊细胞、软骨细胞、杂交瘤细胞，和/或它们的组合。

方面35提供根据方面25至34中任一项所述的装置，其中所述细胞包括用于伤口愈合的在治疗上有用的细胞，优选地为间充质干细胞、脂肪衍生干细胞或骨髓衍生干细胞。

方面36提供一种制造包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的装置的方法，所述膜的至少一侧包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域，其中所述方法包括以下步骤

a.提供细胞；

b.吸收包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜，所述膜的至少一侧包括具有带有水介质的微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域；

c.将所述细胞转移到所述膜上；以及

d.在允许所述细胞附着在所述膜上并且允许所述细胞的维持或者未分化生长或分化生长的条件下孵育所述细胞。

方面37提供根据方面36所述的方法，其中所述细胞包括自体细胞、同种异体细胞、干细胞、祖细胞、前体细胞、结缔组织细胞、上皮细胞、肌细胞、神经元细胞、内皮细胞、纤维母细胞、角质细胞、平滑肌细胞、基质细胞、间充质细胞、脐血细胞、胚胎干细胞、诱导多能细胞、胎盘细胞、骨髓衍生细胞、免疫系统细胞、造血细胞、树突细胞、毛囊细胞、软骨细胞、杂交瘤细胞，和/或它们的组合。

方面38提供根据方面36至37中任一项所述的方法，其中所述细胞被冻干。

方面39提供根据方面36至38中任一项所述的方法，其中步骤b和步骤c同时进行。

方面40提供根据方面36至39中任一项所述的方法，其中所述膜为根据方面1至13中任一项所述的膜。

方面41提供根据方面1至13中任一项所述的膜或根据方面25至35中任一项所述的用于治疗的装置。

方面42提供根据方面1至13中任一项所述的膜或根据方面25至35中任一项所述的用于伤口治疗，优选地用于皮肤伤口或皮肤烧伤的治疗的装置。

方面43提供根据方面25至35中任一项所述的装置，其包括脂肪衍生干细胞或骨髓衍生干细胞，用于在真皮组织损伤的恢复期间防止炎症、免疫排斥或疤痕形成。

方面44提供根据方面1至13中任一项所述的膜在组织工程学、微流体学或微电子学中的使用。

方面45提供一种包括根据方面1至13中任一项所述的膜的试剂盒，其任选地包括水介质，和用于组织工程学、微流体学或微电子学的使用说明。

方面46提供包括根据方面45所述的膜的试剂盒，其中所述膜为无菌的并且无菌包装，所述任选的水介质为无菌的并且设置成吸收在所述膜中或单独的小瓶中，并且所述使用说明在伤口愈合中与在治疗上有用于的细胞结合使用。

方面提供一种治疗伤口的方法，其包括将根据方面1至13中任一项所述的膜或将根据方面25至35中任一项所述的装置应用到具有皮肤伤口的患者的所述伤口部位。

给出以下示例仅用于说明本发明的各个方面的目的，并且它们并非意味着以任何方式限制本发明。

示例

材料

纳米纤丝纤维素

纳米纤维利用Masuko Sangyo的Supermasscolloider 9次穿过研磨石与漂白桦纸浆分离。最终产物具有以下特性：

-浓度2.0wt％

-半透明或不透明，浊度150AU

-稍微带有阴离子表面电荷，-2mV

-纤维直径7nm纳米纤维+20nm至50nm纤丝束，长度几微米。

-未原纤化颗粒的数量200(颗粒/mg)，FiberLab

-碳水化合物组合物：72.8％的葡萄糖、25.6％的木糖、1.4％的甘露糖

-0.5wt％样品的零剪切粘度8 000Pa s和屈服应力5Pa。

-1.0wt％样品的零剪切粘度30 000Pa s和屈服应力20Pa。

-0.5wt％样品G'的存储模量＝10Pa

示例1

纳米纤丝多糖膜的制备

使用用于制备NFC膜的两阶段方法。在第一阶段中，使用修改的实验室片材模具形成湿的NFC膜。利用1μm或10μm孔隙率的过滤布。过滤织物为Sefar Petex 07-10/2和Sefar Petex 07-1/2，它们的丝径分别为47μm和34μm。首先，将过滤布放置在片材模具线的顶部上并且将NFC分散体倾倒在其上。NFC分散体的稠度为2g/l，但是有必要根据NFC的现状和性质改变NFC分散体的稠度。片材模具真空用于从NFC分散体中去除水。

当不再从形成的NFC-膜中去除水时，将涂敷有聚四氟乙烯的金属板放置在NFC-膜的顶部上，使得膜在金属板与聚酰胺织物之间。纤维素吸水纸放置在聚酰胺织物下方。

在第二阶段中，吸水纸/聚酰胺/NFC-膜/金属板包装从片材模具中去除并且被带到液压机。将压机的上板加热到90℃并且抵靠上板放置涂敷有聚四氟乙烯的金属板。开始按压并持续几分钟。在此期间，第一阶段期间未从膜中去除的水转移到吸水纸，并且NFC膜内形成强的内部结合，使得其可易于从聚酰胺织物中去除。同时，过滤器织物的表面形貌的负像转移到成形的NFC膜。

NFC膜的性质

在此研究中，60g/m²NFC膜被制成大约60μm厚。膜的干密度为1.4g/cm³至1.5g/cm³。在生产之后，膜是干的(1w％至5w％残留水分)、半透明且刚性的片状材料。膜的上侧非常光滑，其具有最小的表面粗糙度。底部具有由过滤织物的形貌引起的独特表面结构，参见图5至图8。

在图5中，呈现了使用1μm过滤布制成的NFC膜的表面结构。形成连续凸出的图案：所述结构由长的、闭合的菱形井结构组成，其中对角线长度接近300μm。在较长形状之间，还可看到较短的矩形井形状。相应过滤布的SEM图像显示，表面结构还未被直接复制。井形状被拉伸成菱形。该拉伸由在干燥阶段2期间干燥湿NFC膜时的收缩引起。此行为在例如造纸中是众所周知的。受控的干燥收缩可用于在干燥完成之后调节形状的尺寸。当材料的部分与织物细丝牢固接触而后面的部分与该细丝表面较少接触时形成菱形的形状。这导致干燥收缩和干燥率的局部差异，从而导致非矩形形状。这种现象可采用织物波动图案、结构和细丝类型来控制。拉伸的形状可通过使膜湿润而松弛：松弛的矩形形状可从与细胞培养实验相关的SEM图像看出，参见图8。凸出的壁结构的高度可从SEM图像粗略估计，参见图8。对于使用1μm过滤器制成的膜，凸出部分的高度分布是宽的。最低部分仅为数微米，而最高部分从平面上升到20μm至40μm。

在图6中，呈现了使用10μm过滤布制成的NFC膜的表面结构，以及过滤器的相应SEM图像。尽管纱线直径(20μm)接近1μm过滤器的大小，但与图5相比，相应的NFC膜看起来显著不同。看起来，在10μm的过滤布中，在干燥阶段期间织物纹理防止收缩，并且NFC膜的表面结构很类似过滤器的负像，参见图7。闭合的井结构为近似矩形(20μm×180μm)。凸出的壁结构的高度难从SEM图像中难以精确估计，但可以为大约5μm至10μm。

示例2

伤口愈合治疗

图9中示出伤口治疗的流程。在纳米纤丝上接种脂肪间充质干细胞(hASC)，并且在递送到伤口区域之前在体外培养一周。在将细胞接种在膜上之前，细胞的分离和培养条件根据由(Escobedo-Lucea等人，公共科学图书馆2013)建立的方案开发。

纳米纤丝纤维素膜具有2个不同侧面，2个不同侧面具有2种不同的性质，光滑和粗糙。hASC细胞在膜的粗糙侧上接种，假定机械粘附明显更好(参见图10)。此时不需要化学粘附。除此之外，纳米纤丝纤维素膜可涂覆有可改善hASC到表面的粘附的任何ECM衍生物，但也可在无任何涂层的情况下使用。

纳米纤丝纤维素膜对细胞的安全性已经通过不同测定进行检验(在所用情况下)。培养7天之后，通过透射电子显微镜检查(TEM)测定在细胞中未检测到形态学超微结构变化(图11)。当通过QRT-PCR进行分析时，间充质干细胞标志继续保持它们的特征水平(图12)。

在任何情况下，在膜上培养hASC之后，细胞死亡并未增加。

关于hASC细胞因子阵列的体外免疫调节，执行研究以检验在涂敷或未涂敷的纳米纤维素膜上培养的或者以传统方式在塑料上培养的间充质干细胞之间的任何变化或差异。在纳米纤维素膜上进行培养之后，细胞因子的表达和释放似乎并未受到危害(图13和表1)。细胞因子的表达确保一切都在运作中，并且无排斥正在进行。

表1.从在塑料和具有不同涂层的膜上培养的细胞释放的细胞因子的鉴定。该表示出以高于5％的相对像素密度表达的那些细胞因子。

关于体内伤口修复测定，使用Geer等人(2007)描述的经过验证的伤口愈合裸鼠模型，伤口区域在膜具有细胞治疗之后已开始恢复。

在细胞膜治疗的5天和10天之后，处死动物并执行病理解剖学研究。如图14中所示，使用具有细胞的纳米纤丝膜进行治疗的动物显示出更好的愈合预后症状以及更快的恢复。

材料和方法

hASC细胞在膜上的分离和培养

使用先前由Escobedo-Lucea等人(2013)建立的方案分离和培养脂肪间充质干细胞，其中在涂覆的膜的情况下存在简单的修改。对于涂覆而言，在无菌条件下在培养罩内部切割膜，以具有用于覆盖伤口的期望区域。分别用5μg/ml和10μg/ml的人层粘连蛋白和CS涂覆膜至1小时。清洗之后，在培养基中接种细胞并且在37℃，95％的湿度和5％的CO2的条件下将它们在培养箱中培养1周直到进行治疗或体外分析。每隔一天更换培养基。

扫描电子显微镜检查

将培养物在2.5％的戊二醛中浸泡固定1小时。随后在1％的四氯化锇中后固定1小时，进行脱水、临界点干燥、溅涂，且在扫描电子显微镜(日本，日立，S-4100)下进行分析。

透射电子显微镜检查

对于精细超微结构分析，在室玻片中培养细胞并且随后在将它们固定用于透射电子显微镜检查(TEM)之前，在0.1M的磷酸盐缓冲(PB；pH 7.4)溶液中进行连续清洗。在37℃下，在PB中的3％的戊二醛溶液中执行固定至30分钟，并且在PB中的2％的OsO₄中进行后固定。通过一系列梯度乙醇溶液以及使用氧化丙烯(荷兰，德温特，Lab Baker)的最终清洗实现脱水。最终，将板包埋在环氧树脂(Durkupan,Fluka)中一夜。聚合之后，将包埋的样品与室玻片脱离并且将其粘附到环氧树脂块。使用安装到载玻片上的Ultracut UC-6(德国，海德尔堡，Leica)切割连续半薄(1.5μm)切片，并且最终使用1％的甲苯胺蓝将所述切片染色。超薄(0.07μm)切片使用Ultracut制备并且使用柠檬酸铅染色。使用数字照相机(Morada,Soft Imaging System,Olympus)，在透射电子显微镜(FEI Tecnai Spirit G2)下获得显微照片。

RNA制备和QRT-PCR

使用RNeasy迷你试剂盒(希尔登，Quiagen；编号74104)由细胞制备总RNA。为消除污染的基因组DNA，在制造商提供的缓冲液中在室温下使用脱氧核糖核酸酶(DNase)I(2U/μL至4U/μL；卡尔斯巴德，Qiagen；编号79254)孵育初始RNA沉淀至15分钟。RT–PCR和引物序列由Escobedo-Lucea等人在公共科学图书馆(2013)中进行描述。它们使用引物3软件进行设计并且由Sigma–Aldrich合成。对于每次实验均执行控制，其中从cDNA反应混合物中省去反转录酶，并且从PCR混合物中省去模板DNA。对于定量实时PCR(QRT-PCR)，5μg RNA被转化成cDNA，并且将一系列稀释的样品用于Light Cycler 480(曼海姆，Roche Diagnostics)仪器中的Light Cycler 480SYBR Green I Master(试剂盒编号04707516001)中的40次循环PCR。反应物(总共20μL)包含1μL cDNA、每个引物10μM，以及4μM探针，并且使用默认的Lightcycler 480程序运行。为生成用于比较不同样品中的mRNA水平的标准曲线，制备了多个稀释度的对照cDNA样品，横跨至少3个数量级。描述阈值循环Ct相对对数浓度的曲线图的方程用于确定实验样品中的mRNA的相对量。使用优化条件和阈值，使用感兴趣的探针和在样品中间预期未改变的内部对照，对单个样品一式三份进行分析。使用三个不同的内部对照：甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Gapdh)、β-2微球蛋白和β-肌动蛋白。根据Ct值，计算相对转录物浓度并且标准化到内部对照的浓度。将最大表达数据点调节到100。用于样品的所示数据标准化到Gapdh，但是当仅使用β-2微球蛋白或全部3个对照的组合进行分析时，结果是相当的。

细胞因子阵列

使用链霉亲和素-HRP孵育膜至30分钟。通过添加化学试剂混合物显示阵列至1分钟。取出过量的试剂并密封。将膜与其标识一起放置在自动射线照相术胶片盒中，并且暴露于X光胶片从1分钟至10分钟。供应商在使用说明中列出了对照、参考和候选细胞因子的位置和识别。

为在条件之间进行比较，使用透射模式扫描仪和图像分析软件(图像J)收集并分析显影X光胶片上的像素密度。创建模板以分析阵列的每个点中的像素密度。考虑到来自清晰区的信号或负对照点作为背景，使用代表每个细胞因子的复制点对来确定平均信号(像素密度)。将平均背景信号从每个点中减去。

动物手术

从查尔斯河(法国)购买瑞士nu/nu裸鼠，并饲养在由位于西班牙瓦伦西亚市的Centro de InvestigacionPrincipe Felipe(CIPF)维持的机构中，伦理许可编号为12-02-38。我们通过赫尔辛基与瓦伦西亚协议之间的合作拥有这些裸鼠。所有实验均使用7周至8周大的雄性动物。实验得到了CIPF机构动物护理委员会的批准。所有程序均使用无菌技术执行，并且所有材料均为无菌材料。手术程序在生物安全柜中执行，并且动物被饲养在层流笼隔离器中的顶端有过滤器的笼子中。对于实验而言，老鼠均放置在充满异氟烷(IsoFlo；伊利诺伊州，北芝加哥，雅培公司)的气体室中，直到它们达到期望的麻醉水平。使用夹挤试验并且监测呼吸率以确定麻醉的适当水平。随后将老鼠从室内移除并且在整个全部过程中用异氟烷气将它们遮蔽。用乙醇清洗小鼠的背部之后，我们在小鼠的肩部上方1cm至2cm处创建两处全层伤口(包括肉膜)，伤口中的其中一处用作对照而另一处用于治疗。接下来，将伤口愈合治疗物放置在伤口上，并且用6-0Vicryl(新泽西州，萨默维尔市，爱惜康&强生公司)缝合线固定在每个拐角处。在敷料上应用一片聚氨酯封闭敷料(Tegaderm；明尼苏达州，圣保罗，3M)。将修整过的3M运动创可贴放置在敷料上方并且采用连续的6-0Vicryl缝合线缝合在适当位置。随后使用防水胶带(新泽西州，斯基尔曼，强生公司)将移植物与敷料牢固地包裹在适当位置。使用Geer等人(2007)描述的建议将伤口区域水化。

组织学

通过石蜡包埋组织切片的标准苏木精和伊红染色以及马森的三色染色来评估组织形貌。对于石蜡，在室温下将切除的皮肤替代物固定在10％缓冲福尔马林(飞世尔科技公司)中至2个小时，然后使用乙醇-二甲苯洗涤液进行脱水。组织在60℃下浸润一夜后被包埋在石蜡中。

Claims (29)

1.一种包括以连续布置进行布置的纳米纤丝多糖的膜，其中所述膜包括至少一个图案化区域，所述图案化区域包括在所述膜的至少一侧上的微观尺度凹部和/或凸部，并且其中所述纳米纤丝多糖包括植物衍生的纳米纤丝纤维素。

2.根据权利要求1所述的膜，其中所述图案化区域包括单元的重复图案，其中单元沿所述膜的所述平面的至少一个尺寸为从1μm至500μm。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的膜，其中所述膜的至少一侧包括图案化区域，所述图案化区域具有作为连续互连单元的微观尺度凹部和/或凸部。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的膜，其中所述图案化区域的数均厚度为100nm至100μm，优选地为200nm至10μm，最优选地为1μm至10μm。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的膜，其中所述图案化区域包括与公共壁互连的单元的重复图案，所述公共壁的宽度为10nm至10μm，优选地为从100nm至1μm，最优选地为从200nm至1μm。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的膜，其中所述膜的厚度为1μm至300μm，优选地为10μm至100μm，最优选地为20μm至60μm。。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的膜，其中所述膜包括90％干重至100％干重的纳米纤丝多糖、优选地包括95％干重至100％干重的纳米纤丝多糖，更优选地包括99％干重至100％干重的纳米纤丝多糖。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖进一步包括半纤维素、壳多糖、壳聚糖、藻朊酸盐、果胶、阿拉伯糖基木聚糖，或它们的衍生物。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖包括植物衍生的纤维素的衍生物。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖被机械地分解。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的膜，其中所述纳米纤丝多糖包括多糖纳米纤丝和/或纳米纤丝束，所述多糖纳米纤丝和/或纳米纤丝束的数均直径在1nm至500nm之间，优选地在2nm至200nm之间。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的膜，其中所述膜的所述两侧均被图案化。

13.一种制造根据权利要求1至12中任一项所述的膜的方法，其中所述方法包括提供纳米纤丝多糖分散体的所述步骤；以及选自由以下各项组成的组的步骤：

a.将所述纳米纤丝多糖分散体浇铸在包括具有微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域的浇铸支撑件上，干燥并且去除所述成形的膜，所述成形的膜与所述浇铸支撑件相比包括具有处于相反布置的微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域；以及

b.在膜中形成所述纳米纤丝多糖分散体，蚀刻所述膜的至少一个区域以提供包括微观尺度凹部和/或凸部的至少一个图案化区域。

14.一种制造根据权利要求1至12中任一项所述的膜的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.在包括微观尺度凹部和/或凸部的图案化过滤器上，优选地在图案化的过滤织物上提供纳米纤丝多糖分散体；

b.通过改变穿过所述图案化过滤器的压力的作用将液体从所述纳米纤丝多糖分散体中排出，所述图案化过滤器基本上不能透过所述纳米纤丝多糖的所述纤丝但能透过所述液体，从而在所述图案化过滤器上形成膜；

c.任选地干燥所述膜，同时继续从所述纳米纤丝多糖分散体中去除所述液体；以及

d.任选地从所述图案化过滤器中去除所述膜；

由此获得包括纳米纤丝多糖的膜，所述膜具有与带有微观尺度凹部和/或凸部的所述图案化过滤器相比处于相反布置的微观尺度凹部和/或凸部。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述纳米纤丝多糖分散体通过多糖的分解、任选地通过多糖的机械分解而获得。

16.根据权利要求14所述的方法，其中步骤d可选地包括将所述图案化过滤器保持为膜产品的组成部分的步骤，所述膜产品包括所述图案化过滤器和纳米纤丝多糖膜。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述膜片通过在步骤c中将所述纳米纤丝多糖膜与任选地涂覆有非粘合层的加热表面接触而在所述膜上施加热量进行干燥。

18.根据权利要求17所述的方法，其中抵靠所述膜按压所述加热表面，以向所述膜片提供压力，从而在所述图案化过滤器上至少部分地产生所述压力差。

19.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中所述加热表面和/或非粘合层被图案化，并且当抵靠所述膜按压所述加热表面时，所述相反图案转移到所述膜面向所述加热表面和/或非粘合层的所述侧。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中热量通过插入在所述加热表面与所述纳米纤丝多糖膜之间的层，诸如所述纳米纤丝多糖膜层压到其上的图案化过滤器或结构层，从所述加热表面施加到所述纳米纤丝多糖膜。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述纳米纤丝多糖分散体作为连续网设置在移动的图案化过滤器上，并且通过不同处理步骤转移在所述移动的图案化过滤器上的所述连续网而产生连续图案化的膜，并且所述图案化的膜与所述图案化过滤器分离。

22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中纳米纤丝多糖在0.5wt％浓度的水分散体中的存储模量在1Pa至50Pa之间，优选地在3Pa至20Pa之间。

23.一种根据权利要求13至22中任一项所述的方法获得的膜。

24.根据权利要求1至12中任一项所述的膜，其用于治疗。

25.根据权利要求1至12中任一项所述的膜，其用于伤口治疗，优选地用于皮肤伤口或皮肤烧伤的治疗。

26.一种根据权利要求1至12中任一项所述的膜在组织工程学、微流体学或微电子学中的使用。

27.一种包括根据权利要求1至12中任一项所述的膜的试剂盒，其任选地包括水介质，以及用于组织工程学、微流体学或微电子学的使用说明。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述膜为无菌的并且无菌包装，所述任选的水介质为无菌的并且设置成吸收在所述膜中或单独的小瓶中，并且所述使用说明在伤口愈合中与在治疗上有用的细胞结合使用。

29.一种治疗伤口的方法，其包括将根据权利要求1至12中任一项所述的膜应用到具有皮肤伤口的患者的所述伤口部位。