CN104758278A - 芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了芦荟苷（Aloin）作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，通过建立氧糖剥夺模型从而探究芦荟苷对氧糖剥夺后的PC-12细胞的保护作用及可能的机制。实验结果表明在氧糖剥夺再灌注之后，芦荟苷的保护作用与抗氧化有关，它降低了细胞内的活性氧，丙二醛含量，增加了过氧化物歧化酶的含量；除此之外，芦荟苷可以稳定线粒体膜电位，降低PC-12细胞的凋亡率以及钙离子浓度，说明这些结果证明芦荟苷对缺血性损伤有保护作用。

Description

芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途

技术领域

本发明涉及芦荟苷的应用，特别涉及芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途。

背景技术

缺血性脑病(Ischemic Brain Disease)又称缺血性中风，目前已成为全球范围内主要致死、致残的疾病之一，严重威胁着人类的生命与健康。研究发现，脑缺血后有相当部分的血管能自然再通或经溶栓治疗后恢复再通，但会导致脑损伤和功能障碍即缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury)，因此抑制缺血再灌注损伤已成为目前治疗缺血性脑病的关键环节。

有关脑缺血再灌注损伤发生机制的研究近年来进展很快。研究发现，脑血流中断和再灌注导致的脑细胞损伤是多因素、多机制和快速的恶性级联反应。这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成和凋亡基因激活等。这些环节互为因果，彼此重叠，相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡。

随着深入研究细胞抗氧化，人们逐渐认识到细胞抗氧化在继发于缺血性脑损伤发病机制中发挥着重要作用。目前，抗氧化机制参与脑缺血损伤已成为基础与临床研究的热点。

芦荟苷为双子叶植物百合科植物库拉索芦荟Aloe vera L、好望角芦荟Aloe ferox Mill和斑纹芦荟提取物。研究发现芦荟苷能帮助排出体内污物，净化血液、软化血管，降低血压和血液粘度，促进血液循环，防止动脉硬化和脑溢血的作用，但其对脑缺血神经损伤、神经退行性疾病等神经损伤性疾病的保护作用目前尚未见报道，将其发展为缺血性脑卒中治疗药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的通过芦荟苷药理作用的研究，提供芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，所述芦荟苷的分子结构式如式(1)所示：

具体地，所述缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中。

具体地，所述芦荟苷的单次应用量仅限于不引起血糖降低的剂量。

具体地，所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为10μg/mL～40μg/mL。

优选地，所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为10μg/mL。

优选地，所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为20μg/mL。

优选地，所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为40μg/mL。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型或粉针剂型。

本发明公开的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，具有如下有益效果：

本发明通过建立氧糖剥夺模型从而探究芦荟苷对氧糖剥夺后的PC-12细胞的保护作用及可能的机制，在氧糖剥夺再灌注之后，它降低了细胞内的活性氧，丙二醛含量，增加了过氧化物歧化酶的含量，芦荟苷的保护作用可能与抗氧化有关，并且芦荟苷可以稳定线粒体膜电位，降低PC-12细胞的凋亡率以及钙离子浓度的升高，对缺血性损伤有保护作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明：

实施例1

芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其中，芦荟苷的分子结构 式如式(1)所示

缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中，芦荟苷在细胞中的单次应用量为10μg/mL，药物的剂型为药剂学上允许的粉针剂型。

实施例2

芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其中，芦荟苷的的分子结构式如式(1)所示

缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中，芦荟苷在细胞中的单次应用量为20μg/mL，药物的剂型为药剂学上允许的注射剂型。

实施例3

芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其分子结构式如式(1)所示

缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中，芦荟苷在细胞中的单次应用量为40μg/mL，药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型。

实施例1-3的效果可以通过下面的动物实验得到验证：

1.实验材料

培养的PC-12细胞，甲氮甲唑蓝(MTT)购自广州化学试剂厂；酶标仪购自Thermo公司；乳酸脱氢酶LDH，丙二醛MDA，超氧化物歧化酶SOD，ROS测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；钙离子，Hoechst，MMP试剂盒：碧云天试剂公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：上海贝博生物公司。Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA、内参引物(购自生工生物公司)余均为市售商品，荧光显微镜(BX51，日本Olympus公司)。电泳仪、电转仪、凝胶成像仪。PCR仪、实时定量PCR仪，核酸浓度测定仪(均购自美国Bio-RAD公司)。激光共聚焦显微镜(TCS-SP，德国LEICA公司)。流式分析仪(美国BD FACSCalibur)。

2.实验方法

2.1实验分为模型组，芦荟苷不同浓度组(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)，尼莫地平阳性对照组和正常组，制作细胞氧糖剥夺再灌注模型组：PC-12细胞于培养第3d换以无糖EBSS平衡盐缓冲液充分冲洗若干次，使葡萄糖终浓度小于1mol/L，加入无糖Earle’s平衡盐溶液(EBSS液)，并放入缺氧盒内，持续缓慢通入含有N₂的混合气体4h，取出并吸弃平衡盐缓冲液，换以完全培养基置入CO₂培养箱孵育，模拟体内缺血再灌注的过 程，孵育24h；芦荟苷不同浓度组：换以无糖EBSS液建立缺糖缺氧模型，在再灌注时间点前分别加入不同浓度(10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL)的芦荟苷，其他处理同氧糖剥夺再灌注模型组；尼莫地平阳性对照组：换以无糖EBSS液以建立氧糖剥夺模型，在再灌注时间点前加入尼莫地平，其他处理同氧糖剥夺再灌注模型组；正常组：对细胞不做任何处理。

2.2芦荟苷对缺糖缺氧再灌注损伤PC-12细胞的LDH与细胞活力的影响：给予不同药物处理的细胞经氧糖剥夺恢复氧糖正常培养24h后，收集上清用于测定LDH；再加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜DMSO混匀，选择490nm波长测定各孔光吸收值，记录结果。细胞活力(％)＝实验组光吸收值/对照组光吸收值×100％。

2.3芦荟苷对缺糖缺氧再灌注损伤PC-12细胞保护作用的机制分析：PC-12细胞，每组8例，于培养第3d，制备各实验组缺糖缺氧再灌注损伤模型，依检测指标要求，进行预处理。分光光度计检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，用hoechst染色法检测细胞损伤程度，激光共聚焦显微镜(CLSM)测定海马神经元内Ca²⁺浓度和线粒体膜电位水平(MMP)，用流式分析仪检测细胞凋亡程度。

2.4PCR实时荧光定量检测Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达水平：

Caspase-3上游引物：5'-ACGGGACTTGGAAAGCATC-3'

Caspase-3下游引物：5'-TAAGGAAGCCTGGAGCACAG-3'

产物长度：110bp

Bcl-2上游引物：5'-GGTGGACAACATCGCTCTG-3'

Bcl-2下游引物：5'-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3'

产物长度：139bp

Bax上游引物：5'-ACGCATCCACCAAGAAGC-3'

Bax下游引物：5'-GCCACACGGAAGAAGACCT-3'

产物长度：130bp

退火温度：60℃

严格按照爱思进RNA提取试剂盒操作说明进行组织总RNA提取。用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行RNA逆转录。严格按照按照TransStart Green qPCRSuperMix试剂盒操作说明在实时荧光定量PCR仪上以cDNA为模板在与已优化的扩增条件下进行PCR特异性扩增与荧光定量。

3.结果

3.1芦荟苷对氧糖剥夺后PC-12细胞的存活率和LDH的影响。由表1结果可见，芦荟苷降低了氧糖剥夺再灌注后对PC-12细胞的损伤率，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，说明芦荟苷对其有保护作用。

表1芦荟苷对氧糖剥夺后PC-12细胞的存活率和LDH的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.2芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞损伤程度的影响。由表2结果可以看出，与模型组相比，芦荟苷降低氧糖剥夺对PC-12细胞的损伤程度，并且随芦荟苷浓度的增大，PC-12细胞损伤程度降低，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，说明芦荟苷可以抗凋亡。

表2芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞损伤程度的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.3芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞内Ca²⁺浓度的影响。细胞内钙离子越多，荧光越强，细胞损伤越大，由表3结果可知，与模型组相比，芦荟苷组能明显降低PC-12细胞内的Ca²⁺浓度，与正常组比较： ^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，说明芦荟苷能减少细胞损伤，对其有保护作用。

表3芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞内Ca²⁺浓度的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.4芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞MMP的影响。检测到的线粒体膜电位(MMP)越大，红绿荧光比值越小，细胞损伤的越严重， 由表4结果可见，与模型组比较，芦荟苷可以稳定线粒体膜电位(MMP)，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05。

表4芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞MMP的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.5芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞丙二醛含量的影响。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜指过氧化程度和植物对逆境地条件反应的强弱，细胞损伤越严重，丙二醛含量越大。由表5结果可见，与模型组相比，芦荟苷组降低了PC-12细胞内的丙二醛含量，且随芦荟苷浓度的增大，丙二醛含量降低，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01。

表5芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞丙二醛含量的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.6芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞超氧化物歧化酶影响。细胞内抗氧化能力越强，说明细胞损伤越少，由表6结果可知，与模型组相比，芦荟苷组增加了氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞中的超氧化物歧化酶(SOD)的含量，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，说明苦豆碱对细胞有保护作用。

表6芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞超氧化物歧化酶影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.7芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞凋亡的影响。通过流式检测到氧糖剥夺后PC-12细胞的凋亡越低说明细胞活性越强，由表7结果可知，与模型组相比，芦荟苷组提高了细胞凋亡能力，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01。

表7芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞凋亡的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.8芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损PC-12细胞总活性氧(ROS)影响。检测氧糖剥夺后PC-12细胞的活性氧，活性氧含量越大，细胞损伤越大，由表8的结果可见，与模型组相比，芦荟苷组可以降低PC-12细胞总活性氧(ROS)的含量，且在一定浓度范围内，随着芦荟苷浓度的升高，对PC-12细胞总活性氧(ROS)含量降低得越多，与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01。

表8芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞总活性氧(ROS)的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

1.3.9芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损PC-12细胞实时荧光定量PCR结果分析。由表9-11可知，实时荧光定量PCR结果显示，与正常组比较，氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞内Caspase-3、Bax mRNA基因相对表达明显高于正常组Bcl-2mRNA基因相对表达明显低于正常组；与模型组相比，尼莫地平组和芦荟苷(40μg/mL)组可明显抑制氧糖剥夺再灌注损伤诱导的Caspase-3、Bax基因表达的上调和Bcl-2基因表达的下调。

表9芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞Caspase-3mRNA表达的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

表10芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞Bcl-2mRNA表达的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

表11芦荟苷对氧糖剥夺再灌注损伤PC-12细胞Bax mRNA表达的影响

(与正常组比较：^##P＜0.01；与模型组比较：^**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)

上述所有实验结果都证明芦荟苷对氧糖剥夺后的PC-12细胞具有保护作用，其保护机制与抗氧化有关。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述芦荟苷的分子结构式如式(1)所示:

2.根据权利要求1所述的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中。

3.根据权利要求1所述的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述芦荟苷的单次应用量仅限于不引起血糖降低的剂量。

4.根据权利要求1所述的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为10μg/mL～40μg/mL。

5.根据权利要求4所述的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为10μg/mL。

6.根据权利要求4所述的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为20μg/mL。

7.根据权利要求4所述的芦荟苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述芦荟苷在细胞中的单次应用量为40μg/mL。

8.根据权利要求1-7任一项权利要求所述的芦荟苷作为治疗脑卒中药物的用途，其特征在于：所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型或粉针剂型。