CN105861322B - 一种快速、大量制备病原菌谷物粒接种体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速、大量制备病原菌谷物粒接种体的方法，包括制作双层牛皮纸袋、谷物粒准备、病原菌孢子悬浮液的制备和病原菌谷物粒接种体的培养等步骤。本发明具有突出的优势：首先，减少接种体污染。牛皮纸袋通透性好，病原菌在生长过程中呼吸散出热量能及时散出，同时也有足够氧气满足病原菌生长所需，使病原菌能很好的生长，再加上本发明用的是病原菌孢子悬浮液接种，孢子量大且在谷物粒上分布比较均匀，所以病原菌能在培养上快速长满菌丝，能明显减少杂菌的污染。其次，节省培养时间和空间，提高工作效率。本发明能缩短接种体制作时间，提高工作效率；每个牛皮纸袋内可装1.5‑2.5kg谷物粒，比传统的三角瓶或聚乙烯塑料袋装的多3‑5倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速、大量制备病原菌谷物粒接种体的方法，属于病原菌接种体制备技术领域。
背景技术
植物病害的防治方法主要有植物检疫、抗病育种、农业防治、化学防治、物理机械防治和生物防治等防治方法，其中选育抗病品种是防治植物病害的主要方法之一，与其他防治方法相比，选育抗病品种的方法效果稳定，简单易行，成本低，能减轻或避免农药对农产品和环境的污染，有利于保持生态平衡等。特别是对于一些化学防治、生物防治等方法很难控制的植物病害，选育抗病品种就更为重要。
在抗病品种的选育中，通过人工接种进行材料的抗病性鉴定是一项重要环节。植物病害的种类很多、其传染方式和侵染途径各异，因此接种方法也不相同，根据病害的传染方式和侵染途径，植物病害人工接种方法主要有喷雾法、涂抹法、浸根法和埋根法。人工接种需要制备大量病原菌的接种体，目前常用的接种体有孢子悬浮液、菌丝体、谷物粒接种体等，孢子悬浮液主要用于喷雾、涂抹或蘸根接种，菌丝体主要用于涂抹、贴附植物表面或与其他基质混合接种，谷物粒接种体主要用于埋根接种法或作为一种产孢基质。利用谷物粒(麦粒，玉米粒，高梁粒等)培养基制备接种体是目前真菌根部病害接种中广泛使用的方法之一。在实际操作中，制备谷物粒接种体往往存在污染率高、制备慢、操作复杂、培养和存放不便等许多问题，特别是需要快速、大量制备接种体时就更加困难。目前使用的传统方法是用三角瓶或装谷物粒培养基高压灭菌，接种用病原菌菌丝块，由于三角瓶和聚乙烯塑料袋透气性不好，菌丝块生长点少且不均匀，菌丝不能在前期快速长满培养物，易滋生杂菌；后期因菌丝生长呼吸需要氧气，三角瓶或聚乙烯塑料袋透气差，湿度大，菌丝生长受到抑制，细菌会大量滋生，时间越长污染越严重，污染率很高，培养出的接种体质量就会很差。所以这给需要用谷物粒培养基培养接种体的抗病性鉴定工作带来了很大的困难，目前要想推动这一工作的进展，必须寻找一种优化的方法，能快速、大量制备出优质病原菌谷物粒接种体，从而为植物的抗病鉴定工作做出重大贡献。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、大量制备病原菌谷物粒接种体的方法，该方法制备出的接种体无污染、菌量大，制备过程操作简单，能节省大量时间和空间，明显提高工作效率。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种快速、大量制备病原菌谷物粒接种体的方法，包括以下步骤：
(1)培养容器的制备：将牛皮纸制作成上部开口的牛皮纸袋，然后将两个牛皮纸袋套在一起，在内层牛皮纸袋的内腔底部覆上防水加固介质，得到培养病原菌谷物粒接种体的双层牛皮纸袋；将双层牛皮纸袋进行高压湿热灭菌，再进行干燥，备用；
(2)谷物粒的准备：先将谷物粒加水浸泡，再加热煮沸，过滤，将谷物粒进行高压湿热灭菌，冷却后备用；
(3)病原菌孢子悬浮液的制备：将病原菌菌株活化，再将活化的病原菌接种至病原菌的产孢培养基中，促进病原菌产孢，得到病原菌孢子悬浮液；
(4)病原菌谷物粒接种体的培养：将步骤(2)的谷物粒装入步骤(1)的双层牛皮纸袋中，再将病原菌孢子悬浮液均匀洒在谷物粒上，将双层牛皮纸袋封口，对病原菌进行培养，直至病原菌长满谷物粒，即得。
本发明两个牛皮纸袋是按照开口同向的方式套在一起。
本发明在双层牛皮纸袋的内层牛皮纸袋的内腔底部覆上一层防水加固介质，一是为了防止底部承重后破损，二是为了防止接种后袋内孢子液下渗。
所述的牛皮纸的重量为70-100g/m2；所述的中空牛皮纸袋的长为20-30cm，宽为10-15cm，高为25-35cm。
所述的防水加固介质为防水不干胶。
步骤(1)中高压湿热灭菌的温度为121℃，时间为30-60min；干燥的温度为50-70℃，时间为3-5h。
所述的谷物粒为玉米粒、小麦粒或高粱粒。
步骤(2)中谷物粒的浸泡时间为10-15h，加热煮沸时间为40-60min。
谷物粒的高压湿热灭菌方法为：将谷物粒装入聚乙烯塑料袋中，束口，在121℃高压湿热灭菌30-60min。优选的，谷物粒装至聚乙烯塑料袋总容积的1/2，用皮筋束口，谷物粒不可装过多，皮筋不可太紧，否则会影响灭菌效果，灭菌不彻底。
步骤(3)中病原菌孢子悬浮液的浓度为104个/ml以上。如果镜检病原菌孢子悬浮液的浓度没有达到104个/ml，最好继续培养，直至病原菌孢子悬浮液的浓度达到104个/ml，再进行后续步骤。
步骤(4)中谷物粒装入双层牛皮纸袋的量为装至双层牛皮纸袋总容积的2/3。
步骤(4)中每1.5-2.5kg谷物粒洒25-40ml病原菌孢子悬浮液。
步骤(4)中对病原菌进行培养的具体方法为：将封口的双层牛皮纸袋在24-26℃、相对湿度50-80％条件下培养5-7d。本发明所采用的封口方法是将双层牛皮纸袋口对齐，连续向下折两次，袋口用两个夹子夹住。
由于接种体培养过程中会产生量热，导致接种体温度过高，会影响病原菌的制备速度和制备量，因此在数个、数十个或者数百个接种体同时培养的情况下，必须控制牛皮纸袋之间的距离，即保持两两双层牛皮纸袋之间的距离为5-15cm，在保证牛皮纸袋通风透气的前提下，同时能够提高空间的利用率。
本发明具有突出的优势：
首先，减少接种体污染。牛皮纸袋通透性好，病原菌在生长过程中呼吸散出热量能及时散出，同时也有足够氧气满足病原菌生长所需，使病原菌能很好的生长，再加上本发明用的是病原菌孢子悬浮液接种，孢子量大且在谷物粒上分布比较均匀，所以病原菌能在培养上快速长满菌丝，能明显减少杂菌的污染。
其次，节省培养时间和空间，提高工作效率。牛皮纸袋内菌丝能快速长满谷物粒，传统的三角瓶或聚乙烯塑料袋内菌丝生长慢，本发明能缩短接种体制作时间，提高工作效率；每个牛皮纸袋内可装1.5-2.5kg谷物粒，比传统的三角瓶或聚乙烯塑料袋装的多3-5倍，培养过程能节省很大空间，操作和运输过程也方便，可大量制备，传统的三角瓶使用和运输过程中容易破碎，操作很不方便，用后很难清洗。本发明可以快速、大量制备接种体。
再者，利用牛皮纸袋制备接种体，接种体前期如果没有因为人为操作而造成污染，后期一般就不会被污染，污染率不会超过5％，三角瓶或聚乙烯塑料袋内制备接种体，前期接菌时若无人为因素造成污染，后期污染率也会很高，大概有50％以上的污染率，多为细菌污染。接种体如果没有被污染，就能长期保存。三角瓶和聚乙烯塑料袋内的接种体需要倒出晾干，再装入袋内保存备用，保存过程中保持干燥；牛皮纸袋内的接种体制备好后，不需要倒出晾干，直接带袋存放，保持干燥，自然风干即可。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明所用的培养基如下：
PDA平板：将马铃薯洗净去皮，称取200g去皮马铃薯切成小块，加入1000ml水，煮沸20-30min(能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖和15g琼脂，继续加热搅拌均匀，待琼脂溶解完全，加水补足1000ml，倒入培养皿中，121℃高压灭菌25min。
绿豆汤培养液：称取绿豆30-50g，加蒸馏水1000ml，煮沸30min，绿豆部分开花即可，用纱布过滤后加水补足1000ml，分装到250ml的三角瓶内，每瓶装150ml，然后灭菌(121℃，25min)，备用。
本发明所用的牛皮纸重量为70-100g/m2。
实施例1
一种快速、大量制备禾谷镰刀菌玉米粒接种体的方法，包括以下步骤：
(1)培养容器的制备：将牛皮纸制作成上部开口的长25cm，宽12cm，高30cm的牛皮纸袋，然后将两个牛皮纸袋套在一起，在内层牛皮纸袋的内腔底部覆上一层防水不干胶，得到培养禾谷镰刀菌玉米粒接种体的双层牛皮纸袋；将双层牛皮纸袋进行高压湿热灭菌，再进行干燥，备用；高压湿热灭菌的温度为121℃，时间为30min；干燥的温度为60℃，时间为4h；
(2)玉米粒的准备：先将玉米粒加水浸泡12h，再加热煮沸50min，过滤，将玉米粒进行高压湿热灭菌，冷却后备用；玉米粒的高压湿热灭菌方法为：将玉米粒装入聚乙烯塑料袋中，装至聚乙烯塑料袋总容积的1/2，橡皮筋束口，在121℃高压湿热灭菌60min；
(3)禾谷镰刀菌孢子悬浮液的制备：将禾谷镰刀菌菌株接种至PDA平板上，在25℃条件下培养5d进行活化，再挑取10块新鲜菌丝块(1cm2)接种至绿豆汤培养液150ml中，25℃、160rpm摇床培养72h，促进禾谷镰刀菌产孢，镜检禾谷镰刀菌孢子浓度，禾谷镰刀菌孢子浓度达到104个/ml，得到禾谷镰刀菌孢子悬浮液，备用；
(4)禾谷镰刀菌玉米粒接种体的培养：将步骤(2)的玉米粒装入步骤(1)的双层牛皮纸袋中，装至双层牛皮纸袋总容积的2/3，再将禾谷镰刀菌孢子悬浮液均匀洒在玉米粒上，每2kg玉米粒洒30ml禾谷镰刀菌孢子悬浮液，摇匀，将双层牛皮纸袋封口，对禾谷镰刀菌进行培养，直至禾谷镰刀菌长满玉米粒，此时，禾谷镰刀菌玉米粒接种体制备完成。
若不现用，便可一直在牛皮纸袋内存放，一定要保持通风透气，使接种体自然风干备用。
步骤(4)中对禾谷镰刀菌进行培养的具体方法为：将封口的双层牛皮纸袋在25℃、相对湿度50％条件下培养5d。
当双层牛皮纸袋超过一个时，两两双层牛皮纸袋之间的距离为10cm。
本发明的方法从准备到接种体制备完成周期短，一般2周即可完成。
实施例2
一种快速、大量制备新月弯孢菌小麦粒接种体的方法，包括以下步骤：
(1)培养容器的制备：将牛皮纸制作成上部开口的长20cm，宽15cm，高25cm的牛皮纸袋，然后将两个牛皮纸袋套在一起，在内层牛皮纸袋的内腔底部覆上一层防水不干胶，得到培养新月弯孢菌小麦粒接种体的双层牛皮纸袋；将双层牛皮纸袋进行高压湿热灭菌，再进行干燥，备用；高压湿热灭菌的温度为121℃，时间为40min；干燥的温度为50℃，时间为5h；
(2)小麦粒的准备：先将小麦粒加水浸泡10h，再加热煮沸60min，过滤，将小麦粒进行高压湿热灭菌，冷却后备用；小麦粒的高压湿热灭菌方法为：将小麦粒装入聚乙烯塑料袋中，装至聚乙烯塑料袋总容积的1/2，橡皮筋束口，在121℃高压湿热灭菌50min；
(3)新月弯孢菌孢子悬浮液的制备：将新月弯孢菌菌株接种至PDA平板上，在25℃条件下培养5d进行活化，再挑取10块新鲜菌丝块(1cm2)接种至绿豆汤培养液150ml中，25℃、170rpm摇床培养72h，促进新月弯孢菌产孢，镜检新月弯孢菌孢子浓度，新月弯孢菌孢子浓度达到104个/ml，得到新月弯孢菌孢子悬浮液，备用；
(4)新月弯孢菌小麦粒接种体的培养：将步骤(2)的小麦粒装入步骤(1)的双层牛皮纸袋中，装至双层牛皮纸袋总容积的2/3，再将新月弯孢菌孢子悬浮液均匀洒在小麦粒上，每1.5kg小麦粒洒25ml新月弯孢菌孢子悬浮液，摇匀，将双层牛皮纸袋封口，对新月弯孢菌进行培养，直至新月弯孢菌长满小麦粒，此时，新月弯孢菌小麦粒接种体制备完成。
步骤(4)中对新月弯孢菌进行培养的具体方法为：将封口的双层牛皮纸袋在24℃、相对湿度80％条件下培养7d。
当双层牛皮纸袋超过一个时，两两双层牛皮纸袋之间的距离为5cm。
本发明的方法从准备到接种体制备完成周期短，一般2周即可完成。
实施例3
一种快速、大量制备玉米长蠕孢菌高粱粒接种体的方法，包括以下步骤：
(1)培养容器的制备：将牛皮纸制作成上部开口的长30cm，宽10cm，高35cm的牛皮纸袋，然后将两个牛皮纸袋套在一起，在内层牛皮纸袋的内腔底部覆上一层防水不干胶，得到培养玉米长蠕孢菌高粱粒接种体的双层牛皮纸袋；将双层牛皮纸袋进行高压湿热灭菌，再进行干燥，备用；高压湿热灭菌的温度为121℃，时间为60min；干燥的温度为70℃，时间为3h；
(2)高粱粒的准备：先将高粱粒加水浸泡15h，再加热煮沸40min，过滤，将高粱粒进行高压湿热灭菌，冷却后备用；高粱粒的高压湿热灭菌方法为：将高粱粒装入聚乙烯塑料袋中，装至聚乙烯塑料袋总容积的1/2，橡皮筋束口，在121℃高压湿热灭菌30min；
(3)玉米长蠕孢菌孢子悬浮液的制备：将玉米长蠕孢菌菌株接种至PDA平板上，在25℃条件下培养5d进行活化，再挑取10块新鲜菌丝块(1cm2)接种至绿豆汤培养液150ml中，25℃、180rpm摇床培养72h，促进玉米长蠕孢菌产孢，镜检玉米长蠕孢菌孢子浓度，玉米长蠕孢菌孢子浓度达到104个/ml，得到玉米长蠕孢菌孢子悬浮液，备用；
(4)玉米长蠕孢菌高粱粒接种体的培养：将步骤(2)的高粱粒装入步骤(1)的双层牛皮纸袋中，装至双层牛皮纸袋总容积的2/3，再将玉米长蠕孢菌孢子悬浮液均匀洒在高粱粒上，每2.5kg高粱粒洒40ml玉米长蠕孢菌孢子悬浮液，摇匀，将双层牛皮纸袋封口，对玉米长蠕孢菌进行培养，直至玉米长蠕孢菌长满高粱粒，此时，玉米长蠕孢菌高粱粒接种体制备完成。
步骤(4)中对玉米长蠕孢菌进行培养的具体方法为：将封口的双层牛皮纸袋在26℃、相对湿度60％条件下培养6d。
当双层牛皮纸袋超过一个时，两两双层牛皮纸袋之间的距离为15cm。
本发明的方法从准备到接种体制备完成周期短，一般2周即可完成。
Claims (10)
1.一种制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养容器的制备：将牛皮纸制作成上部开口的牛皮纸袋，然后将两个牛皮纸袋套在一起，在内层牛皮纸袋的内腔底部覆上防水加固介质，得到培养病原菌谷物粒接种体的双层牛皮纸袋；将双层牛皮纸袋进行高压湿热灭菌，再进行干燥，备用；
(2)谷物粒的准备：先将谷物粒加水浸泡，再加热煮沸，过滤，将谷物粒进行高压湿热灭菌，冷却后备用；
(3)病原菌孢子悬浮液的制备：将病原菌菌株活化，再将活化的病原菌接种至病原菌的产孢培养基中，促进病原菌产孢，得到病原菌孢子悬浮液；
(4)病原菌谷物粒接种体的培养：将步骤(2)制备得到的谷物粒装入步骤(1)的双层牛皮纸袋中，再将病原菌孢子悬浮液均匀洒在谷物粒上，将双层牛皮纸袋封口，对病原菌进行培养，直至病原菌长满谷物粒，即得。
2.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，所述的牛皮纸的重量为70-100g/m2；所述的双层牛皮纸袋的长为20-30cm，宽为10-15cm，高为25-35cm。
3.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，所述的防水加固介质为防水不干胶。
4.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，步骤(1)中高压湿热灭菌的温度为121℃，时间为30-60min；干燥的温度为50-70℃，时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，所述的谷物粒为玉米粒、小麦粒或高粱粒。
6.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，步骤(2)中谷物粒的浸泡时间为10-15h，加热煮沸时间为40-60min；谷物粒的高压湿热灭菌方法为：将谷物粒装入聚乙烯塑料袋中，装至聚乙烯塑料袋总容积的1/2，束口，在121℃高压湿热灭菌30-60min。
7.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，步骤(3)中病原菌孢子悬浮液的浓度为104个/ml以上。
8.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，步骤(4)中谷物粒装入双层牛皮纸袋的量为装至双层牛皮纸袋总容积的2/3。
9.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，步骤(4)中每1.5-2.5kg谷物粒洒25-40ml病原菌孢子悬浮液。
10.根据权利要求1所述的制备病原菌谷物粒接种体的方法，其特征在于，步骤(4)中对病原菌进行培养的具体方法为：将封口的双层牛皮纸袋在24-26℃、相对湿度50-80％条件下培养5-7d，两两双层牛皮纸袋之间的距离为5-15cm。
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