CN105838735A - 一种人胰腺癌裸鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法及其应用。本发明运用Lonza核转染系统将携带有luc基因的质粒稳定转染人胰腺癌PANC‑1细胞，利用嘌呤霉素筛选出能稳定表达荧光素酶的细胞株PANC‑1‑LUC，进一步构建PANC‑1‑LUC裸鼠皮下移植瘤。体内外生物发光检测结果证实了本发明所构建的PANC‑1‑LUC细胞株能够稳定、长期地表达荧光素酶，由此建立的胰腺癌裸鼠模型，相比较慢病毒载体介导的生物发光胰腺癌裸鼠模型，具有成瘤潜伏期短、成瘤率高、肿瘤生长符合PANC‑1移植瘤的生长特点等优势，更适合活体成像研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
胰腺癌是一种全球常见的消化道恶性肿瘤，是预后最差的恶性肿瘤之一。早期确诊率低和术后转移是胰腺癌死亡率高的主要原因，临床上很难得到新鲜的、不同时期的胰腺癌病理组织标本，大大制约了对胰腺癌发生、发展过程的研究。近年来，活体成像技术作为一种高效、灵敏的新兴检测手段被广泛应用于肿瘤研究，尤其是生物发光成像技术，具有信号干扰小，成像本底较低，信噪比高且组织穿透力强等优点，特别适用于动物成像。因此，构建生物发光标记的胰腺癌细胞，在此基础上建立适用于活体成像研究的胰腺癌实验动物模型，对深入探讨胰腺癌的发病机制，寻找新的有效的治疗手段有着非常重要的意义。
目前，生物发光标记细胞最常用的方法是慢病毒载体介导的荧光素酶基因(luc)的细胞转染，慢病毒载体能通过感染细胞将外源基因有效整合到细胞染色体上，从而达到持久性表达。然而，慢病毒作为“自杀”性病毒，虽然其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，但是该病毒仍然具有可能的潜在生物学危险，易激发细胞免疫反应，同时，病毒核酸会随机插入宿主细胞从而影响细胞正常生长。因此，通过慢病毒转染获得稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞系在构建小鼠移植瘤模型的过程中，往往出现成瘤率低、潜伏期大大延长、肿瘤生长不正常、裸鼠状态差等问题。
本发明运用Lonza核转染系统将携带有luc基因的质粒稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞，利用嘌呤霉素筛选出能稳定表达荧光素酶的细胞株PANC-1-LUC，进一步构建PANC-1-LUC裸鼠皮下移植瘤，同样方法接种慢病毒载体构建的PANC-1-luc细胞作为对照，观察成瘤率、瘤体积，检测生物发光强度。体内外生物发光检测结果证实了本发明所构建的PANC-1-LUC细胞株能够稳定、长期地表达荧光素酶，由此建立的胰腺癌裸鼠模型，相比较慢病毒载体介导的生物发光胰腺癌裸鼠模型，具有成瘤潜伏期短、成瘤率高、肿瘤生长符合PANC-1移植瘤的生长特点等优势，更适合活体成像研究。为深入研究胰腺癌发生、发展、转移、肿瘤微环境以及肿瘤对药物的反应等打下了基础。
发明内容
本发明的目的是建立一种适合活体成像研究的胰腺癌动物模型，该模型成瘤潜伏期短，成瘤率高，肿瘤生长符合胰腺癌特点，并且具有稳定、高效、线性关系良好的生物发光特点，克服了慢病毒载体构建的生物发光标记细胞成瘤率低、成瘤潜伏期长、肿瘤生长不正常等缺点，特别适合胰腺癌活体成像研究。
本发明采用的技术方案如下：
一种人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)Lonza核转染系统将携带有luc基因的质粒稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞；
2)利用嘌呤霉素筛选出能稳定表达荧光素酶的细胞株PANC-1-LUC；
3)构建PANC-1-LUC裸鼠皮下移植瘤，移植瘤的光强度与瘤体积有显著的线性关系。
优选的，所述步骤1)采用SE Solution高效转染液重悬细胞，在LonzaNucleofectorTM核转染系统中将携带luc基因的GV258质粒载体稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞48h。
优选的，所述步骤2)嘌呤霉素的浓度为7.5μg/ml。
其中，所述嘌呤霉素筛选浓度的方法为：采用不同浓度的嘌呤霉素处理PANC-1细胞，选择4天细胞全部死亡的最小浓度作为筛选浓度。
更优选的，所述步骤2)为：采用7.5μg/ml嘌呤霉素筛选表达荧光素酶的阳性细胞21天，撤去嘌呤霉素，阳性克隆继续扩增培养，获得稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为PANC-1-LUC。
优选的，所述步骤3)接种PANC-1-LUC细胞的细胞浓度为2.5×107个/ml。
优选的，以PANC-1-LUC细胞构建裸鼠皮下移植瘤，调整细胞浓度为2.5×107个/ml，取200μl皮下接种于裸鼠颈背部；一周后观察成瘤率，并以游标卡尺测量裸鼠移植瘤的瘤结节最大直径a和最小径b，计算瘤体积(TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b2，同时，每周一次检测肿瘤生物发光强度。
另外本发明还提供了人胰腺癌裸鼠模型在活体成像中的应用。
下面对本发明作进一步的说明：
本发明采用SE Solution高效转染液重悬细胞，在Lonza NucleofectorTM核转染系统中将携带luc基因的GV258质粒载体稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞48h。
嘌呤霉素最佳筛选浓度的方法：采用不同浓度的嘌呤霉素(1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml)处理PANC-1细胞，选择4天细胞全部死亡的最小浓度作为筛选浓度。
本发明所述方法采用7.5μg/ml嘌呤霉素筛选表达荧光素酶的阳性细胞21天，撤去嘌呤霉素，阳性克隆继续扩增培养，获得稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为PANC-1-LUC。
本发明所述方法以PANC-1-LUC细胞构建裸鼠皮下移植瘤，调整细胞浓度为2.5×107个/ml，取200μl皮下接种于裸鼠颈背部。一周后观察成瘤率，并以游标卡尺测量裸鼠移植瘤的瘤结节最大直径a和最小径b，计算瘤体积(TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b2，同时，每周一次检测肿瘤生物发光强度。
本发明所述的PANC-1-LUC细胞，体内外光通量值与细胞数之间呈显著的直线相关，在此基础上建立的裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤快，成瘤率高，皮下肿瘤生长符合Gompertzian曲线，移植瘤的光强度与瘤体积有显著的线性关系。相比较慢病毒载体方法，更适合胰腺癌活体成像研究。
附图说明
图1为PANC-1细胞转染后经嘌呤霉素筛选在显微镜下的细胞形态(×100)；
其中，图1A为PANC-1细胞转染后加嘌呤霉素筛选第2天的细胞形态；图1B为筛选14天单克隆的细胞形态；图1C为筛选21天阳性克隆增殖的细胞形态。
图2为活体成像系统检测PANC-1-LUC细胞荧光素酶的表达；
其中，图2A表示PANC-1细胞转染带有荧光素酶基因的质粒(GFP标记)24h后，荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，90％以上的细胞表达绿色荧光；图2B为PANC-1-LUC细胞生物发光图；图2C为PANC-1-LUC细胞生物发光值。
图3为活体成像系统检测PANC-1-LUC细胞在裸鼠体内荧光素酶的表达；
其中，图3A表示皮下注射不同浓度PANC-1-LUC细胞1h后裸鼠的生物发光成像，编号1-12分别代表了不同的细胞数，1、2：1×107，3、4：5×106，5、6：2×106、7、8：1×106，9、10：5×105，11、12：2×105；图3B表示PANC-1-LUC细胞在裸鼠体内的生物发光值。
图4为裸鼠皮下移植瘤的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。
实施例1：嘌呤霉素最佳筛选浓度的测定
(1)材料：嘌呤霉素、人胰腺癌PANC-1细胞(购于美国ATCC)。
(2)实验方法：将处于对数生长期的PANC-1细胞用0.25％胰酶消化，以50％的细胞密度接种于6孔板中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃，5％CO2培养箱培养过夜。第2天加入不同浓度的嘌呤霉素(1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml)，每2天更换新的含有不同浓度嘌呤霉素的培养基，选择4天细胞全部死亡的最小浓度作为筛选浓度。
(3)实验结果：培养第2天，5μg/ml以上剂量嘌呤霉素孔中细胞出现大量死亡。培养3天后，每孔均可见不同程度的细胞死亡，培养4天后，嘌呤霉素浓度为7.5μg/ml和10μg/ml的孔中细胞全部死亡。因此确定嘌呤霉素对人胰腺癌PANC-1细胞的最佳筛选浓度为7.5μg/ml。
实施例2：构建稳定表达荧光素酶的PANC-1细胞
(1)材料：带有荧光素酶基因的质粒载体GV258，嘌呤霉素，NucleofectorTM Solution SEKit。
(2)实验方法
1.1细胞转染
取复苏后第4代PANC-1细胞，以0.25％trypsin+0.02％EDTA消化细胞，1000r/min离心5min收集细胞，取5×106个细胞，轻轻弹试管底部将细胞混匀，以SE Solution重悬细胞，加入8μg表达荧光素酶的GV258质粒载体，将细胞悬液轻轻加入电转杯中，4D-NucleofectorTM System核转染系统以DN-100程序进行细胞转染。以37℃预热的培养基将电转杯中的细胞转移至6孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养箱培养48h。
1.2稳定表达荧光素酶的PANC-1细胞筛选
收集6孔细胞培养板中PANC-1细胞，以2×103细胞数接种于96孔细胞培养板，第2天待细胞贴壁后，加入7.5μg/ml嘌呤霉素，每2-3天更换新鲜的含嘌呤霉素的培养基。嘌呤霉素处理后未转染细胞大量死亡，耐药细胞克隆继续生长，连续观察21天，21天后撤去嘌呤霉素，存活的单克隆细胞继续常规扩增培养。
(3)实验结果
处于对数生长期的PANC-1细胞经4D-NucleofectorTM System核转染系统转染携带有luc基因的质粒GV258，48h后，加入嘌呤霉素(7.5μg/ml)，第2天细胞出现大量死亡，仅有少部分细胞存活，14天形成克隆，形成的克隆继续在含嘌呤霉素的培养基中筛选培养，第21天撤去嘌呤霉素，存活的细胞克隆继续常规扩开培养，获得稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为PANC-1-LUC。结果详见图1。
实施例3：活体成像系统检测PANC-1-LUC细胞荧光素酶的表达
(1)材料：PANC-1-LUC细胞，D-荧光素钾盐，异氟烷。
实验动物：SPF级BALB/c-nu/nu裸鼠，雄性，4-5周龄。
(2)实验方法
1.1体外生物发光检测
取对数生长期的PANC-1-LUC细胞消化、计数，将细胞浓度调整为5×105个/ml，每孔100μl接种于黑色的96孔板中，依次逐孔倍比稀释，每个数量级的细胞设3个平行孔，各孔加入100μl D-荧光素(150μg/ml)，于活体成像系统中进行检测。
1.2体内生物发光检测
取对数生长期的PANC-1-LUC细胞消化、计数，调整细胞密度为5×107个/ml，再依次稀释为2.5×107个/ml、1×107个/ml、5×106个/ml、2.5×106个/ml、1×106个/ml，分别取200μl接种于3只裸鼠的背侧皮下(共12个点)。瘤细胞接种后1h经腹腔给予D-荧光素(150mg/kg)，注射15min后，用麻醉机进行小鼠异氟烷麻醉，置于小动物活体成像仪中检测荧光素酶的表达情况。
(3)实验结果：携带有luc基因的质粒经4D-NucleofectorTM System核转染系统可以有效转染PANC-1细胞，经7.5μg/ml嘌呤霉素筛选21天得到高表达荧光素酶的阳性细胞株。在活体成像系统中观察不同接种浓度细胞的生物发光情况，在接种6250个细胞的孔内可见明确的蓝色，并且孔底面的颜色随着接种细胞数的增多而变亮，经SPSS线性回归分析，细胞数目与发光值呈直线相关(P<0.01)，R2＝0.9775。证明了荧光素酶基因已经稳定转入PANC-1细胞中。结果详见图2。
皮下接种不同浓度PANC-1-LUC细胞后1h，活体成像系统中可明确检测到接种部位有生物发光，且光强度随接种细胞数的增多而增强。经SPSS线性回归分析，接种细胞数与发光值具有显著的线性关系(P<0.01)，R2＝0.8517。结果详见图3。
实施例4：PANC-1-LUC裸鼠皮下移植瘤生长及生物发光特点分析
(1)材料：PANC-1-LUC细胞，D-荧光素钾盐，异氟烷。
实验动物：SPF级BALB/c-nu/nu裸鼠，雄性，4-5周龄。
(2)实验方法：取对数生长期PANC-1-LUC细胞，调整细胞浓度为2.5×107个/ml，取200μl皮下接种于裸鼠颈背部，以同样方法皮下接种相同浓度慢病毒载体构建的PANC-1-luc细胞作为对照。一周后观察成瘤率，并以游标卡尺测量裸鼠移植瘤的瘤结节最大直径a和最小径b，计算瘤体积(TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b2，同时，每周一次检测肿瘤生物发光强度。
(3)实验结果：PANC-1-LUC细胞皮下接种裸鼠，潜伏期为3～5天，1周后成瘤率达到80％以上。而同样条件下接种的慢病毒载体构建的PANC-1-luc细胞，潜伏期需10～14天，接种10天后成瘤率仅为30％，19天后成瘤率才达到80％。观察6周，PANC-1-LUC裸鼠皮下肿瘤生长曲线符合Gompertzian曲线，而慢病毒载体构建的PANC-1-luc细胞移植瘤接种30天后才出现对数生长。详见图4。
活体成像系统检测移植瘤生物发光强度，分析其与瘤体积的相关性，结果如表1所示。接种后10、19、27、34、40天均可明确检测到接种部位有生物发光，并且在后4次检测中，PANC-1-LUC移植瘤的光强度与瘤体积具有显著的线性关系(P<0.05)。而慢病毒载体构建的PANC-1-luc移植瘤在前3次的检测中，光强度与瘤体积相关系数很小，未呈现线性关系(P>0.05)，在34d和40d的检测中，两者呈现较高的相关系数，具有显著的线性关系(P<0.01)。
表1裸鼠皮下移植瘤生物发光强度及其与瘤体积的相关性
*P<0.05,**P<0.01,生物发光强度与瘤体积线性关系的显著性检验。
Claims (8)
1.一种人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)Lonza核转染系统将携带有luc基因的质粒稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞；
2)利用嘌呤霉素筛选出能稳定表达荧光素酶的细胞株PANC-1-LUC；
3)构建PANC-1-LUC裸鼠皮下移植瘤，移植瘤的光强度与瘤体积有显著的线性关系。
2.根据权利要求1所述的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤1)采用SE Solution高效转染液重悬细胞，在LonzaNucleofectorTM核转染系统中将携带luc基因的GV258质粒载体稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞48h。
3.根据权利要求1所述的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤2)嘌呤霉素的浓度为7.5μg/ml。
4.根据权利要求4所述的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：所述嘌呤霉素筛选浓度的方法为：采用不同浓度的嘌呤霉素处理PANC-1细胞，选择4天细胞全部死亡的最小浓度作为筛选浓度。
5.根据权利要求1所述的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤2)为：采用7.5μg/ml嘌呤霉素筛选表达荧光素酶的阳性细胞21天，撤去嘌呤霉素，阳性克隆继续扩增培养，获得稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为PANC-1-LUC。
6.根据权利要求1所述的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤3)接种PANC-1-LUC细胞的细胞浓度为2.5×107个/ml。
7.根据权利要求1所述的适用于活体成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤3)为：以PANC-1-LUC细胞构建裸鼠皮下移植瘤，调整细胞浓度为2.5×107个/ml，取200μl皮下接种于裸鼠颈背部；一周后观察成瘤率，并以游标卡尺测量裸鼠移植瘤的瘤结节最大直径a和最小径b，计算瘤体积(TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b2，同时，每周一次检测肿瘤生物发光强度。
8.权利要求1-7任一所述方法制备的人胰腺癌裸鼠模型在活体成像中的应用。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111304250A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-19 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用 |
| CN112369369A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-02-19 | 嘉兴学院 | 一种人源黑素瘤细胞a375/dr5稳转株裸鼠移植瘤模型的构建方法及其应用 |
| CN112553166A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-26 | 广西医科大学附属武鸣医院 | 基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法 |
| CN113455465A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-01 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | 人前列腺癌LNCaP细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法 |
| CN113736740A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-12-03 | 天津市肿瘤医院（天津医科大学肿瘤医院） | 胰腺癌稳转细胞系及其构建方法和应用 |
| CN114621930A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-06-14 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种胰腺癌动物模型的构建方法及其应用 |
| CN117305244A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-12-29 | 湖南省肿瘤医院 | 人胰腺癌细胞株及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103743902A (zh) * | 2013-11-25 | 2014-04-23 | 南通大学附属医院 | 检测沉默gpc-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法 |
-
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- 2016-02-19 CN CN201610093498.XA patent/CN105838735B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103743902A (zh) * | 2013-11-25 | 2014-04-23 | 南通大学附属医院 | 检测沉默gpc-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GHADIRLAN P等: "Epidemiology of pancreatic cancer：an overview", 《CANCER DETECT PREV》 * |
| 屠珏 等: "电转系统介导的荧光素酶稳定表达PANC-1细胞的构建及其生物发光成像检测", 《中国细胞生物学学报》 * |
| 杨阿碰 等: "Amaxa NucleofectorTM核转染仪转染白血病细胞株L1210", 《中国实验血液学杂志》 * |
| 王剑超 等: "活体成像技术动态观测华蟾素对裸小鼠BxPC3-luc2异体移植胰腺癌的抗肿瘤作用", 《浙江中医药大学学报》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111304250A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-19 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用 |
| CN112369369A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-02-19 | 嘉兴学院 | 一种人源黑素瘤细胞a375/dr5稳转株裸鼠移植瘤模型的构建方法及其应用 |
| CN112553166A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-26 | 广西医科大学附属武鸣医院 | 基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法 |
| CN113455465A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-01 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | 人前列腺癌LNCaP细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法 |
| CN113455465B (zh) * | 2021-06-29 | 2023-02-28 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | 人前列腺癌LNCaP细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法 |
| CN113736740A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-12-03 | 天津市肿瘤医院（天津医科大学肿瘤医院） | 胰腺癌稳转细胞系及其构建方法和应用 |
| CN114621930A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-06-14 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种胰腺癌动物模型的构建方法及其应用 |
| CN117305244A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-12-29 | 湖南省肿瘤医院 | 人胰腺癌细胞株及其应用 |
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