CN105837411B - 用于葡萄糖转运抑制的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

葡萄糖剥夺为癌症研究和治疗中令人关注的策略。癌细胞增量调节葡萄糖摄取和代谢，以维持加速的生长和增殖速率。特异性阻断这些过程，可能为葡萄糖转运和代谢在肿瘤发生以及在凋亡中的作用提供新见识。由于实体瘤过大而不适于周围脉管系统，它们遭遇营养物受限供应的微环境，导致在肿瘤的某些区域中形成葡萄糖剥夺的环境。生存在葡萄糖剥夺环境中的癌细胞经受变化以防止葡萄糖剥夺诱导的凋亡。了解癌细胞如何逃避凋亡诱导，亦可能产生有价值的关于如何克服癌细胞中对凋亡诱导的抵抗的信息和知识。本文公开了抑制基础葡萄糖转运、导致肿瘤抑制的新型抗癌化合物，以及用于在动物癌症研究中研究葡萄糖剥夺的新方法。

Description

用于葡萄糖转运抑制的组合物和方法
相关申请
本申请是申请日2011年3月24日、申请号201180025712.3、发明名称“用于葡萄糖转运抑制的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。本申请要求保护2010年3月24日提交的美国临时申请号61/317,062的权益，所述申请的全部内容通过引用结合到本文中。
关于联邦赞助研究的声明
美国国家科学基金通过创新奖助金(HER-0227907)的合作，部分地赞助本工作。美国政府可在本发明中具有一定权利。
技术领域
本申请涉及用于葡萄糖转运抑制的组合物和方法。
背景技术
自2008年起，癌症已超过心血管疾病，成为美国的第一杀手，仅在2008年，估计有565,650个美国人死于癌症。已提出关于癌症的起因的不同理论，并且已制定和开发许多策略用于对抗所述疾病。一些癌症例如乳腺癌的死亡率在过去30年间已显著减少，这主要是因为早期检测而不是因为治疗，而其它癌症例如肺癌和胰腺癌的死亡率实际上却增加。绝对和迫切需要新方法用于进一步改进现存癌症疗法以及用于治疗对其而言仍无有效疗法的那些癌症。葡萄糖剥夺可具有成为这类新型且有效抗癌策略之一的潜力，这是因为在理解Warburg效应上取得的最新进展所致，Warburg效应即癌细胞对增加的葡萄糖转运和葡萄糖代谢(主要是糖酵解)增加的和“沉迷的”依赖。
几乎所有癌症的共同特征之一以及亦可能是它们的共同弱点之一，为增加的葡萄糖摄取以及对于将葡萄糖作为细胞生长和增殖的结构单元来源、能源或二者的增加的依赖性。尽管癌症并非单一疾病，但是不同的癌症特别是实体恶性瘤的确共享一些共同特征。这类共同特征之一为，它们均比正常细胞长得快并因此需要更多合成前体和更多能量来维持其加速的生长和增殖速率。正常细胞可将不同的化学品(例如氨基酸、脂质和葡萄糖)用作其能源。
与典型细胞相比，用于癌细胞的生物合成材料和能量的优选来源为葡萄糖。例如，健康结肠细胞从短链脂肪酸特别是丁酸盐中得到其能量供应的60-70%。丁酸盐经由单羧酸转运体MCT1转运穿过结肠上皮的管腔膜。已发现显示降低水平的MCT1的癌样品，表达高亲和力葡萄糖转运体GLUT1，这表明在转变成恶性期间就结肠上皮中的能源/生物合成来源而言存在从丁酸盐到葡萄糖的转换。
与体内正常细胞相比，几乎所有癌细胞在体内具有增加的葡萄糖供应和代谢，这是已通过正电子发射断层扫描(PET)提供的最强有力的证据片段(图14)。在癌症的PET扫描中，将作为不可代谢葡萄糖类似物的18F标记的2-脱氧葡萄糖(2-DG或FDG)用作示踪物。在扫描中发亮的区为捕获较多FDG的器官、组织、细胞以及癌症。斑点越亮表示FDG浓度越高。与许多其它PET扫描一样，此特异性PET扫描显示，原发癌和转移癌(接近肺和腋窝)二者均比周围正常细胞含有更高的FDG浓度，提供了癌细胞相对于正常细胞具有增加的葡萄糖摄取的有力证据。对不同癌症类型(包括原发癌和继发转移癌二者)的PET扫描显示，与环绕肿瘤的正常细胞和组织相比，几乎所有研究的肿瘤“捕获”明显更多FDG。此外，PET扫描研究已将预后不良和增加的肿瘤侵占性与增加的葡萄糖摄取和增量调节的葡萄糖转运体一致地关联。尽管已提出多种理论来解释在癌细胞内使用葡萄糖的机制，但是本领域存在几乎一致共识：不论葡萄糖在其吸收后如何被癌细胞使用，在几乎所有恶性瘤中葡萄糖摄取为增加的。癌细胞增加的葡萄糖摄取及其伴随增加的葡萄糖代谢可以是、应当是并且已成为用于深入细致的的基础和临床研究以及用于开发新抗癌疗法的一般靶标。
在1920年代，Warburg发现，即使在充足氧气存在下，癌细胞仍优选通过在胞质溶胶中的糖酵解来代谢葡萄糖，而不像在正常细胞中通过在线粒体中的氧化磷酸化来代谢葡萄糖。这看似矛盾，因为糖酵解在生成ATP上效率更低。已表明这类向糖酵解的转换赋予癌细胞一些选择优势，用于在独特的肿瘤微环境中生存和增殖。因加速的生长速率和不足的供氧所致，结节中的大部分癌细胞处于含氧量低的环境，迫使癌细胞通过增加葡萄糖转运体、糖酵解酶和线粒体代谢抑制剂的表达来向糖酵解转变。然而，Warburg效应不能仅通过对缺氧的适应来解释，因为即使在存在充足氧气时，癌细胞仍优选糖酵解。这有可能涉及其他的分子机制。
近期研究已显示，在Warburg效应中观察到的现象亦可在癌基因激活中发现，所述现象为增加的葡萄糖消耗和减少的氧化磷酸化，以及伴随的大幅增加的乳酸盐产生。发现Ras在突变时促进糖酵解。发现Akt的激活增加糖酵解的速率，这部分地因为其通过HIFα促进糖酵解酶表达的能力。将此推测为促成癌细胞的高糖酵解性质的主要因素。亦发现Myc(原癌基因和转录因子)增量调节多个代谢基因的表达。还发现肿瘤抑制基因例如p53涉及代谢调节。所有这些近期研究结果表明，癌细胞中的Warburg效应不只是仅在糖酵解中独立变化的结果，更是通过多个信号转导途径中已知和未知的串扰网络形成的广泛交流的生物学后果。这些途径涉及细胞生长、增殖以及线粒体代谢和葡萄糖代谢二者，所述代谢响应在供氧和营养物供应上的变化。理解Warburg效应中的这类广泛的信号转导网络，对于理解和对抗癌症而言为必需的。
一些最近的研究已集中在糖酵解酶特别是丙酮酸激酶(PK)上。这些研究已显示，癌细胞中增加的葡萄糖转运和糖酵解似乎指向癌细胞中结构单元的产生(大分子的生物合成)，并且为细胞分裂和增殖做准备，而非作为提供生物能(ATP)的方式。尽管通常认为有氧糖酵解是癌症的代谢标志，但是其与肿瘤发生的因果关系仍不清楚。糖酵解基因包括癌细胞中最多增量调节的基因集之一。在肿瘤中显著增量调节的基因中有PK，其调节糖酵解的最终限速步骤。在哺乳动物中存在PK的4个同种型：L和R同种型在肝和红细胞中表达；M1同种型在大多数成体组织中表达；和M2同种型为在胚胎发育期间表达的M1的剪接变体。值得注意的是，已报道肿瘤组织唯一地表达丙酮酸激酶的胚胎M2同种型。由于其几乎普遍存在于癌细胞中，因此将PKM2称为肿瘤特异的，并且目前将其在人血浆中的存在用作诊断多种癌症的分子标志。正常增殖细胞和肿瘤细胞二者均表达PKM2。PKM2调节葡萄糖碳的比例，所述葡萄糖碳被引入合成过程(无活性二聚体形式)或用于糖酵解能量产生(高活性四聚体形式，糖酵解酶复合体的组分)。在癌细胞中，二聚体形式的PKM2总是占优势的。四聚体和二聚体形式的PKM2之间的转换允许肿瘤细胞在具有不同供氧和营养物供应的环境中生存。两种形式之间的转换在肿瘤细胞中调节糖酵解通量。这些研究结果表明，PKM2为代谢传感器，其以葡萄糖供应依赖性方式调节细胞增殖、细胞生长和凋亡性细胞死亡。发现PKM2的核易位足以诱导非胱天蛋白酶依赖性细胞死亡和同种型特异性细胞死亡。这些结果显示，肿瘤标记物PKM2在肿瘤细胞的非胱天蛋白酶依赖性细胞死亡中起广泛作用，并因此将此糖酵解酶定义为用于癌症疗法开发的新靶标。
两项近期研究证实，PKM2通过与磷酸酪氨酸基序结合来调节，导致促进增加的细胞生长和肿瘤发展。PKM2增强糖酵解中间体用于大分子生物合成和肿瘤生长的应用。这些研究结果说明此代谢表型在癌细胞生长中的独特优势。似乎PKM2的表达以及从氧化磷酸化向有氧糖酵解的转换对于维持癌生长和增值而言为绝对需要的。因此，抑制糖酵解以及PKM2可形成新且有效的抗癌策略。这些新研究结果意义重大，因为它们几乎完全改变了我们对Warburg效应在癌症中的生物学功能的常规理解，曾认为所述效应用于在含氧量低的条件下生物合成ATP。
葡萄糖为大部分细胞中代谢的必需底物。由于葡萄糖为极性分子，因此通过生物膜转运需要特定的转运蛋白。通过肠上皮细胞和肾上皮细胞的顶膜转运葡萄糖依赖于次级主动Na+/葡萄糖同向转运体SGLT-1和SGLT-2的存在，所述SGLT-1和SGLT-2利用由Na+离子顺其电化学梯度向下的协同转运提供的能量在细胞内浓缩葡萄糖。通过细胞膜促进扩散葡萄糖由葡萄糖载体(对于溶质载体家族2，蛋白质符号GLUT，基因符号SLC2)另外催化，所述葡萄糖载体属于转运促进剂超家族(主要的促进剂超家族)，所述超家族包括有机阴离子和阳离子转运体、酵母己糖转运体、植物己糖/质子同向转运体以及细菌糖/质子同向转运体。通过这类转运体的分子移动通过促进的扩散来进行。此特征使得这些转运体为非能量依赖性的，不同于常常需要ATP的存在以驱动其易位机制并且在ATP/ADP比率降至过低时停止的主动转运体。
基础葡萄糖转运体(GLUT)充当葡萄糖通道并且是维持细胞的基本葡萄糖需求所必需的。这些GLUT在细胞中组成地表达和有功能，并且不受胰岛素调节(或者对胰岛素不敏感)。所有细胞在线粒体中利用糖酵解和氧化磷酸化二者，但在氧充足时极大地依赖于氧化磷酸化，在氧剥夺(缺氧)时则转换成糖酵解，如在癌症中发生的转换。在糖酵解中，葡萄糖转变为丙酮酸盐并且在所述过程中生成2个ATP分子(图15)。癌细胞因其较快的增殖速率所致，主要处于含氧量低的(低氧)状态。因此，癌细胞利用糖酵解(乳酸形成)作为其优势的葡萄糖代谢途径。这类糖酵解转换不仅使癌症具有更高的转移和侵袭潜力，而且还增加癌症对于在糖酵解方面的外部干扰的易损性，这是因为癌细胞“沉迷”于葡萄糖和糖酵解。基础葡萄糖转运的减少可能限制对癌细胞的葡萄糖供应，导致迫使癌细胞减缓生长或饿死的葡萄糖剥夺。Thompson小组发现激活的Akt在成胶质细胞瘤细胞系中导致受激的需氧葡萄糖代谢，并发现所述细胞随后在撤去葡萄糖时死亡。这为癌细胞对葡萄糖浓度变化非常敏感以及葡萄糖剥夺可在癌细胞中诱导死亡提供直接证据。
在正常细胞中，如图15所示，靶细胞通过一个或多个基础葡萄糖转运体(GLUT)摄取胞外葡萄糖。细胞使用的GLUT取决于细胞类型和生理需要。例如，GLUT1负责所有细胞类型中低水平的基础葡萄糖转运。所有GLUT蛋白包含12个跨膜结构域并且通过促进扩散(非能量依赖性过程)来转运葡萄糖。GLUT1可能通过改变其构象来转运葡萄糖进入细胞。根据此模型，GLUT1向细胞外或细胞内暴露单一的底物结合部位。葡萄糖与一个部位的结合触发构象改变，将葡萄糖释放到膜的另一侧。转基因和敲除动物研究的结果支持这些转运体在控制葡萄糖利用、葡萄糖储存和葡萄糖传感方面的重要作用。GLUT蛋白在其动力学上不同并且针对其服务的细胞类型的需要而定制。尽管特定的细胞类型可表达多于一种GLUT蛋白，但是癌症经常过表达GLUT1 (其为高亲和力葡萄糖转运体，并且其表达水平与癌症的侵袭力和转移潜能相关)，表明葡萄糖转运的增量调节在癌细胞生长和癌症恶性的严重性上的重要性。亦发现GLUT1表达显著高于任何其他葡萄糖转运体的表达。在一项研究中，测试的全部23种肿瘤为GLUT1阳性并且GLUT1为主要表达的葡萄糖转运体。此外，FDG摄取和GLTU1表达二者似乎都与增加的肿瘤大小有关。在数种肿瘤（包括NSCLC、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌和甲状腺癌）中，增加的GLUT1表达不仅赋予恶性表型，还预示着较低的总体存活率。基于所有的这些观察结果，可以想象的是，通过基础葡萄糖转运抑制来抑制癌症生长，可以是阻止癌症生长以及改善预后和存活时间的有效方式。
证据指出，与正常细胞相比，癌细胞对葡萄糖剥夺更敏感。许多研究强烈表明，基础葡萄糖转运抑制诱导凋亡并阻止癌细胞生长。首先，已显示抗血管发生是限制癌症生长并引起癌症消融的非常有效的方式。本质上，所述抗血管发生方法将减少新血管形成并且在肿瘤结节之内和周围达到血管标准化。这严重限制了到达癌细胞的对肿瘤生长所需的营养物。葡萄糖为通过抗血管发生剥夺的关键营养物之一。在这种意义上，基础葡萄糖转运的抑制在限制对癌细胞的营养物供应上可看作抗血管发生疗法的备选方法。因此，抗血管发生策略的成功间接支持将限制对癌细胞的葡萄糖供应作为相关但新型策略的潜在功效。其次，涉及糖酵解的多种酶的抑制剂已用于抑制糖酵解过程中的不同步骤，并且已显示具有显著的抗癌功效。已靶定的糖酵解酶包括：己糖激酶，催化糖酵解第一步的酶；ATP柠檬酸裂解酶；以及更近的丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)。在测试的糖酵解抑制剂中，发现3-溴丙酮酸和己糖激酶抑制剂完全根除经治疗小鼠中的晚期糖酵解肿瘤。靶定线粒体糖酵解酶乳酸脱氢酶A (LDH-A)的化合物在体外和体内均显示显著的抗癌活性。此结果表明线粒体功能和胞质糖酵解之间的强烈联系。用于PET扫描以定位转移的示踪物2-DG，已用作抗癌临床试验中的葡萄糖竞争剂和糖酵解抑制剂。这些研究以及其他相关研究亦已显示，这些抑制剂在癌细胞中诱导凋亡作为癌细胞杀伤机制。可从所有这些公布的研究中得出两个重要结论。(1)抑制糖酵解多个步骤的化合物在体外和体内均减少癌细胞生长，和(2)在癌细胞中抑制糖酵解的多个步骤之一诱导凋亡并且为有效的抗癌策略。其亦强烈表明，抑制葡萄糖转运(临糖酵解前的步骤以及糖酵解和细胞内所有葡萄糖代谢的第一限速步骤)将对癌细胞产生类似于糖酵解抑制或者可能比糖酵解抑制更严重的生物学后果。此外，葡萄糖转运可能是与下游糖酵解靶标相比更好的靶标，因为1)已知葡萄糖转运体在癌细胞中高度增量调节，2)通过在第一步限制葡萄糖供应以及因此造成绝对的胞内葡萄糖缺乏，将防止任何潜在的胞内葡萄糖相关的补偿/补救途径，癌细胞可利用所述补偿/补救途径自我救护和避免细胞死亡。
为于使抑制基础葡萄糖转运成为成功的抗癌策略，其必须在不显著伤害正常细胞的情况下杀死癌细胞。一些实验观察结果表明，事实的确如此。由于癌细胞偏爱将葡萄糖用作能源以及糖酵解在癌细胞中增量调节，因此抑制糖酵解的化合物可杀死癌细胞同时不伤害正常细胞，所述正常细胞可将脂肪酸和氨基酸用作备选能源。
最近报道，向多种肺癌和乳腺癌细胞系中添加抗GLUT1抗体显著降低癌细胞的葡萄糖摄取速率和增殖，导致凋亡的诱导。此外，所述抗体增强诸如顺铂、紫杉醇和吉非替尼等癌症药的抗癌作用。这些结果明确指出，抑制GLUT1介导的葡萄糖转运的物质，在单独作用时或在与其他抗癌治疗药联用时，对抑制癌细胞生长以及在癌细胞中诱导凋亡有效。两个最近的出版物进一步支持这些研究结果，在所述出版物中，发现葡萄糖转运抑制剂fasentin使癌细胞对经历由抗癌药顺铂或紫杉醇诱导的凋亡敏感，以及发现抗癌化合物芹菜素在mRNA和蛋白质水平上减量调节GLUT1。提出将GLUT1的减量调节作为芹菜素可能的抗癌机制。所有这些新研究结果指明以下方向，葡萄糖转运抑制剂可能敏化并协同其他抗癌药，以进一步增强药物的抗癌功效。本文公开了在抑制基础葡萄糖转运和诱导凋亡上有效性为fasentin或芹菜素有效性的2-5倍的化合物和方法。
在使用葡萄糖剥夺的一项近期研究中，发现在高浓度生长因子中生长的细胞在撤去生长因子后显示出对细胞死亡增加的易感性。此易感性与生长因子撤去之后在糖酵解速率上的变化幅度相关。为了研究糖酵解产物的可用性变化是否影响线粒体开始的凋亡，通过操纵细胞培养基中的葡萄糖水平来人为地限制糖酵解。与生长因子撤去相同，葡萄糖限制导致Bax易位、线粒体膜电位下降以及细胞色素c释放至胞质溶胶。相比之下，通过过表达GLUT1来增加细胞自主的葡萄糖摄取，在生长因子撤去之后显著延迟凋亡。这些结果表明，生长因子的主要功能为调节葡萄糖摄取和代谢，并因此维持线粒体内环境稳定以及使细胞生长所需的合成代谢途径能够进行。亦发现涉及葡萄糖摄取和糖酵解定型的三个基因(GLUT1、己糖激酶2和磷酸果糖激酶1)的表达，在生长因子撤去后迅速降至几乎不可检测的水平。所有这些研究表明，葡萄糖剥夺已是用于研究癌症的非常有价值且频繁使用的方法。亦可通过抑制基础葡萄糖转运来造成胞内葡萄糖剥夺。因自细胞培养基中去除葡萄糖所致的葡萄糖剥夺和因抑制葡萄糖转运/葡萄糖代谢所致的葡萄糖剥夺之间的区别为，葡萄糖去除首先产生缺乏葡萄糖的胞外环境，而葡萄糖转运/葡萄糖代谢的抑制在不改变或甚至增加胞外葡萄糖浓度的情况下，产生缺乏葡萄糖的胞内环境。葡萄糖转运抑制剂的使用应当能够补充和替代传统的葡萄糖剥夺。此外，通过降低胞外葡萄糖浓度的传统葡萄糖剥夺不能用于动物，而葡萄糖转运的抑制剂可用于动物，这创建了在体内研究癌症和治疗癌症的新方法。
发明内容
本文公开了式(I)化合物或其盐，其中R1选自氢、烷基、苄基、芳基和杂芳基部分；R2选自氢、烷基、苄基、芳基、杂芳基和荧光标签；R3选自氢、卤素、烷基、苄基、芳基、杂芳基、氨基、氰基和烷氧基。在一些实施方案中，如本领域技术人员所公认的，两个R1基团可独立选择，且因此不同。在其他实施方案中，当R1基团不同时，可将R1表示为R1’和R1’’以表明R1部分之间的不同。
在一些实施方案中，可进一步限定式(I)化合物包括以下种类，其中R1为芳基官能团，选自2-、3-和4-羟基苯基，2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基，2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基，2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基以及全羟基苯基。在其他实施方案中，可进一步限定式(I)化合物，其中R2为荧光标签，选自香豆素、丹酰、罗丹明、荧光素和羧基萘并荧光素。在一些实施方案中，式(I)化合物由以下分子组成，其中R1和R2为3-羟基苯基，R3为氢原子。
本文公开了式(II)化合物或其盐，其中R1选自氢、烷基、苄基、芳基和杂芳基；R2选自氢、烷基、苄基、芳基和杂芳基；X选自氢、卤素、烷基、苄基、芳基、杂芳基、氨基、氰基和烷氧基；Y选自氢、卤素、烷基、苄基、芳基、杂芳基、氨基、氰基和烷氧基。
在一些实施方案中，可进一步限定式(II)化合物包括以下种类，其中R1为芳基官能团，选自2-、3-和4-羟基苯基，2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基，2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基，2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基以及全羟基苯基。在其他实施方案中，式(II)化合物由以下分子组成，其中R1和R2为3-羟基苯基，X为氟，Y为氢。
本文公开了一系列式(III)化合物或其盐，其中R1选自氢、卤素、烷基、苄基、氨基、硝基、氰基和烷氧基；R2选自氢、卤素、烷基、苄基、氨基、硝基、氰基和烷氧基；R3选自氢、卤素、烷基、苄基、氨基、硝基、氰基和烷氧基；X选自碳、氧、氮和硫；Y选自碳、氧、氮和硫。
在一些实施方案中，式(III)化合物可选自下列化合物；
。
在一些实施方案中，式(III)化合物可选自下列化合物；
，并且
其中X选自H、3-Cl、3-F、3-CN、4-F、4-CN、4-NO2、4-SO2Me和4,5-Cl2。在其它实施方案中，式(III)化合物由以下分子组成，其中R1、R2和R3为氢，X和Y为氧。
本文公开了式(IV)化合物或其盐，其中R1选自氢、卤素、烷基、苄基、氨基、硝基、氰基和烷氧基；R2选自氢、烷基、苄基、芳基和杂芳基；R3选自氢、烷基、苄基、芳基和杂芳基。在一些实施方案中，式(IV)化合物是这样的分子，其中R1为氯，R2和R3为2-硝基-5-羟基苯基。
本文公开了用于治疗癌症的方法，其包括给予需要这类治疗的受试者治疗上有效量的选自式1、2、3和4的化合物。
在一些实施方案中，所述癌症为实体恶性瘤，其通过在称为Warburg效应的过程中从氧化磷酸化向糖酵解的生物学转变，增量调节基础葡萄糖转运。在一些实施方案中，可通过选自以下的任何方法给予人受试者所述化合物：经口、局部、动脉内、胸膜内、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内、囊内和卡氮芥糯米纸胶囊剂。
在一些实施方案中，可将来自式1、2、3和4的化合物与一种或多种化学治疗剂组合给予人受试者或患者，作为增强一种或多种所述治疗上有用化合物的功效的方法。在其它实施方案中，来自式1、2、3和4的化合物可与之组合给予的化学治疗剂选自：甲氨蝶呤、盐酸阿霉素、氟尿嘧啶、依维莫司、咪喹莫特、阿地白介素、阿仑单抗、培美曲塞二钠、盐酸帕洛司琼、苯丁酸氮芥、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞吡坦、依西美坦、奈拉滨、三氧化二砷、奥法木单抗、贝伐珠单抗、阿扎胞苷、盐酸苯达莫司汀、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、卡巴他赛(cabazitaxel)、盐酸依立替康、卡培他滨、卡铂、盐酸柔红霉素、西妥昔单抗、顺铂、环磷酰胺、氯法拉滨、异环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、地西他滨、达沙替尼、地加瑞克、地尼白介素-毒素连接物(denileukin difitox)、狄诺塞麦(denosumab)、盐酸右雷佐生、多西他赛、拉布立酶、盐酸表柔比星、奥沙利铂、艾曲波帕乙醇胺(eltrombopaq olamine)、甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate)、盐酸厄洛替尼、磷酸依托泊苷、盐酸雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、非格司亭、磷酸氟达拉滨、普拉曲沙、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨(gemcitibine)-顺铂、吉妥珠单抗奥佐米星、甲磺酸伊马替尼、曲妥珠单抗(trastuzamab)、盐酸拓扑替康、替伊莫单抗、罗咪酯肽(romadepsin)、伊沙匹隆、帕利夫明、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、脂质体盐酸丙卡巴肼、替莫唑胺、普乐沙福、acetidine、甲苯磺酸索拉非尼、尼洛替尼、枸橼酸他莫昔芬、罗米司亭(romiplostim)、紫杉醇、盐酸帕唑帕尼(pazopanib hydrochloride)、培门冬酶、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、proleukin、利妥昔单抗、罗米地辛、滑石粉(Talc)、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenictosylate)、苹果酸舒尼替尼、沙利度胺、坦罗莫司、托瑞米芬、曲妥珠单抗(trastuzumub)、帕尼单抗(pantiumumab)、硫酸长春碱、长春新碱、伏林司他和唑来膦酸。
另外的特征和优势将部分地在下列描述中阐述，以及部分地从所述描述中显而易见，或者可通过本发明的实践而知悉。本发明的目标和优势将通过在随附权利要求中明确指出的要素和组合来实现和达到。
要理解的是，上述概述和下列详述二者仅为示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的本发明。
附图说明
结合到本说明书中并构成本说明书一部分的附图，说明了本发明的一些实施方案，并连同描述，用来解释本发明的原理。
图1显示初始葡萄糖转运的抑制剂1a和2a。
图2显示可能来自1p、9a和2a的水解产物的葡萄糖摄取结果。这些可能的水解产物未显示显著的基础葡萄糖摄取抑制，表明所述抑制是因原始化合物而非水解产物所致。
图3显示α-PGG和β-PGG的分子结构。PGG具有葡萄糖核，其通过在葡萄糖的羟基和没食子酸之间形成的酯键，与五个没食子酰基连接。α-PGG和β-PGG为结构异构体。α-PGG及其衍生物为亲水的并且可能胞外地作用于细胞膜蛋白。
图4显示基础葡萄糖转运的新抑制剂WZB-25、WZB-26和WZB-27的结构。
图5显示α-PGG处理在癌细胞中诱导细胞死亡，并且所述细胞死亡主要通过凋亡介导。图A显示，如通过细胞生存力(MTT)测定所测定，α-PGG处理导致细胞生存力减少70-80%。图B显示，如通过凋亡(ELISA)测定所测定，α-PGG处理在HeLa细胞中导致凋亡大于2倍的增加。图C显示，如通过抗体偶联的流式细胞术研究所测定，HeLa细胞的α-PGG处理导致G1期细胞减少而凋亡细胞显著增加(约3倍)。
图6显示如通过蛋白质印迹分析所测定的p53激活和失活。当用25µM α-PGG处理HeLa、RKO或MCF-7细胞时，发现p53蛋白在HeLa细胞中未被激活，但在RKO细胞为已激活的。
图7显示α-PGG及其衍生物在HeLa、RKO和MCF-7癌细胞中抑制葡萄糖摄取。在用3H标记的2-DG处理之前，将细胞用α-PGG处理20分钟。在加入2-DG 30分钟之后，将细胞收集、裂解并对其各自的葡萄糖摄取计数。样品：1.模拟的；2.胰岛素(100nM)；3. α-PGG (30µM)；4. WZB-25 (30µM)；5. WZB-26 (30µM)；和6. WZB-27 (30µM)。
图8A-C显示α-PGG及其衍生物以剂量依赖性方式在HeLa细胞中抑制基础葡萄糖转运。
图9显示通过α-PGG或α-PGG衍生物诱导的葡萄糖转运抑制的时程。除在不同的时间(从1、5、10直至30分钟)终止葡萄糖摄取之外，用与前述相同的方式进行葡萄糖摄取测定。
图10显示α-PGG诱导Akt，而α-PGG衍生物不诱导Akt。用α-PGG或其衍生物处理过表达胰岛素受体的CHO细胞。处理之后，裂解细胞并通过对磷酸化Akt特异的抗体来分析蛋白质。
图11显示，与在其正常细胞对应物相比，PGG衍生的化合物在癌细胞中诱导更多的细胞死亡。左图显示，使用25mM化合物处理人肺癌细胞(H1299)或正常肺细胞(NL20)。在处理后48小时，进行细胞生存力测定以确定细胞杀伤的百分比。将未经化合物处理的细胞用作对照(100%基线)。右图显示用于处理人乳腺癌细胞(MCF-7)和正常乳腺细胞(MCF-12A)的化合物。在与左图肺癌细胞所用条件相同的条件下，进行细胞生存力测定。
图12显示细胞生存力测定和凋亡测定。图A显示在RKO结肠癌细胞中的细胞生存力测定。RKO细胞含有高水平的p53，而RKO E6细胞含有低得多水平的p53。图B显示H1299肺癌细胞中的凋亡测定，其使用经切割的PARP蛋白(89 kDa)作为胱天蛋白酶3的指示剂，因为PARP是已激活胱天蛋白酶3的底物。
图13显示葡萄糖转运的示意图。
图14显示原发性和转移性人癌症的PET扫描。
图15显示α-PGG在3T3-L1脂肪细胞中的胰岛素样活性。A.如通过葡萄糖摄取测定所测定的与胰岛素的葡萄糖转运刺激活性相比的α-PGG的葡萄糖转运刺激活性。B. α-PGG诱导胰岛素样GLUT4膜易位，如在经不同物质的细胞诱导之后，使用GLUT4特异性抗体通过荧光共聚焦显微术所示。α-PGG诱导胰岛素样GLUT4易位，如在环绕细胞的环状结构中。
图16显示新型PGG衍生物。
图17显示两个试验化合物抑制剂的结构。化合物WZB-27和WZB-115为衍生自PGG的多酚化合物。与PGG不同，它们不具有胰岛素样葡萄糖摄取刺激活性。相反的是，它们仅具有有效的葡萄糖转运抑制活性和抗癌活性，如在葡萄糖摄取测定和MTT细胞生存力测定中所证实。
图18显示细胞生存力测定和凋亡测定(W25 = WZB-25，W27 = WZB-27)。A. RKO结肠癌细胞中的细胞生存力测定。RKO细胞含有高水平的p53，而RKO E6细胞含有低得多水平的p53。B. α-PGG在RKO中比在RKO-E6细胞中诱导更强的生存力降低效应。RKO细胞具有较高水平的p53，而RKO-E6细胞为p53缺陷型。***p < 0.001，**p < 0.01。C. A549肺癌细胞中的凋亡测定，其使用经切割的PARP蛋白(89 kDa)作为胱天蛋白酶3的指示剂，因为PARP是已激活胱天蛋白酶3的底物。低葡萄糖(正常的5%)处理的样品作为阳性对照。
图19显示，与其非癌对应物相比，癌细胞表达更多的GLUT1蛋白以及在葡萄糖摄取上受化合物抑制更大。使用或不使用化合物处理癌细胞及其非癌对应物，然后测定其各自的葡萄糖摄取。A.使用或未使用WZB-27处理的H1299肺癌细胞及其非癌NL20细胞的葡萄糖摄取测定。B. MCF7癌细胞及其非癌MCF12A细胞的葡萄糖摄取测定。C.癌细胞和非癌细胞中GLUT1蛋白表达的蛋白质印迹分析，其使用对GLUT1 (H43片段)特异的抗体。β-肌动蛋白用作蛋白质上样对照。
图20显示化合物注射后的血糖水平。将化合物W27 (= WZB-27)或W115 (= WZB-115) IP注入禁食的Balb/c健康小鼠中，并在注射后多次测定血糖水平。N = 5只/组。PBS +DMSO组为溶媒对照。
图21显示葡萄糖抑制剂和抗癌药的组合进一步降低癌细胞生存力。在不存在或存在10 µM WZB-115或30µM WZB-27的情况下，使用抗癌药顺铂(2.5 µM用于W27 (= WZB-27)研究或5 µM用于W115 (=WZB-115)研究)或泰素(2.5 µM)处理H1299、A549肺癌细胞或MCF7乳腺癌细胞。通过MTT测定法测定细胞生存力。所述化合物的存在显著增加通过顺铂或泰素诱导的癌细胞死亡。将此实验重复三次并将结果表示为平均值±标准差。
图22显示在癌细胞的葡萄糖摄取抑制和细胞生存力上，内部化合物抑制剂与fasentin之间的比较研究。在葡萄糖摄取测定和细胞生存力(MTT)测定二者中，将已知的基础葡萄糖化合物fasentin和内部制备的化合物抑制剂并列比较。将模拟处理样品的葡萄糖摄取或细胞生存力任意指定值为100%。A. H1299癌细胞中的葡萄糖摄取测定。对于所有化合物浓度均为30 µM。B.三种不同癌细胞系中的细胞生存力测定。对于所有化合物浓度均为60 µM。
图23显示化合物WZB-115在59个癌细胞系中的NCI抗癌活性筛选结果。将WZB-115送至NCI，使用包括9种癌症类型的59个癌细胞系进行抗癌活性筛选。以单一浓度10 µM完成试验。将模拟处理癌细胞的生长速率用作基线100%。小于100%的任何生长速率表示抑制。因其有前景的抗癌活性谱所致，NCI推荐使用五个不同的浓度再次测试所述化合物，以确定其在这些癌细胞系中的IC50。
图24显示用于鉴定改进的基础葡萄糖转运抑制剂的一般方案。
图25显示用于结构修饰的数个先导化合物和区域。
图26显示束缚类似物(tether analog)的初始集合。
图27显示所提议键合类似物的最小能量结构。
图28显示酚基的生物异构体类似物。
图29显示核心芳环的初始集合。
图30显示移植到裸小鼠上的人肺癌A549的肿瘤大小比较。在治疗后8周获取照片。使用雄性NU/J裸小鼠(7-8周大)，购自Jackson实验室(Bar Harbor, Maine)并且提供来自Harlan实验室(Indianapolis, Indiana)的已辐照Teklad Global 19%蛋白质啮齿类动物食物。为了确定化合物WZB-117对人NSCLC肿瘤异种移植物生长的体内功效，收集指数生长的A549细胞，并用PBS重悬浮以达到5×106个细胞/25µl混悬液的终浓度。将25µl细胞悬液皮下注入每只小鼠的右胁。此时，将小鼠随机分成两组：用PBS/DMSO (1:1，v/v)治疗的对照组(n=10)，以及用WZB-117 (15mg/kg)治疗的WZB-117治疗组(n=10)。将化合物WZB-117溶于PBS/DMSO (1:1, v/v)。自肿瘤细胞接种之日起，每天用PBS/DMSO混合物或化合物WZB-117(15mg/kg)给予小鼠腹膜内注射。A.肿瘤生长曲线。动物肿瘤研究表明，通过每天以10 mg/kg体重的剂量注射WZB-117，经化合物治疗肿瘤的肿瘤大小平均比经模拟治疗小鼠的肿瘤大小小约75%。B.小鼠肿瘤照片。左边的荷瘤小鼠为经模拟治疗的，而右边的小鼠是用WZB-117治疗的。C.小鼠体重测定。D.经WZB-117治疗小鼠的体重组成与经模拟治疗小鼠的体重组成的比较。
图31显示WZB-117通过抑制Glut1来抑制葡萄糖转运。A.和B. WZB-117以剂量依赖性方式在红细胞(RBC)中抑制葡萄糖转运。C.和D. WZB-117以剂量依赖性方式在RBC衍生的“内翻外”囊泡(IOV)中抑制葡萄糖转运。E. WZB-117在RBC衍生的“右翻外”囊泡(ROV)中抑制葡萄糖转运。
图32显示癌细胞的WZB-117治疗诱导ER应激、凋亡以及在糖酵解酶上的改变。A.WZB-117治疗以类似于葡萄糖剥夺的方式增量调节ER应激蛋白BiP。B. WZB-117治疗诱导PARP的切割，表明凋亡诱导由p53介导。C. WZB-117治疗以类似于葡萄糖剥夺的方式在癌细胞中增量调节关键的糖酵解酶PKM2。
图33显示使用或未使用WZB-117治疗的小鼠的摄食。在研究期间，PBS/DMSO治疗组和WZB-117治疗组之间没有摄食的改变。自肿瘤细胞接种起，每7天测定各组的摄食。
图34显示使用或未使用WZB-117治疗的荷瘤裸小鼠的血糖测定。通过血糖监测器测定各小鼠的血糖水平，并且在临IP注射WZB-117 (15mg/kg)之前和注射后每30分钟测定血糖水平。测定期间小鼠可得到食物。以平均值±标准差表达数据。在紧接化合物注射之后或动物研究期间或动物研究之后，未发现未治疗组和化合物WZB-117注射组之间在血糖水平上的显著差异。
图35显示化合物WZB-117杀死的癌细胞显著多于杀死的非癌细胞。使用或不使用WZB-117将A. A549肺癌细胞和B. MCF7乳腺癌细胞处理48小时，然后用MTT测定法测定其各自的生存率。经模拟处理的细胞作为对照(100%生存力)用于比较。以相同的方式处理非癌NL20和MCF12A细胞以用于比较。
图36显示如通过克隆形成测定所证实的WZB-117的抗癌活性。使用WZB-117或较弱的抑制剂WZB-134处理或者不使用化合物(模拟的)将生长在培养皿中的三个癌细胞系A549、H1299 (肺癌)和MCF7 (乳腺癌)处理48小时。然后使经处理的细胞回到无化合物的正常细胞培养基中生长2周，随后用结晶紫(crustal violet)染色并对存活克隆的数量计数。染色斑(克隆)越少且越小，抑制越高。
图37显示数个新型葡萄糖转运抑制剂WZB-115、117和173的结构。化合物117为115的类似物，而173为醚键类似物。化合物WZB-117和WBZ-173衍生自化合物WZB-115，所述WZB-115为用于我们早前癌症研究的多酚模型化合物。WZB-115衍生自称为五没食子酰基葡萄糖(PGG)的天然抗癌抗糖尿病化合物。WZB-117和WZB-173在结构上非常类似于115，但是与WZB-115相比，二者在结构上简化且在功能上优化。因此，WZB-117和WZB-173在其抗癌活性上比WZB-115更有效，并且在溶液和细胞培养基中在结构上亦比115更稳定。
具体实施方式
现在将通过参考一些更详细的实施方案并偶尔参考附图来描述本发明。然而，这些发明可以不同的形式实施，并且不应解释为限于本文所述实施方案。但是，提供这些实施方案以使本公开内容透彻和完整，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的意义，与这些发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。本文用于描述本发明的术语仅用于描述具体的实施方案，且不意图其为本发明的限制。除非文段另有明确指示，否则在本发明的描述和随附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”，亦意图包含复数形式。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，均通过引用以其整体结合。
除非另有指示，否则用于说明书和权利要求中表达组分的量、反应条件等的所有数字，应理解为在所有情况中受术语“约”修饰。因此，除非表示反对，否则下列说明书和所附权利要求中陈述的数值参数为近似值，其可根据本发明试图获得的所需特性而改变。丝毫不试图限制权利要求范围的等同物的原则的应用，应根据有效位数和普通四舍五入法来解释各数值参数。
虽然描述本发明广泛范围的数值范围和数值参数为近似值，但是尽可能精确地记录具体实施例中陈述的数值。然而，因在其各自测试法中存在的标准差所致，任何数值固有地必然含有一定的误差。在本说明书各处给出的各数值范围包含各更窄的数值范围(其落入所述更宽的数值范围内)，犹如所述更窄的数值范围均在本文中明确写出。
此外，当以Markush群组或其他备选分组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识的是，亦因此以Markush群组或其他群组成员的任何独立成员或子群的方式描述本发明。
定义
“烷基”应指仅由元素氢和碳组成的任何化合物，其中原子唯一地通过单键连接在一起。术语烷基亦可扩展为意指仅由元素氢、氟和碳组成的任何化合物，其中原子唯一地通过单键连接在一起。这组氟化化合物亦可称为“氟代烷”、“氟烷基”、“氟烷基基团”和“碳氟化合物”。烃的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、新戊基、环戊基、正己基、环己基、叔己基、正庚基、正辛基、正癸基和金刚烷基。氟化化合物的实例包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1,1,1-三氟乙基、2,2-二氟乙基和全氟乙基。
“苄基”应用来描述这样的取代基或分子片段，其具有与有机化合物的RC6H4CH2-相关的结构。经取代的苄基化合物亦可描述为与亚甲基(-CH2-)亚单元连接的任何芳基或杂芳基环系。苄基的实例包括但不限于苄基；2、3和4-卤代苄基；2、3和4-烷基苄基；2、3和4-氰基苄基；2、3和4-酮基苄基；2、3和4-羧基苄基；2、3和4-氨基苄基；2、3和4-硝基苄基；2、3和4-羟基苄基；2、3和4-烷氧基苄基；二取代苄基和三取代苄基衍生物。
“芳基”应意指化合物上衍生自简单芳环的任何官能团。实例包括但不限于苯基；2-、3-和4-羟基苯基；2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基；2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基；2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基；全羟基苯基；2、3和4-卤代苯基；2、3和4-烷基苯基；2、3和4-氰基苯基；2、3和4-酮基苯基；2、3和4-羧基苯基；2、3和4-氨基苯基；2、3和4-硝基苯基；2、3和4-羟基苯基；2、3和4-烷氧基苯基；二取代苯基和三取代苯基衍生物。
“杂芳基”应意指化合物上衍生自杂芳环的任何官能团。杂芳物质包含杂原子或者除氢或碳之外的原子，包括氧、氮、硫、磷、硅和硼。实例包括但不限于呋喃、苯并呋喃、噻吩、苯并噻吩、吡咯、吲哚和硼杂苯。
“卤代”和“卤素”应指周期表第17族的任何元素，由氟、氯、溴、碘和砹组成。
“胺”和“氨基”应指含有碱性氮的任何有机化合物或官能团，所述碱性氮带有孤对电子。胺衍生自氨，并且可为伯胺、仲胺和叔胺的。胺的实例包括但不限于氨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二甲胺、异丙胺、二异丙胺、二异丙基乙胺、二苯胺、二苄胺、叔丁胺、苯胺(analine)和吡啶。
认为“氰基”应与有机官能团腈同义，其包含与氮原子三键连接的碳。氰化物在自然中倾向于为高毒性的，并且通常作为盐发现。
“烷氧基”应意指与氧单键连接的烷基。烷氧基的范围很大，其范围从甲氧基到许多芳基烷氧基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和苯氧基。
“荧光标签”、“荧光分子”、“荧光团”和“荧光标记”应意指以下分子的任何部分，科学家或研究员已将所述分子化学地连接，以帮助检测与其连接的分子。荧光标签的实例包括但不限于香豆素、丹酰、罗丹明、荧光素、羧基萘并荧光素和荧光蛋白。
“盐”应指由来自式1、2、3和4的化合物之一的阴离子衍生物与阳离子物质配对形成的离子物质。阳离子物质可包括但不限于锂、钠、钾、铷、铯、铍、镁、钙、锶、钡、铝、铜、锌、铁、铬、锰、镍、钯、铂、铟、铑和砷。
“治疗上有效的”，当用于描述在方法中施用的化合物的量时，是指化合物达到所需生物效应的量，例如，导致基础葡萄糖转运抑制的量。
“抑制”或“终止”应意指减少、抑制、损伤、消除、杀死或其组合。
文段中“降低”基础葡萄糖转运应意指降低癌细胞内葡萄糖转运的效率。
α-PGG衍生的第1代化合物的结构；WZB-25、WZB-26和WZB-27
用于合成化合物WZB-25、WZB-26和WZB-27的方法如下：
室温下，向1,6-脱水-β-D-葡萄糖(100 mg，0.62 mmol)的无水乙腈(25 mL)溶液中加入酰氯2 (863 mg，1.88 mmol)。室温搅拌30 min后，向反应混合物中加入DMAP (241 mg，1.97 mmol)，将混合物搅拌24h并去除溶剂，通过色谱法在硅胶上纯化粗制品，以83%产率得到730 mg 3。1H NMR (CDC13) δ 7.60-7.31 (m，51H)，5.88 (s，1H)，5.69 (t，1H，J= 3.0Hz)，5.29 (d，3H，J= 5.3 Hz)，5.23 (s，4H)，5.11-5.02 (m，13H)，4.98 (d，1H，J= 6.2Hz)，4.28 (d，1H，J= 7.4 Hz)，3.97 (q，1H，J= 6.2，7.4 HZ)。
向3 (420 mg，0.29 mmol)的无水THF (20.0 mL)溶液中加入10%披钯碳(21 mg，0.02 mmol)，室温下将混合物在氢气气氛下搅拌过夜。将混合物滤过硅藻土(Celite)，用甲醇和二氯甲烷稀释滤液，并滤过硅藻土三次直至溶液澄清。去除溶剂，以64%产率得到粗制品4。
室温下，向3-甲氧基儿茶酚(140 mg，1.00 mmol)的无水乙腈(10 mL)溶液中加入酰氯2 (941 mg，2.05 mmol)。室温搅拌30 min后，向反应混合物中加入DMAP (268 mg，2.20mmol)，将混合物搅拌2天并去除溶剂，通过色谱法在硅胶(25 % EA/己烷)上纯化粗制品，以72%产率得到708 mg 6。1H NMR (CDC13) δ 7.64 (d，4H，J= 16.7 Hz)，7.51-7.33 (m，31H)，7.16 (d，1H，J= 8.2 Hz)，7.06 (d，1H，J= 8.4 Hz)，5.18 (d，4H，J= 7.0 Hz)，5.06(d，8H，J= 11 Hz)，3.96 (s，3H)；13C NMR (CDC13) δ 164.0、163.6、153.1、152.8、152.3、144.1、143.2、137.6、137.5、136.5、136.4、132.3、128.6、128.4、128.3、128.2、128.1、128.0、127.8、127.7、126.6、123.9、123.8、115.4、110.2、109.7、109.6、75.3、71.2、56.4。
向6 (500 mg，0.51 mmol)的无水THF (20.0 mL)溶液中加入10%披钯碳(43 mg，0.04 mmol)，室温下将混合物在氢气气氛下搅拌12h。然后将混合物滤过硅藻土，通过色谱法在硅胶上浓缩并纯化滤液，得到9.5 mg 7。大部分化合物7在硅胶上分解。1H NMR(CDC13) δ 8.30 (brs，6H)，7.31-7.13 (m，5H)，7.04 (d，1H，J= 8.1 Hz)，6.95 (d，1H，J=8.3 Hz)，3.83 (s，3H)。
室温下，向连苯三酚(126 mg，1.00 mmol)的无水乙腈(15 mL)溶液中加入酰氯2(1.40 g，3.05 mmol)。室温搅拌30 min后，向反应混合物中加入DMAP (391 mg，3.20mmol)，将混合物搅拌24h并去除溶剂，通过色谱法在硅胶(25 % EA/己烷作为洗脱液)上纯化粗制品，以41%产率得到570 mg 9。1H NMR (CDC13) δ 7.53 (s，4H)，7.49-7.20 (m，50H)，5.10 (s，4H)，5.01 (s，8H)，4.94 (s，2H)，4.85 (s，4H)；13C NMR (CDC13) δ 163.6、163.0、152.7、144.2、143.6、143.3、137.4、137.3、136.3、136.1、135.2、128.6、128.5、128.4、128.2、128.1、128.0、127.9、127.8、126.3、123.6、123.1、120.9、109.6、75.2、75.1、71.2。
向6 (260 mg，0.29 mmol)的无水THF (15.0 mL)溶液中加入10%披钯碳(16 mg，0.024 mmol)，室温下将混合物在氢气气氛下搅拌过夜。然后将混合物滤过硅藻土，通过色谱法在硅胶(25% EA/己烷)上浓缩并纯化滤液，得到11.3 mg 10。化合物10在柱上分解。1HNMR (CDC13) δ 8.24 (brs，4H)，7.47-7.41 (m，1H)，7.34-7.32 (m，2H)，7.17 (s，4H)，7.09 (s，2H)，2.92 (brs，5H)。
衍生自α-PPG的第1代化合物的评价
最初将化合物1a和2a制备为α-PGG的潜在抗糖尿病药类似物(图1)。考虑到这类化合物紧密的SAR，猜测更刚性的支架(即苯环)可能增强活性。令人惊讶且意外地发现，这两种化合物在30 µM的浓度下对宫颈癌细胞(HeLa)、结肠癌细胞(RKO)和乳腺癌细胞(MCF-7)抑制基础葡萄糖转运(表1)，而非具有胰岛素样活性。
表1.1a和2a在不同癌细胞系中的葡萄糖转运抑制活性(%)
与未经化合物处理的细胞对照(视为0%抑制)相比，如通过标准葡萄糖摄取测定法所测定，化合物1a和2a亦在H1299细胞中抑制基础葡萄糖转运分别达58.4 ± 6.3%和86.1± 1.0% (表2)。在H1299细胞中使用MTT细胞增殖测定法测试，发现其对癌细胞生长的抑制活性分别为36.0 ± 6.1%和39.9 ± 5.0% (未经化合物处理的细胞对照视为0%抑制)。
考虑到葡萄糖转运的抑制对于开发新抗癌剂的潜在效用，研究了这些化合物作为葡萄糖转运抑制剂和癌细胞增殖抑制剂二者的构效关系。基于这两种化合物制备了许多衍生物，以了解在中心芳环上对三羟基苯基酯的需要以及对这三种酯的需要。
通过用一组经取代的苯甲酰基卤化物将一系列二羟基苯和三羟基苯酰化，制备了所需类似物。选择一组一羟基苯甲酰基卤化物、二羟基苯甲酰基卤化物和三羟基苯甲酰基卤化物以及甲氧基苯甲酰基卤化物作为酰化剂。羟基苯甲酰基卤化物的合成在方案1中概述。将可市购的酚3a-f全苄化并将所得的酯水解，将酸转化成酰氯5a和苄氧基苯甲酰氯5b、5c、5d、5e和5f。必需的甲氧基取代苯甲酰基卤化物制备自可市购的羧酸。
表2.制备的化合物，其在H1299肺癌细胞中在基础葡萄糖转运和细胞生长上诱导 的抑制活性
方案1.苄氧基苯甲酰氯5的合成
根据核心芳环，选择连苯三酚8 (用2a表示)和3-甲氧基儿茶酚6a (X = OMe，Y =H，用1a表示)。选择两个经卤素取代的酚6b (X = H，Y = Cl)和6c (X = F，Y = H)来提供p-供体(类似于甲氧基)而不是吸电子基团。未取代的儿茶酚6d (X，Y = H)包含在内。如在方案2中所示，然后使这些酚的每一种与每种酰氯5a-f以及数个甲氧基取代苯甲酰氯偶联。偶联之后，通过催化氢化将苄氧基酯脱保护。总产率在表2中显示。
方案2.类似物1、2、7和9的合成
如表2所示，使用标准葡萄糖摄取测定法测试化合物。简单说来，在葡萄糖摄取测定法之前，使用或不使用化合物(30 µM)一式三份将H1299癌细胞处理10 min。在不存在或存在化合物的情况下，通过在无葡萄糖KRP缓冲液中将细胞与0.2 Ci/mL [3H]2-脱氧葡萄糖(比活，40 Ci/mmol)一起孵育30 min，来测定细胞葡萄糖摄取。在用冰冷的PBS洗涤细胞并通过0.2 N NaOH裂解细胞之后，将细胞裂解物转移至闪烁计数瓶并通过液体闪烁计数来定量细胞裂解物中的放射性。利用MTT测定法一式六份(hexad)在每孔接种有5,000个细胞的96孔组织培养板中进行细胞生长测定。在存在或不存在所述化合物(30 µM)的情况下将细胞孵育48 h。孵育之后，使用96孔SPECTRAMAX™吸光度/荧光板读数器(MolecularDevices)测定细胞生存力。
在一些实施方案中，将化合物1a和2a与其中核心芳环经氟或氯取代的衍生物(1b和1c)进行比较，显示这两种化合物在葡萄糖转运抑制测定中具有类似于化合物2a且显著优于1a的活性。显然核心芳环上的卤素取代很重要。未取代的核心芳环1d显示低于1a和2a的抑制水平。为了确定酚羟基的必要性，我们制备了1a和2a的数个衍生物，其中用甲氧基取代OH基(9a–d，7a–d)。这些化合物一致显示更低水平的葡萄糖转运抑制。仅化合物9b和9d(2,6-二甲氧基苯甲酰基和3-甲氧基苯甲酰基)显示适度水平的抑制。
在一些实施方案中，系统地去除酚羟基，制备一系列二羟基和一羟基衍生物。3,5-二羟基和3,4-二羟基衍生物总体上显示良好水平的葡萄糖转运抑制。在两个系列中，三苯甲酰基衍生物(2b和2c)以及氟取代和氯取代衍生物显示>90%抑制，而甲氧基取代的衍生物(1e和1h)显示几乎没有至没有抑制。显示>90%葡萄糖转运抑制的所有化合物亦显示癌细胞生长速率降低约40%。
在一些实施方案中，去除额外的羟基提供在2-、3-和4-位的一组一羟基化合物。2-羟基系列一致显示较弱的葡萄糖转运抑制。4-羟基系列尽管显示较弱的葡萄糖转运抑制，但的确提供具有葡萄糖转运抑制>85%的化合物。这些化合物显示癌细胞生长速率降低>35%。3-羟基系列显示优秀的葡萄糖转运抑制，三苯甲酰基衍生物2f显示葡萄糖转运抑制>99%。此化合物亦显示最高水平的细胞生长抑制，约为60%。通过分析表2中的所有数据，得到线性相关系数R = 0.817 (R2 = 0.667)，表明约2/3 (66.7%)的癌细胞生长抑制活性来自基础葡萄糖转运的抑制活性。
一般来说，侧臂苯甲酰基的3-位上羟基的存在，对于葡萄糖转运抑制和癌细胞生长抑制二者而言均为重要的。此3-羟基可与氯取代或氟取代的核心苯环连接或者为三苯甲酰基体系的部分。未取代的或供电子的取代基导致葡萄糖转运活性抑制的显著减小。
在其他实施方案中，酚酯的水解产物(8、6c、10、11和12)可表现出葡萄糖摄取抑制活性。如图2所示，这些化合物均不具有任何葡萄糖摄取抑制活性。类似地，这些化合物均未显示在抗癌筛选上的任何活性。总的来说，已合成多酚酯化合物的文库作为基础葡萄糖转运的新型抑制剂和新型抗癌剂，其具有潜在的新靶标——基础葡萄糖转运。
通过SAR研究鉴定出有效且具选择性的基础葡萄糖转运抑制剂
在构效关系(SAR)研究期间(其中已合成超过80个PGG类似物并通过葡萄糖摄取测定和功能测定进行分析)，亦鉴定出葡萄糖摄取的一组抑制剂，其具有与PGG相对的活性。偶然发现的是，这些抑制剂引起癌细胞生长抑制和癌细胞死亡。利用这些新研究结果，决定化学合成更有效且更具选择性的抑制剂，并将它们用于癌症研究。
考虑到PGG类似物初始集合的紧密SAR，猜测没食子酰基附于其上的更刚性的支架，可能提供增强的效力和选择性。制备了PGG类化合物的数个新类似物。两种化合物基于芳香核(与葡萄糖核相对)。对所有化合物的假设为，刚性中心核将防止与葡萄糖核相关的任何构象可动性。当分析这些化合物(WZB-26和WZB-27)时，发现其具有基础葡萄糖转运抑制活性而不具有任何胰岛素样活性。因此，这些化合物为动物细胞的基础葡萄糖转运的选择性抑制剂。当使用这些化合物处理不同的癌细胞系时，发现它们亦在宫颈癌细胞(HeLa)、结肠癌细胞(RKO)和乳腺癌细胞(MCF-7)中抑制基础葡萄糖转运。此结果表明，这些化合物为广泛的基础葡萄糖转运抑制剂；抑制测试的全部三种癌细胞系。基于这两种化合物制备了许多衍生物，以了解在中心芳环上对三羟基苯基酯的需要以及对这三种酯的需要(图16)。简单说来，使用受保护的羟基苯甲酸酰化一系列二或三羟基苯。偶联之后，去除保护基(苄基)以提供靶化合物——三苯甲酰基衍生物(3)或苯基取代的二苯甲酰基衍生物(5)。
化合物WZB-26和WZB-27为首先制备的化合物。两种化合物均显示类似的基础葡萄糖转运抑制(约85%)。最初，中心芳环上的取代模式令人关注。因为WZB-27具有三个没食子酰基，而WZB-26仅具有2个没食子酰基，但是具有额外的甲氧基。完成了多种化合物的制备，以探测中心芳环上的其他取代基将对抑制水平的影响。在一些实施方案中，可将制备的化合物命名为WZB-89 (F取代)、WZB-90 (Cl取代)和WZB-110 (H取代)。WZB-89和WZB-90二者均显示与WZB-26和-27类似的活性水平，而未取代的WZB-101显示显著降低的活性水平。显然，如在WZB-26、-27、-89和-90中所示，在3-或4-位中一些类型的π-供电子团有益于活性。WZB-26和WZB-27二者均具有三个酚羟基。为了确定这些羟基是充当H键供体还是H键受体，制备了4种类似物，其中用OMe基团取代OH基团(WZB-76、-81、-101、-102)。这些化合物的活性显著降低，明确表明对于H键供体(即酚OH)的需要。接着，通过系统去除羟基来检测对于没食子酰基(即3,4,5-三羟基苯甲酰基)的需要。制备了一系列二羟基(3,5-二羟基和3,4-二羟基)和一羟基(2-OH、3-OH和4-OH)衍生物。在所有情况下，不论侧臂苯甲酰酯上羟基的数量或位置，中心芳环上具有甲氧基或无取代的类似物均提供显著更低水平的抑制。制备的类似物中，3,5-二羟基(WZB-111、WZB-113、WZB-114)、3,4-二羟基(WZB-119、WZB-121、WZB-112)和3-一羟基(WZB-115、WZB-117、WZB-118)衍生物显示95-99%的抑制水平。鉴于在制药工业存在对于开发更简单、更低分子量抑制剂的关注，因此首先将化合物WZB-27和WZB-115用于生物研究，并且在后续合成和测定中将使用更佳的化合物。表3表明，以制备对基础葡萄糖转运更有效和更具选择性的抑制剂为目标，我们已系统地合成超过100种不同的化合物来研究所述化合物的SAR。如表3中所示，这些抑制剂中的某些是迄今为止报道的最佳基础葡萄糖转运抑制剂并且可用于未来的临床研究。
表3.制备的类似物以及基础葡萄糖转运抑制
α-PGG在人结肠癌细胞、宫颈癌细胞和乳腺癌细胞中诱导凋亡
当使用α-PGG处理RKO(结肠)、HeLa(宫颈)和MCF-7(乳腺)人癌细胞时，发现所述处理导致明显的细胞死亡(图5A)，且所述细胞死亡主要地(如果不是唯一地)由凋亡引起(图5B & 5C)。α-PGG在正常(非癌)细胞中不会引起大量凋亡(未显示数据)，表明所述化合物更多地对癌细胞显示增加的细胞毒性。
与其正常对应物相比，PGG-衍生的化合物优先在癌细胞中诱导细胞死亡
癌细胞强烈地依赖葡萄糖作为其优选的能源，并且已提出将葡萄糖剥夺作为抗癌策略。为了使这些化合物成为有效的抗癌剂，它们必须能够杀死多于正常细胞的癌细胞。细胞杀伤(或细胞生存力)测定显示，这些化合物中的某些特别是WZB-27 (= W27)，与其非癌细胞对应物(NL20或MCF12A细胞，表3)相比，优先杀死癌细胞(NSCLC H1299和乳腺癌MCF7)。这些结果表明，这些化合物具有成为抗癌剂的优秀潜力。基于此观察结果，推测可确定最佳的化合物和药物浓度，其将最小地影响正常细胞，同时对癌细胞造成最大的损伤。
使用WZB-27、WZB-115以及两种已知的抗癌药(顺铂和泰素)完成比较测定。在表4中，显示了癌细胞系以及正常细胞系中的细胞死亡百分比。化合物WZB-27和WZB-115杀死与泰素几乎相同百分比的肺癌细胞系H1299，同时杀死显著更少的正常肺细胞系NL20。比较乳腺癌细胞系MCF7时，WZB-27和WZB-115相对于泰素杀死稍少的细胞，但与顺铂相比杀死更多的细胞。WZB-27和WZB-115二者与泰素或顺铂相比，均杀死更少的正常乳腺细胞系MCF12A。WZB-27与泰素或顺铂相比，杀死更少的正常乳腺细胞系MCF12A，而WZB-115与顺铂或泰素相比，不会杀死更多的正常细胞。表4所示结果表明，化合物在癌细胞中的细胞毒性与顺铂和/或泰素相当或更好，同时它们与抗癌药相比，在非癌(“正常”)细胞中表现出更小的细胞毒性。
表4.癌细胞与正常细胞中通过化合物诱导的%细胞死亡的比较 a,b,c
癌细胞系过表达GLUT1以及与其非癌细胞对应物相比，化合物在癌细胞中抑制更 多的葡萄糖摄取
为了确定与其非癌细胞对应物相比，在癌细胞中杀伤增加的可能原因，进行比较研究以确定化合物处理对葡萄糖摄取的作用。发现与在非癌细胞系NL20或MCF12A中的降低相比，化合物WZB-27在癌细胞系H1299和MCF7中在葡萄糖摄取上产生更大的降低(图19A和19B)。蛋白质印迹分析显示，这些相同的癌细胞系与其非癌对应物相比，表达显著更高水平的GLUT1蛋白(图19C)。在癌细胞系中观察到的葡萄糖摄取的更大降低，与这些细胞中更高的GLUT1水平有关。
α-PGG在RKO(结肠)细胞中激活p53，但在HeLa(宫颈)或MCF-7(乳腺)癌细胞中不激 活p53
发现α-PGG在三个癌细胞系中诱导凋亡之后，研究了凋亡机制的知识(即，凋亡是否与p53状态有关)。使用抗p53抗体的蛋白质印迹分析显示，α-PGG在RKO细胞中导致p53的激活，但在HeLa或MCF-7细胞中不导致p53的激活(图6)。此结果表明，在HeLa和MCF-7细胞中诱导的凋亡为非p53依赖性的。此结果既令人关注又重要，因为其显示α-PGG可利用非p53依赖性机制在某些癌细胞中诱导凋亡，非p53依赖性机制应在超过50%的所有人类癌症中有效诱导凋亡，在所述人类癌症中，p53已突变且为无功能的。
此结果表明，与在RKO细胞中不同，α-PGG在HeLa细胞和MCF-7中诱导的凋亡不通过p53或p53信号转导途径介导。因此，α-PGG在HeLa细胞中诱导的凋亡为非p53依赖性的。
PGG及其衍生物在人癌细胞系中抑制基础葡萄糖转运
将基础葡萄糖转运的抑制推测为α-PGG诱导的癌细胞死亡的原因。合成PGG衍生物并且在不同的人癌细胞系中与α-PGG一起测试。发现这些衍生物在宫颈癌细胞系、结肠癌细胞系和乳腺癌细胞系中抑制基础葡萄糖转运(图7)。
胰岛素不影响葡萄糖摄取，表明测定的葡萄糖为基础葡萄糖转运，而非胰岛素介导的葡萄糖转运。基于此观察结果，我们进一步猜测，显著的葡萄糖转运抑制可能是凋亡(特别是在HeLa细胞中)的原因。
α-PGG及其衍生化合物以剂量依赖性方式在HeLa细胞中抑制基础葡萄糖转运
使用不同浓度的α-PGG或其衍生化合物WZB-25和WZB-27，以确定基础葡萄糖转运的抑制是否为剂量依赖性的。实验结果表明，α-PGG及其衍生物以剂量依赖性方式抑制基础葡萄糖转运，并且在抑制转运上，α-PGG似乎比其衍生物稍更有效(图8)。亦发现30 µM任何化合物在HeLa细胞中导致基础葡萄糖转运的约50%抑制(图8)，表明全部4种化合物在HeLa细胞中抑制基础葡萄糖转运上几乎同样有效。此结果使我们得到结论，我们可使用α-PGG或用其衍生物代替α-PGG来进行葡萄糖转运抑制研究。我们亦发现，降低细胞培养基中的葡萄糖浓度，亦以葡萄糖浓度依赖性方式在HeLa和MCF-7细胞中降低细胞生长速率并诱导凋亡(未显示数据)。这些结果明确显示，α-PGG及其衍生物WZB-25和WZB-27抑制基础葡萄糖转运，并且所述抑制为剂量依赖性的。
将HeLa细胞与不同浓度的α-PGG或其衍生物(WZB-25或WZB-27)一起孵育20 min，然后向细胞中加入3H-标记的2-DG达30 min。2-DG孵育30 min之后，将细胞收集、裂解并使用闪烁计数器对其各自的葡萄糖摄取计数(胞内2-DG计数)。结果显示，α-PGG在5 µM时开始抑制葡萄糖转运，而其他衍生物在约10 µM时开始抑制转运，并且全部三种化合物显示剂量反应的抑制特征。图8中的误差棒代表测定值的标准差。一式三份制备样品，重复了实验三次。
与α-PGG(胰岛素模拟物)不同，α-PGG衍生物不诱导Akt磷酸化
迄今为止，已显示α-PGG及其衍生物抑制基础葡萄糖(图7)并表现出非常相似的剂量反应(图8)。然而，这些衍生物在分子量上比α-PGG小得多，以及预期这些衍生物将比α-PGG更纯净，因为它们更具选择性并且不具有同样多的与基础葡萄糖转运抑制无关的活性。先前数据显示，α-PGG结合并激活胰岛素受体(IR)，并且诱导Akt (涉及IR信号转导的蛋白质因子)的磷酸化。由于衍生物与α-PGG相比，在结构上更简单且在大小上更小，因此推测这些衍生物不会诱导Akt磷酸化，这通过对经化合物处理CHO细胞的蛋白质印迹分析得以确证，所述细胞过表达IR (图10)。
Akt为胰岛素受体信号转导途径中的关键因子。因此，从WZB-25到WZB-27的α-PGG衍生物似乎比α-PGG更具选择性，这是因为它们不诱导与基础葡萄糖转运无关的活性。它们应产生葡萄糖转运抑制和凋亡数据，其甚至比α-PGG的葡萄糖转运抑制和凋亡数据更易分析和解释。
基础葡萄糖转运抑制剂利用非p53依赖性信号转导途径诱导凋亡和细胞死亡
为了确定抗癌化合物W25和W27利用p53依赖性途径还是利用非p53依赖性途径杀死癌细胞，在RKO和RKO E6细胞系中进行细胞杀伤测定。两个细胞系之间的差异为，RKO细胞与RKO E6细胞相比，含有高得多水平的p53。W25和W27在测定中杀死几乎相同量的RKO细胞和RKO E6细胞(图12A)，这一事实表明癌细胞系中的p53在细胞杀伤上不起任何重要作用。此外，PARP测定显示，在W25和27处理的H1299细胞中，完整的116 kDa PARP蛋白被切割成89kDa蛋白(图12B)，表明胱天蛋白酶3已激活并且胱天蛋白酶3凋亡途径在化合物处理的肺癌细胞中有活性。这些结果表明，所述化合物利用p53独立性和胱天蛋白酶3依赖性凋亡途径杀死癌细胞。
尽管发现用经化合物WZB-25或WZB-27处理之后，RKO和RKO-E6细胞的生存力之间没有显著差异(图18A)，但是在经α-PGG处理时，观察到两个细胞系之间在生存力上的显著差异(图18A和18B)，表明通过WZB-25或WZB-27诱导的凋亡为非p53依赖性的，因为两个细胞系中的p53水平不影响细胞生存力。相比之下，通过α-PGG诱导的凋亡为p53依赖性的，因为其处理在相同的两个细胞系中导致非常不同的细胞生存力(图18B)。此研究结果很重要，因为已知所有人类癌症中超过50%含有p53突变。不论其p53状态，这些抑制剂应能够对所有人类癌症发挥其抗癌作用。
此外，蛋白质印迹分析显示，在WZB-27和WZB-115处理的A549细胞中，完整的116kDa PARP蛋白被切割成89 kDa蛋白(图18C)，表明胱天蛋白酶3已激活并且胱天蛋白酶3凋亡途径在化合物处理的肺癌细胞中有活性。更令人关注的是，在含有5%正常葡萄糖浓度(1.25 mM对比25 mM正常)的细胞培养基中生长的细胞亦显示切割的89 kDa条带(图18C)，表明葡萄糖撤去导致相同的PARP切割。这些结果表明，化合物WZB-27和WZB-115利用p53独立性和胱天蛋白酶3依赖性凋亡途径在这些癌细胞系中诱导凋亡，而α-PGG以不同的p53依赖性机制诱导凋亡。亦显示的是，通过化合物抑制剂的细胞处理与葡萄糖撤去产生相同的PARP切割，提供了以下初步实验证据：化合物处理模拟通过葡萄糖撤去产生的效应。这很重要，因为其表明当在细胞中产生某些生物效应时，通过抑制剂抑制基础葡萄糖转运的方法与通过降低细胞培养基中葡萄糖浓度的葡萄糖撤去法可以互换。
化合物在癌细胞杀伤上的机制
癌细胞杀伤的可能机制在图13中以图解法表示。根据假设，癌细胞通过葡萄糖转运体1 (GLUT1)来摄取胞外葡萄糖。化合物α-PGG及其衍生物通过抑制GLUT (最可能为GLUT1)来抑制基础葡萄糖转运。基础葡萄糖转运的抑制导致胞内葡萄糖浓度的降低以及胞内游离Zn2+的增加；这些改变通过未知机制诱导ER应激以及最终诱导凋亡(图11)。
葡萄糖转运抑制剂在禁食小鼠中诱导轻度和暂时性高血糖症
针对基础葡萄糖转运的抑制剂在用于动物时可能增加血糖水平，这是因为所述抑制剂部分地阻断血糖进入靶细胞(主要为肌细胞和脂肪细胞)的移动。为了找出在动物中诱导的高血糖症的强度和持续时间以及其他潜在的副作用，我们通过将两种先导化合物WZB-27和WZB-115单独且腹膜内(IP)注入禁食小鼠中并观察血糖变化、经化合物注射动物的运动以及行为，来进行动物研究。如预期的，与溶媒注射组(PBS + DMSO)相比，化合物注射小鼠显示轻度和暂时性高血糖症，并且所述高血糖症在化合物注射后约3小时消失(图20)。化合物WZB-27和WZB-115二者均显示非常相似的血糖谱(图20)。在IC50 (对于WZB-27为10 mg/kg，对于WZB-115为1.5 mg/kg)下，两种化合物均诱导轻度和暂时性高血糖症。令人关注的是，在3x IC50的浓度下，两种化合物均未诱导更高的高血糖症。反而，注射3X IC50 (对于WZB-27为30 mg/kg ，对于WZB-115为5 mg/kg)导致与溶媒注射组的血糖水平非常相似的血糖水平(图20)。将此实验重复一次，获得相似结果。尽管目前不清楚在较高化合物浓度下血糖量正常的机制，但是推断这些化合物不会在小鼠中引发严重的高血糖症。在此实验中未观察到在动物运动、活动和行为上的其他显著变化。
为了进一步讨论对动物副作用的关注，在较高浓度下进行了较长期的多种化合物注射。在6x IC50或10x IC50的浓度下每天一次注射动物达一周。类似于单日实验，除两组中的轻度和暂时性高血糖症以及6x IC50组的一些体重减轻(≤总体重的10%)之外，未观察到显著的副作用。在一周研究结束时，化合物治疗组的血糖与溶媒治疗组的血糖之间无显著差异。这些结果强烈表明，基础葡萄糖转运的抑制可能没有很大毒性并且对于小鼠而言为相对安全的。可进行本文所公开的抗癌动物研究，以确定所述化合物的体内抗癌功效。
在通过葡萄糖去除或通过抑制基础葡萄糖转运诱导的葡萄糖剥夺中胞内葡萄糖 水平的比较
已频繁地进行葡萄糖剥夺实验，其中部分去除细胞培养基中的葡萄糖。然而，在剥夺期间或之后，常常未测定胞内葡萄糖水平变化。为了比较葡萄糖撤去和基础葡萄糖转运抑制对胞内葡萄糖水平的影响，将进行比较研究。
在其具有25 mM葡萄糖浓度的常规培养基中，将H1299和MCF7在24孔板中培养过夜，细胞的胞内葡萄糖浓度应与胞外葡萄糖浓度平衡。通过在不同的比例下将常规的含葡萄糖培养基与不含葡萄糖的培养基混合达到下列最终葡萄糖浓度：25 mM、10 mM、2.5 mM、1mM、0.25 mM (起始浓度的1%)，来降低一些孔的细胞生长培养基中的葡萄糖浓度。以无放射性葡萄糖浓度的1/50用3H-脱氧葡萄糖补充培养基，然后加入细胞中。将细胞孵育30、60和120 min，如在标准葡萄糖摄取测定中，在培养基去除和细胞裂解之后，通过闪烁计数器测定胞内3H-DG。经葡萄糖去除处理的这些样品可视为实验的阳性对照。为了比较，使用不同浓度的已知葡萄糖转运抑制剂fasentin、芹菜素或抗GLUT1抗体处理含有用3H-DG补充的常规生长培养基的孔中的癌细胞，然后在与葡萄糖去除样品相同的处理后时间测定其胞内3H-DG水平。剂量反应曲线和时间反应曲线可自这些数据生成并随后进行比较。这些曲线将显示葡萄糖去除和基础葡萄糖转运的抑制导致相同还是不同的胞内葡萄糖浓度。我们的内部葡萄糖转运抑制剂WZB-27和WZB-115亦将用于实验并且与经fasentin、芹菜素或抗GLUT1抗体处理的那些样品进行比较。未经葡萄糖撤去或化合物处理的细胞(但是具有相同量的放射性3H-DG)将作为未处理基线(阴性)对照。
葡萄糖去除或基础葡萄糖转运抑制期间GLUT1蛋白和mRNA水平的测定
已知GLUT1蛋白和mRNA在撤去葡萄糖时减量调节。然而，未知通过fasentin或我们的抑制剂化合物诱导的基础葡萄糖转运抑制是否亦导致GLUT1减量调节。为了解答这个问题，用以下方面处理癌细胞H1299和MCF7细胞：(1)在多个葡萄糖浓度下的葡萄糖撤去(自细胞培养基去除)，和(2)在多个化合物浓度下通过化合物(fasentin、芹菜素、抗GLUT1抗体以及化合物WZB-27和WZB-115)抑制基础葡萄糖转运。在处理1、2、4、8、12、24或48小时后，收集细胞并分离总细胞蛋白。使用抗GLUT1抗体(来自Santa Cruz)进行蛋白质印迹分析，以比较两种不同处理的样品中的GLUT1蛋白水平。利用光密度法定量各GLUT1蛋白条带，然后用其自身的β-肌动蛋白上样对照标准化，并与未处理对照样品中的GLUT1水平比较。处理样品和未处理样品之间的比较，将告诉我们所述处理是否导致GLUT1蛋白的减量调节。葡萄糖去除的样品和经化合物处理的样品之间的比较，将显示这两种处理是否导致在GLUT1上的差异，而fasentin/芹菜素/抗GLUT1抗体处理的样品和经WZB-27/WZB-115处理的那些样品之间的比较，将显示这些化合物之间的相似性和差异。
在同一实验中，亦分离总RNA。购买对GLUT1特异的可市购引物并用于实时PCR，以定量各处理条件中的GLUT1 mRNA水平。将GAPDH和/或β-肌动蛋白mRNA用作内部RNA参照。在这些处理中与未处理样品(对照)进行比较，以及在葡萄糖去除和通过化合物抑制基础葡萄糖转运之间进行比较。这些比较将显示是否亦在mRNA水平上减量调节GLUT1，以及这两种处理是否导致不同的GLUT1 mRNA表达结果。
不同实验条件下糖酵解速率的测定
使用或不使用葡萄糖去除或基础葡萄糖转运抑制剂处理H1299肺癌细胞和MCF7乳腺癌细胞。如先前所述，通过监测5-3H-葡萄糖向3H2O的转化来测定各处理条件的糖酵解速率。简单说来，将106个H1299和MCF7细胞用PBS洗涤一次，然后用1 ml Krebs缓冲液重悬浮并在37℃孵育30 min。然后将细胞沉淀，用0.5 ml含葡萄糖(10 mM，如果未指定)并掺加由10 µCi 5-3H-葡萄糖的Krebs缓冲液重悬浮。在37℃孵育1 h后，将一式三份50-µl等分试样转移到含有50 µl 0.2 N HCl (用于终止反应)的开盖PCR管中，并将一管转移到含有0.5ml H2O的闪烁瓶中，由此使得瓶中的水与PCR管的内容物不会混合。密封所述小瓶，并允许扩散进行至少24 h (以达到平衡)。已扩散和未扩散3H的量通过闪烁计数来确定。适当的仅含3H-葡萄糖(无细胞)和仅含3H2O的对照可包含在测定中，使得能够计算各样品中的3H2O并由此计算糖酵解速率。根据以下公式，将葡萄糖利用率计算为自3H-葡萄糖形成的3H H2O(以pmol已利用葡萄糖/106个癌细胞的形式表达)：
。
这些测定结果使我们能够确定葡萄糖撤去和化合物抑制如何在癌细胞中影响糖酵解速率。将未处理的癌细胞用作基线对照。亦将非癌细胞对应物NL-20(正常肺)细胞和MCF12A (正常乳腺)细胞用作对照以用于比较。
葡萄糖撤去或基础葡萄糖转运抑制期间的糖酵解酶变化
已显示葡萄糖撤去导致诸如己糖激酶和丙酮酸激酶(PK)等糖酵解酶的减量调节。已发现PKM2对于肿瘤发生而言非常重要，并且在癌细胞或增殖细胞中唯一表达。仍不清楚通过fasentin或我们的化合物抑制剂对基础葡萄糖转运的抑制是否亦导致类似的结果。为了解答这个问题，使用或不使用在其各自的IC50和IC70下的抗GLUT1抗体、fasentin以及我们的抑制剂化合物WZB-27和WZB-115，处理在24孔细胞培养板中生长的H1299和MCF7癌细胞。在24小时和48小时处理之后，收集细胞并分离总蛋白质。使用PK抗体(Cell Signaling)进行蛋白质印迹分析，以比较处理和未处理样品中的PKM2水平。此研究使我们能够确切地知道，当用化合物抑制剂处理癌细胞时，PKM2会发生什么。研究可包含使用或未使用葡萄糖撤去处理的同一癌细胞以用于比较。
亦将通过对PK描述的类似方法来研究己糖激酶(糖酵解中的第一种酶)的活性。针对己糖激酶的抗体可市购。此外，亦将测定己糖激酶的酶活性并用作糖酵解中变化的指征，因为己糖激酶是催化糖酵解的第一限速步骤的酶。使用已公布的方案测定己糖激酶活性。简单说来，通过将6-磷酸葡萄糖的形成与其经6-磷酸葡萄糖脱氢酶的去除偶联，在30℃以分光光度法测定活性，期间NADPH在340 nm处的吸光度改变。以mU表达活性，1mU定义为1nmol NADPH的形成/min。将酶溶于pH 8.0的Tris•MgCl2缓冲液以获得0.02-0.04 ΔA/min的速率。测定介质含有pH 8.0的0.05M Tris•MgCl2缓冲液、15 mM MgCl2、16.5 mM ATP、6.8mM NAD、0.67 mM葡萄糖和1.2个单位/ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶。在分光光度计中于30℃孵育6-8分钟以达到温度平衡并建立空白速率(如果有的话)。在0时，加入0.1 ml 稀释的己糖激酶溶液并充分混合。记录3-4分钟内340 nm处吸光度的增加。从曲线的起始线性部分确定ΔA/min。
利用下示公式进行计算：
与通过抑制基础葡萄糖转运诱导的葡萄糖剥夺期间的蛋白因子信号转导相关的 研究
发现Akt的激活增加糖酵解速率，这部分地因其通过HIFα来促进糖酵解酶表达的能力所致。将此推测为促成癌细胞的高糖酵解性质的主要因素。找出在葡萄糖转运和糖酵解上的改变如何影响Akt表达，亦令人关注。在此实验中，使用或不使用在其各自IC50下的抗GLUT1抗体、fasentin、WZB-27或WZB-115，处理癌细胞H1299和MCF7。在处理后1、2、4、8、24小时收集差异处理的细胞。自各样品中分离总蛋白并使用对Akt特异的抗体通过蛋白质印迹进行分析。Akt具有多个磷酸化位点，将不同的抗体用于区分在不同位点磷酸化的Akt。将处理的样品与未处理的样品进行比较，并且亦比较经不同处理的样品。在总Akt蛋白强度上的变化以及在Akt的不同磷酸化形式上的变化，将说明基础葡萄糖转运的抑制如何影响Akt的表达和磷酸化。亦使用与Akt相同的方式，研究涉及细胞生长信号转导途径的另一个蛋白因子AMPK，已发现所述AMPK影响糖酵解。
在癌细胞杀伤中葡萄糖转运的抑制剂使抗癌药敏化并与之协同
本文所公开的抑制剂靶定基础葡萄糖转运，而其他抗癌药靶定与葡萄糖转运非直接相关的途径或过程。因此，推测当一起使用时，葡萄糖转运抑制剂可在癌杀伤活性上增强或协同其他抗癌药。这会符合以下近期发现：抗GLUT1抗体致敏和增强抗癌药的抗癌活性，而我们的抑制剂同样应该做到这点。已在对H1299或A549细胞肺癌细胞的化合物研究中显示事实确实如此，所述肺癌细胞经WZB-115或(WZB-115+顺铂)或(WZB-115+泰素)处理(图21)。与仅通过药物诱导的癌细胞杀伤相比，向顺铂或泰素中添加WZB-115导致显著更多的癌细胞杀伤。对于WZB-27亦获得了相似结果(图21)。
此结果表明，诸如WZB-115或WZB-27等葡萄糖抑制剂可显著增强抗癌药的细胞毒性。这通过化合物的独立性抗癌活性或化合物对抗癌药的致敏活性或二者来实现。进一步的机制研究应能够确定实际的机制。此结果与其他人在其葡萄糖转运抑制剂研究中发现的结果相似，强烈表明这些化合物可单独用于抑制癌生长，或者与其他抗癌药一起使用以进一步增加所述药物的抗癌功效。这亦表明我们可以不需要在非常高的浓度使用这些抑制剂，只要其与其他抗癌药共同给予。
在葡萄糖摄取抑制以及在降低癌细胞生存力二者上，抑制剂比已知抑制剂 fasentin更有效
fasentin是已公布的基础葡萄糖转运抑制剂和已知的GLUT1抑制剂。完成了已报道抑制剂与fasentin的比较，以确定关注化合物是否表现出类似于fasentin的生物活性。已发现的是，类似于fasentin，我们的抑制剂诱导葡萄糖摄取的减少。某些化合物(例如WZB-115、131和133)与fasentin相比，在癌细胞中表现出更强的抑制(图22A)。此外，与fasentin相比，以相同的浓度向不同的癌细胞系中加入这些化合物(WZB-131和133)，导致更多的癌细胞死亡(图22B)。
这些结果证实，(a)这些化合物表现出类似于fasentin的生物活性，如同fasentin，它们是真正的基础葡萄糖转运抑制剂，(b)在测试的两种活性上，它们均比fasentin更有效。所有这些结果表明，这些化合物为fasentin样且为葡萄糖转运的抑制剂，但是它们具有更有效的抗癌活性。因此，可将它们作为可能优于fasentin的抑制剂用于癌细胞的葡萄糖转运、糖酵解和凋亡的研究。
通过NCI完成化合物WZB-115在59个癌细胞系中的抗癌活性筛选
为了进一步评价先导化合物WZB-115，将化合物送至国家癌症研究所(NCI)，以筛选其在总计59个癌细胞系中的抗癌活性(图23)。筛选结果表明，(a)在59个癌细胞系中以及在10 µM下，所述化合物使51个细胞系的生长速率降低超过10% (<对照生长速率的90%)。(b)所述化合物使21个癌细胞系的生长速率降低超过50% (或者测试的59个细胞系的35.6%，图23)。此结果表明，在这21个细胞系中，WZB-115的IC50低于10 µM。(c)所述化合物在全部癌症类型中均显示抗癌活性，虽然其在某些癌症类型中可能比在其他癌症类型中更有效。(d)在单一癌症类型或在不同癌症类型二者的癌细胞系中，均观察到活性的巨大变化。因此，与对全部癌细胞系同等细胞毒性的那些化合物相比，此化合物更不可能对正常细胞有非常大的细胞毒性。这亦符合我们在动物注射试验中的观察结果(图20)。因这些有前景的结果所致，NCI推荐使用5个不同的浓度对所述化合物进行第二轮筛选，以确定其在所有这些不同的癌细胞系中的IC50。
概括地说，初步结果表明，这些化合物为测试的全部癌细胞系中基础葡萄糖转运的抑制剂(表3和图19)。化合物处理导致p53独立性和胱天蛋白酶3依赖性的凋亡(图18)。化合物处理在癌细胞中比在其正常细胞对应物中引起显著更多的细胞死亡(表4)。其优先的癌细胞杀伤亦表明，这些癌细胞系与其正常细胞对应物相比，对化合物处理更敏感，这强烈表明，这些化合物对癌细胞的毒性显著大于对正常细胞的毒性。它们在动物中仅引发轻度和暂时性高血糖症(图20)，而不存在其他显著的副作用。此外，它们增强和协同现有的抗癌药(图21)。化合物的添加导致如通过葡萄糖剥夺所诱导的癌细胞表型改变(图18C)。这些化合物形成一组新型分子工具和抗癌剂，因为它们抑制新靶标——基础葡萄糖转运。fasentin和这些化合物可用于研究葡萄糖剥夺如何影响糖酵解以及糖酵解的变化如何影响诸如凋亡等其他变化。
初步动物功效和安全性研究
可确定化合物WZB-27和WZB-115在裸小鼠中抑制/逆转肿瘤生长的能力，以及所述化合物的临床安全性。使用化合物治疗患有癌症的裸小鼠(Jackson实验室)，所述癌症发展自H1299(肺癌)和MCF-7(乳腺癌)细胞。将五百万个癌细胞皮下注入30只裸小鼠每只的胁中。将肿瘤细胞注射的小鼠随机分成三组：十只用于化合物治疗，十只用于药物(例如WZB-117)治疗(阳性对照)以及另外十只接受溶媒(溶剂)治疗。在肿瘤变得可触及且可见之后(约5-7天)，开始化合物治疗。对于各化合物选择IC50的摩尔浓度用于治疗。临注射前，将化合物溶于DMSO或其他相容的溶剂。将溶解化合物的溶剂用于溶剂治疗组。在表5中显示动物研究设计。
表5.初步动物研究的设计(在H1299和MCF-7肿瘤小鼠二者中进行相同的研究)
根据肿瘤生长速率，每天一次进行化合物的IP注射，进行4-5周。一周两次使用测径器测定肿瘤大小并记录为LW2/2 = 以mm3计的体积(L=长度，W=宽度)，并且与溶剂注射对照小鼠的肿瘤大小进行比较。每周一次测定小鼠的体重。体重是经治疗小鼠健康状态的指征。为了确定化合物治疗如何影响血糖水平，亦在临化合物注射前以及注射后1、2和4小时测定血糖，并且将血糖水平与溶剂注射小鼠的血糖水平进行比较。一旦测定葡萄糖水平，便作出血糖监测应继续还是可终止的决定。化合物治疗持续3-5周，直至在溶剂治疗小鼠中生长的肿瘤变大(>体重的5% 但是<体重的10%，或者最大长度测定值≥ 20 mm)。可依照NIH以及我们大学IACUC的规章制度来进行和终止动物研究。依照NIH和DOA的相关规章，在研究结束时对荷瘤小鼠实行安乐死。将治疗组中肿瘤的平均大小与未治疗对照组进行比较，以显示治疗功效和统计学差异。基于对抗癌功效以及对小鼠的毒性(主要是其对血糖水平以及体重变化的影响，和/或其他意外的副作用)的综合考虑，选择两种化合物中的较好者用于下述剂量反应动物研究。
动物中化合物治疗的剂量反应的确定
尽管可在初步动物研究中显示抗癌功效，但是用于研究的剂量对于各化合物而言绝不是最佳的。为了进一步确定更佳的剂量(在所述剂量下抗癌功效最大但是副作用仍可耐受)，可进行剂量反应动物研究(表6)。
表6.化合物剂量反应的确定
对于化合物Fasentin、WZB-27和WZB-115，将尝试两个剂量：IC50和3x IC50。在此实验之后，将得知这些化合物的剂量反应。我们亦将得知何种化合物在减少肿瘤大小和副作用方面表现最佳，以及裸小鼠能否良好地耐受3x IC50剂量。此研究将使用H1299和MCF-7癌细胞模型二者完成。根据此实验的结果，将两种化合物之一(WZB-27或WZB-115)命名为待确定的化合物(化合物tbd)，并且选择其更佳的剂量用于下一轮动物研究。
基础葡萄糖转运的抑制剂是否增强和协同癌症药的抗癌活性
在fasentin和抗癌药(Ref)之间发现了协同和增强效应。在我们的初步研究中，亦观察到类似效应(图21)。然而，不清楚可否亦在动物中发现这类协同效应。为了该目的，将进行大型动物研究(表7)。
表7.用于确定抑制剂和癌症药之间的协同的动物研究设计
化合物抑制剂治疗如何影响涉及糖酵解、细胞生长信号转导和凋亡的蛋白质/酶 的水平
为了更好地理解基础葡萄糖转运的抑制剂如何在体内抑制肿瘤生长，从在上述动物实验结束时已实行安乐死的肿瘤小鼠中移出使用或未使用化合物抑制剂处理的肿瘤，并通过液氮将其迅速冷冻用于后续分析。对于肿瘤分析，自移出的肿瘤中提取蛋白质并定量。然后使蛋白质样品进行PAGE，随后使用特异性针对p53、Akt、PKM2、己糖激酶和胱天蛋白酶的抗体进行蛋白质印迹分析。将来自化合物治疗样品的这些蛋白质的强度与经溶剂(溶媒)治疗肿瘤样品的蛋白质强度进行比较。将蛋白质β-肌动蛋白和/或GAPDH用作蛋白质上样对照，用于标准化蛋白质条带。这些蛋白质印迹使我们能够获得化合物治疗的肿瘤中的蛋白质表达变化，所述变化可能利于这些化合物抑制剂体内抗癌机制的最终阐明。
第2代化合物的合成
本文公开了基于母体芳环和酚类芳族取代基之间的键合的改变，设计并合成第2代基础葡萄糖转运体。预先合成并评价了多酚酯的小型文库。显示第1代化合物在H1299肺癌细胞中抑制基础葡萄糖转运，并且亦在H1299细胞中抑制癌细胞生长。从此文库中选择WZB-115作为先导化合物。遗憾的是，WZB-115未通过动物模型中的长期稳定性试验。已确定WZB-115和WZB-117在人血清中的降解速率，两种化合物均在48小时后完全降解。因此，需要设计并合成更稳定的类似物。
本文公开了新型葡萄糖转运抑制剂WZB-115、WZB-117和WZB-173的结构(图37)。化合物WZB-117为WZB-115的类似物，而WZB-173为醚键类似物。化合物WZB-117和WBZ-173 (图37)衍生自化合物WZB-115，所述WZB-115为用于我们第1代癌症研究的多酚模型化合物。WZB-115衍生自称为五没食子酰基葡萄糖(PGG)的天然抗癌抗糖尿病化合物。WZB-117和WZB-173在结构上与WZB-115非常相似，但是与WZB-115相比，既经结构简化又经功能优化。因此，WZB-117和WZB-173在其抗癌活性上比WZB-115更有效，并且在溶液和细胞培养基中，结构上比WZB-115更稳定。
多酚醚衍生物的合成
经四步以高产率合成3-(甲氧基甲氧基)苄基氯(用于初步设计多酚衍生物的前体)。在甲醇中用硫酸处理可市购的3-羟基苯甲酸，以引发Fischer酯化。通过用MOMCl处理酚酯来完成酚的保护。在还原酯之后，进行改进的Appel反应，经四步以大于65%提供所需化合物(方案2)。
方案2. 3-(甲氧基甲氧基)苄基氯的合成
经由SN2型反应或亲核酰基取代反应(方案3和4)完成了多酚醚、多酚胺和多酚酰胺的合成。本领域技术人员可在未进一步描述或公开进一步的实验详情的情况下，完成第二代基础葡萄糖转运抑制剂的合成。
方案3.多酚醚衍生物的合成
方案4.多酚胺和多酚酰胺衍生物的合成
第2代化合物的评价
如通过标准葡萄糖摄取测定法所测定，与未经化合物处理的细胞对照(视为0%抑制)相比，化合物WZB-134、WZB-141和WZB-144在H1299细胞中抑制基础葡萄糖转运分别达92.5 ± 2.2%、96.5 ± 0.5%和78.2 ± 1.4% (表12)。在H1299细胞中用MTT细胞增殖测定法测定，发现其对癌细胞生长的抑制活性分别为10.6 ± 2.0%、39.5 ± 1.8%和14.5 ±7.6% (将未经化合物处理的细胞对照视为0%抑制)。
表12.多酚醚(Polyphenolic ethes)、多酚胺和多酚酰胺在H1299肺癌细胞中诱导 在基础葡萄糖转运和细胞生长方面的抑制活性
抗肿瘤研究。WZB-117对移植到裸小鼠上的人肺癌A549的抗癌活性
此动物肿瘤研究表明，通过每天注射WZB-117，尽管肿瘤大小的变化相当大，但是化合物治疗肿瘤的肿瘤大小平均比模拟治疗组肿瘤大小小约75% (图30A)。此结果定性地类似于使用抗糖酵解剂的肿瘤研究结果。值得注意的是，十个化合物治疗肿瘤中的两个在治疗期间消失，并且甚至在研究结束时它们仍未生长回(图30B)。体重测定和分析显示，与模拟治疗小鼠相比，经WZB-117治疗的小鼠减轻2-3克重量，大部分重量减轻在脂肪组织上(表8)。血细胞计数和分析显示，一些关键的血细胞(例如淋巴细胞和血小板)在化合物治疗小鼠中显著变化，但是它们仍在正常范围中(表9)。所有这些结果表明，WZB-117的治疗在减小肿瘤大小上有效，并且小鼠相对良好地耐受所述治疗。使用基础葡萄糖转运抑制剂的关注点之一为，所述抑制剂可能在经注射的患者中引发高血糖症。已发现WZB-117的注射产生轻度和暂时性高血糖症，所述高血糖症在化合物给予后2小时的时间内消失，并且其不会导致持久的高血糖症。
抗癌机制研究。抗癌化合物WZB-117对Glut1的抑制
为了证实葡萄糖转运的抑制剂诱导ER应激，使用30 µM抑制剂WZB-117处理A549细胞(以葡萄糖剥夺为对照)。分离自经处理细胞的蛋白质的蛋白质印迹显示，葡萄糖调节的蛋白质-78 (GRP78，亦称为BiP，关键的ER应激标志物之一)在抑制剂处理48和72小时后显著增量调节(图32)，表明所述抑制剂的确在癌细胞中诱导ER应激。常规细胞培养基中的葡萄糖浓度为25 mM，将2.5 mM (常规浓度的10%)用作葡萄糖剥夺对照条件。所述抑制剂亦导致在BiP增量调节上与葡萄糖剥夺定性相似的结果(图32)。
葡萄糖剥夺诱导ER应激蛋白BiP的增量调节。将肺癌A549细胞通过葡萄糖剥夺或通过抑制剂117处理不同的时间，然后通过使用抗BiP抗体来分析细胞的蛋白质。β-肌动蛋白作为蛋白质对照(图32A)。
先前发现，我们的抗葡萄糖转运化合物在测试的所有癌细胞系中抑制葡萄糖转运。推测这些抑制剂的靶标为Glut1，因为Glut1在几乎所有细胞类型中负责基础葡萄糖转运。为了检验这个假设，选择RBC作为研究的细胞模型，因为已知RBC仅表达Glut1，不表达任何其它葡萄糖转运体。葡萄糖摄取测定显示，WZB-117的确在RBC中抑制葡萄糖转运(图31A)，这支持以下观点：WZB-117通过抑制Glut1来抑制葡萄糖转运。为了进一步排除其它可能性，在RBC衍生的囊泡中重复葡萄糖摄取测定，所述囊泡中已去除所有胞内蛋白质和酶，仅留下膜结合蛋白和紧密相关的蛋白。测定结果显示，WZB-117在这些囊泡中仍然抑制葡萄糖转运，表明胞内蛋白质对于抑制而言为非必需的，并且为Glut1是抑制的靶标提供有力证据(图31C-E)。
使用人红细胞(RBC)以便确定通过我们的化合物抑制基础葡萄糖转运的蛋白质靶标。RBC的选择基于(1)猜测Glut1作为最可能的靶标并且RBC表达Glut1作为其唯一的葡萄糖转运体，(2) RBC是用于研究葡萄糖转运的已建立的模型，并且已频繁用于研究葡萄糖转运。
发现除在所有癌细胞系中抑制基础葡萄糖转运之外，我们的化合物亦在RBC中抑制葡萄糖转运(图31)，表明所述化合物作用于Glut1以进行抑制，并且支持Glut1为抑制的靶标。
为了促进靶标鉴定，自破裂的RBC (称为血影细胞)制备囊泡。这些小型密封的囊泡在不同的盐条件下形成自RBC的血浆膜，并且其显示两种不同的方向：内翻外或右翻外。右翻外囊泡(ROV)表现出与RBC相同的膜方向，而内翻外囊泡(IOV)显示与RBC膜相反的膜方向。然而，由于Glut1为葡萄糖单输送体并且可在两个方向转运葡萄糖，因此位于IOV或ROV的Glut1均应能够顺葡萄糖梯度转运葡萄糖。如预期的，葡萄糖摄取测定显示，我们的化合物可在IOV和ROV二者中抑制Glut1介导的葡萄糖转运(图31C-E)，为我们的假设提供了有力的支持证据，所述假设为，Glut1是通过我们的化合物抑制的作用标靶。化合物在IOV中比在ROV中显示更多抑制的原因，是因为ROV制品中Mg++的存在。先前未知Mg++对Glut1功能的干扰。
化合物对ROV和IOV二者均起作用的观察结果亦表明，所述化合物可与Glut1的胞外部分相互作用。所述Glut1的胞外部分胞内地(囊内地)位于IOV中。化合物可能穿过囊泡膜并与Glut1的囊内部分相互作用，抑制葡萄糖顺梯度转运。这符合所述化合物的化学性质，所述化学性质指出，化合物的疏水性可能允许所述化合物穿过囊泡膜，并且在人造囊泡中囊内地起作用或者在完整细胞中胞内地起作用。
第2代化合物优先在与其正常对应物相对的癌细胞中诱导细胞死亡
癌细胞依赖葡萄糖作为其能源，并且已提出将基础葡萄糖转运抑制作为抗癌策略。为了使这些化合物成为有效的抗癌剂，它们必须能够杀死多于正常细胞的癌细胞。化合物WZB117杀死显著多于非癌细胞的癌细胞。使用或不使用WZB117将A549肺癌细胞和MCF7乳腺癌细胞(图35)处理48小时，然后使用MTT测定法测定其各自的生存率。模拟处理的细胞作为对照(100%生存力)以用于比较。以相同方式处理非癌NL20和MCF12A细胞以用于比较。这些结果表明，化合物WZB-117具有作为抗癌剂的潜力。图36表明，化合物WZB-117对癌细胞比对非癌(即“正常”)细胞表现出显著更大的细胞毒性。
实施例
一般实验方案
实验方案。化学的和合成的。
用于鉴定改进的基础葡萄糖转运抑制剂的一般方案
在图24中概述了改进的小分子抗癌剂的鉴定，所述抗癌剂充当基础葡萄糖转运的抑制剂。在设计并合成潜在的基础葡萄糖摄取抑制剂之后，在单一浓度下用基础葡萄糖抑制测定和凋亡测定二者检测所述化合物。进一步检测超过基线值的化合物，并确定IC50值。这些测定的结果将用于指导另外的药剂设计。
基础葡萄糖转运抑制剂的药理学评价
所有化合物将使用一系列药理学测定来评价，设计所述药理学测定以确定所述化合物抑制基础葡萄糖摄取和杀死癌细胞二者的能力。化合物的初步评价将集中在以下化合物的去除，所述化合物在血清中不稳定或者缺乏适当的活性。
对化合物测定其抑制基础葡萄糖摄取的能力。首先在10 μM的浓度下测试所有化合物，测定其对基础葡萄糖转运的抑制活性并与WZB-27的抑制活性进行比较。在葡萄糖摄取测定之前，使用或不使用所述化合物将生长在24孔细胞培养板中的细胞系H1299 (肺癌)和MCF-7 (乳腺癌)处理10 min。通过在不存在和存在化合物的情况下，在无葡萄糖RPMI1640缓冲液中将细胞与0.2 Ci/mL [3H]2-脱氧葡萄糖(比活，40 Ci/mmol)一起孵育30min，来测定细胞葡萄糖摄取。在去除缓冲液之后，用冰冷的PBS洗涤细胞，裂解细胞、转移至闪烁瓶并通过液体闪烁计数来定量细胞裂解物中的放射性。仅挑选以下化合物用于下一轮测定，所述化合物显示与WZB-27的抑制活性相当或者更强的抑制活性。使用已知的葡萄糖转运抑制剂Fasentin (IC50≥50 μM)和芹菜素(IC50≥60 μM)作为阳性对照以用于比较。
初步测定亦将确定这些化合物杀死癌细胞以及不影响正常细胞的能力。通过上述基础葡萄糖转运的抑制活性的葡萄糖摄取测定标准的那些化合物，将在随后的细胞杀伤(生存力)测定进行测试。在30 μM的浓度下将化合物分别加入生长在24孔板中的H1299 (及其正常细胞对应物NL20)和MCF-7 (及其正常细胞对应物MCF-12A)细胞中，并且在细胞培养箱中于37℃培养48小时。培养之后，通过MTT测定法对各孔中的细胞测定其生存力。
当关注化合物比WZB-27更大地抑制葡萄糖摄取，导致癌细胞生存力减少至少50%并且导致正常细胞生存力减少不超过20%时，进行化合物的进一步研究。满足最低初筛要求的化合物的进一步测定可包括，通过包含多个浓度测定点(例如0.1、0.3、1、3、10、30和50 μM)来确定葡萄糖摄取抑制的IC50和细胞杀伤的EC50。
更有效且更具选择性的基础葡萄糖转运抑制剂的合成
总体目标为产生更有效且更具选择性的葡萄糖摄取抑制剂。这些化合物应具有较低的分子量、改进的水溶性以及良好的稳定性。所有化合物将以15-20 mg规模制备并纯化至如通过HPLC、LCMS和1H/13C NMR所分析的>90%纯度。将每种化合物作为DMSO中的50 mM溶液储存在条码瓶中。此规模将提供足够的材料用于初筛，以及如有必要的后续筛选。
如图25所示，先导化合物(WZB-115、WZB-117和WZB-118)具有四个不同的关注分子区：中心芳香核、侧臂芳基、接头以及中心芳香核上的取代。检测这四个区的每一个，以确定其重要性并开发更有效的类似物。初期焦点将放在不可水解接头的开发上，所述接头保留母体酯的活性。这对于完成体内功效研究而言为关键的。同时，将检测侧臂酚被生物电子等排取代物的的取代，以试图改善生物利用度。亦将测定中心芳香核的取代和身份，以试图改善效力。
接头修饰
本文考虑一系列类似物(图26)，其中已修饰中心芳香核和侧臂芳环之间的接头。这些深入接头修饰的研究聚焦于可能不稳定的酯键合的取代。这些研究意义在于，所述接头对中心芳香核和侧臂芳环之间的构象关系可具有深远的影响。此外，水解上更稳定的类似物将在体内研究中非常有用。将制备在中心芳环和侧臂芳环之间全为碳键合的三种类似物(6、7、8)。亦将制备硫连接的类似物(amalogs)，其包括硫化物、亚砜和砜接头(9、10、11)。将制备中心芳环和侧臂芳环之间具有氧键合的醚类似物(12)。将制备酰胺连接的类似物13以及两个双环连接的衍生物(14、15)。所有这些类似物均基于WZB-117结构。已基于母体化合物的活性选择该核，以及相对于WZB-27核，基于WZB-117核简化合成。
本文考虑所提出类似物的最小能量结构，其在图14中显示。数种类似物在其与母体WZB-117的相似性上突出。这些包括烯烃7、亚砜10、砜11和酰胺13。所有这些类似物均在核心芳环的对侧具有侧臂芳环。正如可能预期的，烷烃8、硫醚9和醚12具有很大的相似性。这些类似物的高柔性表明，它们可采用很多种构象异构体，包括活性WZB-117的构象异构体。炔烃6和苯并咪唑14相似，因为它们共有相对平面的总体结构。二英15为唯一的，具有单一良好限定的构象，其两个侧臂芳环在核心芳环的同侧。显然，具有非常刚性接头的炔烃衍生物和烯烃衍生物提供不同于任何其它结构的唯一结构。这组类似物的合成和测定将提供最佳构象的信息，并确定适当的水解上稳定的接头。
本文考虑的第一组类似物在侧臂羟基苯基环和核心氟代苯环之间含有碳键合，并且使用单一合成序列制备。从已知的二溴氟苯16开始，将获得与末端炔烃17偶联的两个Sonagashira偶联物，以提供炔烃连接的中间体。炔烃17可从必要的醛制备或经由溴化物的Sonagashira偶联制备。用酸将羟基脱保护应提供目标类似物6。然后将所述炔烃部分还原，以提供顺式烯烃类似物7。最后，使用H2和Pd实现烯烃的完全氢化，以提供碳连接的类似物8。
本文亦考虑一系列硫连接的类似物，包括化合物10和11，其将提供母体酯的生物电子等排且水解上稳定的类似物。此外，所述三种类似物(9-11)将改变酚基的酸度。此系列的合成从可市购的氟化物18的二溴化开始。然后将二溴化物用于烷基化苯硫酚19，以提供第一种类似物。然后两个连续氧化将提供亚砜(10)和砜(11)。
醚连接衍生物的合成从使用溴化苄(21)将二醇20二烷基化开始，以提供受保护的二醚。溴化物21可通过还原/溴化对应的酸容易地制备。然后用酸将酚羟基脱保护，提供目标醚连接的类似物12。
酰胺衍生物提供相对于母体酯构象受限的类似物，以及提供水解上更稳定的衍生物。合成相当简单，仅需要使用必需的酸将可市购的二胺23酰化。MOM基的去除将提供类似物13。
二英衍生物14将提供高度构象受限的类似物。如下所示，此化合物将通过α-溴酮27和二醇20的缩合来制备。溴化物27可通过将Weinreb酰胺24与格氏试剂25偶联来制备。这将提供酮26，其可容易地溴化以提供关键的α-溴酮27。27与二醇20缩合接着立体选择性还原中间体氧离子，提供顺式二取代二英14。
苯并咪唑类似物15提供相对于二英14的备选构象。此外，苯并咪唑环应提供相对于母体WZB-117改善的水溶性。化合物WZB-117具有2.96的ClogP(数字越小表示水溶性越大)，而类似物15具有2.72的ClogP。另外，此化合物应为水解上稳定的。将二胺22与醛28缩合，以提供取代的苯并咪唑29。酰化接着去除苄基保护基，应提供目标化合物15。
相对于接头基团，这组化合物将提供葡萄糖摄取抑制的初始构效关系。已提出数种类似物，其解决酯基的稳定性以及侧臂芳环的构象。如通过这组的药理学活性所证实的，这些类似物仅代表用于酯键合修饰的初始靶标，并且将进行进一步修饰以扩展这些研究。
本文亦考虑以下化合物，其中R选自H、Me、Et和iPr：
侧臂生物电子等排取代
已将3-羟基苯基鉴定为最佳侧臂芳基。已知酚类常常具有低生物利用度以及短的活性持续时间，由于此基团的流畅代谢、缀合和排泄。考虑到开发代谢上更稳定类似物的需要，将检测一系列苯酚生物电子等排体。已在文献中报道数十个这类生物电子等排体。
本文考虑两大组类似物，乙酰氨基生物电子等排体和一系列杂环生物电子等排体。将3-氨基苯甲酸转化成乙酰胺、甲磺酰胺和尿素，然后与二醇20偶联以分别提供类似物31、32和33。亦将制备额外的类似物(34)，其基于用如在β肾上腺素能阻断剂沙丁胺醇中所见的羟甲基取代苯酚。通过将可市购杂环羧酸与二醇20偶联来制备四种不同的杂环衍生物(35-38)。该组化合物将提供关于能够使用可能代谢上更稳定的部分取代酚基的信息。
本文亦考虑以下化合物，其中X选自H、3-Cl、3-F、3-CN、4-F、4-CN、4-NO2、4-SO2Me和4,5-Cl2：
中心芳香核的优化
本文亦考虑第三组类似物，其中修饰来自WZB-117和WZB-118的中心芳环。此研究通过芳环上取代(即F基团或Cl基团)的改变来允许WZB-117和WZB-118类似物活性的优化。芳香核上氯基或或氟基的引入以及其中一个苯甲酰基的去除，产生了改善的效力以及更低的分子量。已证实3-氟和4-氯衍生物(当从最远的O-苯甲酰基开始计数时)具有最佳活性。就生成另外的类似物而言，这意味着图29中所示二醇将对进一步的支架精化极其重要。已利用Topliss树形法来生成这些衍生物中的许多。如前所示用酰氯23将这些衍生物酰化并随后脱保护。这些化合物可市购或者可通过本领域技术人员容易地制备自可市购的前体。化合物39、42、46和43可市购。可通过将相应的醛氧化转化成腈来制备腈40和44。可通过使用沸石负载的硝酸铜试剂硝化，来制备硝基衍生物41和45。
这组化合物将提供有价值的深入中心芳环上最佳取代的见识，并为第4代和第5代类似物的合成提供指导。这组衍生物为潜在类似物的小样品，所述类似物将根据来自第2代类似物的阳性生物学结果而合成，更多代的类似物可基于来自数种特定修饰的结果的组合而合成。
实验方案。生物学的
化合物。在-20 ℃储存化合物粉末并在各实验之前新鲜制备溶液。将化合物溶于DMSO以制备10 mM储液。在大多数研究中，将30 µM WZB-27和10 µM WZB-115用于细胞处理。
细胞系和细胞培养。人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系H1299和A549、人导管上皮乳腺癌MCF7以及人非致瘤性NL20肺细胞和MCF12A乳腺细胞购自ATCC。将H1299、A549和MCF7细胞维持在含有10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中。使NSCLC细胞系A549、H358、H226和H1650生长在含10% FBS的Ham氏F12K中。将NL20细胞维持在用0.1 mM非必需氨基酸、0.005 mg/ml胰岛素、10 ng/ml表皮生长因子、0.001 mg/ml转化因子、500 ng/ml皮质醇和4%胎牛血清补充的Ham氏F12培养基中。在DMEM和Ham氏F12培养基的1:1混合物中培养MCF12A细胞，所述混合物含有20 ng/ml人表皮生长因子、100 ng/ml霍乱毒素、0.01 mg/ml牛胰岛素、500 ng/ml皮质醇和5%马血清。使所有细胞生长在37 ℃具有5% CO2的潮湿气氛中。分别用30 µM或10 µM浓度下的化合物WZB-27或WZB-115将细胞处理24或48小时。将未处理的细胞用作对照。
细胞裂解物制备和蛋白质印迹分析。方案1。从培养板中收集细胞，用3x样品缓冲液重悬浮，并煮沸5 min。蛋白质浓缩之后，将通过Pierce二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定法(Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL)测定的约50 µg蛋白质提取物上样。使样品在10% Bio-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上跑动并转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF,Biorad)。将所述膜与对p53或PARP或β-肌动蛋白特异的抗体一起孵育。在胶片显影后可见特异性蛋白质条带。用于p53的抗体购自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz,CA, USA)。PARP抗体和β-肌动蛋白抗体购自Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA, USA)。
细胞裂解物制备和蛋白质印迹分析。方案2。通过NP40裂解制备来自细胞的裂解物。在等体积的2× SDS样品缓冲液中煮沸样品，并在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离。在半干转移至负载硝酸纤维素膜之后，使用来自R&D systems的针对GLUT1的单克隆抗体探查印迹。通过使用来自Amersham Biosciences的增强化学发光测定系统来探测蛋白质。
实时RT-PCR方案。使用Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, CA)分离总RNA。为了清除基因组DNA的任何遗留物，使用无DNA试剂盒(Ambion, Austin, TX)，用DNA酶处理总RNA。使用用于PCR的先进RT(Advantage RT for PCR) (BD Biosciences, Palo Alto, CA)自总RNA合成cDNA。在含有随机六聚体引物的50 µl反应混合物中使用1 mg总RNA。用于GAPDH的实时引物和TaqMan®探针购自Biosource (Camarillo, CA)，并依照制造商说明书使用。在含有ABI TaqMan® Universal Master Mix (Applied Biosystems, Branchburg, NJ)的25µl实时PCR反应物中使用3 ml cDNA模板。依照制造商说明书，在25 µl反应体积中使用1 µlcDNA模板，使用Sybr®绿色染料和Quntitect Sybr®绿色试剂盒完成GLUT1检测。
葡萄糖摄取测定。在葡萄糖摄取测定之前，使用或不使用化合物将癌细胞处理10min。通过在不存在和存在化合物的情况下，在无葡萄糖RPMI 1640中将细胞与0.2 Ci/mL[3H]2-脱氧葡萄糖(比活，40 Ci/mmol)一起孵育30 min，来测定细胞葡萄糖摄取。在用冰冷的PBS洗涤细胞并裂解细胞之后，将细胞裂解物转移至闪烁计数瓶，并通过液体闪烁计数来定量细胞裂解物中的放射性。
细胞周期分析。在经化合物或含有低浓度葡萄糖的培养基处理之后，收集细胞，用冷PBS洗涤并用70%冷乙醇重悬浮。在过夜固定之后，去除乙醇并使用碘化丙啶、无DNA酶的RNA酶A和PBS混合物(4:1:95)将细胞在37 ℃处理30 min。通过流式细胞术(FACS, BD)分析DNA含量。使用Modfit软件(Verity Software House)计算细胞周期各阶段中细胞的百分比。将每个样品重复三次。
细胞生存力测定。通过以下良好确立的方法进行MTT测定。在96孔组织培养板中，在各孔中接种10,000个细胞。在存在或不存在化合物的情况下将细胞培养18 h。将溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯四唑(MTT)溶于PBS (10 mg/ml)并过滤除菌。在培养结束前3小时，向96孔板中含有细胞的各孔中加入20 μL MTT溶液。将培养板在培养箱中于37℃培养3 h。轻轻吸出培养基并向各孔中加入200 μL DMSO，以溶解甲晶体。对于细胞生存力，在550 nm处测定吸光度。
增殖测定。将MCF-7、H1299和H1650细胞接种到多聚右旋赖氨酸(Sigma)包被的8孔玻璃小室载玻片(10,000个细胞/孔)上。将细胞与化合物一起孵育24 h或48 h。依照制造商方案，使用来自Roche的5-溴-2′-脱氧尿苷标记和检测试剂盒固定细胞并染色。
对抗癌协同作用的研究。使H1299和MCF7细胞在96孔板中生长。在存在或不存在化合物WZB-27 (30 µM)或WZB-115 (10 µM)的情况下，使用在其IC50下的顺铂或泰素，于37 ℃将细胞处理48小时。通过MTT细胞增殖测定法测定经处理细胞的生存力。
凋亡测定。将MCF-7、H1299细胞接种到多聚右旋赖氨酸(Sigma)包被的8孔玻璃小室载玻片(10,000个细胞/孔)上。将细胞与不同浓度的化合物一起孵育24 h。未经化合物处理的细胞作为对照。孵育24 h后，依照制造商说明书，使用Promega的DeadEndColorimetric TUNEL系统固定细胞并染色。亦可通过经相同操作加入5 μM顺铂或紫杉醇或者10 μM吉非替尼，来评价药物的协同作用。
免疫荧光法。GLUT1单克隆抗体购自R&D Systems Inc (Minneapolis, MN)。将细胞接种到多聚右旋赖氨酸(Sigma)包被的8孔玻璃小室载玻片(10,000个细胞/孔)上用于免疫染色。将细胞用3.5%低聚甲醛固定25 min，用0.2% Triton X-100/PBS透化5 min并在PBS中用5%正常山羊血清于室温阻断1 h。第一抗体孵育于4℃过夜进行。洗涤之后，使用山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor-488于室温进行30 min第二抗体孵育。使用含DAPI的Vectashield封固剂(Vector Laboratories, Inc.)检测DAPI。将仅经第二抗体的染色用作阴性对照。使用带有照相机的荧光显微镜(40×/0.75数值孔径)，通过荧光显微术来观察载玻片。
统计学分析。相同实验条件的样品以一式三份或更多份进行。每个实验重复至少一次(动物研究除外)。以平均值±标准差或平均值的标准误差来报告数据。根据测定的性质，利用非配对斯氏t检验以及使用单向或双向ANOVA以及Turkey事后检验来分析数据。将显著性水平设定为p≤0.05。
实验方案。动物研究
确定化合物在裸小鼠中抑制/逆转肿瘤生长的能力，以及所述化合物的临床安全性。仅考虑满足以下标准的化合物用于动物研究；在葡萄糖摄取抑制中IC50 < 10 μM，在细胞杀伤测定中EC50 < 10 μM，以及在正常细胞中显著更少的杀伤。
对于抗癌功效及安全性动物研究，使用各选择的化合物治疗患有癌症的裸小鼠，所述癌症发展自H1299 (肺癌)和MCF-7 (乳腺癌)细胞。将五百万个癌细胞皮下注入15只裸小鼠每只的胁中。将肿瘤细胞注射的小鼠随机分成三组：5只用于化合物治疗，5只用于药物(例如WZB-117)治疗(阳性对照)以及另外5只接受溶媒(溶剂)治疗。在肿瘤变得可触及并可见(约2-3周)之后，开始化合物治疗。对于各化合物选择EC50的摩尔浓度用于治疗。将化合物溶于DMSO或其他相容的溶剂中。
根据肿瘤生长速率，每周3次进行化合物的IP注射达3-5周。每周两次用测径器测定肿瘤大小并记录为WxLxH = 以mm3计的体积，并且与未经化合物注射的对照小鼠的肿瘤大小进行比较。每周一次测定小鼠的体重。为了确定化合物治疗如何影响血糖水平，亦在临化合物注射之前和注射后1小时测定血糖，并将血糖水平与未经化合物注射小鼠的血糖水平进行比较。所述化合物治疗持续3-5周，直至生长在未治疗小鼠中的肿瘤变大(>体重的5%但是<体重的10%)。依照NIH以及我们大学IACUC的规章制度来进行和终止动物研究。依照NIH和DOA的相关规章，在研究结束时对荷瘤小鼠实行安乐死。将治疗组中肿瘤的平均大小与未治疗对照组进行比较，以显示治疗功效和统计学差异。
基于对抗癌功效以及毒性(主要是其对血糖水平以及体重变化的影响，和/或其他意外的副作用)的综合考虑，选择最佳化合物用于下述较大规模动物研究。
基础葡萄糖转运抑制剂作用的分子机制研究
在更多癌细胞系中的抗癌活性
本文考虑包含多个肺癌细胞系和乳腺癌细胞系的癌细胞系筛选，用化合物测试所述细胞系以经由MTT测定确定其抗癌活性，进而表明所述化合物的癌细胞杀伤活性为非细胞系依赖性活性。H1299细胞来源于非小细胞肺癌(NSCLC)。亦可测试诸如A549、H358、H226和H1650等其他NSCLC细胞系。类似地，亦可在乳腺癌细胞系T47D连同MCF-7中测试化合物，以确定所述化合物是否在另外的乳腺癌细胞系中表现出相似的抗癌活性。相同组织的正常细胞(对于正常肺组织为NL20，对于正常乳腺组织为MCF-12A)将包括在研究内，以确定与对其正常对应物相比，化合物对癌细胞的细胞毒性和杀伤增加。为了使基础葡萄糖转运的抑制与化合物的细胞毒性相关联，使用葡萄糖摄取测定来测定和比较癌细胞系和正常细胞系的葡萄糖摄取速率。因其更高的能量需要所致，预期癌细胞系与其正常细胞对应物相比，表现出更高的葡萄糖摄取速率。相对于正常细胞，在癌细胞中增加的细胞杀伤可能是因为基础葡萄糖转运的抑制，所述基础葡萄糖转运对于癌细胞增殖和生存而言极其重要。此研究亦将进一步强化以下观点，基础葡萄糖转运为在本专利和相关出版物中所公开化合物的抗癌作用的靶标。亦可使用未处理细胞作为对照，用标准测定法在化合物处理的细胞中测定己糖激酶(涉及糖酵解的第一种酶)的酶活性，以确定在这些癌细胞中化合物处理如何影响糖酵解。
除所述细胞系之外，亦将向开发治疗药计划的NCI 60-细胞系筛选(Developmental Therapeutics Program’s NCI 60-Cell Line Screen)提交所选化合物。
本文亦考虑以下理论：所公开的基础葡萄糖转运体将增强其它抗癌剂的化学治疗效应。为了确定所述化合物可否增强其它抗癌药的抗癌活性，在不存在和存在化合物的情况下，向H1299和MCF-7细胞中加入5 μM顺铂或紫杉醇或者10 μM吉非替尼达48小时。孵育之后，通过MTT测定和细胞增殖测定(对于详情参见本节末尾处的一般程序)二者来确定细胞生存力。将(药物+化合物)处理的样品与仅经药物处理的那些样品进行比较。在(药物+化合物)处理的样品中增加的细胞死亡表明，所述化合物可增强药物的抗癌活性。
附加的受体结合测定
本文考虑一系列受体结合测定，所述测定将用于确定在本申请中公开的基础葡萄糖转运抑制剂的作用靶标。为了研究所述化合物的作用靶标，将进行结合竞争研究。在不存在和存在渐增量的化合物的情况下，于37℃向H1299或MCF-7细胞中加入抗GLUT1抗体达1小时。共同孵育之后，通过洗涤去除未结合的抗体和化合物。将经处理细胞与第二抗体(山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor-488)一起孵育，所述第二抗体与结合的抗GLUT1抗体相互作用。在第二抗体结合之后进行“显色”反应。由结合的第二抗体产生的荧光强度应与GLUT1结合的第一抗体成比例。定量和比较经差异处理细胞的荧光强度。抗体/化合物处理样品中强度的减小，表明所述化合物的存在减少GLUT1抗体与GLUT1的结合，并进一步强烈表明，所述化合物与位于细胞膜上的GLUT1结合。另一方面，如果未发现竞争，则未必意味着所述化合物不与GLUT1结合。其亦可意味着所述化合物与GLUT1上这样的位置结合，所述位置不同于抗GLUT1抗体的结合部位。
为了进一步确定化合物如何起作用，在不存在和存在不同浓度化合物的情况下，在葡萄糖测定中向癌细胞中加入固定浓度的抗GLUT1抗体。在类似研究中，可固定化合物浓度，而抗体浓度可改变。这些葡萄糖摄取测定，将确定抗GLUT1抗体和所述化合物的基础葡萄糖转运抑制活性彼此累加还是彼此协同。如果所述活性彼此累加，则可表明这两种物质可能但未必作用于相同的靶标。如果所述活性协同，则更可能的是，这两种分子作用于不同的靶标。还可能的是，当将化合物与GLUT1 Ab一起加入时，作用可能不变或者甚至降低。
本文考虑直接显示所述化合物与GLUT1的结合的方法，这通过包含荧光标签包来实现，所述荧光标签作为任何先导化合物上的部分。预期在制备荧光示踪物之前，鉴定出更有效且更具选择性的类似物。可使用两种方法鉴定必需的荧光探针。作为说明性实例，我们将显示基于现有先导化合物的合成。在第一种方法中，我们用荧光标签取代侧臂芳环。根据这些化合物的SAR，这可以是最佳方法，因为我们可使用类似于侧臂芳环的荧光标签。因此，对生物靶标的亲和力上的显著变化会减小。如下所示，我们会单保护三醇1，并随后在游离羟基上引入两个酯。将受保护的羟基脱保护以提供48。将荧光香豆素49偶联以提供靶荧光探针50。
第二种方法将用荧光标签简单标记活性化合物。例如，我们将WZB-113与许多可市购荧光羧酸(flRCOOH = 49或罗丹明，或者羧基萘并荧光素)中的任一个偶联。基于WZB-113相对于WZB-117的活性，两个羟基中仅一个可能涉及显著的非共价相互作用。因此我们可使用这些羟基之一来连接荧光标签。
首先评价所有荧光标记的化合物抑制基础葡萄糖转运和诱导凋亡二者的能力。如果荧光类似物不以类似于母体化合物的方式作用，则制备新衍生物。
使用不同浓度的荧光化合物与预结合到96孔板底部的GLUT1一起孵育，所述预结合使用的方案与先前用于胰岛素受体与多酚化合物PGG结合的方案相似。于4℃振荡孵育过夜后，洗去未结合的化合物。使用96孔读板仪(SPECTRA Max M2，软件：SoftMax Pro)测定不同样品的荧光强度。可由对应于不同化合物浓度的强度生成GLUT1结合饱和曲线。亦可由此结合实验得到GLUT1结合亲和力(Ka)。还可由测定生成结合置换曲线，在所述测定中，向预结合到96孔板的GLUT1中加入渐增量的常规化合物，同时将荧光化合物保持在固定的浓度。在较高的浓度下，常规化合物将与荧光化合物竞争GLUT1上的相同结合部位，降低与增加的常规化合物浓度成比例的荧光强度。可利用计算机软件从置换曲线中得到化合物的结合亲和力(Kd)。
使癌细胞系中的基础葡萄糖转运抑制与凋亡诱导相关联的关系和信号转导途径
尽管已显示化合物的添加导致基础葡萄糖转运的抑制以及凋亡(癌细胞)，但是仍未确立抑制和凋亡之间的因果关系。为了确定所述关系，将经抗GLUT1抗体处理的细胞样品用作阳性对照。由于抗GLUT1抗体仅具有一个靶标——GLUT1，因此通过添加抗体诱导的凋亡为通过抗体引起的“直接效应”。在此研究中，将通过化合物诱导的凋亡与通过抗体诱导的凋亡并列比较。比较的参数包括：1)诱导凋亡的开始时间；2)凋亡的剂量反应；3)凋亡诱导机制。已公开通过化合物WZB-25和WZB-27诱导的凋亡为非p53依赖性的(图18A )。如果通过抗体诱导的凋亡亦为非p53依赖性的(抗体处理未显著改变p53)，则此证据会支持以下事实：这些化合物使用与抗体机制类似的机制在癌细胞中诱导凋亡。如果通过抗体诱导的凋亡为p53依赖性的(p53为激活的)，则表明抗体在凋亡诱导中使用的机制与化合物使用的机制不同。这将强烈表明，化合物抑制不同于GLUT1的靶标。
本文亦考虑蛋白质组学方法来研究基础葡萄糖转运抑制与凋亡诱导之间的联系。使用所选化合物将H1299和MCF-7细胞处理24小时，未处理细胞作为阴性对照。从经处理和未处理细胞中分离总蛋白。使用蛋白酶抑制剂TBP以及含有尿素、硫脲和CPHAS的样品缓冲液将蛋白质样品处理2小时。然后加入IAA。20 min后，再次向样品中加入IAA。处理之后，将样品上样至长条，并将带有样品的长条在室温保持2小时，然后将其置于第一维凝胶电泳仪中进行第一维蛋白质分离。在完成第一维蛋白质分离之后，将长条上样至SDS-PAGE凝胶进行第二蛋白质分离。分离之后，用含有乙醇、醋酸和SDS的固定缓冲液将凝胶固定过夜。然后用含有醋酸和SDS的洗涤缓冲液洗涤凝胶，之后用宝石橙将其染色2小时以用于印迹检测。使用PDQuest软件分析2-D凝胶结果。
在照相机的控制下自动挑取蛋白质印迹并转移至底部带孔的96孔微量滴定板。将带有全部凝胶印迹的微量滴定板转移至自动消化器(Tecan GmbH)以洗涤凝胶块，用胰蛋白酶于50℃消化蛋白质达2小时。使用2 mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)进行消化以降低盐含量，并将0.5 μL提取肽自动印迹在MALDI靶标上，而将剩下的20 μL储存在微量滴定板中。通过将肽质量指纹与顶部五个肽信号的串联质谱相结合，通常可从MALDI-TOF/TOF质谱鉴定出全部蛋白质印迹的约90%。或者，可通过nanoRP-HPLC-nano-ESIQqTOF-MS/MS分析储存在微量滴定板中的样品，nanoRP-HPLC-nano-ESIQqTOF-MS/MS通常给出更好的序列覆盖度并常常给出更好的置信水平。可在100 fmol水平鉴定总蛋白质。
选出与未处理对照凝胶相比，单个凝胶上20个增量调节的蛋白质印迹和20个减量调节的印迹用于MS分析和氨基酸序列确定。考虑到体系的固有变动，仅选择增量调节2倍或更多倍或者减量调节2倍或更多倍的那些印迹。在确定蛋白质N端的氨基酸序列之后，通过将所述序列与数据库中的蛋白质序列进行比较来揭示蛋白质的身份。通过了解化合物处理使何种蛋白质增量调节或减量调节，将这些蛋白质归为不同的组以及不同的代谢途径和/或信号转导途径，这应使我们能够鉴定所述化合物激活或失活的途径，为基础葡萄糖转运抑制如何导致癌细胞凋亡的最终诱导提供线索。
体内抗癌研究
尽管在初步研究以及多种癌细胞系的近期GLUT1抗体研究中已确定所述化合物在细胞系中的抗癌活性，但是仍在动物模型中测试了所述化合物，这是将癌症研究从实验室推向临床的中间步骤。其次，抑制基础葡萄糖转运可在治疗的动物中诱发高血糖症。为了解决体内功效及安全性的问题，将化合物用于此动物研究，所述化合物基于其改进的IC50 (基础葡萄糖转运)、EC50 (癌细胞杀伤)和维持/改善的靶选择性(在癌细胞中增进的杀伤，而在正常细胞中无增加的杀伤)以及来自上述动物研究的抗癌功效和安全性研究结果而选择。
提出动物研究的目的是为了确定化合物治疗是否减少癌生长以及化合物治疗对于荷瘤小鼠而言是否安全。将基于对癌细胞系的细胞杀伤测定，和在所测癌细胞的正常对应物中以及在与上述动物研究相似的短期初步动物研究中的可耐受细胞毒性，选择有效且安全的剂量，其中在裸小鼠(3只/组)中测试细胞研究确定的化合物剂量以及2x和4x剂量。在初步研究中，将化合物每天一次给予小鼠，持续5天，并对化合物注射的小鼠监测副作用的迹象(紧接化合物治疗以及随时间推移的高血糖症、运动上的减少和困难、体重减轻)。选出安全剂量并如下进行动物研究：
由于使用人癌细胞系，因此使用免疫缺陷型裸小鼠。使用总计30只裸小鼠，10只小鼠/组。将这些小鼠随机选入各组。组1为阴性对照组，其将接种癌细胞但不接受后续的化合物治疗；组2为低剂量化合物治疗组，组3为高剂量化合物治疗组。将H1299或MCF-7细胞系的五百万个细胞皮下(SubQ)注入裸小鼠的胁中。我们决定使用H1299 NSCLC和MCF-7细胞作为我们的癌细胞模型，这基于以下这些考虑：(a)虽然抑制剂在我们测试的所有癌细胞系中均显示抗癌活性，但是在测试的所有细胞系中，它们显示更高的抗癌活性或更高的癌细胞：正常细胞杀伤比率或二者，(b) NSCLC和乳腺癌是这样的两种癌症，认为其是目前癌症研究和治疗性治疗的主要靶标。此外，已发现GLUT1在这两种癌症类型中过表达。
当肿瘤变得可触及且可见时开始化合物治疗。腹膜内(IP)注射浓度为10 mg/kg体重的化合物，在整个研究中，每隔一日(周末除外)注射一次。以完全相同的方式但是使用溶媒(化合物溶于其中的溶液)注射阴性对照小鼠。使用测径器一周两次测定肿瘤大小，以及测定肿瘤的长度、宽度和高度尺寸并记录(LxWxH)为肿瘤体积。化合物治疗持续3-5周，直至生长在未治疗小鼠中的肿瘤变大(>体重的5% 但是<体重的10%)。将依照NIH以及我们大学IACUC的规章制度进行和终止动物研究。依照NIH和DOA的相关规章，在研究结束时对荷瘤小鼠实行安乐死。将治疗组中肿瘤的平均大小与未治疗对照组进行比较，以显示治疗功效和统计学差异。亦在高剂量组和低剂量组之间比较肿瘤大小，以显示治疗的剂量反应。亦将一周两次测定食物摄取、体重以及血糖水平，以监测动物健康并与未治疗对照组比较这些健康参数。动物研究结束时，在动物安乐死之后，从化合物治疗小鼠中以及从未治疗对照小鼠中移出肿瘤。自肿瘤中分离总蛋白并测定其各自的p53和胱天蛋白酶3，以确定在化合物治疗小鼠中是否诱导更多的凋亡，以及在激活的p53上是否有任何变化。这是为了确定体内抗癌机制是否与癌细胞系中观察到的相同。
动物肿瘤治疗研究。方案
1. 2009年11月-2010年1月(10周)的研究；2.裸小鼠(免疫缺陷型)，10只小鼠/组；3.肿瘤模型-人肺癌A549 (经NIH认可和推荐)，将5 x 106个细胞皮下注入每只小鼠的胁中；4.使用或不使用化合物WZB-117的治疗，整个10周每天PI注射，剂量= 15 mg/kg体重；5.每周测定：肿瘤大小、体重、食物摄取；和6.测定的其它指标：血糖、血清胰岛素、身体组成和血细胞计数。图30-34和表8-11显示此研究的结果。
表8.身体质量组成
Minispec数据表明，对照组和WZB-117治疗组之间在体重上的差异主要是因为WZB-117治疗小鼠中脂肪组织的减少。在70天的化合物WZB-117治疗后，通过Minispec NMR分析仪mq7.5 (Bruker, Billerica, MA)测定每只小鼠的身体质量组成。通过OPUS程序(Bruker)分析结果。
表9.经差异治疗小鼠的血细胞计数分析
在70天治疗后，使用肝素化毛细管通过小鼠尾静脉采血，然后将其转移至含有EDTA的微量离心管中。使用Drew Scientific (Dallas, TX)的Hemavet 950血液学系统分析血液。CBC分析表明，与PBS-DMSO治疗组相比，WZB-117治疗组在WBC、淋巴细胞上显示减少的计数，以及显示增加的血小板计数。然而，治疗组的这些变化仍在正常范围内。
表10.经差异治疗小鼠中的血清胰岛素水平
通过以10,000 rpm将来自小鼠尾静脉的血液离心10分钟并保留上清液，获得来自各小鼠的血清。使用Mercodia超灵敏小鼠胰岛素ELISA (Uppsala, Sweden)测定各小鼠的血清胰岛素水平。与PBS-DMSO治疗组相比，WZB-117治疗组显示血清中减少的循环胰岛素。然而，所述变化仍在正常范围内。考虑到未治疗组和化合物WZB-117注射组之间在血糖水平上无显著差异，降低但正常的血清胰岛素水平表明在化合物WZB-117治疗70天后胰腺的正常功能。
表11.人血清中化合物稳定性的HPLC分析
向22.5 ml人血清中加入总计2.5 ml化合物溶液，并将混合物于37 C孵育不同时间。血清中化合物的终浓度为6.8 mM。孵育之后，向混合物中加入200 ml乙腈，在HPLC分析之前离心去除蛋白质。对0 h (在血清中但是未孵育)处样品的相对浓度任意赋值为100%，并将所有其它样品与0h样品进行比较。分析表明，在血清中，含有醚键的化合物WZB-141和WZB-149比含有酯键的化合物WZB-115和WZB-117稳定得多。

Claims (8)

1.一种式(IV)化合物或其盐：
(IV)
其中，R1选自氢、卤素、烷基、苄基、氨基、硝基和氰基；
其中，R2选自苄基、2-硝基-5-羟基苯基，2-、3-和4-羟基苯基，2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基，2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基，2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基，全羟基苯基，2-氨基-5-羟基苯基，2-氰基-5-羟基苯基，2-氟-5-羟基苯基，2-氯-5-羟基苯基，2-溴-5-羟基苯基，2-羧基-5-羟基苯基，2-酮基-5-羟基苯基，2-烷氧基-5-羟基苯基和2-烷基-5-羟基苯基；
其中，R3选自苄基、2-硝基-5-羟基苯基，2-、3-和4-羟基苯基，2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基，2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基，2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基，全羟基苯基，2-氨基-5-羟基苯基，2-氰基-5-羟基苯基，2-氟-5-羟基苯基，2-氯-5-羟基苯基，2-溴-5-羟基苯基，2-羧基-5-羟基苯基，2-酮基-5-羟基苯基，2-烷氧基-5-羟基苯基和2-烷基-5-羟基苯基。
2.权利要求1的化合物，其中
R1为卤素；以及R2和R3独立地选自2-硝基-5-羟基苯基、2-溴-5-羟基苯基、2-甲基-5-羟基苯基和2-氯-5-羟基苯基。
3.式(IV)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中根据式(IV)的化合物是：
(IV)
其中，R1选自氢、卤素、烷基、苄基、氨基、硝基和氰基；
其中，R2选自苄基、2-硝基-5-羟基苯基，2-、3-和4-羟基苯基，2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基，2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基，2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基，全羟基苯基，2-氨基-5-羟基苯基，2-氰基-5-羟基苯基，2-氟-5-羟基苯基，2-氯-5-羟基苯基，2-溴-5-羟基苯基，2-羧基-5-羟基苯基，2-酮基-5-羟基苯基，2-烷氧基-5-羟基苯基和2-烷基-5-羟基苯基；
其中，R3选自苄基、2-硝基-5-羟基苯基，2-、3-和4-羟基苯基，2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-和3,5-二羟基苯基，2,3,4-、2,3,5-、2,3,6-和3,4,5-三羟基苯基，2,3,4,5-和2,3,4,6-四羟基苯基，全羟基苯基，2-氨基-5-羟基苯基，2-氰基-5-羟基苯基，2-氟-5-羟基苯基，2-氯-5-羟基苯基，2-溴-5-羟基苯基，2-羧基-5-羟基苯基，2-酮基-5-羟基苯基，2-烷氧基-5-羟基苯基和2-烷基-5-羟基苯基。
4.权利要求3的用途，其中，所述癌症包括实体恶性瘤。
5.权利要求3的用途，其中，所述癌症增量调节基础葡萄糖转运。
6.权利要求3的用途，其中式(IV)化合物或其药学上可接受的盐通过至少一种以下方法给予：经口、局部、动脉内、胸膜内、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内、囊内和卡氮芥糯米纸胶囊剂。
7.权利要求3的用途，其中，进一步包括选自以下的第二种癌症药物：甲氨蝶呤、盐酸阿霉素、氟尿嘧啶、依维莫司、咪喹莫特、阿地白介素、阿仑单抗、培美曲塞二钠、盐酸帕洛司琼、苯丁酸氮芥、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞吡坦、依西美坦、奈拉滨、三氧化二砷、奥法木单抗、贝伐珠单抗、阿扎胞苷、盐酸苯达莫司汀、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、卡巴他赛、盐酸依立替康、卡培他滨、卡铂、盐酸柔红霉素、西妥昔单抗、顺铂、环磷酰胺、氯法拉滨、异环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、地西他滨、达沙替尼、地加瑞克、地尼白介素-毒素连接物、狄诺塞麦、盐酸右雷佐生、多西他赛、拉布立酶、盐酸表柔比星、奥沙利铂、艾曲波帕乙醇胺、甲磺酸艾日布林、盐酸厄洛替尼、磷酸依托泊苷、盐酸雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、非格司亭、磷酸氟达拉滨、普拉曲沙、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉妥珠单抗奥佐米星、甲磺酸伊马替尼、曲妥珠单抗、盐酸拓扑替康、替伊莫单抗、罗咪酯肽、伊沙匹隆、帕利夫明、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、脂质体盐酸丙卡巴肼、替莫唑胺、普乐沙福、acetidine、甲苯磺酸索拉非尼、尼洛替尼、枸橼酸他莫昔芬、罗米司亭、紫杉醇、盐酸帕唑帕尼、培门冬酶、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、proleukin、利妥昔单抗、罗米地辛、滑石粉、甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼、沙利度胺、坦罗莫司、托瑞米芬、曲妥珠单抗、帕尼单抗、硫酸长春碱、长春新碱、伏林司他、唑来膦酸及其任何组合。
8.权利要求3的用途，其中R1是卤素，R2和R3独立选自2-硝基-5-羟基苯基，2-溴-5-羟基苯基，2-甲基-5-羟基苯基，和2-氯-5-羟基苯基。
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