CN105837679A - 多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用 - Google Patents

多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105837679A
CN105837679A CN201610284885.1A CN201610284885A CN105837679A CN 105837679 A CN105837679 A CN 105837679A CN 201610284885 A CN201610284885 A CN 201610284885A CN 105837679 A CN105837679 A CN 105837679A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ndrg2
tat
peptide
polypeptide
astrocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610284885.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105837679B (zh
Inventor
李燕
尹安琪
郭航
熊利泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fourth Military Medical University FMMU
Original Assignee
Fourth Military Medical University FMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fourth Military Medical University FMMU filed Critical Fourth Military Medical University FMMU
Priority to CN201610284885.1A priority Critical patent/CN105837679B/zh
Publication of CN105837679A publication Critical patent/CN105837679A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105837679B publication Critical patent/CN105837679B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。本发明的多肽的序列为：igvgvgagayilaryalnhp。通过静脉注射本发明的肽使其穿透血脑屏障，进入星形胶质细胞，增加细胞内Na+/K+‑ATPase β1的稳定性，促进Na+跨膜浓度梯度形成和维持，谷氨酸摄取能力明显增强。缺血性脑卒中病理过程中伴随谷氨酸的大量堆积，运用本发明的多肽治疗，可以减轻缺血损伤。

Description

多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及多肽NDRG2141-160、连接TAT制备TAT-NDRG2141-160融合肽段，以及该融合肽段穿过血脑屏障与Na+/K+-ATPaseβ1结合，促进星形胶质细胞谷氨酸摄取能力，并有效降低脑细胞外液兴奋性神经递质谷氨酸的浓度。
背景技术
谷氨酸是中枢神经系统含量最多的兴奋性神经递质，主要由突触前膜释放，与突触后膜上的谷氨酸受体结合，介导神经元兴奋和兴奋传递。突触间隙的谷氨酸必须保持在较低的浓度，从而保证谷氨酸受体的高度敏感以及避免谷氨酸堆积诱发的兴奋性毒性损伤。多种神经系统病变，包括急性脑缺血和脑外伤、慢性神经退行性疾病如阿尔茨海默病、癫痫等均与脑中兴奋性神经递质谷氨酸诱发的兴奋性神经毒性损伤有关。目前针对兴奋性毒性损伤的治疗，主要集中在突触后膜的谷氨酸受体，比如开发了一系列NMDAR(一种谷氨酸受体)拮抗剂，如美金刚等。但是这类谷氨酸受体拮抗剂对缺血性脑卒中患者的临床疗效不佳，有很多副作用，可能与拮抗剂彻底阻断谷氨酸的生理效应有关。因此，对于缺血性脑卒中的治疗，急需寻找新的、更安全、更有效的药物靶点。
发明内容
由于突触间隙缺乏使谷氨酸失活的酶，谷氨酸的清除主要依赖突触周围的星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体摄取多余的谷氨酸。谷氨酸转运体摄取谷氨酸的同时将Na+同向转运到星形胶质细胞内，因此跨细胞膜的Na+浓度差驱动着谷氨酸的摄取。而分布于星形胶质细胞膜表面的Na+/K+-ATPase负责将细胞中的Na+转运到细胞外，维持跨细胞膜的Na+浓度差。如果从星形胶质细胞摄取谷氨酸的角度考虑增加其摄取能力，有可能减轻谷氨酸介导的兴奋性神经损伤。
NDRG2(Human N-myc downstream regulated gene 2)基因主要在哺乳动物星形胶质细胞中表达。发明人在前期研究中发现NDRG2可以与Na+/K+-ATPaseβ1亚基相互作用，促进Na+/K+-ATPase的酶活性和Na+转运。Na+/K+-ATPaseβ1亚基是Na+/K+-ATPase的组成性亚基，可以促进全酶正确定位于细胞膜发挥其酶活性。发明人还发现，NDRG2通过与Na+/K+-ATPaseβ1亚基相互作用，调节星形胶质细胞摄取谷氨酸。发明人进一步筛选到NDRG2141-160这20个氨基酸片段是其与Na+/K+-ATPaseβ1相互作用并稳定Na+/K+-ATPaseβ1、促进谷氨酸摄取的关键片段。用该关键片段处理星形胶质细胞，可以增强Na+/K+-ATPaseβ1蛋白稳定性、促进Na+/K+-ATPase介导的Na+转运、促进谷氨酸摄取。
为此，本发明的目的之一是提供一种多肽。
本发明所提供的多肽序列为：igvgvgagayilaryalnhp。
本发明的目的之二是上述多肽用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。
本发明的目的之三是上述多肽用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
考虑到大于6个氨基酸的多肽一般不能穿过血脑屏障，难以在脑内达到有效的蛋白浓度。本发明目的之四是提供一种融合肽。
本发明的融合肽包括穿膜肽和权利要求1所述多肽，所述穿膜肽为TAT、VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine。
一种实施方式中，本发明融合肽的氨基酸序列为：
YGRKKRRQRRRigvgvgagayilaryalnhp。
本发明目的之五是提供上述融合肽用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。
本发明目的之六是提供上述融合肽用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
通过静脉注射本发明的肽使其穿透血脑屏障，进入星形胶质细胞，增加细胞内Na+/K+-ATPaseβ1的稳定性，促进Na+跨膜浓度梯度形成和维持，谷氨酸摄取能力明显增强。缺血性脑卒中病理过程中伴随谷氨酸的大量堆积，运用TAT-NDRG2141-160融合肽治疗，脑细胞外液谷氨酸浓度明显降低，脑缺血损伤明显减轻。
附图说明
图1：高效液相色谱检测TAT-NDRG2141-160融合肽纯度大于99％；
图2：体外培养的星形胶质细胞中NDRG2可以与Na+/K+-ATPaseβ1亚基相互作用；
图3：将NDRG2逐步截短并利用免疫共沉淀筛选出其与Na+/K+-ATPaseβ1相互作用的位点位于NDRG2蛋白的141-239肽段中；
图4：将NDRG2蛋白的141-239肽段进一步截短并连接TAT穿膜肽段：
TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-200，TAT-NDRG2201-220，
TAT-NDRG2221-239，在体外培养的星形胶质细胞中利用免疫共沉淀证实
TAT-NDRG2141-160可以显著干扰内源性NDRG2与Na+/K+-ATPaseβ1亚基相互作用；
图5：TAT-NDRG2141-160处理体外培养的星形胶质细胞，能明显增加Na+/K+-ATPaseβ1蛋白的稳定性和半衰期；
图6：使用绿色荧光素FITC标记的谷氨酸(FITC-Glu)检测星形胶质细胞对于谷氨酸的再摄取，发现TAT-NDRG2141-160处理后与对照肽段处理组相比，谷氨酸摄取明显增加；
图7：微透析实验证实，使用TAT-NDRG2141-160处理后，脑缺血再灌注模型小鼠脑外液谷氨酸含量与对照肽段比明显降低；
图8：TTC染色显示TAT-NDRG2141-160处理组，脑缺血再灌注模型小鼠脑梗死体积明显减少。
具体实施方式
以下实验中所选用穿膜肽为TAT，携带与其融合的肽段穿透血脑屏障并进入细胞膜，实现该功能的穿膜肽还有VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine等。实施例1：多肽的构建
发明人前期研究发现在体外培养的星形胶质细胞中NDRG2可以与Na+/K+-ATPaseβ1亚基相互作用(图2)，并抑制Na+/K+-ATPaseβ1亚基的降解。通过逐步截短NDRG2，发明人筛选并发现NDRG2第141-239片段中，包含两种蛋白相互作用的关键位点(图3)。为进一步明确这99个氨基酸中与NDRG2相互作用的最重要的肽段，发明人将这99个肽段进一步截短，得到：
NDRG2141-160，NDRG2161-180，NDRG2181-200，NDRG2201-220和NDRG2221-239。
实施例2：TAT-NDRG2141-160的构建及筛选
1.发明人将NDRG2蛋白141-239肽段截短并连接TAT穿膜肽段：
TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-200，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239。
2.以TAT-NDRG2141-160融合肽的构建方法为例，各融合肽段的制备方法和步骤如下：
(A)称取1g氯树脂于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡；
(B)2小时后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；
(C)称取182mg Fmoc-Asn(trt)-OH(根据树脂取代度计算)于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；
(D)2小时后，用10ML的甲醇封头(甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2)半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用；
(E)向反应器中加入20ML的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干；
(F)取少量树脂用茚三酮法检测(检A(茚三酮)、检B(吡啶)各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功；
(G)称取一定量的Fmoc-Ser(tbu)-OH和HOBT于10ml的离心管中，加入5m的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；
(H)1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全，若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；
(I)待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去；
(J)按照步骤(G)-(I)依次接上剩余氨基酸；
(K)脱去最后一个氨基酸Y的保护后，用切割试剂切割下肽链冻干，送纯化用高效液相色谱进行纯化分离；
(L)待纯化制备检测纯度大于99％可进行使用；
(M)-20℃保存制备好的粉剂，使用时准确称量，溶解于生理盐水中，离体实验浓度为20μM，在体实验浓度为10mg/kg。
2.在细胞水平利用免疫共沉淀的方法证实：体外培养的原代星形胶质细胞分别用TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-200，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239五种融合肽处理，TAT-NDRG2141-160处理组内源性NDRG2与Na+/K+-ATPaseβ1亚基相互作用被明显阻断(图4)，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-200，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239处理组没有明显的阻断效应。
3.TAT-NDRG2141-160处理星形胶质细胞后，融合肽可通过与Na+/K+-ATPaseβ1的结合和相互作用，提高Na+/K+-ATPaseβ1蛋白的稳定性(图5)。
实施例3：TAT-NDRG2141-160的药效学实验
1.细胞实验：对离体培养的原代星形胶质细胞分别用TAT-Ctrl(对照乱序融合肽)和TAT-NDRG2141-160处理后，给予200μM剂量的FITC-Glu(即FITC标记的谷氨酸)进行处理，采用活细胞工作站进行图像采集，检测两种肽段对星形胶质细胞再摄取谷氨酸的能力影响，发现TAT-NDRG2141-160处理后，星形胶质细胞再摄取谷氨酸的能力明显增强(图6)。
2.在体实验：给小鼠进行大脑中动脉闭塞(MCAO)手术，模拟急性缺血性脑卒中，缺血1小时后，拔取线栓、恢复脑血流，同时经锁骨下静脉分别注射TAT-Ctrl和TAT-NDRG2141-160。再灌注24小时后，微透析获得小鼠纹状体部位的脑外液样本，HPLC分析表明，与对照肽段TAT-Ctrl相比，TAT-NDRG2141-160可以明显降低小鼠脑细胞外液谷氨酸水平(图7)，TAT-NDRG2141-160处理组小鼠脑梗死体积明显减少(图8)。人工合成小分子融合肽TAT-NDRG2141-160用于治疗缺血性脑卒中药效确切，有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一种多肽，该多肽的序列如SEQ NO 1所示。
2.权利要求1所述多肽用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。
3.权利要求1所述多肽用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
4.一种融合肽，其特征在于，该融合肽包括穿膜肽和权利要求1所述多肽，所述穿膜肽为TAT、VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine。
5.一种融合肽，其特征在于，该融合肽的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。
6.权利要求4或5所述融合肽用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。
7.权利要求4或5所述融合肽用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
CN201610284885.1A 2016-04-29 2016-04-29 多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用 Expired - Fee Related CN105837679B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610284885.1A CN105837679B (zh) 2016-04-29 2016-04-29 多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610284885.1A CN105837679B (zh) 2016-04-29 2016-04-29 多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105837679A true CN105837679A (zh) 2016-08-10
CN105837679B CN105837679B (zh) 2019-04-23

Family

ID=56590660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610284885.1A Expired - Fee Related CN105837679B (zh) 2016-04-29 2016-04-29 多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105837679B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861462A (zh) * 2016-04-05 2016-08-17 中国人民解放军第四军医大学 一种多肽及其应用
CN112142856A (zh) * 2020-09-30 2020-12-29 中国人民解放军空军军医大学 一种用于改善脑卒中兴奋性毒性损伤的特异性降解ndrg2靶向肽及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005024055A1 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 Garvan Institute Of Medical Research Methods of diagnosis and prognosis of ovarian cancer ii
US20070128194A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-07 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Preparation of monoclonal antibody to N-myc downstream regulated gene 2 and determination of NDRG2 using protein chip
CN101088089A (zh) * 2004-02-23 2007-12-12 鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心 通过基因表达图形对急性粒细胞性白血病进行分类、诊断和预后
CN104758278A (zh) * 2015-03-24 2015-07-08 宁夏医科大学 芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005024055A1 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 Garvan Institute Of Medical Research Methods of diagnosis and prognosis of ovarian cancer ii
CN101088089A (zh) * 2004-02-23 2007-12-12 鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心 通过基因表达图形对急性粒细胞性白血病进行分类、诊断和预后
US20070128194A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-07 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Preparation of monoclonal antibody to N-myc downstream regulated gene 2 and determination of NDRG2 using protein chip
CN104758278A (zh) * 2015-03-24 2015-07-08 宁夏医科大学 芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MITCHELMORE C 等: "NDRG2: a novel Alzheimer"s disease associated protein", 《NEUROBIOL DIS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861462A (zh) * 2016-04-05 2016-08-17 中国人民解放军第四军医大学 一种多肽及其应用
CN105861462B (zh) * 2016-04-05 2019-07-05 中国人民解放军第四军医大学 一种多肽及其应用
CN112142856A (zh) * 2020-09-30 2020-12-29 中国人民解放军空军军医大学 一种用于改善脑卒中兴奋性毒性损伤的特异性降解ndrg2靶向肽及其应用
CN112142856B (zh) * 2020-09-30 2022-05-03 中国人民解放军空军军医大学 一种用于改善脑卒中兴奋性毒性损伤的特异性降解ndrg2靶向肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105837679B (zh) 2019-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI248364B (en) Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
CN102875665B (zh) 一种合成利拉鲁肽的方法
US9296805B2 (en) Stabilized insulinotropic peptides and methods of use
BR112013024706B1 (pt) Método para preparar análogos de exendina peguilada e análogo de exendina peguilada
US10703796B2 (en) CD44v6-derived cyclic peptides for treating cancers and angiogenesis related diseases
US10669313B2 (en) Multitarget-directed bio-inorganic hybrid structure
CN108727475B (zh) 强效抑制hiv的脂肽、其衍生物、其药物组合物及其用途
EP2799445B1 (en) Integrin blocker polypeptide for use in the treatment of rheumatoid arthrits
WO2013149506A1 (zh) 基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽及其合成和应用
US10597426B2 (en) Polypeptide compound and preparation method and use thereof
CN105837679A (zh) 多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用
US10793603B2 (en) Polysaccharide derivative having membrane-permeable peptide chain
US20170313740A1 (en) Methods of preparing peptides
CN105481974A (zh) 胰岛素样肽
US10501564B2 (en) Polymer compound which has membrane-permeable peptide in side chain
CN106279425A (zh) 一种靶向缺血心肌的vegf重组蛋白
CN114940715B (zh) 一种能降解新冠病毒n蛋白的短肽及其应用
WO2005007682A2 (en) A peptide and a pharmaceutical composition, and their medical applications
WO2016186140A1 (ja) 新規な細胞膜透過性ペプチド
CN107987144A (zh) 一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用
PT1869066E (pt) Síntese de peptídeo de hélice-alfa sobre resina peg
CN105861462A (zh) 一种多肽及其应用
JP6320469B2 (ja) 細胞膜透過型ホウ素ペプチド
CN103992401A (zh) 一种制备艾塞那肽的方法
US20140357577A1 (en) HIV Membrane Fusion Inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190423

Termination date: 20200429