CN105850748B

CN105850748B - 一种松杉类植物种子的萌发方法

Info

Publication number: CN105850748B
Application number: CN201610365550.2A
Authority: CN
Inventors: 张丹; 张茂; 张家勋; 王东超
Original assignee: Henan City Gardener Gardening Co Ltd; HENAN HONGFENG INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: Henan Chengshiyuanding Horticulture Co ltd; Henan Hongfeng Biological High Tech Ltd By Share Ltd
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: CN105850748A

Abstract

本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种松杉类植物种子的萌发方法。该萌发方法包括：将松杉类植物种子进行消毒处理，切除远离种脐端的部分胚乳，然后进行生根培养；生根培养包括：将切除胚乳的种子接种到生根培养基中进行培养，待种子生根后接种共生菌进行培养，待长出须根后接种到炼苗培养基进行培养；生根培养基包括KT和NAA。本发明具有的有益效果为：按照本方法提供的萌发方法，银杉的萌发率从过去的不足10％提高到了60％，萌发幼苗的成活率从过去的50％提高到了现在的80％以上，对于实现银杉种群的扩大和迁地保护具有非常重要的作用。

Description

一种松杉类植物种子的萌发方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种松杉类植物种子的萌发方法。

背景技术

银杉(Cathaya argyrophylla Chun et Kuang)，是松科银杉属中的单属种，为我国珍稀濒危树种，是第一批进入国家一级保护植物名录中的植物之一。自1955年在我国被发现之后，引起国内外植物学家的极大兴趣，先后在我国的4个省(自治区)、8个残遗分布区、40多个分布点上找到了1m以上的植株1688株，川黔之间大娄山东段(金佛山、白马山、沙河、桐梓)4个分布区，湘桂之间越城岭北部(花坪、沙角洞)两个分布区，南达大瑶山金秀1个分布区，东至罗霄山脉八面山1个分布区。

绝大部分银杉植株分布在环境条件恶劣的悬岩绝壁，大树有枯枝断梢现象，小树因干旱或荫蔽多生长不良，林地幼苗幼树极少。目前，银杉的繁殖手段主要有播种育苗和无性繁殖两种，前者由于银杉结果期迟，坐果率低，大小年明显，种子多瘪粒，萌发率低，培育困难，幼苗生长缓慢，对环境变化极为敏感，容易死亡。后者无性繁殖分为扦插、嫁接、组培三种方式。经研究发现，采用不同浓度的ABT处理银杉枝条进行扦插，发现仅有1％～2％的插穗长出愈伤组织，但均不生根，而采用马尾松、黄山松、黑松、粤松、铁杉等作为砧木进行嫁接，成活率可达50％以上，但嫁接后生长不良，逐渐死亡。与湿地松、火炬松嫁接，大部分可成活，但也生长，但不亲和，生长不同步。和有性繁殖相比，无性繁殖是一种原始而低级的生殖方式，它是以单个个体作为进化的单位，而有性繁殖是以群体内不同个体产生雌雄配子的相互结合，综合了群体内较多的有利形状，所以在自然选择中可以立于不败之地。

根据银杉已趋于衰败的现象，不宜偏重无性繁殖，而应深入研究其濒危原因，采用有性繁殖，激发其特性，使其在多变的环境中能够生存、繁衍、壮大、繁荣。因此，急需解决银杉种子萌发率低、繁殖困难的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种松杉类植物种子的萌发方法。按照本方法提供的萌发方法，银杉的萌发率从过去的不足10％提高到了60％，萌发幼苗的成活率从过去的50％提高到了现在的80％以上，对于实现银杉种群的扩大和迁地保护具有非常重要的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种松杉类植物种子的萌发方法，包括：将松杉类植物种子进行消毒处理，切除远离种脐端的部分胚乳，然后进行生根培养；

生根培养包括：将切除胚乳的种子接种到生根培养基中进行培养，待种子生根后接种共生菌进行培养，待长出须根后接种到炼苗培养基进行培养；生根培养基包括激动素(KT)和萘乙酸(NAA)。

KT是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糖基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，分子式C₁₀H₉N₅O。不溶于水，溶于强酸、碱及冰醋酸中；除具有促进细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用。

NAA，中文名称1-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，是一种有机化合物，化学式：C₁₀H₇CH₂CO₂H，是一种易溶于有机溶剂的无色固体。它是一种植物激素生长素，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用。它也可用于植物组织培养。

在本发明提供的实施例中，松杉类植物为银杉。

本发明采用包含KT和NAA的培养基对银杉种子进行萌发培养，同时进行无菌培养，创造一个适合种子萌发的无菌环境，解决了种子萌发时被霉菌侵袭的问题，同时打破种子休眠，克服了银杉种子萌发率低的问题。同时，在幼苗生长健壮的条件下接种共生的土生空团菌，促进银杉幼苗生长。按照本发明方法进行银杉的种子育苗，种子萌发率可达80％以上。本方法适用于多数松杉类难萌发种类。

作为优选，KT的浓度为0.8～1.2mg/L，NAA的浓度为0.10～0.15mg/L。

优选地，KT的浓度为1.0mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L。

作为优选，生根培养的条件为：光照时间为8～12h/d，光照强度为2500～3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度为45％～50％。

在本发明提供的实施例中，生根培养的条件为：光照时间为12h/d，光照强度为2500～3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度为45％～50％。

作为优选，生根培养基为包括KT、NAA、蔗糖和琼脂的固体培养基，蔗糖的浓度为25～30g/L，琼脂的浓度为6～7g/L。

在本发明提供的实施例中，生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7g/L。

作为优选，炼苗培养基为包括蔗糖和琼脂的固体培养基，蔗糖的浓度为25～30g/L，琼脂的浓度为6～7g/L。

在本发明提供的实施例中，固体培养基为MS固体培养基。

在本发明提供的实施例中，共生菌为土生空团菌。

在本发明提供的实施例中，接种共生菌进行培养的条件为：温度为25℃，时间为24h，光照强度为3500lx。

作为优选，消毒处理为：在次氯酸溶液中浸泡10～20min，然后依次用酒精和氯化汞各消毒5～10min，无菌水冲洗，将外种皮剥离，放入双氧水中。

在本发明提供的实施例中，消毒处理为：在0.1％次氯酸溶液中浸泡10min，然后依次用75％酒精和0.1％氯化汞各消毒5min，无菌水冲洗5～6遍，将外种皮剥离，放入1％双氧水中。

在消毒处理之前，还包括种子的前处理。种子的前处理包含以下步骤：筛选颗粒饱满的松杉类植物种子，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除种皮上残留的虫卵、污渍，再用流水冲洗2h，晾干水份。

作为优选，切除远离种脐端的部分胚乳为切除远离种脐端的1/4～1/3体积的胚乳。

作为优选，生根培养后还包括炼苗。

炼苗包含以下步骤：

(1)选取生长健壮的瓶苗，先开瓶炼苗2d，使幼苗适应外界环境。

(2)将苗小心取出，不要伤到根系，流水冲净植株上附着培养基，洗不净则容易导致根系发霉腐烂最终死亡。

(3)将苗栽到事先准备好已灭菌的培养土中，培养土采用蛭石：泥炭＝1：1的比例进行配制。

(4)栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置阴凉处。

(5)1个月左右，待新叶、新根长出后放置向阳处培养，注意保持湿度，可白天覆膜，夜晚揭膜，温度保持在15～25℃，逐步加强通风。

(6)待幼苗长势健壮再进行露天栽植。

作为优选，MS固体培养基的配方为：NH₄NO₃ 0.42g/L、KNO₃ 0.48g/L、CaCl₂·2H₂O0.11g/L、MgSO₄·7H₂O 0.09g/L、KH₂PO₄ 0.04g/L、KI 0.815mg/L、H₃BO₃ 3.1mg/L、MnSO₄·4H₂O 11.15mg/L、ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.125mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0125mg/L、CoCl₂·6H₂O0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、IV B烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B₆)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B₁)0.1mg/L、甘氨酸2mg/L。琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，pH值为6.0，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126摄氏度下5分钟。

本发明提供了一种松杉类植物种子的萌发方法。该萌发方法包括：将松杉类植物种子进行消毒处理，切除远离种脐端的部分胚乳，然后进行生根培养；生根培养包括：将切除胚乳的种子接种到生根培养基中进行培养，待种子生根后接种共生菌进行培养，待长出须根后接种到炼苗培养基进行培养；生根培养基包括KT和NAA。本发明具有的有益效果为：按照本方法提供的萌发方法，银杉的萌发率从过去的不足10％提高到了60％，萌发幼苗的成活率从过去的50％提高到了现在的80％以上，对于实现银杉种群的扩大和迁地保护具有非常重要的作用。

具体实施方式

本发明公开了一种松杉类植物种子的萌发方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明实施例采用固体改良的MS培养基，具体配方为：NH₄NO₃ 0.42g/L、KNO₃0.48g/L、CaCl₂·2H₂O 0.11g/L、MgSO₄·7H₂O 0.09g/L、KH₂PO₄ 0.04g/L、KI 0.815mg/L、H₃BO₃ 3.1mg/L、MnSO₄·4H₂O 11.15mg/L、ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.125mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0125mg/L、CoCl₂·6H₂O0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L、肌醇100mg/L、IV B烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B₆)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B₁)0.1mg/L、甘氨酸2mg/L。琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，pH值为6.0，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126摄氏度下5分钟。

组培室条件为：光照时间12h/d，光照强度2500～3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度45％～50％，每3d用紫外灯灭菌30min。

本发明提供的松杉类植物种子的萌发方法中所用种子、激素、培养基组分、试剂等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、银杉种子的筛选、消毒、前处理技术

银杉种子采自四川金佛山，银杉种子瘪粒很多，首先采用浮选法对种子进行筛选，具体办法是：将500粒种子放入500ml烧杯中，加入350ml清水，震荡，静置24h，将漂浮在上层的瘪粒弃去，选择下沉的种子进行下一步的消毒处理。

2、种子的处理

(1)种子筛选后先用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除种皮上残留的虫卵、污渍等，再用流水冲洗2h，晾干水份。

(2)种子清洗完成后放入0.1％HClO中浸泡10min。

(4)在超净工作台内依次用75％酒精和0.1％HgCl各消毒5min。注：消毒液中加入数滴吐温80，消毒液的使用次数不超过10次，达到后倒掉重新配制。其中，酒精使用完毕后要求密封保存，避免挥发降低消毒效果；氯化汞要求避光保存，以免失效。

(5)消毒完成后，用无菌水冲洗5～6遍，每次浸泡时间要求长于3min。

(6)清洗完成后，在超净工作台内用手术刀和镊子把种子外种皮剥开，取出种子，放入1％H₂O₂中待用。

3、接种及培养

(1)在超净工作台内，切除种子远离种脐端的胚乳1/4到1/3体积，接种到灭菌后的加有KT 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的MS培养基中。

(2)培养20-30天后种子胚芽开始伸长，能看到切面有乳黄色胚芽伸出。

(3)30～50天后胚芽向上伸长，变为淡绿色，基本能看到针叶形态开始分化。

(4)60～80天后针叶展开，长大，胚根开始长出。

4、菌根培养

(1)将菌株接种在MMN培养基上，暗培养2～3个月，每40天继代一次。

(2)从生长旺盛的土生空团菌落边缘选取直径约6mm的菌块转接入银杉幼苗生长良好的培养基中，25℃恒温暗培养24h，后转入正常光照培养。

(2)80～100天后第一轮针叶完全展开，叶片绿色，背面有两条银色的气孔带，根系长出，须根开始发育。

(6)100～120天，根系发达，基本布满整个培养瓶。在超净工作台内，将长出须根的幼苗转接到不含激素的MS固体培养基中。

(4)继续培养45～60天后，幼苗根系发达茎干粗壮，叶片发育正常，可以进入炼苗阶段。

5、炼苗

(4)栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置阴凉处。

(6)待幼苗长势健壮再进行露天栽植。

6、试验结果统计

试验过程中统计银杉种子萌发率，并统计幼苗成活率。结果显示，本实施例试验条件下银杉种子的萌发率为60％，幼苗成活率为95％。

实施例2

1、银杉种子的筛选、消毒、前处理技术

2、种子的处理

(2)种子清洗完成后放入0.1％HClO中浸泡10min。

3、接种及培养

(1)在超净工作台内，切除种子远离种脐端的胚乳1/4到1/3体积，接种到灭菌后的加有KT 0.8mg/L、NAA 0.15mg/L的MS培养基中。

(4)60～80天后针叶展开，长大，胚根开始长出。

5、菌根培养

(3)将菌株接种在MMN培养基上，暗培养2～3个月，每40天继代一次。

(4)从生长旺盛的土生空团菌落边缘选取直径约6mm的菌块转接入银杉幼苗生长良好的培养基中，25℃恒温暗培养24h，后转入正常光照培养。

5、炼苗

(4)栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置阴凉处。

(6)待幼苗长势健壮再进行露天栽植。

6、试验结果统计

试验过程中统计银杉种子萌发率，并统计幼苗成活率。结果显示，本实施例试验条件下银杉种子的萌发率为58％，幼苗成活率为85％。

实施例3

1、银杉种子的筛选、消毒、前处理技术

2、种子的处理

(2)种子清洗完成后放入0.1％HClO中浸泡10min。

3、接种及培养

(1)在超净工作台内，切除种子远离种脐端的胚乳1/4到1/3体积，接种到灭菌后的加有KT 1.2mg/L、NAA 0.1mg/L的MS培养基中。

(4)60～80天后针叶展开，长大，胚根开始长出。

6、菌根培养

(5)将菌株接种在MMN培养基上，暗培养2～3个月，每40天继代一次。

(6)从生长旺盛的土生空团菌落边缘选取直径约6mm的菌块转接入银杉幼苗生长良好的培养基中，25℃恒温暗培养24h，后转入正常光照培养。

5、炼苗

(4)栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置阴凉处。

(6)待幼苗长势健壮再进行露天栽植。

6、试验结果统计

试验过程中统计银杉种子萌发率，并统计幼苗成活率。结果显示，本实施例试验条件下银杉种子的萌发率为60％，幼苗成活率为89％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种松杉类植物种子的萌发方法，其特征在于，包括：将松杉类植物种子进行消毒处理，切除远离种脐端的部分胚乳，然后进行生根培养；

所述生根培养包括：将切除胚乳的种子接种到生根培养基中进行培养，待种子生根后接种土生空团菌进行培养，待长出须根后接种到炼苗培养基进行培养；所述生根培养基为：0.8~1.2mg/L KT 、0.10~0.15mg/L NAA、25~30g/L蔗糖和6~7g/L琼脂的MS固体培养基；

MS固体培养基的配方为：NH₄NO₃ 0.42g/L、KNO₃ 0.48g/L、CaCl₂·2H₂O 0.11g/L、MgSO₄·7H₂O 0.09g/L、KH₂PO₄ 0.04g/L、KI 0.815mg/L、H₃BO₃ 3.1mg/L、MnSO₄·4H₂O11.15mg/L、ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.125mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0125mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、ⅣB烟酸 0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸 2mg/L，pH值为6.0；

所述生根培养的条件为：光照时间为8~12h/d，光照强度为2500~3500lx，培养温度为24~26℃，相对湿度为45%~50%。

2.根据权利要求1所述的萌发方法，其特征在于，所述炼苗培养基为包括蔗糖和琼脂的固体培养基，所述蔗糖的浓度为25~30g/L，所述琼脂的浓度为6~7g/L。

3.根据权利要求1所述的萌发方法，其特征在于，所述消毒处理为：在次氯酸溶液中浸泡10~20min，然后依次用酒精和氯化汞各消毒5~10min，无菌水冲洗，将外种皮剥离，放入双氧水中。

4.根据权利要求1所述的萌发方法，其特征在于，所述切除远离种脐端的部分胚乳为切除远离种脐端的1/4~1/3体积的胚乳。

5.根据权利要求1所述的萌发方法，其特征在于，所述生根培养后还包括炼苗。