CN105861349A - 一种生产b型禽偏肺病毒f蛋白的重组菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株及其应用，本发明提供的生产B型禽偏肺病毒F蛋白的基因工程毕赤酵母菌，其保藏编号为CCTCC M 2016097。本发明构建了带有人工设计改造后的B型禽偏肺病毒F蛋白基因的高效表达载体，获得了在毕赤酵母菌中高效表达B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株，该表达产物为可溶性蛋白。这为工业化生产B型禽偏肺病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。

Description

一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株

技术领域

本发明属于重组菌株技术领域，具体涉及一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株及其应用。

背景技术

禽偏肺病毒属于副黏病毒肺病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA，可引起火鸡发生呼吸道疾病，称为火鸡鼻气管炎；感染鸡后引起病毒性气囊炎，鼻气管炎和肿头综合征,产蛋下降。20世纪70年代末，禽偏肺病毒引起的疾病首次在南非报道，随后在北美、南美、中东、远东都有发生。1989年美国首次分离到此病毒。在分离此病毒的同时，往往可分离到波氏杆菌、巴氏杆菌、假单胞杆菌、鼻气管炎鸟疫杆菌、粪产碱杆菌等。禽偏肺病毒能使气管纤毛的活动受到抑制，气管中的灰尘向外排出困难，灰尘中所带的大量细菌很容易发生继发感染，侵害呼吸道。病原禽偏肺病毒可分为三个型：A型感染火鸡，B型感染肉鸡，C型只在美国存在，A和B两型有交叉保护作用，与C型无交叉保护作用。随着我国禽业养殖规模的不断扩大，因禽偏肺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。目前国内外对禽偏肺病毒疫苗的研究大多集中在灭活疫苗的研制。

完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株及其应用，从而为大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的优良亚单位疫苗和诊断试剂服务。

本发明提供的生产B型禽偏肺病毒F蛋白的巴斯德毕赤酵母X33-F(Pichia pastoris X33-F)，已于2016年3月9日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016097。

所述的B型禽偏肺病毒F蛋白，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，

2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；

编码上述F蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明所提供的基因工程毕赤酵母菌可用于制备疫苗。

本发明构建了带有人工设计改造后的B型禽偏肺病毒F蛋白基因的高效表达载体，获得了在毕赤酵母菌中高效表达B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株，该表达产物为可溶性蛋白。这为工业化生产B型禽偏肺病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。

附图说明

图1：本发明实施例1的F基因PCR扩增鉴定图；

图2：本发明F基因的核苷酸序列比对图；

图3：本发明F蛋白的氨基酸序列比对图；

图4：本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图；

图5：本发明实施例重组菌株X33-F的PCR鉴定图；

图6：本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：F蛋白的扩增及序列分析

2010年在山东省多个种鸡场出现了肿头综合症的症状，而发病鸡群之前已经注射了已有的禽肺病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行禽肺病毒的筛选。最终筛选出了一株禽肺病毒SHS/A3。

为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选毒株SHS/A3在内的5个不同来源的病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF鸡后用SHS/A3株病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于其它禽肺病毒疫苗；其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(p＜0.05)；因此确定其发生了遗传上的变异。

1、扩增B型禽偏肺病毒SHS/A3株(APV)F基因

根据NCBI中发表的F基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：

primer1：5′-GGGATGTACCTCAAACTGCTACTAAT-3′；

primer2:5′-TCAACTGATGTAGCCCATGTTGC-3′。

2、PCR扩增F基因克隆与序列测定

提取SHS/A3株的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定(图1为B型禽偏肺病毒F蛋白基因PCR的扩增鉴定图)，结果核苷酸序列为SEQ ID NO:2；其编码的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。与NCBI中已公布的B型禽偏肺病毒的F基因进行核苷酸序列比对分析，结果同源性在95.1％～99.2％(图2为SHS/A3株F基因的核苷酸序列比对图)；推导的氨基酸序列同源性为95.0％～97.4％(图3为SHS/A3株F蛋白的氨基酸序列比对图)。结果表明，分离的SHS/A3株为新的B型禽偏肺病毒，含有新的F基因。

3、设计并合成B型禽偏肺病毒(APV)F基因

根据SHS/A3株F基因的序列测定结果，设计合成一对引物,引物的序列信息如下：

primer3：5′-GGGGGTACCATGTACTTGAAGTTGCAATTG-3′；

primer4:5′-GCGGCCGCTCAACTGATGTAACCCATGT-3′。

以合成的核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F基因为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-F。

实施例2：F蛋白的重组表达

1.重组B型禽偏肺病毒F蛋白的制备方法

包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组F蛋白的诱导和提取纯化。

a.构建表达载体：

将阳性克隆质粒pMD18-T-F和表达载体pPICZα载体分别用KpnI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约1.6kb和3.3kb片段,在16℃定向连接构建pPICZα-F表达载体(图4是本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图)；测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞。

b.构建表达菌株：

电转化后，F基因重组到毕赤酵母基因组中，构建毕赤酵母表达菌株X33-F(已于2016年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016097；图5)；

c.重组F蛋白的诱导和提取纯化：

诱导表达，挑取含X33-F的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基,30℃振荡培养过夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后，加入终浓度0.5％甲醇，30℃诱导96小时。4℃,9000rpm离心5min，保留上清液，加入30％的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定。(图6中1、2、3为F蛋白表达产物沉淀，M为分子量标准蛋白质。)

实施例3：亚单位疫苗的制备

一、亚单位疫苗制备

1.制苗用菌液的制备将X33-F菌种接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基，选取典型菌落2～3个混合于少量YPD液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时，经镜检后，置2～8℃保存

2.制苗用蛋白的制备按发酵罐容积60％(V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入YNB和生物素，接种B型禽偏肺病毒F蛋白生产用二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。

3.灭活将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

4.半成品检验

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定按Bradford法检测蛋白含量。

(3)灭活检验将灭活后的蛋白液取少量接种YPD固体培养基，置于置30℃继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。

5.亚单位疫苗成品制备

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备将B型禽偏肺病毒F蛋白使用生理盐水稀释成150μg/0.1ml。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

二、亚单位疫苗成品检验

(1)性状

外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(4)安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

(5)效力检验21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗，0.3ml/只，另取10只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，点眼攻毒SHS/A3株病毒液，0.1ml/只，病毒含量为10^6.5TCID₅₀/0.1ml。攻毒后连续观察7天，于攻毒后第5天采集鼻拭子、分离病毒。结果表明，用B型禽偏肺病毒F蛋白亚单位疫苗免疫鸡群能够抵抗病毒的攻击，不出现临床症状，病毒分离均为阴性。对照组出现轻微的临床症状，9/10病毒分离阳性。本发明制备的F蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果(p＜0.05)，可以保护免疫鸡抵抗B型禽偏肺病毒的攻击。

(6)同类产品对比试验用上述亚单位疫苗、某进口同类产品，分别按上述方法免疫SPF鸡，进行效力对比试验。用禽肺病毒病ELISA试剂盒测定抗体，从抗体值来看，对照鸡均为阴性，亚单位苗免疫鸡均≥2000，同类产品免疫鸡6/10≥2000，亚单位苗明显高于进口同类产品。按上面的方法使用SHS/A3株病毒攻毒，从攻毒保护结果上看，亚单位疫苗攻毒后90％保护，而同类产品的保护率为60％。由以上结果来看亚单位疫苗优于同类产品(参见表1)，发病率远低于其市售疫苗(p＜0.05)。

表1：与同类产品效力对比试验

Claims (6)

1.一种基因工程毕赤酵母菌，其特征在于，所述的基因工程毕赤酵母菌的保藏编号为CCTCC M 2016097。

2.权利要求1所述的基因工程毕赤酵母菌在生产B型禽偏肺病毒F蛋白中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的B型禽偏肺病毒F蛋白包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，

2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的B型禽偏肺病毒F蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

5.权利要求1所述的基因工程毕赤酵母菌在制备疫苗中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为亚单位疫苗。