CN105838605B - 细胞培养皿及其细胞取样方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞培养皿及其细胞取样方法，细胞培养皿包括：培养皿孔，培养待分离的细胞，套桶，在提取细胞时置于培养皿孔中，圈定目标位置的细胞提取区域，套桶具有三种类型，分别是：第一套桶、第二套桶、第三套桶；第一套桶内具有第一取样孔，与第一套桶共圆心；第二套桶内具有第二取样孔，与第二套桶的圆心相偏离；第三套桶具有第三取样孔，位于第三套桶的桶壁边缘。本发明的细胞培养皿，由于具有三个类型的套桶，每种套桶中的取样孔位置不同，以覆盖培养皿孔中不同位置的目的细胞，从而提高了取样的目的性。

Description

细胞培养皿及其细胞取样方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养皿及其细胞取样方法，属于生物实验器材领域。

背景技术

细胞转染是将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。转染72小时后将转染细胞传代，用含有特定抗生素的选择培养基培养。经一段时间培养后未能成功转染外源基因的细胞被杀死，培养皿中可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆：

①滤纸片法：用消毒的5x5mm滤纸片浸过胰酶，将滤纸片贴在单细胞集落上10-15秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。细胞在24孔板中长满后转入25cm²培养瓶中，长满后再转入75cm²培养瓶中培养。

②有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10-2-10-10)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，7-10天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

转染效率低下、无法筛选出稳定表达转染基因的细胞株是细胞转染中经常遇到的主要技术难题。而上述两种筛选方法对实验技术要求高，且可控性低。如方法1中定位微小的细胞集落并将其移出是很大的挑战。方法2，筛选效率低，经常出现培养孔中无细胞或有多个克隆，而如果抗生素筛选过程中未能全部杀死未转染细胞，则此方法筛选成功率大为降低；另外如果转染效率低则上述矛盾更为突出，很难筛选出转染的单克隆细胞。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提新设计的细胞培养容器来提高筛选效率，提高实验成功率，缩短实验周期。

本发明采用了如下技术方案：

一种细胞培养皿，其特征在于，包括：培养皿孔，培养待分离的细胞，套桶，在提取细胞时置于培养皿孔中，圈定目标位置的细胞提取区域，套桶具有三种类型，分别是：第一套桶、第二套桶、第三套桶；第一套桶内具有第一取样孔，与第一套桶共圆心；第二套桶内具有第二取样孔，与第二套桶的圆心相偏离；第三套桶具有第三取样孔，位于第三套桶的桶壁边缘。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，第一套桶、第二套桶和第三套桶均具有镊子夹取片，设置在套桶上部的边缘，供镊子夹取。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，培养皿孔的底面上具有由同心圆和经过圆心的直线构成的定位线。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，第一套桶、第二套桶和第三套桶的侧壁外侧具有纵向凹槽。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，培养皿孔的内壁具有纵向的突起，与纵向凹槽相匹配。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，在第一取样孔、第二取样孔和第三取样孔的下部开口处，均具有向下突出的边缘。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，培养皿孔的底面具有经过圆心的直线，经过圆心的直线与纵向的突起相对应。

进一步，本发明的细胞培养皿，还可以具有这样的特征：其中，所述突起分布于所述培养皿孔的下部。

本发明提供一种细胞取样的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、确定目的细胞在培养皿孔底部的区域位置；

步骤二、若目的细胞在培养皿孔底部的中心位置，则选用第一套桶，若目的细胞位于远离培养皿孔底部中心位置，并且未达到培养皿孔的侧壁位置时，选用第二套桶，若目的细胞位于靠近培养皿孔的侧壁的位置时，选用第三套桶；

步骤三、吸出培养皿孔中的培养液，将步骤二中选定的套桶置于培养皿孔的上方，旋转套桶，直至取样孔位于目的细胞区域的上方，放下套桶，使取样孔圈定待取样区域；

步骤四、向取样孔中加入细胞消化液，待取样孔区域内的细胞被消化下来后，将细胞取出，完成取样。

本发明还提供一种细胞取样的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、确定目的细胞在培养皿孔底部的区域位置；

步骤二、若目的细胞在培养皿孔底部的中心位置，则选用第一套桶，若目的细胞位于远离培养皿孔底部中心位置，并且未达到培养皿孔的侧壁位置时，选用第二套桶，若目的细胞位于靠近培养皿孔的侧壁的位置时，选用第三套桶；

步骤三、吸出培养皿孔中的培养液，将步骤二中选用的套桶的下端放入培养皿孔，旋转套桶，使得取样孔位于目的细胞区域的上方，放下套桶，使取样孔圈定待取样区域；

步骤四、向取样孔中加入细胞消化液，待取样孔区域内的细胞被消化下来后，将细胞取出，完成取样。

发明的有益效果

本发明通过一种新设计的细胞培养容器来提高筛选效率，提高实验成功率，缩短实验周期。如果转染效率低，可在转染后药物筛选前用本装置选取转染成功细胞所占比例较高的区域的细胞，提高转染成功细胞所占比例(如转染率30％，用本装置初步筛选后转染成功细胞所占比例提高到50-80％)后再用抗生素筛选可显著提高实验成功率。也可用本装置代替滤纸片法进行筛选：通过培养皿底面刻度可准确定位单细胞集落，盖上相应的盖片后可准确、安全的从细胞提取窗内将细胞提取出来。

本发明的细胞培养皿，由于具有三个类型的套桶，每种套桶中的取样孔位置不同，以覆盖培养皿孔中不同位置的目的细胞，从而提高了取样的目的性，进而提高了筛选转染细胞的效率。

附图说明

图1是单个培养皿孔的结构示意图；

图2是单个培养皿孔的俯视图；

图3是第一套桶的结构示意图；

图4是第一套桶的俯视图；

图5是第二套桶的结构示意图；

图6是第二套桶的俯视图；

图7是第三套桶的结构示意图；

图8是第三套桶的俯视图；

图9是实施例二中培养皿孔的结构示意图；

图10是实施例二中第一套桶的结构示意图；

图11是实施例三中第三套桶的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。

<实施例一>

图1是培养皿单个孔的结构示意图，培养皿有多种规格和尺寸，从培养孔的数目上来分有6孔，12孔，24孔，48孔，96孔等规格。图1中仅显示其中一个培养皿孔。如图1和图2所示，在单个培养皿孔10的底部具有多个同心圆13和经过同心圆圆心的直线12，同心圆13和直线12共同形成定位线。如图2所示，同心圆与十字线将培养皿底部划分为多个区域，假设培养皿孔底面的面积是S，假设三个同心圆的半径分别为a、b、c，则满足下列关系式：c＝2a，的半径设置，会使得区域A的面积是1/8S，区域B的面积是1/8S，区域C的面积是1/16S。因此可以通过设置不同的同心圆的半径，使得A、B、C三个区域的面积成为一个特定的值，使得估计与这三个区域形状相同的其它区域内的细胞数量更加简便。

如图3至图8所示，本实施方式提供了三种套桶，置于上述的培养皿孔10中，以单独获取特定区域的细胞。

如图3和图4所示，第一套桶20的底面中间具有第一取样孔21，第一取样孔21的圆心与第一套桶20的圆心重合。第一取样孔21的下部开口于第一套桶20的底面上。第一套桶20的外径与培养皿孔10的内径相匹配，使得第一套桶20刚好能够放入培养皿孔10中。当需要取得培养皿孔10的圆心附近区域的细胞时，用镊子夹住镊子夹取片22将第一套桶20放入培养皿孔10中，第一取样孔21将与之对应区域内的细胞圈起，形成一个独立的空间，此时向第一取样孔21中加入胰酶，消化并移走此区域内的细胞。第一套桶20的底面为透明的着色区域，例如蓝色或者紫色。使得第一取样孔21在底面上的开孔在显微镜下容易找到。

如图1和图2所示，培养皿孔的侧壁上具有纵向突起11，第一套桶的侧壁上具有纵向凹槽23。纵向突起11与纵向凹槽23相匹配。同样的，第二套桶和第三套桶的侧壁上均开有纵向凹槽。在套桶放入细胞培养皿之后防止二者之间发生相对转动，使取样孔的位置固定。

进一步，培养皿孔的侧壁上的纵向突起11与培养皿孔底面上的直线12相对应，可以在直线12上设置数字刻度来方便定位。例如目的细胞位于图2中B区域所在的范围内，B区域两侧的直线上的数字编号定位了B区域的位置，在纵向突起11上设置与直线12相同的数字编号。操作人员在操作培养皿和套桶时，通常情况下其视角倾斜，看到侧壁的位置比较方便。因此在套桶放入培养皿孔时，操作人员看到纵向突起11位置的数字刻度对取样孔进行预定位，再在显微镜下进一步将取样孔对准目的细胞所在的区域，进一步加快定位的速度。

如图5和图6所示，第二套桶30的底面，偏离中间的位置具有第二取样孔31。第二取样孔31的圆心偏离第二套桶30的圆心。使得第二取样孔31的取样位置对应位于培养皿孔底面圆形的外围同心圆范围内的细胞。当目的细胞处于图2中的E位置的五角星处时，可使用第二套桶30对此处的细胞进行取样。取样时，用镊子夹住镊子夹取片32将第二套桶30置于培养皿孔10的上方，并旋转第二套桶30使E位置位于第二取样孔31的开口范围内，然后放下第二套桶30，进行后续的取细胞操作。第二套桶30的底面为透明的着色区域，例如蓝色或者紫色。使得第二取样孔31在底面上的开孔在显微镜下容易找到。

如图7和图8所示，第三套桶40的边缘处具有第三取样孔41，第三取样孔41为扇环形缺口，扇环形缺口除了与第三套桶40的孔壁接触的一边以外，其余各边均具有高起的套桶壁，第三取样孔41与培养皿孔的孔壁配合，形成如图8所示的细胞取样区域D。当目的细胞位于培养皿孔的边缘靠近培养皿孔的孔壁位置时，使用第三套桶40进行取样。取样时，用镊子夹住镊子夹取片42将第二套桶30置于培养皿孔10的上方，并旋转第三套桶40使目的细胞位于第三取样孔41的开口范围内，然后放下第三套桶40，进行后续的取细胞操作。同样的，第三套桶40的底面为透明的着色区域，例如蓝色或者紫色。使得第三取样孔41在显微镜下容易找到。

第一取样孔21、第二取样孔31和第三取样孔41的开孔面积相等，均为培养皿孔底面的面积S的1/8。

以下介绍使用本发明的细胞培养皿进行细胞提取的方法。

步骤一、确定目的细胞在培养皿孔底部的区域位置；

步骤二、若目的细胞在培养皿孔底部的中心位置，则选用第一套桶，若目的细胞位于远离培养皿孔底部中心位置，并且未达到培养皿孔的侧壁位置时，选用第二套桶，若目的细胞位于靠近培养皿孔的侧壁的位置时，选用第三套桶；

步骤三、吸出培养皿孔中的培养液，将步骤二中选定的套桶置于所述培养皿孔的上方，旋转套桶，直至取样孔位于目的细胞区域的上方，放下所述套桶，使取样孔圈定待取样区域；

步骤四、向取样孔中加入细胞消化液，待取样孔区域内的细胞被消化下来后，将细胞取出，完成取样。

<实施例二>

本实施例中的培养皿与实施方式一中的基本相同，不同之处在于：培养皿孔和套桶上的凸起和凹槽的长度与实施例一中不同。本实施方式以第一套桶为例进行说明，其它套桶的凹槽和突起设置与第一套桶一致。

如图9和图10所示，培养皿孔50上的纵向的凸起51并未完全贯穿孔壁，也就是说在培养孔50的孔壁上部没有凸起结构。第一套桶60上的纵向的凹槽61上下贯通桶壁，或者仅分布在套桶的下半部分，这样的设置使得当套桶60放入培养皿50的上部时，由于二者的重叠部分没有凸起结构，二者能够相对转动，当套桶60放到培养皿孔的上部之后仍然能够对取样孔的位置进行定位。同时，套桶60的下部放入培养皿孔的上部之后，培养皿孔还能起到稳定套桶的作用，使套桶60进行取样孔定位的过程更稳定。当第一套桶60完全放入培养皿50中之后，凸起51和凹槽61部分重叠，防止套桶和培养皿孔之间发生相对转动。

基于上述结构上的不同，本实施方式的细胞取样方法也与实施例一中不同。具体如下：

本发明还提供一种细胞取样的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、确定目的细胞在培养皿孔底部的区域位置；

步骤二、若目的细胞在培养皿孔底部的中心位置，则选用第一套桶，若目的细胞位于远离培养皿孔底部中心位置，并且未达到培养皿孔的侧壁位置时，选用第二套桶，若目的细胞位于靠近培养皿孔的侧壁的位置时，选用第三套桶；

步骤三、吸出培养皿孔中的培养液，将步骤二中选用的套桶的下端放入培养皿孔，旋转套桶，使得取样孔位于目的细胞区域的上方，放下套桶，使取样孔圈定待取样区域；

步骤四、向取样孔中加入细胞消化液，待取样孔区域内的细胞被消化下来后，将细胞取出，完成取样。

<实施例三>

本实施方式中的培养皿和套桶可以采用实施例一或实施二中的结构均可。

本实施方式与前两个实施方式的区别在于，第一取样孔、第二取样孔和第三取样孔的下端开口处具有一圈突起的边缘，以第三套桶40为例，如图11所示，第三取样孔41向下延伸出突起的边缘43。三个取样孔的突起的边缘作用是起支撑作用，防止套桶的底部损伤取样孔以外的细胞。同时这一圈突起能将选取细胞区域与其他区域分开。防止细胞消化液或者细胞漏出。

<实施例四>

本实施方式中，与上述实施方式的不同之处在于，取消镊子夹取片，代之以增加套桶的侧壁高度，使套桶的侧壁高出培养皿孔一段距离，这样更加方便使用镊子夹取。

Claims (10)

1.一种细胞培养皿，其特征在于，包括：

培养皿孔，培养待分离的细胞，

套桶，在提取细胞时置于所述培养皿孔中，圈定目标位置的细胞提取区域，

所述套桶包括：

第一套桶、第二套桶、第三套桶；

第一套桶内具有第一取样孔，与所述第一套桶共圆心；

第二套桶内具有第二取样孔，与所述第二套桶的圆心相偏离；

第三套桶具有第三取样孔，位于第三套桶的桶壁边缘。

2.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，所述第一套桶、所述第二套桶和所述第三套桶均具有镊子夹取片，设置在套桶上部的边缘，供镊子夹取。

3.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，所述培养皿孔的底面上具有由同心圆和经过圆心的直线构成的定位线。

4.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，所述第一套桶、所述第二套桶和所述第三套桶的侧壁外侧具有纵向凹槽。

5.如权利要求4所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，所述培养皿孔的内壁具有纵向的突起，与所述纵向凹槽相匹配。

6.如权利要求1所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，在第一取样孔、第二取样孔和第三取样孔的下部开口处，均具有向下突出的边缘。

7.如权利要求5所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，所述培养皿孔的底面具有经过圆心的直线，所述经过圆心的直线与所述纵向的突起相对应。

8.如权利要求5所述的细胞培养皿，其特征在于：

其中，所述突起分布于所述培养皿孔的下部。

9.一种利用权利要求1-7中任意一项所述的细胞培养皿进行细胞取样的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、确定目的细胞在培养皿孔底部的区域位置；

步骤二、若目的细胞在培养皿孔底部的中心位置，则选用第一套桶，若目的细胞位于远离培养皿孔底部中心位置，并且未达到培养皿孔的侧壁位置时，选用第二套桶，若目的细胞位于靠近培养皿孔的侧壁的位置时，选用第三套桶；

步骤三、吸出培养皿孔中的培养液，将步骤二中选定的套桶置于所述培养皿孔的上方，旋转套桶，直至取样孔位于目的细胞区域的上方，放下所述套桶，使取样孔圈定待取样区域；

步骤四、向取样孔中加入细胞消化液，待取样孔区域内的细胞被消化下来后，将细胞取出，完成取样。

10.一种利用权利要求8中所述的细胞培养皿进行细胞取样的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、确定目的细胞在培养皿孔底部的区域位置；

步骤二、若目的细胞在培养皿孔底部的中心位置，则选用第一套桶，若目的细胞位于远离培养皿孔底部中心位置，并且未达到培养皿孔的侧壁位置时，选用第二套桶，若目的细胞位于靠近培养皿孔的侧壁的位置时，选用第三套桶；

步骤三、吸出培养皿孔中的培养液，将步骤二中选用的套桶的下端放入培养皿孔，旋转套桶，使得取样孔位于目的细胞区域的上方，放下所述套桶，使取样孔圈定待取样区域；

步骤四、向取样孔中加入细胞消化液，待取样孔区域内的细胞被消化下来后，将细胞取出，完成取样。