CN105821005A - 用于处理病毒的阳离子型聚胺 - Google Patents
用于处理病毒的阳离子型聚胺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105821005A CN105821005A CN201610055363.4A CN201610055363A CN105821005A CN 105821005 A CN105821005 A CN 105821005A CN 201610055363 A CN201610055363 A CN 201610055363A CN 105821005 A CN105821005 A CN 105821005A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cationic polyamine
- virus
- cell
- ethylene imine
- imine units
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 CCCN=C(*)O Chemical compound CCCN=C(*)O 0.000 description 3
- NRBFGPWYKWVYGE-UHFFFAOYSA-N CC(CO1)(COC1=O)C(NCc1ccccc1)=O Chemical compound CC(CO1)(COC1=O)C(NCc1ccccc1)=O NRBFGPWYKWVYGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/74—Synthetic polymeric materials
- A61K31/785—Polymers containing nitrogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
- C08G73/02—Polyamines
- C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
- C08G73/02—Polyamines
- C08G73/0233—Polyamines derived from (poly)oxazolines, (poly)oxazines or having pendant acyl groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16661—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/16663—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/20063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/32363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/36163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
通过用引入包含一个或多个碳和至少一个醇羟基的侧链的N-酰化剂对聚乙烯亚胺进行改性来制备抗病毒阳离子型聚胺。所述阳离子型聚胺可具有直链或支链聚乙稀亚胺骨架结构。优选地,所述阳离子型聚胺包含侧接单糖基团,所述侧接单糖基团可通过包含侧接受保护单糖(例如,甘露糖)基团的环状碳酸酯被引入。所述阳离子型聚胺在低浓度下可对广谱病毒具有活性和选择性,并且通常无毒。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗病毒感染的阳离子型聚胺和其方法,且更具体地涉及用于抗病毒应用的经改性的阳离子型聚乙烯亚胺。
背景技术
由于病毒结构的差异(RNA病毒、DNA病毒、有包膜病毒和无包膜病毒)连同病毒快速突变并获得抗性的能力,因此病毒感染的治疗一直难以实现。病毒性疾病自古以来一直是发病和死亡的主要原因之一。近年来,主要由于人群的快速增加、衰老、气候变化和抑制免疫系统的医学治疗(包括照射疗法、抗癌化学疗法和器官移植),因此病毒感染已显现为突出的全球公共健康问题。例如,严重急性呼吸性综合征(SARS)于2003年的世界性爆发、亚洲在最近二十年内的登革热和禽流感(例如,H1N1)的爆发已经造成了巨大的经济负担。最近,已经在人群中发现几种新的病毒病原体,如尼帕病毒(Nipahvirus)、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus)(CHIKV)和突变的流行性禽流感病毒(例如,H7N9)。因此,已付出巨大努力来开发疫苗和抗病毒药物以控制和根除病毒感染。然而,病毒(尤其是流感病毒)由于固有的基因组不稳定性所致的快速突变使得疫苗接种效率低下。此外,对于许多病毒感染(例如,登革热病毒和基孔肯雅病毒)来说,没有可用的临床药物。由于容易突变而形成抗药株的病原性病毒存在如此多的类型和亚型,因此还不可能单个地控制它们。
病毒可根据它们持有的基因被分类为DNA病毒和RNA病毒,以及有包膜病毒和无包膜病毒。这显示尝试设计通用型抗病毒剂的问题的复杂性。多数出现的和再次出现的病毒属于RNA类型,包括黄病毒科(例如,登革热病毒或DENV)、流感、CHIKV、肠道病毒71(EV71)和SARSCo-V。这些病毒中的许多利用胞内体途径来感染细胞。胞内体的低pH允许将病毒基因组引入胞质中。此外,许多有包膜病毒利用阴离子型磷脂酰丝氨酸(PS)/TIM(T细胞/跨膜、免疫球蛋白和粘蛋白)受体结合和/或凋亡细胞清除途径来进入细胞中。这表明掩蔽TIM受体可为控制病毒感染提供新的手段。
由于在病毒表面上存在阳离子区域和阴离子区域,因此带电荷的聚合物潜在地提供了利用静电相互作用来抑制病毒感染的手段。然而,尝试使用阴离子型聚合物(例如,硫酸化的多糖如葡聚糖、木糖呋喃聚糖(xylofuranan)、核糖呋喃聚糖(ribofuranan)和凝胶聚糖)与病毒表面上的阳离子电荷结合来预防病毒感染获得的成功有限。
从动物中提取的肝素具有抗登革热病毒的强活性,但由于它是抗凝血剂而因此具有有限的实用性。
阳离子型聚合物(包括阳离子型丙烯酸酯聚合物、聚乙烯亚胺和阳离子型聚(亚苯基亚乙基)聚合物)还可通过非特异性静电相互作用与病毒表面的阴离子基团潜在地相互作用。
聚乙烯亚胺(PEI)是商购的宽范围分子量的聚胺。PEI形成为直链(LPEI)或支链(BPEI)大分子。PEI在例如洗涤剂、添加剂、水处理剂和化妆品的产品中有许多应用。由于PEI能够通过细胞膜进入细胞中,因此它们已在生物医学应用中被用作药物载体。聚阳离子型PEI可作为与DNA的复合体在体外和体内介导向哺乳动物细胞中的基因转移。然而,阳离子型聚合物如直链聚乙烯亚胺(PEI)展现出对哺乳动物细胞的高的非特异性细胞毒性并诱导溶血。此外,直链PEI的水溶性低于支链PEI。
许多病毒感染是pH依赖性的,其中复制需要胞内体中的低pH。最近,氯硝柳胺(一种经FDA批准的抗蠕虫化合物)被报道通过中和胞内体pH来预防pH依赖性病毒的感染。然而,其抗流感病毒(PR8)和人鼻病毒(HRV14)的最高选择性仅为约24。具有pH中和能力的氯化铵和氯喹也被报道预防病毒感染,但它们是高毒性的,从而限制了临床应用。
对非溶血性的且提供一般且安全的策略来预防病毒感染的广谱抗病毒剂一直存在需要。需要具有独特官能团的抗病毒大分子特异性地结合到病毒表面蛋白质并且与病毒竞争与免疫细胞/靶细胞结合以预防感染。
发明内容
因此,公开了一种方法,其包括:
用阳离子型聚胺处理病毒,由此形成包含所述阳离子型聚胺的经处理的病毒,所述阳离子型聚胺通过非共价相互作用结合到所述病毒;
其中:
i)所述经处理的病毒相比于未经处理的病毒进入活的哺乳动物细胞中的能力和/或在活的哺乳动物细胞内进行复制的能力变弱,
ii)所述阳离子型聚胺包含:
多个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′包含至少一个碳和至少一个醇羟基,和
多个式(3a)的带正电荷的仲乙烯亚胺单元:
其中氮的带星号键连接到碳,且是通过非共价缔合与带正电荷的氮结合的带负电荷的抗衡离子,并且
iii)所述阳离子型聚胺包含以随机分布排布且头接尾共价连接的N-酰化乙烯亚胺单元和仲乙烯亚胺单元,其中给定乙烯亚胺单元的氮1连接到不同乙烯亚胺单元的碳3。
还公开了一种方法,其包括:
用阳离子型聚胺处理活的哺乳动物细胞,由此形成包含通过非共价相互作用结合的所述阳离子型聚胺和细胞的经处理的细胞;其中:
i)所述经处理的细胞相比于未经处理的细胞对病毒进入所述经处理的细胞中和/或病毒在所述经处理的细胞内复制具有更高抗性,
ii)所述阳离子型聚胺包含:
多个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′包含至少一个碳和至少一个醇羟基,和
多个式(3a)的带正电荷的仲乙烯亚胺单元:
其中氮的带星号键连接到碳,且是通过非共价缔合与带正电荷的氮结合的带负电荷的抗衡离子,并且
iii)所述阳离子型聚胺包含以随机分布排布且头接尾共价连接的N-酰化乙烯亚胺单元和仲乙烯亚胺单元,其中给定乙烯亚胺单元的氮1连接到不同乙烯亚胺单元的碳3。
公开了另一种方法,其包括:
向被病毒感染的患者施用治疗有效量的阳离子型聚胺,由此抑制和/或阻止所述病毒的复制;
其中:
i)所述阳离子型聚胺包含:
多个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′包含至少一个碳和至少一个醇羟基,和
多个式(3a)的带正电荷的仲乙烯亚胺单元:
其中氮的带星号键连接到碳,且是通过非共价缔合与带正电荷的氮结合的带负电荷的抗衡离子,并且
ii)所述阳离子型聚胺包含以随机分布排布且头接尾共价连接的N-酰化乙烯亚胺单元和仲乙烯亚胺单元,其中给定乙烯亚胺单元的氮1连接到不同乙烯亚胺单元的碳3。
本领域技术人员根据以下具体实施方式、附图和所附权利要求将了解和理解本发明的上述和其它特征以及优点。
附图说明
图1是CDCl3中的阳离子型聚胺B3的1HNMR谱。
图2A是阳离子型聚胺B11的前体在氢解前于MeOD中获取的1HNMR谱。支链聚乙烯亚胺结构是用于赋予NMR峰的简化再现。
图2B是阳离子型聚胺B11在氢解和酸化后于D2O中获取的1HNMR谱。支链聚乙烯亚胺结构是用于赋予NMR峰的简化再现。
图3是显示阳离子型聚胺B3预防DENV-2病毒感染人原代外周血单核细胞的能力的图表。在病毒感染后,峰移位到更高的PE-A(藻红蛋白(PE)缀合的抗小鼠IgG)。从用2mg/L或10mg/L的B3处理获得的样品的峰未移位,而是与无病毒感染的对照样品的峰几乎重叠,表明B3处理有效地预防人原代外周血单核细胞被DENV-2感染。
图4是显示阳离子型聚胺B3预防DENV-2病毒感染巨噬细胞的能力的图表。在病毒感染后,峰移位到略高的PE-A。从2mg/L或10mg/L的B3处理获得的样品的峰未移位,而是与无病毒感染的对照样品的峰几乎重叠,表明B3处理有效地预防巨噬细胞被DENV-2感染。
图5是比较表达TIM-1受体或TIM-3受体的293T细胞与不表达TIM-1受体或TIM-3受体的空载体293T细胞(标记为"空")的CHIKV(基孔肯雅病毒)感染率的条形图。TIM-1受体或TIM-3受体的存在增强了CHIKV感染。
图6是显示阳离子型聚胺B3在预防空载体293T细胞(即,不表达TIM-1或TIM3受体)的CHIKV感染方面的作用的条形图。EC50是0.21mg/L。
图7是显示阳离子型聚胺B3在预防表达TIM-1受体的293T细胞中的CHIKV感染方面的作用的条形图。EC50是1.26mg/L并且选择性指数(CC50/EC50)>794。
图8是显示阳离子型聚胺B3在预防表达TIM-3受体的293T细胞中的CHIKV感染方面的作用的条形图。EC50是0.68mg/L并且选择性指数(CC50/EC50)>1471。
图9是显示阳离子型聚胺B3在预防自然表达TIM-1受体的A549细胞的DENV-2感染方面的作用的条形图。EC50是6.8mg/L,CC50>1000mg/L,并且选择性指数>147。
图10是比较有阳离子型聚胺B3的细胞、无B3(标记为DMSO)的细胞和有强效抗病毒的腺苷核苷类似物NITD008(2R,3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-乙炔基-5-(羟甲基)氧戊环-3,4-二醇的细胞的荧光素酶活性的条形图。该发现证实抗病毒聚合物B3在DENV-2的细胞进入的晚期和复制周期未发挥功能。
图11是显示阳离子型聚胺B3(和肝素)的添加时间对LLC-MK2细胞中的DENV-2的抑制的作用的一组图表。对于时间=-1.5小时来说,将病毒和B3一起在4℃添加到所述细胞中。对于所有其它时间来说,在将病毒和细胞在4℃培育1.5小时且升温到37℃后添加B3。结果显示当在病毒附着步骤期间或附着步骤后的早期(0-1小时)添加时,B3在预防病毒感染方面有效,但此后无效。
图12是显示在添加LLC-MK2细胞前将DENV-2病毒和阳离子型聚胺B3在4℃组合1小时的作用的条形图。获得了病毒效价的40%降低,表明B3结合到病毒抑制了病毒感染。
图13是显示在添加DENV-2病毒前用阳离子型聚胺B3将LLC-MK2细胞在37℃预处理15分钟到2小时的作用的条形图。EC50值是8.7mg/L,表明B3结合到细胞膜是抑制DENV-2病毒的感染的因素。
图14是显示阳离子型聚胺B3和肝素对被病毒感染的细胞融合的作用的一组显微照片和相应的程序图解。用DENV-2病毒处理白纹伊蚊(Aedesalbopictus)C6/36细胞。在4℃(标记为"4℃+"的图像)或在28℃(标记为"4℃-"的图像)添加抗病毒剂。标记为"培养基(Medium)"的样品仅含有细胞和病毒(无抗病毒剂)。标记为"模拟(Mock)"的样品仅含有细胞(无病毒或抗病毒剂)。在含有B3的样品中未发现融合细胞。
图15是使用MarvinSketch软件构建的模型支链PEI的模型大分子的二维结构。模型支链BPEI并非意在表示用于实施例中的支链PEI的完整结构。
图16是DENV-2E蛋白质(包膜蛋白质)的使用MVD(MolegroVirtualDocker)软件的三维计算机绘图,其中突显的斑点区域表示在4个对接网格中以相等结合能结合的模型支链PEI的4种位姿。
图17是显示DENV-2E蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3结构形成氢键
图18是模型阳离子型聚胺B3与DENV-2E蛋白质的有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图19是显示EV71VP1蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸基团的使用MVD软件的计算机绘图:Gln269、Arg267、Glu124、Asn228、Ser275、Ala224和Gly223。
图20是显示模型阳离子型聚胺B3与EV71VP1蛋白质的有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图21是显示HSV-1GD蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸基团的使用MVD软件的计算机绘图:Asp13、Asn15、Arg18、Leu22、Val24、Gln27、Ser8。
图22是显示模型阳离子型聚胺B3与HSV-1GD蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图23是显示DENV-3E蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Thr155(B)、Lys47(B)、Thr274(B)、Ser271(B)、Asn8(B)和Asp98(A)、His27(B)。
图24是DENV-3E蛋白质中的5个空腔的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图25是显示模型阳离子型聚胺B3与DENV-3E蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图26是显示CHIKVE1蛋白质的通过氢键合与模型阳离子型聚胺B3相互作用的7个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Gln373、Gln368、Thr17、Gly12、Glu32、Thr338和His394。
图27是模型阳离子型聚胺B3与CHIKVE1蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图28是显示流感病毒HA蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的4个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Arg285、Ser282、Ser130和Phe415。
图29是HA蛋白质中的4个空腔的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图30是显示模型阳离子型聚胺B3与HA蛋白质的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图31是显示HSV-2GD蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的9个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Asp139、Arg222、Ser140、Asp26、Asn227、Thr230、Lys237、Val24和Gln27。
图32是GD蛋白质中的4个空腔的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图33是显示模型阳离子型聚胺B3与GD蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图34是显示TIM-1蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的8个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Lys102(B)、Ser3(B)、Thr20(A)、Thr20(B)、Ser22(A)、Gln101(A)、Asp100(A)和Glu6(B)。
图35是显示模型阳离子型聚胺B3与TIM-1蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图36是显示TIM-3蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的5个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Glu106(A)、Cys39(A)、Lys103(A)、Ser20(A)和Tyr7(A)。
图37是显示模型阳离子型聚胺B3与TIM-3的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图38是显示DENV-3E蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3结构形成氢键的3个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Glu13(A)、Ala35(A)和Phe335(A)。
图39是显示模型阳离子型聚胺B3与DENV-3E蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图40是显示流感HA蛋白质的与模型阳离子型聚胺B2形成氢键的5个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Arg285、Glu430、Ser282、Ile283和Asp287。模型B2材料具有2个甘露糖基团。
图41是显示模型阳离子型聚胺B2与流感HA蛋白质的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
具体实施方式
公开了预防、处理和/或抑制病毒进入哺乳动物细胞中和/或在哺乳动物细胞中复制的方法。所述方法利用了经改性的聚乙烯亚胺(PEI),其在本文中被称为阳离子型聚胺。所述阳离子型聚胺包含连接到各自的骨架氮的具有一般结构*-C(=O)-K′的侧链,其中K′包含至少一个碳和至少一个醇基。所述阳离子型聚胺可包含1到约70个连接到PEI的伯胺基和仲胺基的*-C(=O)-K′侧链基团。PEI的总数的0%到约70%、优选约20%到约40%的胺基(即,伯胺基、仲胺基和叔胺基)包含K′基团。阳离子型聚胺的超过0%且最多100%的任何剩余未经改性的伯胺基、仲胺基和叔胺基以作为铵盐的质子化形式存在。在一个实施方案中,每个K′基团包含单糖部分(糖部分)。
阳离子型聚胺可与免疫细胞以及靶细胞竞争与病毒包膜蛋白质(E蛋白质)结合,由此阻碍所述病毒进入哺乳动物细胞中、缓解对免疫系统的应力并且减轻因免疫缺陷所致的副作用。分子对接计算揭示了阳离子型聚胺与病毒表面蛋白质的意外的且通常特异性的相互作用。病毒结合测定证实在将病毒与阳离子型聚胺培育后的感染的显著降低。该动态氢键合特异性相互作用的一般性提供了似乎对突变免疫的广谱抗病毒活性,由此缓和和/或预防产生病毒抗性。
阳离子型聚胺还可通过结合到表面蛋白质和其它分子如细胞的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖来干扰病毒进入哺乳动物细胞中。例如,阳离子型聚胺可结合到TIM(T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白)受体蛋白质,由此抑制靶向哺乳动物细胞的TIM受体的病毒。经处理的细胞可具有在约2.7mg/L到约6.8mg/L范围的EC50值(即,将抑制50%细胞的病毒感染的阳离子型聚胺的有效浓度),EC50值取决于TIM受体的类型。
阳离子型聚胺的pH缓冲能力也可抑制酸驱动的病毒的胞内体释放,由此阻碍病毒复制。
阳离子型聚胺可抑制一种或多种病毒。代表性病毒包括登革热病毒(例如,DENV-1、DENV-2、DENV-3、和/或DENV-4)、流感病毒(A/H3N2)、CHIKV(基孔肯雅病毒)、SARSCo-V(SARS冠状病毒)、EV71(肠道病毒71)和单纯疱疹病毒(例如,HSV-1和HSV-2)。在一些情况下,在低到0.012mg/L的阳离子型聚胺浓度下,病毒活性被有效地抑制,对哺乳动物细胞具有高选择性。在对病毒的有效浓度下,阳离子型聚胺对哺乳动物细胞可以是非细胞毒性的和非溶血性的。
阳离子型聚胺
阳离子型聚胺包含至少一条具有聚合物骨架的聚合物支链,所述聚合物骨架包含多个在本文中被称为乙烯亚胺单元的重复单元。每个乙烯亚胺单元具有排布如下的1个骨架氮和2个骨架碳:
这里,带星号的键表示附着点,而非甲基。应当理解,标记为1的氮是三价且每个碳是四价。碳和氮上的其它取代基在上述结构中未显示。标记为1的氮表示给定乙烯亚胺单元的头部,并且标记为3的碳表示给定乙烯亚胺单元的尾部。相邻乙烯亚胺单元是头接尾共价连接的(给定乙烯亚胺单元的带星号的氮1键连接到相邻乙烯亚胺单元的碳3)。
阳离子型聚胺可以是不具有呈季铵盐形式的骨架氮的有效抗病毒剂。这里,季铵盐包含仅共价连接到碳(例如,4个碳)且与带负电荷的抗衡离子非共价缔合的带正电荷的氮。季铵盐的带正电荷的氮不共价结合到任何氢。在一个实施方案中,阳离子型聚胺结构不包括呈季铵盐形式的任何骨架氮。
阳离子型聚胺包括一条或多条包含乙烯亚胺单元的聚合物链(支链)。直链阳离子型聚胺包含i)一个包含多个乙烯亚胺单元的支链和ii)两个聚合物链端基(也被称为外周端基或悬挂端基)。支链阳离子型聚胺包含两个或更多个包含乙烯亚胺单元的交叉支链和三个或更多个外周端基。
方案1说明直链阳离子型聚胺和具有两个支链的支链阳离子型聚胺的乙烯亚胺单元的骨架碳对和骨架氮的交替排布的示例。包围在圆括号中的*-C-C-N-*单元表示乙烯亚胺单元。未显示骨架碳和氮的端基、电荷、抗衡离子和取代基。
方案1.
如上文所示,相邻*-C-C-N-*单元头接尾连接(即,一个乙烯亚胺单元的氮1连接到相邻乙烯亚胺单元的碳3)。
阳离子型聚胺的骨架伯胺氮、骨架仲胺氮和骨架叔胺氮可作为质子酸的铵盐(即,伯铵盐、仲铵盐或叔铵盐)存在。伯铵盐包含共价连接到1个碳和3个氢并且与带负电荷的抗衡离子非共价缔合的带正电荷的氮。仲铵盐包含共价连接到2个碳和2个氢并且与带负电荷的抗衡离子非共价缔合的带正电荷的氮。叔铵盐包含共价连接到3个碳和1个氢并且与带负电荷的抗衡离子非共价缔合的带正电荷的氮。
阳离子型聚胺包含至少一个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′是基团包含至少一个碳和至少一个醇羟基。
阳离子型聚胺进一步包含多个独立地选自由以下组成的组的乙烯亚胺单元:
i)式(2a)的质子化伯乙烯亚胺单元:
ii)式(2b)的非质子化伯乙烯亚胺单元:
iii)式(3a)的质子化仲乙烯亚胺单元:
其中带星号的氮键连接到碳,
iv)式(3b)的非质子化仲乙烯亚胺单元:
其中带星号的氮键连接到碳,
v)式(4a)的质子化叔乙烯亚胺单元:
其中带星号的氮键连接到不同的碳,和
vi)式(4b)的非质子化叔乙烯亚胺单元:
其中带星号的氮键连接到不同的碳。超过0%的乙烯亚胺单元以质子化形式存在。
在上述结构以及以下结构中的每一个中,是通过与标记为1的带正电荷的氮非共价相互作用而被结合的带负电荷的抗衡离子。示例性的带负电荷的抗衡离子包括卤离子(例如,氟离子、氯离子、溴离子、碘离子)、硝酸根、氢氧根、甲磺酸根和羧酸根(例如,乙酸根、苯甲酸根)。在一个实施方案中,是氯离子。阳离子型聚胺包含单独或组合的基团。
K′基团包括环状和非环状基团、芳香族和非芳香族基团以及其组合,包含一个或多个醇羟基。在一个实施方案中,K′选自由以下组成的组:羟基亚烷基、羟基亚烷氧基、包含儿茶酚基团的基团和包含单糖基团(糖部分)的基团。单糖基团包括己糖的立体特异性形式和非立体特异性形式,特别是甘露糖、葡萄糖和半乳糖的那些。这些例示在方案2中。
方案2.
单糖部分可通过任何合适的连接基团(包括单键)连接到式(1)的羰基。
将式(1)的羰基接合到糖部分的连接基团可连接到糖部分的任一个醇羟基。
*-C(=O)K′基团的非限制性示例包括方案3的那些。
方案3.
在上述结构中,带星号的键连接到式(1)的羰基。式(1)的骨架氮可与连接到K′的羰基完成酰胺基、氨基甲酸酯基或脲基。阳离子型聚胺可包含单独或组合的K′基团。
阳离子型聚胺骨架包含以头接尾排布共价连接的乙烯亚胺单元。这里,"共价连接"意指直接和/或间接共价连接。"直接共价连接"意指通过单个共价键接合在一起。"间接共价连接"意指通过连接基团共价连接。例如,阳离子型聚胺的含有阳离子型聚胺的聚合物骨架的一个或多个其它乙烯亚胺单元的化学结构的一部分可以是将N-酰化乙烯亚胺单元共价连接到质子化仲乙烯亚胺单元的连接基团。
阳离子型聚胺可进一步包含一个或多个式(5)的氧化乙烯亚胺单元:
阳离子型聚胺可进一步包含一个或多个式(6)的酰胺乙烯亚胺单元:
其中R′是甲基、乙基、丙基或丁基。
质子化和非质子化的叔乙烯亚胺单元用作交叉支链的接合点。质子化和非质子化的伯乙烯亚胺单元用作支链端接单元。这里,连接到伯乙烯亚胺单元的氮的氢可以是聚合物链端基。阳离子型聚胺可具有其它聚合物链端基。
阳离子型聚胺包含至少一个式(1)的N-酰化乙烯亚胺单元和至少一个选自由式(2a)、式(3a)和式(4a)组成的组的阳离子型乙烯亚胺单元。更具体的阳离子型聚胺包含约100到约400个乙烯亚胺单元,其中1到约200个乙烯亚胺单元是式(1)的N-酰化乙烯亚胺单元。仍更具体的阳离子型聚胺包含约200到约300个乙烯亚胺单元,其中1到约170个乙烯亚胺单元是式(1)的N-酰化乙烯亚胺单元。仍更具体的阳离子型聚胺包含约200到约300个乙烯亚胺单元,其中1到约50个乙烯亚胺单元是式(1)的N-酰化乙烯亚胺单元。
直链阳离子型聚胺的端基可以是任何合适的端基,如例如氢、烷基、胺基、羟基烷基和其组合。
直链阳离子型聚胺包含1个包含聚乙烯亚胺骨架的聚合物支链。更具体的直链阳离子型聚胺包含100到400个乙烯亚胺单元,其中1到约200个是式(1)的N-酰化乙烯亚胺单元。直链阳离子型聚胺的其余乙烯亚胺单元可以是式(3a)和式(3b)的仲乙烯亚胺单元。在一个实施方案中,直链阳离子型聚胺包含1到约50个式(5)的氧化乙烯亚胺单元。在另一实施方案中,直链阳离子型聚胺包含1到约30个式(6)的酰胺乙烯亚胺单元。
支链阳离子型聚胺包含2个或更多个交叉聚合物支链,其中每个支链包含聚乙烯亚胺骨架。更具体的支链阳离子型聚胺包含100到400个乙烯亚胺单元,其中1到约170个是式(1)的N-酰化乙烯亚胺单元。剩余的乙烯亚胺单元包括至少1个叔乙烯亚胺单元和至少1个仲乙烯亚胺单元。剩余乙烯亚胺单元中的至少一个是式(2a)、式(3a)或式(4a)的带正电荷的乙烯亚胺单元。在一个实施方案中,支链阳离子型聚胺包含1到约50个式(5)的氧化乙烯亚胺单元。在另一实施方案中,支链阳离子型聚胺包含1到约30个式(6)的酰胺乙烯亚胺单元。
阳离子型聚胺可具有约500到约100000、更特别地约1500到约60000且最特别地约5000到约60000的数量平均分子量(Mn)。
阳离子型聚胺可包含1到约200个、更特别地1到约150个且最特别地约4到约100个式(1)的乙烯亚胺单元。在一个实施方案中,阳离子型聚胺具有支链聚乙烯亚胺骨架结构并且包含约4到约150个式(1)的乙烯亚胺单元。在另一实施方案中,阳离子型聚胺具有支链聚乙烯亚胺骨架结构并且包含约4到约150个式(1)的乙烯亚胺单元,其中式(1)的K′包含甘露糖部分。在另一实施方案中,阳离子型聚胺具有直链聚乙烯亚胺骨架结构并且包含约1到约70个式(1)的乙烯亚胺单元,其中式(1)的K′包含甘露糖部分。
直链阳离子型聚胺的制备
阳离子型聚胺可从聚乙烯亚胺的基础形式或部分N-酰化的聚乙烯亚胺制备。这些基础聚胺包含至少一个式(7)的非质子化乙烯亚胺单元:
更特别地,直链阳离子型聚胺可从基础聚胺制备,所述基础聚胺是部分或完全水解的聚(2-烷基唑啉)。聚(2-烷基唑啉)可通过2-烷基唑啉的阳离子型开环聚合(方案4)制备。
方案4.
2-烷基唑啉的开环聚合(ROP)可通过阳离子型引发剂E′+引发,阳离子型引发剂E′+变成第一端基E′。E″是以第二端基结束的链。R通常是C1-C10烷基,更特别地C1-C4烷基。使用质子酸将聚(2-烷基唑啉)部分水解、之后中和水解的聚合物获得如方案4中所示的部分水解的非质子化聚(2-烷基唑啉),其中a+b=n,且a>0并且b>0。完全水解的聚(2-烷基唑啉)是直链聚乙烯亚胺(LPEI)均聚物(a=n并且b=0)。部分或完全水解的聚(2-烷基唑啉)的乙烯亚胺单元是头接尾连接的。在方案2的上述括号符号中,乙烯亚胺单元在方括号内的垂直叠加表明聚合物链的乙烯亚胺单元的随机分布。部分水解的聚(2-烷基唑啉)的商业基础形式是溶血的,而质子化的部分水解的聚(2-烷基唑啉)可以是较不溶血的。
制备抗病毒直链阳离子型聚胺的方法包括形成适于进行N-酰化的包含基础直链聚乙烯亚胺(基础LPEI,其可以是部分或完全水解的聚(2-烷基唑啉))和有机溶剂(例如,氯仿)的混合物。将所述混合物任选地在升高温度下加热足以溶解基础LPEI的时间段。然后用一种或多种N-酰化剂处理溶解的基础LPEI,之后用质子酸(例如,甲醇/HCl)处理,由此形成含有式(1)的乙烯亚胺单元的直链阳离子型聚胺(经改性的LPEI)。
式(5)的氧化乙烯亚胺单元可通过用空气和/或过氧化物处理包含基础LPEI和有机溶剂的混合物被引入基础LPEI中。所述处理可在任何合适的温度下进行。用N-酰化剂处理氧化的基础LPEI、之后进行酸处理得到包含式(1)的乙烯亚胺单元和式(5)的氧化乙烯亚胺单元的阳离子型聚胺。通过氧化引入的骨架酰胺基也可潜在地改善生物相容性、生物降解性和/或降低红细胞毒性。
支链阳离子型聚胺的制备
支链阳离子型聚胺优选从支链聚乙烯亚胺(支链PEI或BPEI)制备,支链聚乙烯亚胺可例如通过氮丙啶的开环聚合形成。支链PEI具有2个或更多个包含骨架氮的交叉聚合物链(支链),所述骨架氮呈被骨架亚乙基(*-CH2CH2-*)交替间隔的伯胺氮、仲胺基氮和叔胺氮的形式。支链PEI包含:
i)1个或多个式(8)的仲乙烯亚胺单元:
ii)1或多个式(9)的叔乙烯亚胺单元:
其用作交叉支链的接合点;和
iii)2或多个式(12)的伯乙烯亚胺单元:
其用作支链端接末端单元。
支链PEI在本文中也由式(13)表示:
其中j、r、s和t表示BPEI大分子的各自独立官能团的平均数量。下标j具有大于或等于4的平均值,并且r+s+t具有大于或等于4的平均值。通过式(13)的符号应当理解开始于方括号[]内且终止方括号外的每组圆括号()包围了BPEI的独立官能团,而非聚合物链。另外,具有带星号键的原子表示与在相反括号上具有带星号键的原子的附着点。另外,官能团的垂直叠加表明叠加的官能团在支链PEI中的随机分布。右方括号上的给定氮的每个带星号键连接到左方括号上的不同亚乙基,并且左方括号上的亚乙基的每个带星号键连接到右方括号上的不同氮,这与相邻乙烯亚胺单元的头接尾排布一致。
在一个实施方案中,j具有约180到约360的平均值,r具有约90到约140的平均值,s具有约45到约70的平均值,t具有约45到约70的平均值,并且(r+s+t)具有约180到约360的平均值。在另一实施方案中,支链聚乙烯亚胺具有大于1000的重量平均分子量(Mw)。
作为示例,商购的支链聚乙烯亚胺具有约25,000的重量平均分子量(Mw)、约10,000的数量平均分子量(Mn),并且基于Mn和等于43的平均乙烯亚胺单元分子量,含有平均233个亚乙基(j)、116个骨架仲氮(r)、58个骨架叔氮(s)和58个伯胺氮(t)。在这种情况下,j=233,r=116,s=58且t=58。该材料在本文中被称为BPEI25。
作为另一示例,商购的支链聚乙烯亚胺具有约2000的重量平均分子量(Mw)、约1800的数量平均分子量(Mn),并且基于Mn和等于43的平均乙烯亚胺单元分子量,含有平均40个亚乙基(j)、20个骨架仲氮(r)、10个骨架叔氮(s)和10个伯胺氮(t)。在这种情况下,j=40,r=20,s=10且t=10。该材料在本文中被称为BPEI1.8。
支链阳离子型聚胺可通过用能够引入一个或多个上述N-酰基的N-酰化剂处理支链PEI的基础形式来制备。用质子酸处理经改性的支链PEI提供支链阳离子型聚胺。
如果期望的话,支链PEI和/或经改性的支链PEI可如上文所述被氧化以引入式(5)的氧化乙烯亚胺单元,用于将溶血最小化和/或增强生物降解性。氧化可发生在形成经改性的支链PEI之前、期间和/或之后。
用于形成阳离子型聚胺的BPEI可具有约1000到约75,000的数量平均分子量(Mn)。
下文进一步的实施例中利用了两种BPEI,其被命名为BPEI1.8和BPEI25。BPEI1.8具有约2000的Mw和约1800的数量平均分子量(Mn)。BPEI25具有约25,000的Mw和约10,000的Mn。
BPEI可具有大量的阳离子电荷和中和胞内体pH的强大能力。经改性的BPEI还可具有缓冲能力,所述缓冲能力可通过选择BPEI的分子量和/或官能化的程度和类型来改变。大量的伯胺基提供了用于众多种官能团的随后转化和安置的位点。以这种方式,可以调节聚合物/细胞相互作用、聚合物/病毒相互作用和细胞毒性。
端基
对于阳离子型聚胺端基没有限制,条件是所述端基不降低所述聚合物的抗病毒性质。
直链阳离子型聚胺包含连接到乙烯亚胺单元的骨架氮(上文标记为1)的第一端基E′。示例性第一端基包括氢或C1-C10烷基或芳基。直链阳离子型聚胺可包含连接到乙烯亚胺单元的末端碳(上文标记为3)的第二端基E″。示例性第二端基包括伯胺基(*-NH2)、羟基(*-OH)和其起因于与N-酰化剂的反应的酰化衍生物。支链阳离子型聚胺的端基可基本上由式(9)的伯乙烯亚胺单元和其酰化衍生物组成。直链和支链阳离子型聚胺可具有其它端基。
烷基端基通过阳离子型聚胺的以下链端接单元来例示:
i)连接到烷基取代基Re的仲乙烯亚胺单元,其具有式(14):
其中Re是C1-C10烷基或芳基,和
ii)连接到烷基取代基Re的酰化乙烯亚胺单元,其具有式(15):
其中Re是C1-C10烷基或芳基,并且Rd是C1-C10烷基。在一个实施方案中,Re是甲基或乙基。
羟基端基通过直链PEI的以下链端接单元来例示:
i)连接到羟基的质子化仲乙烯亚胺单元:
和
ii)连接到羟基的酰化乙烯亚胺单元:
氨基端基通过直链PEI的以下链端接单元来例示:
i)连接到质子化伯胺基的仲乙烯亚胺单元:
ii)连接到质子化伯胺基的酰化乙烯亚胺单元:
其它端基包括烷氧基、巯基(*-SH)以及经取代的质子化仲胺基和经取代的质子化叔胺基。其它端基包括任何上述基团的衍生物(例如,羟基端基和氨基端基各自的酯和酰胺)。阳离子型聚胺可包含单独或组合的端基。
N-酰化剂
N-酰化剂是能够在一个或多个方法步骤中与PEI骨架的伯胺氮或仲胺氮反应以形成包含侧链*-C(=O)K′的式(1)的乙烯亚胺单元的化合物,其中K′含有至少一个醇基。
N-酰化剂包含用于偶合到PEI氮的活性基团。用于N-酰化的非限制性活性基团包括羧酰氯、羧酸酐、活性酯、活性碳酸酯、环状碳酸酯、内酯、异氰酸酯和活性氨基甲酸酯。
N-酰化剂可包含受保护的醇基,其可在N-酰化后脱保护。
N-酰化剂可包含潜在形式的醇基(例如,如环状碳酸酯的开环中由于N-酰化而形成的醇基)。
基于这些考虑,对于本领域技术人员将显而易见的是,许多化合物可以得到或可被容易地制备用于引入*-C(=O)K′侧链。
优选的N-酰化剂包括可在一个步骤中引入醇基的环状碳酸酯。示例性环状碳酸酯包括方案5的那些。
方案5.
其它优选的环状碳酸酯包含糖部分或儿茶酚基团的受保护和/或未受保护的醇基,如例如方案6的那些。
方案6.
抗病毒性质
对于下文进一步的实施例来说,以下定义可适用。
EC50被定义为50%的测试哺乳动物细胞在给定的响应时间内不被病毒感染的阳离子型聚胺的浓度(mg/L)。小EC50值是期望的。
CC50被定义为在给定的响应时间内杀死50%的测试哺乳动物细胞的阳离子型聚胺的浓度(mg/L)。高CC50值是期望的。
病毒选择性被定义为CC50/EC50。高病毒选择性值是期望的。
LD50被定义为在给定的响应时间内杀死50%的测试群体(例如,小鼠)的剂量(毫克阳离子型聚胺/千克测试动物)。高LD50值是期望的。
抑制病毒的第一方法包括在所述病毒接触哺乳动物细胞前使所述病毒与阳离子型聚胺接触,由此形成包含通过非共价相互作用结合的所述病毒和所述阳离子型聚胺的复合体,由此抑制所述病毒感染所述细胞。被结合的阳离子型聚胺的缓冲能力也可潜在地阻碍所述病毒从所述复合体的胞内体释放,由此抑制病毒复制。非限制性示例性哺乳动物细胞包括血细胞、肝细胞、鼻细胞、肺细胞和子宫颈细胞。
抑制病毒的第二方法包括在哺乳动物细胞接触病毒前使所述细胞的膜与阳离子型聚胺接触,由此形成包含通过非共价相互作用结合到所述细胞膜的所述阳离子型聚胺的复合体,其中所述复合体抑制和/或阻断所述病毒进入所述细胞中。在一个实施方案中,阳离子型聚胺结合到细胞膜的TIM受体。
还公开了治疗患有由病毒引起的疾病的患者的方法,其包括向所述患者施用治疗有效量的所公开的阳离子型聚胺,由此抑制和/或治愈所述疾病。在一个实施方案中,所述阳离子型聚胺通过注射被施用。在另一实施方案中,所述阳离子型聚胺作为呈鼻喷雾或吸入喷雾形式的溶液被施用。在另一实施方案中,所述阳离子型聚胺被口服施用。
进一步公开了治疗和/或预防由病毒引起的医学病况的方法,所述方法通过使所述病毒与所公开的阳离子型聚胺接触、由此抑制所述病毒在哺乳动物细胞中进行感染和/或复制而进行。
还公开了用于预防和/或治疗病毒感染的医学组合物,其包含一种或多种上述阳离子型聚胺。所述医学组合物可以是药物。对所述药物的施用方式没有限制。药物可具有溶液、凝胶、粉末、丸剂、糊剂或软膏的形式。药物可包含水。药物可作为可摄入固体(例如,丸剂)、可摄入液体(例如,饮料)、作为冲洗溶液(例如,漱口液、其它卫生冲洗液)、作为静脉内注射、作为喷雾(例如,鼻喷雾)、作为吸入剂、作为皮肤贴剂、作为液滴(例如,滴眼剂)和/或作为局部施用的软膏(例如,洗剂)被施用。
阳离子型聚胺的低平均质量、高抗病毒活性和低体内毒性(即,通过静脉内注射的小鼠中的高LD50)使得这些材料作为用于各种各样的医学用途(包括治疗和/或预防病毒感染)的广谱抗病毒剂是有吸引力的。
以下实施例显示抗病毒阳离子型聚胺的制备和性质。发现了病毒表面蛋白质与甘露糖官能化的支链聚乙烯亚胺的非共价相互作用。关于病毒的结合和病毒摄取的预防的相互作用似乎普遍适用于众多种病毒。其它相互作用如形成病毒/聚合物复合体所需的氢键数量可以是病毒特异性的。超分子聚合物-病毒相互作用提供了具有高选择性的广谱活性。该氢键合病毒/聚合物复合体的一般性似乎不受随后的病毒突变影响,这有助于预防病毒抗性的发生。因此,所述聚合物/病毒复合体可用于预防病毒感染。
实施例
用于以下实施例中的材料列于表1中。
表1.
这里,Mn是数量平均分子量,Mw是重量平均分子量,并且MW是一个分子的分子量。
固体支链聚乙烯亚胺(BPEI25,Mn10,000,PDI2.5)在使用前被冷冻干燥。
外周血单核细胞(PBMC)和巨噬细胞从来自知情同意后的健康成年个体的人血获得。
使用活化的氧化铝柱将无水溶剂干燥并且储存在分子筛上。
在BrukerAvance400仪器上于400MHz获得1HNMR谱。使用装配有4个以增加的孔径(100埃、1000埃、105埃和106埃)串联连接的5微米Waters柱(300mm×7.7mm)、Waters410差示折射计和996光电二极管阵列检测器的Waters系统在四氢呋喃(THF)中进行凝胶渗透色谱分析(GPC)。使用聚苯乙烯标准物对所述系统进行校准。还使用装配有两个串联连接的AgilentPolyPore柱(300mm×7.5mm)、Waters410差示折射计的Waters系统在掺加有0.01MLiBr的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中进行GPC分析。利用聚(甲基丙烯酸甲酯)标准物对所述系统进行校准。
环状碳酸酯的制备
MTC-OH(MW160.1)的制备.
MTC-OH可通过R.C.Pratt等人,ChemicalCommunications,2008,114-116的方法制备。
MTC-C6F5(MW326.2)的制备.
向100mL圆底烧瓶中装入双-MPA,(7),(5.00g,37mmol,MW134.1)、双-(五氟苯基)碳酸酯(PFC,31.00g,78mmol,MW394.1)和CsF(2.5g,16.4mmol),用70ml四氢呋喃(THF)冲洗。起初反应是多相的,但1小时后形成澄清的均相溶液,将其搅拌20小时。在真空中去除溶剂并且将残余物再溶解于二氯甲烷中。将溶液静置大约10分钟,此时五氟苯酚副产物沉淀并且可以被定量地回收。该五氟苯酚副产物显示如下特征:在五氟苯酚的19FNMR中的3个特征峰和在GCMS中的质量为184的单峰。用碳酸氢钠水溶液萃取滤液并且用MgSO4干燥。在真空中蒸发溶剂并且使产物再结晶(乙酸乙酯/己烷混合物),得到呈白色结晶粉末的MTC-C6F5。GCMS具有质量为326g/mol的单峰。C12H7FsO5的计算分子量与所指派的结构一致。1H-NMR(400MHz,在CDCl3中):δ4.85(d,J=10.8Hz,2H,CHaHb),4.85(d,J=10.8Hz,2H,CHaHb),1.55(s,3H,CCH3)。
实施例1.受保护的甘露糖官能化的环状碳酸酯(MTC-IPMAN)的合成.
5-甲基-5-羧基-1,3-二烷-2-酮(MTC-OH)和单体MTC-ipman制备如下。将草酰氯的无水四氢呋喃(THF)溶液(2.48mL,19.0mmol,50mL)逐滴添加到5-甲基-5-羧基-1,3-二烷-2-酮(MTC-OH)的无水THF溶液(2.75g,17.2mmol,50mL)中。然后在氮气氛下经30min添加催化量(3滴)的无水二甲基甲酰胺(DMF),并且将反应混合物搅拌1小时,同时使氮鼓泡通过该混合物以去除挥发物。在真空下蒸发溶剂后,将固体残余物(中间产物MTC-Cl)溶解于50mL的无水氯仿中,并且在室温下经30分钟将2,3;5,6-二-O-异亚丙基-D-呋喃甘露糖(IPMAN,4.13g,15.8mmol)和三乙胺(2.8mL,20.6mmol)于50mL无水氯仿中的混合物逐滴滴加到所述溶液中。将反应混合物加热到40℃并且搅拌48小时。将所得到的溶液冷却到室温,浓缩,用THF(100mL)处理以使三乙胺盐沉淀,并且过滤。在蒸发滤液后,将粗制产物通过硅胶柱,通过乙酸乙酯和己烷(20/80到50/50)的梯度洗脱,提供呈粘性无色油的产物,其缓慢凝固成白色固体(5.85g,85%)。1H-NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ6.22(s,1H,H-a),4.89(dd,1H,H-b),4.72(d,2H,H-c),4.66(m,2H,H-c),4.41(m,1H,H-d),4.22(m,2H,H-e),4.11(dd,,2H,H-e),4.03(m,2H,Hf+H-g),1.50-1.33(5s,15H,H-h+H-i)。
MTC-儿茶酚的制备.
将3,4-双(苄氧基)苯甲酸2-羟乙酯(HEBB,2.81g,7.42mmol)、MTC-C6F5(2.54g,7.79mmol)和质子海绵(1.59g,7.42mmol)溶解于THF(10mL)中并且在室温下搅拌过夜。在完成反应后,添加二乙醚和己烷的混合物,并且将所述溶液在-40℃静置几小时。获得白色晶体并且用二乙醚和己烷洗涤。产率:2.0g(71%)。1HNMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ7.64(d,2H,苯甲酸酯的H),7.43(m,10H,-OCH2PhH),6.97(d,1H,苯甲酸酯的H),5.24(d,4H,-OCH2PhH),4.68(d,2H,-CH2OCOO-),4.54(s,4H,-COOCH2CH2O-),4.19(d,2H,-CH2OCOO-),1.32(s,3H,-CH3)。
BPEI25和BPEI1.8缀合物的制备
在以下实施例中,BPEI25和BPEI1.8的结构由以下符号表示:
下标q表示仲胺基(pKa8.6)的数量。对于BPEI25来说,q=116。下标s表示叔胺基(pKa7.5)的数量。对于BPEI25来说,s=58。下标t表示伯胺基(pKa9.6)的数量。对于BPEI25来说,t=58。下标j表示亚乙基的数量。对于BPEI25来说,j=233。因此,BPEI25是每摩尔具有平均233个亚乙基、58个伯胺基、116个仲胺基、58个叔胺基的超支链聚合物。对于下面的反应来说,1摩尔=10000g=Mn。
BPEI1.8每摩尔具有平均40个亚乙基、10个伯胺基、20个仲胺基和10个叔胺基。对于下面的反应来说,1摩尔=1800g=Mn。
应当理解,右括号的给定氮的每个带星号键连接到左括号的不同亚乙基,并且左括号上的给定亚乙基的每个带星号键连接到右括号上的不同氮。因此,BPEI骨架包含交替的胺氮和亚乙基(即,相邻乙烯亚胺单元以头接尾排布连接)。叔胺基、仲胺基和伯胺基随机分布于BPEI中,如通过右侧方括号上的胺基的垂直叠加所表明的。BPEI可含有于叔胺位点交叉的许多支链。取决于BPEI的形成方法,外周端基(悬挂端基)可以是伯胺基、烷基或另一C1-C10部分。在下面的实施例中,支链于外周端端接伯胺基。在上文的符号中,所有外周端基(悬挂端基)都是伯胺基。
用经甘露糖取代的环状碳酸酯MTC-IPMAN对BPEI25上的所选数量的伯胺基和/或仲胺基进行改性。开环反应生成含有氨基甲酸酯侧链的侧链,所述氨基甲酸酯侧链含有受保护的甘露糖官能团。受保护的甘露糖基团的脱保护获得带有甘露糖基团的侧链。这一改性的额外益处是经改性的BPEI25的毒性相比于未经改性的BPEI25显著降低。
实施例2到7.通过用MTC-IPMAN对BPEI25(Mn10,000=1摩尔)进行改性来制备B1-B6。下文说明了对BPEI25的改性用于制备B3(实施例4)。对于B3来说,MTC-IPMAN的使用超过BPEI25的伯胺基。在这些条件下,MTC-IPMAN不经历开环聚合。用1开环分子的MTC-IPMAN对约100%的BPEI25伯胺基和约6%的BPEI25仲胺基位点进行改性。随后异亚丙基缩酮保护基团的酸催化水解得到含有65个甘露糖单元的经改性的BPEI25,所述甘露糖单元通过各自的氨基甲酸酯连接基团连接到PEI骨架。
在手套箱中,将MTC-IPMAN(0.302g,0.75mmol,MW=402.15g)添加到BPEI25(0.1g,0.01mmol,基于1摩尔=10,000g=Mn)于2mL二氯甲烷(DCM)中的溶液中。BPEI25∶MTC-IPMAN进料质量比是1∶3,摩尔比是1∶75。将反应溶液搅拌1小时。添加10mL甲醇和10mL1MHCl(含水)。将所得到的反应混合物在回流下加热2小时,然后冷却到室温。最后,通过在Vivaspin20浓缩器(MWCO=5000,SartoriusAG,Goettingen,Germany)中超滤将上述混合物纯化,用去离子(DI)水洗涤3次,并且冷冻干燥(0.19g,48%)。1H-NMR(400MHz,D2O,22℃):δ4.11(s,130H,H-d和H-e),2.56-3.70(br,m,1190H,H-e,H-f,H-g和BPEI的H),1.10(s,195H,H-i)。
在B3的上述结构中,s′表示质子化叔胺基的数量,q′表示呈质子化盐形式的剩余仲胺基的数量,t′表示呈质子化盐形式的剩余伯胺端基的数量,u表示带有部分M′的经改性仲胺基的数量,并且v表示带有部分M′的经改性伯胺基的数量。对于B3来说,q′=109,s′=58,t′=0,u=7,v=58,并且u+v=65。
使用1H-NMR对B3的胺改性水平进行监测和定量(图1)。例如,比较1H-NMR谱中的宽峰(2.56-3.70ppm)的相对积分强度(其归属于BPEI25亚甲基的质子以及甘露糖部分的H-e、H-f和H-g)和MTC甲基信号(1.10ppm)的相对积分强度以确定甘露糖基团的数量。B4-B6中的更多仲胺基位点被改性,其中所引入的甘露糖基团的数量分别是86个、104个和143个。
依照用于B3(实施例4)的上述一般程序,通过BPEI25(0.2g,0.02mmol)与MTC-IPMAN(201mg,0.5mmol)在二氯甲烷中的反应制备B1(实施例2)。引入了总共28个甘露糖基团(BPEI25∶MTC-IPMAN摩尔比:1∶28)。对于B1来说,q′=116,s′=58,t′=30,u=0,v=28,并且u+v=28。
依照用于B3(实施例4)的上述一般程序,通过BPEI25(0.12g,0.012mmol)与MTC-IPMAN(280mg,0.7mmol)在二氯甲烷中的反应制备B2(实施例3)。引入了总共51个甘露糖基团(BPEI25∶MTC-IPMAN摩尔比:1∶51)。对于B2来说,q′=116,s′=58,t′=7,u=0,v=51,并且u+v=51。
随着改性程度的增加,开环反应愈加受到空间位阻影响,需要更强制的条件以在更高改性水平下获得期望水平的经改性胺基。
除了在环境温度下将反应搅拌2.5小时之外,依照用于B3(实施例4)的上述一般程序,通过BPEI25(58mg,0.0058mmol)与MTC-IPMAN(280mg,0.7mmol)在二氯甲烷中的反应制备B4(实施例5)。引入了总共86个甘露糖基团(BPEI25∶MTC-IPMAN摩尔比:1∶86)。对于B4来说,q′=88,s′=58,t′=0,u=28,v=58,并且u+v=86。
除了在40℃将反应搅拌3小时之外,依照用于B3(实施例4)的上述一般程序,通过BPEI25(70mg,0.007mmol)与MTC-IPMAN(338mg,0.84mmol)在二氯甲烷中的反应制备B5(实施例6)。引入了总共104个甘露糖基团(BPEI25∶MTC-IPMAN摩尔比:1∶104)。对于B5来说,q′=70,s′=58,t′=0,u=46,v=58,并且u+v=104。
除了在40℃将反应搅拌3小时之外,依照用于B3(实施例4)的上述一般程序,通过BPEI25(50mg,0.005mmol)与MTC-IPMAN(362mg,0.9mmol)在二氯甲烷中的反应制备B6(实施例7)。引入了总共143个甘露糖基团(BPEI25∶MTC-IPMAN摩尔比:1∶143)。对于B6来说,q′=31,s′=58,t′=0,u=85,v=58,并且u+v=143。
实施例8和9.通过用三亚甲基碳酸酯(TMC)对BPEI25进行改性来制备B7和B8。其中引入25个TMC单元的B7的制备示于以下反应图中。
依照用于B3(实施例4)的上述一般程序,通过BPEI25(0.25g,0.025mmol)与TMC(64mg,0.63mmol)在二氯甲烷中的反应制备B7(实施例8)。引入总共25个TMC基团。对于B7来说,q′=116,s′=58,t′=33,u=0,v=25,并且u+v=25。
依照用于B3(实施例4)的一般程序,通过BPEI25(0.25g,0.025mmol)与TMC(191mg,1.87mmol)在二氯甲烷中的反应制备B8(实施例9)。引入总共75个TMC基团。对于B8来说,q′=99,s′=58,t′=33,u=17,v=58,并且u+v=75。
实施例10到12.通过用MTC-儿茶酚对BPEI25进行改性来制备B9到B11。B9(实施例10)的制备是代表性的,其中引入5个MTC-儿茶酚基团。受保护的儿茶酚基团的氢还原可在最终产物中留下0个或多个受保护的儿茶酚基团。
根据实施例2在二氯甲烷中用MTC-儿茶酚(62.4mg,0.12mmol)处理BPEI25(0.3g,0.03mmol)。引入总共5个受保护的儿茶酚基团。将所得到的产物在真空中干燥。将受保护的缀合物(362mg)、MeOH(7.5mL)、THF(7.5mL)和Pd-C(10%w/w,0.2g)的混合物在H2(7个大气压)下涡旋过夜。在抽空氢气氛后,通过注射器将混合物过滤并且将滤液浓缩到干燥。然后,依序添加MeOH(10mL)和1MHCl(10mL)并且将反应溶液搅拌2到3小时。在酸化后,通过离心过滤(MWCO=3,000)将溶液纯化并且用去离子(DI)水洗涤二次重复三次。最后,将离心管中的浓缩溶液冷冻干燥,获得脱保护且酸化的BPEI-儿茶酚缀合物B9(0.43g,53%)。1H-NMR(400MHz,D2O,22℃):1H-NMR(400MHz,D2O,22℃):δ6.70-7.60(br,m,15H,PhH),3.90-4.40(br,m,10H,-CH2OCOO),2.50-3.70(br,m,950H,-CH2CH2OC(O)Ph和BPEI25的H),1.03(m,15H,-CH3)。
对于B9来说,q′=116,s′=58,t′=53,u=0,u′=0,v>0,v′≥=0,并且u+u′+v+v′=5。
依照实施例10的一般程序,通过BPEI25(0.3g,0.03mmol)与MTC-儿茶酚(124.8mg,0.24mmol)在二氯甲烷中的反应制备B10(实施例11)。引入总共12个儿茶酚基团。对于B10来说,q′=116,s′=58,t′=46,u=0,u′=0,v>0,v′≥=0,并且u+u′+v+v′=12。
依照实施例10的一般程序,通过BPEI25(0.2g,0.02mmol)与MTC-儿茶酚(167mg,0.32mmol)在二氯甲烷中的反应制备B11(实施例12)。引入总共20个儿茶酚基团。图2A是氢解前于MeOD中获取的1HNMR谱。图2B是B11在氢解和酸化后于D2O中获取的1HNMR谱。对于B11来说,q′=116,s′=58,t′=38,u=0,u′=0,v>0,v′≥=0,并且u+u′+v+v′=20。
BPEI1.8缀合物的制备
BPE1.8具有Mw2000和Mn1800。BPEI1.8具有q=20个仲胺基、s=10个叔胺基、t=10个伯胺基和j=40个亚乙基。对于下面的计算来说,1摩尔BPEI1.8=1800g。
实施例13到15.通过用MTC-IPMAN对BPEI1.8(Mn1800=1摩尔)进行改性来分别制备B12到B14。B12(实施例13)的制备示于以下反应图中,其中引入4个甘露糖基团。
依照用于B3(实施例4)的一般程序,通过BPEI1.8(0.198g,0.11mmol)与MTC-IPMAN(199mg,0.495mmol)在二氯甲烷中的反应制备B12(实施例13)。引入总共4个甘露糖基团。
在B12的上述结构中,s′表示质子化叔胺基的数量,q′表示呈质子化盐形式的剩余仲胺基的数量,t′表示呈质子化盐形式的剩余伯胺端基的数量,u表示带有部分M′的经改性仲胺基的数量,并且v表示带有部分M′的经改性伯胺基的数量。对于B12来说,q′=20,s′=10,t′=6,u=0,且v=4,并且u+v=4。
依照用于B3(实施例4)的一般程序,通过BPEI1.8(0.108g,0.06mmol)与MTC-IPMAN(326mg,0.81mmol)在二氯甲烷中的反应制备B13(实施例14)。引入总共9个甘露糖基团。对于B13来说,q′=20,s′=10,t′=1,u=0,且v=9,并且u+v=9。
依照用于B3(实施例4)的一般程序,通过BPEI1.8(0.072g,0.04mmol)与MTC-IPMAN(348mg,0.864mmol)在二氯甲烷中的反应制备B14(实施例15)。引入总共17个甘露糖基团。对于B13来说,q′=13,s′=10,t′=0,u=7,且v=10,并且u+v=17。
LPEI25缀合物的制备
LPEI25是由以下符号表示的直链聚乙烯亚胺,其具有Mw=25000、Mn=10950、PDI1.16;0个伯胺端基、247个仲胺基(x)和8个酰化的仲胺基(y)。
在方括号内重复单元的垂直叠加表示重复单元的随机分布。端基E′是甲基并且端基E″是OH。E′和E″并不限于这些端基。对于以下实施例来说,1摩尔LPEI25=10950克。
实施例16到18.经甘露糖改性的LPEI25聚合物L1到L3(聚合物t到v)的分别制备。L1的制备是代表性的,其中引入8个甘露糖基团。
在真空中将LPEI25(0.35g,0.032mmol)在烧瓶中在65℃加热3小时。当烧瓶冷却到室温时,将二烷(30mL)添加到所述烧瓶中。然后,将烧瓶中与冷凝器安装在一起并且加热到85℃。在将所有LPEI25溶解于二烷中并且获得均匀溶液后,添加MTC-IPMAN(50mg,0.12mmol)于10mL二烷中的溶液。将反应混合物在85℃与空气接触搅拌过夜。将烧瓶冷却到室温,并且通过旋转蒸发去除溶剂。将所得到的产物在真空中干燥。对于L1来说,x′=239,y=8并且z=8。
将上述缀合物溶解于MeOH(10mL)和1MHCl(10mL)中。将所述溶液在回流下加热2小时并且冷却到室温。将所得到的溶液通过离心过滤纯化(MWCO=2,000)并且用去离子(DI)水洗涤三次。最后,将离心管中的浓缩溶液冷冻干燥,获得酸化的LPEI-Man缀合物L1(0.47g,80%)。1H-NMR(400MHz,D2O,22℃):δ3.00-4.00(m,1059H,LPEI和甘露糖的H),2.37(m,16H,CH3CH2CONH-),1.06(m,24H,CH3CH2CONH-),0.96(m,24H,-CH3)。
依照实施例16的一般程序,通过LPEI25(0.3g,0.027mmol)与MTC-IPMAN(100mg,0.25mmol)的反应制备L2。引入总共15个甘露糖基团。对于L2来说,x′=232,y=8并且z=15。
依照实施例16的一般程序,通过LPEI25(0.2g,0.018mmol)与MTC-IPMAN(200mg,0.5mmol)的反应制备L3。引入总共26个甘露糖基团。对于L3来说,x′=221,y=8并且z=26。
表2汇总了实施例2-18的经改性的BPEI25和LPEI25聚合物的制备。
表2.
a从1HNMR获得.
滴定实验
B1到B6的经甘露糖改性的胺基的数量分别是28个、51个、65个、86个、104个和143个。对聚合物B1到B6进行酸碱滴定实验以评估它们的相对pH中和能力(缓冲能力)。
首先将给定的聚合物(0.1mmol的所有胺,不包括与甘露糖官能化的环状碳酸酯反应的那些)溶解于NaCl溶液(7.5mL,150mM)中。添加HCl溶液(22.5mL,0.01N)以使pH降到2,然后使用自动滴定器(SpectralabInstruments)用0.01NNaOH将该溶液滴定到pH10。使用未经改性的BPEI25(Mn10kDa)作为对照。缓冲能力被定义为聚合物的在5.0到7.4的pH内被质子化的胺基的百分比,并且通过以下公式来计算:缓冲能力(%)=100×(ΔVNaOH×0.01×40)/W,其中ΔVNaOH是将pH从5.0增加到7.4所需的NaOH(0.01N,MW40)的体积,并且W是所述聚合物的重量(毫克)。
表3列出了BPEI25和B1到B6的的缓冲能力。
表3.
如上文所示的,在聚合物的相同重量浓度下,由于叔胺的数量减少和/或分子量增加,因此从5.0到7.4的胞内体pH的中和能力随着甘露糖含量的增加而降低,分子量增加降低了所述聚合物的每单位质量的叔胺含量。
抗病毒活性
细胞
在37℃在5%CO2中在补充有10%胎牛血清(FBS,Invitrogen,Carlsbad,CA)、100单位/mL青霉素和100微克/mL链霉素的伊格尔氏最低必需培养基(EMEM,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中培养LLC-MK2细胞(猴肾细胞)。
将白纹伊蚊C6/36细胞维持在具有HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸,25mM)且补充有10%FBS(胎牛血清)、100U/mL青霉素和100微克/mL链霉素的罗斯韦尔公园纪念研究所(RPMI)培养基RPMI-1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并且在28℃在5%CO2中培育。
在37℃在5%CO2中使A549复制子细胞(含有DENV-2NS基因)、Vero细胞系(猴肾上皮)、MDCK细胞系(狗肾上皮)和RD细胞系(人肌梭细胞、横纹肌肉瘤)在补充有10%FBS、100U/mL青霉素和100微克/mL链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中生长。
病毒
DENV-1和DENV-4的临床样品以及DENV-2的新几内亚C(NewGuineaC)(NGC)实验室适应株由JustinJHChu博士(新加坡国立大学,新加坡)友好提供。通过Low等人,"EarlyDengueInfectionandOutcomeStudy(EDEN)-StudyDesignandPreliminaryFindings″,AnnalsAcademyofMedicineSingapore2006,35,第783-789页的方法分离DENV-3株EDEN8630K1。使所述病毒在如下文(表5)进一步所述的各种细胞系中繁殖。将来自受感染细胞的上清液离心以去除细胞碎片,然后等分并储存在-80℃。
基于细胞毒性测定的抗病毒活性
通过用DENV(即,DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4)感染LLC-MK2细胞来监测聚合物在所述细胞中的抗登革热病毒活性和细胞毒性。使受感染(感染复数(MOI):0.5)细胞和未受感染细胞暴露于一定范围的浓度的聚合物(在96孔板中的细胞播种密度:2000个/孔),并且使其增殖5天。通过3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)测定对活细胞数量进行定量以获得EC50(来自受感染细胞)和CC50(来自未受感染细胞)。
噬斑形成测定
对于聚合物的EC50确定来说,将病毒以100pfu/孔的MOI与各种浓度的聚合物添加到6孔板(细胞播种密度:3×105个)中的LLC-MK2细胞中,并且在4℃培育90min。然后去除培养基,并且用冷PBS(pH7.4)洗涤所述细胞,然后用含有相应浓度的聚合物的培养基在37℃培育所述细胞。在接种后5天,在室温下用PBS(pH7.4)中的4%多聚甲醛将所述细胞固定20分钟。接下来,用水将细胞洗涤20分钟,然后添加1mL1%结晶紫,室温下保持20分钟。将板洗涤并干燥,并且对每毫升的噬斑形成单位(pfu/mL)进行计数和计算以获得EC50。
添加时间实验
将LLC-MK2细胞以30×104个细胞/孔播种于6孔板中。在摇动平台上将所述细胞与DENV-2(100pfu/孔)在4℃培育90min。然后用冷PBS将所述细胞洗涤3次并且将板转移到37℃培育器并培养。在预定时间点(-1.5小时、0小时、1小时、2小时、3小时、4小时和5小时)将含有50mg/LB3或100mg/L肝素(MPBiomedicals,Solon,OH)的培养基添加到所述细胞中。在37℃培育5天后,通过噬斑测定来研究病毒抑制活性。一式三份进行实验并且相对于对照计算平均抑制百分比,对照是在没有聚合物的相同条件下进行的。
病毒结合测定
将DENV-2与PBS(pH7.4)或含有B3(50mg/L)的PBS在4℃培育1小时以使所述聚合物结合到所述病毒上。然后6000×g通过Vivaspin500(100kDa分子量截止值)(GEHealthcare,Buckinghamshire,UK)以过滤15分钟来去除未结合的聚合物分子。使病毒经受如上文所述的噬斑测定以确定效价。
细胞结合测定
在37℃用B3(50mg/L)将LLC-MK2细胞处理2小时、1小时、30分钟和15分钟,并且用PBS洗涤。然后使所述细胞被DENV-2感染90分钟,并且在噬斑减少测定前在37℃接种5天。将无聚合物的对照感染设定为100%。将数据表示为三次单独实验的平均值±SD(标准偏差)。
细胞融合抑制测定
本测定用于检测聚合物在低pH下对细胞融合的抑制。在测定前一天将C6/36细胞以1.0×106个细胞/孔的细胞密度播种于6孔板中。在4℃将DENV-2以感染复数(MOI)0.03连同50mg/LB3、100mg/L肝素或培养基一起接种到被播种的C6/36细胞上,保持90分钟。然后用PBS将板洗涤3次。将含有所述聚合物/肝素的新鲜培养基添加到板中,并且将所述细胞在28℃培育2天。此后,通过添加50微升的0.5M2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)(pH5.0)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),将所述培养基酸化以诱导融合,之后在28℃培育2天。然后根据制造商方案用吉姆萨(Giemsa)染料改良溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)将融合细胞染色。在光学显微镜(CKX31显微镜,Olympus,Tokyo,Japan)下分析被染色的板。在另一组实验中,将病毒和细胞在4℃培育90分钟,然后添加所述聚合物或肝素。
药物抗性的评估
通过在EC50的B3存在下将DENV-2在LLC-MK2细胞上传代来研究药物抗性。在EC50的B3存在下使6孔板中的细胞(3×105个/孔)被DENV-2(从先前传代获得)以0.1的MOI感染。通过如上文所述的噬班形成测定来确定每次传代的EC50。
通过注射进行的体内毒性研究
根据由新加坡生物研究中心(SingaporeBiologicalResearchCenter)(BRC)的公共机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)和IBM的动物护理和使用委员会批准的方案进行动物研究。在用于研究LD50和对主要器官肝脏和肾脏的毒性以及血液中的电解质平衡的所有实验中均使用雌性Balb/c小鼠(6-7周,18-22g)。
根据OECD化学品测试导则(OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals)(OECD425)中所述的上下法(Up-and-Down-Procedure)来确定LD50(对于给定的测定持续时间,杀死一半小鼠群体所需的剂量)。将20只小鼠观察7天并且随机标记以允许个体识别。将B2或B3溶解于PBS(pH7.4)中,并且通过以设计剂量(即,56.0mg/kg、175mg/kg、560mg/kg和1750mg/kg,0.1mL)进行尾静脉注射给予小鼠。在处理后将死亡率监测14天,并且使用最大似然法确定LD50。
对急性毒性的评估来说,每组各10只小鼠的两个组接受在100微升灭菌盐水中的60mg/kgB3的静脉内注射。于48小时将10只小鼠处死并且于14天将剩余小鼠处死以收集血液样品用于分析ALT、AST、总胆红素(TBIL)、肌酸酐、脲氮、钠离子和钾离子水平。
结果
经改性PEI聚合物的抗病毒活性和选择性
通过常规的MTT测定使用被DENV-2(登革热病毒-2)感染的LLC-MK2细胞研究未经改性的PEI聚合物和经改性的PEI聚合物(支链和直链)的抗病毒活性。表4列出了当同时培育所述病毒、细胞和聚合物时获得的BPEI25、BPEI1.8、B1-B14和L1-L3的EC50、CC50和选择性(CC50/EC50)。
表4.
aEC50是所述聚合物保护50%的细胞免受病毒感染的有效浓度。低EC50值是期望的。
bCC50是杀死50%的细胞的细胞毒性聚合物浓度。高CC50值是期望的。
c选择性被定义为CC50/EC50。高选择性是期望的。
d从1HNMR获得。
所述聚合物以剂量依赖方式抑制DENV-2复制,具有0.01mg/L到50.5mg/L范围的低EC50值。未经改性的BPEI25(对照样品)是针对登革热病毒感染的最强效聚合物,具有最低EC50(0.01mg/L)。未经改性的BPEI25还是细胞毒性最高的,具有5.44mg/L的CC50。尽管甘露糖取代降低了抗病毒能力(即,增加了EC50),但这种方法有效地减轻了PEI细胞毒性(即,CC50随着甘露糖改性的增加而增加)。例如,当甘露糖基团的数量从28个增加到65个(分别为B1-B3)时,CC50从26.7mg/L增加到高于1000mg/L。在所有聚合物中,具有65个甘露糖残基的B3具有3333的最高选择性指数(SI,即CC50/EC50)。高选择性是期望的。
在临床上相关的人原代外周血单核细胞(PBMC,图3,图表)和巨噬细胞(图4,图表)中进一步评估B3针对DENV-2的抗病毒活性。在图3中,在病毒感染后,峰移位到更高的PE-A(藻红蛋白(PE)缀合的抗小鼠IgG)。从2mg/L或10mg/L的B3处理获得的样品的峰未移位,而是与无病毒感染的对照样品的峰几乎重叠,表明B3处理有效地预防人原代外周血单核细胞被DENV-2感染。在图4中,在病毒感染后,峰移位到略高的PE-A。从2mg/L或10mg/L的B3处理获得的样品的峰未移位,而是与无病毒感染的对照样品的峰几乎重叠,表明B3处理有效地预防巨噬细胞被DENV-2感染。这些结果显示B3有效地预防了细胞被DENV-2感染。PBMC和巨噬细胞两者均表达介导DENV-2感染的甘露糖受体。经改性的PEI聚合物的甘露糖基团与DENV-2竞争结合甘露糖受体,由此抑制病毒感染。
广谱抗病毒活性
针对广谱病毒(包括登革热病毒的其它血清型(DENV-1、DENV-3和DENV-4)、HSV-1、HSV-2、CHIKV、SARSCo-V和EV71)进一步评估甘露糖改性的BPEI25聚合物B2和B3的抗病毒活性。结果列于表5中。
表5.
aEC50是所述聚合物保护50%细胞免受病毒感染的有效浓度。低EC50值是期望的。
bCC50是杀死50%的细胞的细胞毒性聚合物浓度。高CC50值是期望的。
c选择性被定义为CC50/EC50。高选择性是期望的。
B3对DENV-1、DENV-2和DENV-4具有活性,分别具有0.20mg/L、0.32mg/L和0.31mg/L的EC50值。B3对DENV-3具有低活性,具有479mg/L的EC50值。然而,具有较少甘露糖取代和较高电荷的B2对DENV-3具有活性,具有0.80mg/L的EC50。值得注意地,B3有效地抑制DNA病毒HSV-1和HSV-2以及RNA病毒CHIKV、SARSCo-V和EV71(无包膜的)对各自靶细胞的感染。B3对流感感染无效,具有>1000mg/L的EC50,而B2有效地预防流感病毒的感染,具有<0.012mg/L的低EC50值。这些发现证实所述聚合物的广谱抗病毒活性。重要地,在其中所述聚合物预防100%细胞发生感染的浓度下没有显著的细胞毒性。
对表达有TIM-1和TIM-3受体的细胞中的病毒感染的抑制
TIM受体通过与病毒包膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)直接相互作用来促进病毒进入。建立稳定表达TIM-1或TIM-3蛋白质的293T细胞,如Tahara-HanaokaS等人"Lentiviralvector-mediatedtransductionofmurineCD34-hematopoieticstemcells",ExperimentalHematology,(2002),30,第11-17页)中所述生成慢病毒载体。用带有期望的ORF(开放读码框,即不含有终止密码子的读码框)的假病毒转染293T细胞。通过杀稻瘟菌素(InvivoGen,Toulouse,France)选择表达TIM-1或TIM-3的细胞。293T细胞由于整合了TIM-1或TIM-3表达基因而稳定表达TIM-1或TIM-3。
用CHIKV以感染复数(M.O.I)0.1攻击亲本293T细胞(具有空载体)、表达TIM-1和TIM-3的293T细胞,同时添加B3(50mg/L)。感染后48小时收集上清液。通过噬斑测定来确定病毒效价并且将其表示为三个重复的每ml的平均噬斑形成单位(pfu/mL)±SD。
TIM-1和TIM-3受体在293T细胞中的表达显著增强了CHIK感染(图5,条形图,TIM1-293T和TIM3-293T相对于空载体-293T细胞)。图6是显示B3在预防空载体293T细胞(即,不表达TIM-1或TIM-3受体)的CHIKV感染方面的作用的条形图,其中EC50是2.6mg/L。图7是显示B3在预防TIM1-293T细胞中的CHIKV感染方面的作用的条形图,其中EC50是2.9mg/L。图8是显示B3在预防TIM3-293T细胞中的CHIKV感染方面的作用的条形图,其中EC50是2.7mg/L。对于预防表达TIM-1和TIM-3的细胞中的CHIKV感染的选择性(CC50/EC50)是高的(分别>345和>370)。
B3还有效地抑制天然表达TIM-1受体的A549细胞的DENV-2感染(图9,条形图)。在这种情况下,EC50是6.8mg/L,CC50>1000mg/L,且选择性指数>147,如通过噬斑减少测定所测量的。这些发现表明所述聚合物能够抑制磷脂酰丝氨酸(PS)/TIM受体结合,这可能通过聚合物与TIM-1/TIM-3受体之间的氢键合相互作用(参见下文的图34-37)和/或所述聚合物上的阳离子电荷与PS上的负电荷之间的静电相互作用,因此预防具有TIM-1或TIM-3受体表达的细胞的病毒感染。
抗病毒机理
病毒进入的抑制
病毒粒子通过其表面蛋白质与细胞膜上的受体(包括蛋白质、甘露糖受体(也被免疫细胞靶向)、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(被DENV、HSV、EV71、SARS-CoV靶向)和唾液酸(流感病毒、EV71))的特异性相互作用、之后进行胞吞内在化来感染细胞。病毒在细胞间传播病毒基因组和感染。为了研究所述聚合物是在病毒生命周期的早期还是晚期施加其抗病毒作用,在荧光素酶-复制子转染的A459细胞中研究所述大分子对仅编码非结构病毒蛋白质的DENV-2亚基因组复制子的复制的作用。
复制子荧光素酶测定.将含有DENV-2的荧光素酶-报告复制子的A549细胞(人男性肺癌)以25x104个细胞/孔的细胞密度播种于6孔板中。用50mg/LB3聚合物c、100mg/LNITD008或具有DMSO的培养基处理所述细胞。NITD008不溶于水,并且使用少量DMSO(二甲亚砜)来促进其在细胞培养基中的溶解。在培育48小时后,使用海肾荧光素酶测定系统(Promega,Madison,WI)测量荧光素酶活性。通过蛋白质的量将结果归一化。
图10是比较无B3(标记为DMSO)、有B3和有强效抗病毒的腺苷核苷类似物NITD008(2R,3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-乙炔基-5-(羟甲基)氧杂环戊烷-3,4-二醇情况下,A459细胞的荧光素酶活性的条形图。结果显示,在抑制DENV-2亚基因组复制子的复制方面,NITD008是有效的,而B3是无效的。该发现证实抗病毒聚合物在DENV-2生命周期的晚期未发挥功能。
为了检查所述聚合物是阻断LLC-MK2细胞中的初始附着步骤还是阻断病毒进入过程中的下游事件,在4℃将B3连同DENV-2一起添加到所述细胞中保持90分钟。然后通过PBS洗涤(3次)去除未结合的聚合物分子,然后将所述细胞在37℃培育5天。在该添加时间(-1.5小时),B3聚合物完全抑制DENV-2感染。对其它添加时间进行评估。图11是显示B3(和肝素)的添加时间对LLC-MK2细胞中的DENV-2的抑制的作用的一组图表。顶部图表显示B3和肝素的添加时间。底部图表描绘了每个添加时间获得的抑制%。仅在时间-1.5小时将病毒和聚合物B3(或肝素)一起添加到细胞中。在所有其它时间,起初在4℃在没有聚合物B3或肝素的情况下培育病毒和细胞,之后升温到37℃,之后在所示时间添加B3或肝素。结果显示,当在将所述细胞和病毒在4℃培育90分钟并且升温到37℃之后立即将所述聚合物添加到所述细胞中时(对应于时间=0小时),病毒感染被有效地预防。然而,当在将所述细胞和DENV-2在37℃培育1小时之后将所述聚合物添加到所述细胞中时,抑制被显著降低。当在所述细胞在37℃被所述病毒感染2-5小时之后引入所述聚合物时未观察到明显抑制。这些结果证实,当在病毒附着步骤期间或附着步骤后的早期添加时,所述聚合物在预防病毒感染方面是有效的,从而确认了DENV进入/膜融合处的作用点。
为了进一步理解抗病毒机理,将DENV-2与50mg/LB3在4℃培育1小时以实现结合,然后进行噬斑测定以测量病毒效价。病毒与所述聚合物结合将病毒效价降低了超过40%,表明所述聚合物结合了所述病毒,并且预防了感染(图12,条形图)。在细胞培养基(pH7.4)中,大部分伯胺和仲胺被质子化,使得所述聚合物高度带电。
除了特异性的病毒蛋白质/聚合物相互作用之外,所述聚合物的阳离子电荷还可通过静电相互作用与病毒的包膜上的阴离子电荷相互作用。这可掩蔽所述病毒,从而预防所述细胞发生病毒感染。
另一方面,当将聚合物B3连同所述病毒一起添加到所述细胞中时,在50mg/L的聚合物B3产生了对病毒感染的完全抑制。在相同浓度下的聚合物结合后,病毒效价的不完全抑制暗示存在促成病毒感染的抑制的其它因素,如所述聚合物与细胞膜上的阴离子型组分(阴离子型硫酸肝素蛋白聚糖)之间的结合和胞内体pH的中和。尽管所有伯胺基均被甘露糖基取代,但B3在pH7.4下带有阳离子电荷,因为大部分仲胺基(pKa:8.6)和约50%的叔胺(pKa:7.5)可被质子化。实际上,使用50mg/LB3预处理细胞2小时或甚至15分钟有效地预防DENV-2感染(图13,条形图)。当在添加所述病毒之前将所述细胞与B3预培育1小时时,B3针对DENV-2感染的EC50值是6.0mg/L。该值高于当将所述聚合物、细胞和病毒同时培育时(EC50:0.30mg/L,表4)。对Vero细胞和RD细胞的预处理对CHIKV、HSV-1和EV71也是高度有效的,EC50值分别为23.5mg/L、1.8mg/L和0.80mg/L。这些发现表明B3结合到细胞膜上是阻断病毒进入的重要因素。
另外,PEI聚合物的未质子化的仲胺和叔胺能够在胞内体环境(pH5.0-6.5)中被质子化,由此中和胞内体pH。已知对胞内体pH的中和抑制pH依赖性病毒感染,如DENV、CHIKV、流感病毒、HSV和EV71。为了证明所述聚合物能够抑制低pH诱导的病毒-细胞膜融合,对低pH诱导的病毒感染的细胞融合的预防进行了研究。病毒感染的细胞融合被报道归因于感染后细胞表面上表达的成融病毒蛋白质。在有B3(50mg/L)和无B3(50mg/L)的情况下将C6/36白纹伊蚊细胞与DENV-2在4℃培育90分钟,之后在28℃培育2天以允许感染并且在用MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)酸化到pH5.0后再培育2天。图14是显示B3和肝素对C6/36细胞的被病毒感染的细胞融合的作用的一组显微照片和相应的程序图解。在4℃(标记为"4℃+"的图像)或在28℃(标记为"4℃-"的图像)添加抗病毒剂。标记为"培养基"的样品仅含有细胞和病毒(无抗病毒剂)。标记为"模拟"的样品仅含有细胞(无病毒或抗病毒剂)。在含有B3的样品中未发现融合细胞。不同于无任何处理的对照组,在含有B3的样品中未发现融合细胞。甚至当在病毒感染点(即,在28℃培育)添加所述聚合物时,所述聚合物也抑制合胞体形成,表明所述聚合物确实上能够预防低pH诱导的病毒-细胞膜融合和病毒感染。
总之,通常对于DENV的处理来说,具有较高水平的甘露糖的阳离子型聚合物具有较低的中和胞内体pH的能力和较低的阳离子电荷,这降低了抗病毒活性。不受限于理论,聚合物-病毒结合、聚合物-细胞膜相互作用和对胞内体pH的中和一起作用可解释对病毒感染的预防。
对药物抗性的预防.
尽管存在可用于一些病毒感染如流感的抗病毒药物,但病毒能够通过突变产生药物抗性。例如,自2003年以来,在流行的流感株中频繁地发现了金刚烷抗性(例如,对M2蛋白质抑制剂的抗性)。对抗金刚烷的流感病毒有效并且被美国疾病控制中心(CenterforDiseaseControl,USA)(CDC)推荐用于治疗和预防流感感染的奥塞米韦(Oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)(神经氨酸酶抑制剂)也被发现在少量流感病毒中的有效性降低。抗性与M2或神经氨酸酶蛋白质中的单个氨基酸变化相关。为了研究由所述聚合物通过多种机理介导的抗病毒活性是否充分地预防药物抗性的产生,将暴露于亚致死剂量的B3(0.31mg/L)的DENV-2传代并且用于确定最多5次传代的EC50值。EC50值保持类似(0.31-0.35mg/L)。另外,在第5次传代后,用100mg/L的聚合物处理病毒,这完全抑制了DENV-2感染。这些结果表明用B3重复处理并未介导DENV-2的抗性。
体内毒性
为了证实阳离子型聚胺用于体内应用的潜力,对B2和B3的体内毒性水平进行研究。B2和B3的通过静脉内注射的LD50值(在两周时期内杀死一半小鼠的致死剂量)分别被确定为313mg/kg和463mg/kg,表明阳离子型聚胺具有低毒性。
为了评估B3对主要器官(肝脏和肾脏)和血液的急性毒性,测量了在取自静脉内注射后48小时的B3-处理小鼠的血液样品中的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、肌酸酐、脲氮、钠离子和钾离子水平。表6列出了结果。所述数据表示为基于从10只小鼠(n=10)获得的值的平均值+标准偏差。使用学生氏(Student’s)t-检验进行统计学分析。概率P<0.05的差异被认为是统计学显著的。使用以下缩写:ALT=丙氨酸转氨酶;AST=天冬氨酸转氨酶;TBIL=总胆红素;单位=国际单位。
表6.
在对照组与接受远高于B3的有效浓度(剂量:60mg/kg;在血液中的估计浓度:1200mg/L,假定小鼠的血液体积是约1mL)的浓度的B3的静脉内注射的组之间在任何测量参数中没有显著差异,表明所述聚合物处理既不导致任何急性肝脏损伤或肾脏损伤,也不干扰血液中的电解质平衡。另外,甚至在注射后14天,肝脏和肾脏的功能、钾离子和钠离子的浓度相比于对照仍然保持不变。此外,聚合物处理未诱导血清或尿液样品中的任何异常的颜色变化,或未导致小鼠的死亡。这些结果证明聚合物处理在测试时期期间对小鼠无毒。
经改性的PEI和未经改性的PEI与病毒蛋白质的盲对接(blinddocking)研究
盲对接研究提供了对聚合物与病毒蛋白质之间的结合相互作用的了解。
从蛋白质数据库检索DENV-2E糖蛋白的晶体结构(PDBID:1OKE)。所述晶体结构详细呈现了呈二聚体预融合构象的E蛋白质。还从PDB检索了DENV-3(PDBID:1UZG)、HSV-1(PDBID:1JMA)、HSV-2(PDBID:4MYW)、流感病毒(PDBID:4KVN)和TIM1(PDBID:2OR8)的晶体结构。从国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI,USA)下载CHIKV(ID:ACT35081.1)和EV71(ID:ACS12925)的氨基酸序列并且使用I-Tasser在线服务器对所述蛋白质结构建模。使用MarvinSketch软件构建支链PEI的模型大分子的二维结构(图15)并且使用OpenBabel软件将其转化为三维结构。用于对接研究中的模型支链PEI以及模型阳离子型聚胺B3和B2并非意在表示上述实施例的支链PEI和B3材料的完整结构。模型B3材料具有3个甘露糖基团,而模型B2材料具有2个甘露糖基团。MVD(MolegroVirtualDocker)用于识别B3和未经改性的支链PEI在病毒蛋白质中的潜在结合位点以进行分子对接分析。空腔检测算法用于检测空腔以缩小结合位点。通过MVD准备蛋白质和配体(模型支链PEI或模型阳离子型聚胺B3的1单位大分子)的结构。如果缺失的话,则指派键、氢和键序。指派配体中的电荷和柔性扭转。基于网格的MolDock评分函数用于定义能量项以对潜在结合位点分级。半径的网格被用作蛋白质上的搜索空间。选择群体大小为100的MolDock单形进化算法。进行单形最小化程序并且将能量阈值设定为100用于位姿生成(posegeneration)。
通过柔性配体对接研究分析蛋白质-聚合物相互作用。当配体以最小能量结合到蛋白质的特定结合位点时,所述配体与所述蛋白质之间的相互作用被定义为特异性的,而当所述配体以相同范围的能量结合到所述蛋白质的不同位点时,相互作用被定义为非特异性的。从柔性对接获得每个网格中的5种结合位姿,并且通过对所述位姿的Moldock评分和再分级评分进行分级,认为具有最小评分的位姿是最好的对接位姿。预测最好的位姿存在于通过MVD软件检测到的5个空腔中的一个中。
DENV-2E蛋白质(包膜蛋白质)具有5个空腔。利用4个网格进行DENV-2E蛋白质的MVD对接研究。图16是DENV-2E蛋白质的MVD三维计算机绘图,其中突显的斑点区域表示4个网格中以相等结合能量结合的模型支链PEI的4种位姿。氢键是估计的。
预测模型阳离子型聚胺B3与DENV-2E蛋白质的特异性结合位点在E蛋白质二聚体的结构域II和结构域III的界面处并且靠近E蛋白质单体的融合环。图17是显示DENV-2E蛋白质(包膜蛋白质)的与模型阳离子型聚胺B3结构形成氢键的8个氨基酸基团的计算机绘图:Thr70、Thr115、Asp154、Gln248、Gly266、Ala267、Thr268和Leu277。图18是模型阳离子型聚胺B3与DENV-2E蛋白质的最有利结合的三维计算机绘图。结合位点还位于衬于疏水空腔中的柔性‘kl’环上方的空穴(pocket)中,所述空穴被先前研究称为BOG结合空穴。
图19是显示EV71VP1蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸基团的使用MVD软件的计算机绘图:Gln269、Arg267、Glu124、Asn228、Ser275、Ala224和Gly223。
图20是显示模型阳离子型聚胺B3与EV71VP1蛋白质的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图21是显示HSV-1GD蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸基团的使用MVD软件的计算机绘图:Asp13、Asn15、Arg18、Leu22、Val24、Gln27、Ser8。
图22是显示模型阳离子型聚胺B3与HSV-1GD蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图23是显示DENV-3E蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Thr155(B)、Lys47(B)、Thr274(B)、Ser271(B)、Asn8(B)和Asp98(A)、His27(B)。
DENV-3E蛋白质具有通过MVD软件检测到的5个空腔。图24是DENV-3E蛋白质中的5个空腔的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图25是显示模型阳离子型聚胺B3与DENV-3E蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图26是显示CHIKVE1蛋白质的通过氢键合与模型阳离子型聚胺B3相互作用的7个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Gln373、Gln368、Thr17、Gly12、Glu32、Thr338和His394。
图27是模型阳离子型聚胺B3与CHIKVE1蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图28是显示流感病毒HA蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的4个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Arg285、Ser282、Ser130和Phe415。
图29是HA蛋白质中的4个空腔的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图30是显示模型阳离子型聚胺B3与HA蛋白质的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图31是显示HSV-2GD蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的9个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Asp139、Arg222、Ser140、Asp26、Asn227、Thr230、Lys237、Val24和Gln27。
图32是GD蛋白质中的4个空腔的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图33是显示模型阳离子型聚胺B3与GD蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图34是显示TIM-1蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的8个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Lys102(B)、Ser3(B)、Thr20(A)、Thr20(B)、Ser22(A)、Gln101(A)、Asp100(A)和Glu6(B)。
图35是显示模型阳离子型聚胺B3与TIM-1蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图36是显示TIM-3蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的5个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Glu106(A)、Cys39(A)、Lys103(A)、Ser20(A)和Tyr7(A)。
图37是显示模型阳离子型聚胺B3与TIM-3的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图38是显示DENV-3E蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3结构形成氢键的3个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Glu13(A)、Ala35(A)和Phe335(A)。
图39是显示模型阳离子型聚胺B3与DENV-3E蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图40是显示流感HA蛋白质的与模型阳离子型聚胺B2形成氢键的5个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Arg285、Glu430、Ser282、Ile283和Asp287。
图41是显示模型阳离子型聚胺B2与流感HA蛋白质的最有利结合的使用MVD软件的三维计算机绘图。
另外,对接结果显示未经改性的PEI-病毒蛋白质相互作用是非特异性的。
表7汇总了使用MVD软件获得的模型阳离子型聚胺B3与多种病毒蛋白质的Moldock评分、再分级评分和形成氢键相互作用氨基酸的计算数量。
表7.
表8汇总了使用MVD软件获得的模型阳离子型聚胺B2与DENV-3E蛋白质和流感HA蛋白质的Moldock评分、再分级评分和形成氢键相互作用氨基酸的计算数量。
表8.
结论
在与甘露糖官能化的环状碳酸酯单体的快速且易行的亲核加成反应中对直链PEI和支链PEI进行改性。所得到的阳离子型聚胺展示了强抗病毒活性、可忽略的毒性和对病毒粒子优于对哺乳动物细胞的高选择性。上述数据显示抗病毒活性随着经改性的BPEI25的甘露糖含量的增加而降低(EC50增加)(表5,B1-B6)。抵消EC50的该趋势的是更快速降低的细胞毒性(增加的CC50),导致选择性(增加的CC50)随着甘露糖含量的增加而增加(表5,B1-B6)。甘露糖残基的并入降低了PEI毒性并且允许靶向免疫细胞上的甘露糖受体。经甘露糖改性的PEI特异性地结合到病毒表面蛋白质。经改性的聚合物具有广谱抗病毒活性,对DNA病毒感染、RNA病毒感染、包膜病毒感染和无包膜病毒感染有效,所述病毒感染包括DENV、HSV-1、HSV-2、CHIKV、SARSCo-V和EV71。阳离子型聚胺通过与病毒表面和细胞表面结合、抑制病毒进入/膜融合和中和胞内体pH(减轻膜融合)来预防病毒感染。阳离子型聚胺还对表达TIM-1或TIM-3的细胞的病毒感染有效。重要地,通过靶向病毒蛋白质和宿主-病毒相互作用两者,抗病毒聚合物可减轻药物抗性。经甘露糖-氨基甲酸酯改性的PEI在其有效浓度下具有广谱抗病毒活性并且没有体内毒性,从而产生用于预防和治疗各种病毒感染的巨大潜力。
本文所用的术语仅仅为了描述特定实施方案的目的,而并非意在限制本发明。除非上下文另有明确指示,否则如本文所用的单数形式"a/an(一)"和"所述"意在也包括复数形式。应当进一步理解,术语"包括"和/或"包含"在用于本说明书中时,指定存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件,但并不排除存在或增加一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或它们的组。当使用范围来表示使用两个数值极限X和Y的可能值(例如,Xppm到Yppm的浓度)时,除非另有说明,否则所述值可以是X、Y或X到Y的任何数字。
已经出于说明和描述的目的给出了对本发明的描述,但该描述并非意在穷举或将本发明限于所公开的形式。在不脱离本发明的精神和范围的情况下,许多修改和改变对于本领域技术人员将显而易见。对实施方案加以选择和描述以最好地解释本发明的原理和它们的实际应用,并且使得本领域其他技术人员能够理解本发明。
Claims (22)
1.一种方法,其包括:
用阳离子型聚胺处理病毒,由此形成包含通过非共价相互作用结合到所述病毒的所述阳离子型聚胺的经处理的病毒;
其中:
i)所述经处理的病毒相比于未经处理的病毒进入活的哺乳动物细胞中的能力和/或在活的哺乳动物细胞内的复制的能力变弱,
ii)所述阳离子型聚胺包含:
多个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′包含至少一个碳和至少一个醇羟基,和
多个式(3a)的带正电荷的仲乙烯亚胺单元:
其中氮的带星号键连接到碳,且是通过非共价缔合与带正电荷的氮结的8个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Thr268(A)、Gly266(A)、Ala267(A)、Thr70(B)、Thr115(B)、Gln248(B)、Leu277(A)和Asp154(A)。模型阳离子型聚胺B3结构并非意在表示实施例中制备的B3的完整结构。模型B3材料具有3个甘露糖基团。
图18是模型阳离子型聚胺B3与DENV-2E蛋白质的有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图19是显示EV71VP1蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸基团的使用MVD软件的计算机绘图:Gln269、Arg267、Glu124、Asn228、Ser275、Ala224和Gly223。
图20是显示模型阳离子型聚胺B3与EV71VP1蛋白质的有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图21是显示HSV-1GD蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸基团的使用MVD软件的计算机绘图:Asp13、Asn15、Arg18、Leu22、Val24、Gln27、Ser8。
图22是显示模型阳离子型聚胺B3与HSV-1GD蛋白质的最有利结合相互作用的使用MVD软件的三维计算机绘图。
图23是显示DENV-3E蛋白质的与模型阳离子型聚胺B3形成氢键的7个氨基酸残基的使用MVD软件的计算机绘图:Thr155(B)、Lys47(B)、Thr274(B)、Ser271(B)、Asn8(B)和Asp98(A)、His27(B)。
合的带负电荷的抗衡离子,并且
iii)所述阳离子型聚胺包含以随机分布排布且头接尾共价连接的N-酰化乙烯亚胺单元和仲乙烯亚胺单元,其中给定乙烯亚胺单元的氮1连接到不同乙烯亚胺单元的碳3。
2.根据权利要求1所述的方法,其中每个K′包含单价单糖部分。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述单糖部分选自由葡萄糖基、半乳糖基和甘露糖基组成的组。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述单糖部分选自由以下组成的组
(α-D-吡喃半乳糖基)、
(α-D-呋喃葡萄糖基)和
(α-D-呋喃甘露糖基)。
5.根据权利要求1所述的方法,其中每个K′包含儿茶酚基团。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述阳离子型聚胺的每个*-C(=O)K′是选自由以下组成的组的独立单价基团:
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述阳离子型聚胺具有一个基本上由所述N-酰化乙烯亚胺单元、所述仲乙烯亚胺单元和聚合物链端基组成的聚合物支链。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述阳离子型聚胺进一步包含具有以下结构的氧化乙烯亚胺单元:
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述病毒是登革热病毒。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述阳离子型聚胺具有多个包含所述N-酰化乙烯亚胺单元、所述仲乙烯亚胺单元和具有以下结构的叔乙烯亚胺单元的聚合物支链
其中是通过非共价缔合与带正电荷的氮结合的带负电荷的抗衡离子。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述阳离子型聚胺在如下过程中形成:所述过程包括用包含K′和/或K′的受保护形式的酰化剂处理支链化聚乙烯亚胺。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述支链化聚乙稀亚胺具有大于1000的数均分子量(Mn)。
13.一种方法,其包括:
用阳离子型聚胺处理活的哺乳动物细胞,由此形成包含通过非共价相互作用结合的所述阳离子型聚胺和所述细胞的经处理的细胞;其中:
i)所述经处理的细胞相比于未经处理的细胞对病毒进入所述经处理的细胞中和/或病毒在所述经处理的细胞内复制具有更高抗性,
ii)所述阳离子型聚胺包含:
多个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′包含至少一个碳和至少一个醇羟基,和
多个式(3a)的带正电荷的仲乙烯亚胺单元:
其中氮的带星号键连接到碳,且是通过非共价缔合与带正电荷的氮结合的带负电荷的抗衡离子,并且
iii)所述阳离子型聚胺包含以随机分布排布且头接尾共价连接的N-酰化乙烯亚胺单元和仲乙烯亚胺单元,其中给定乙烯亚胺单元的氮1连接到不同乙烯亚胺单元的碳3。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述病毒选自由登革热病毒、SARS冠状病毒、基孔肯雅病毒、肠道病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒和其组合组成的组。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述阳离子型聚胺通过干扰所述病毒的胞内体释放来抑制所述病毒进入所述哺乳动物细胞中。
16.根据权利要求13所述的方法,其中所述哺乳动物细胞选自由血细胞、肝细胞、鼻细胞、肺细胞和子宫颈细胞组成的组。
17.一种方法,其包括:
向被病毒感染的患者施用治疗有效量的阳离子型聚胺,由此抑制和/或阻止所述病毒的复制;
其中:
i)所述阳离子型聚胺包含:
多个式(1)的不带电荷的N-酰化乙烯亚胺单元:
其中每个K′包含至少一个碳和至少一个醇羟基,和
多个式(3a)的带正电荷的仲乙烯亚胺单元:
其中氮的带星号键连接到碳,且是通过非共价缔合与带正电荷的氮结合的带负电荷的抗衡离子,并且
ii)所述阳离子型聚胺包含以随机分布排布且头接尾共价连接的N-酰化乙烯亚胺单元和仲乙烯亚胺单元,其中给定乙烯亚胺单元的氮1连接到不同乙烯亚胺单元的碳3。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述阳离子型聚胺作为含水混合物被施用。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述含水混合物通过注射被施用。
20.根据权利要求17所述的方法,其中所述阳离子型聚胺非共价结合到所述病毒,由此阻碍所述病毒进入所述患者的细胞中。
21.根据权利要求17所述的方法,其中所述阳离子型聚胺非共价结合到所述患者的细胞,由此阻碍所述病毒进入所述患者的所述细胞中。
22.根据权利要求17所述的方法,其中所述阳离子型聚胺在治疗有效剂量下是非细胞毒性的。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14/605,228 US9682100B2 (en) | 2015-01-26 | 2015-01-26 | Cationic polyamines for treatment of viruses |
US14/605,228 | 2015-01-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105821005A true CN105821005A (zh) | 2016-08-03 |
Family
ID=56433116
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610055363.4A Pending CN105821005A (zh) | 2015-01-26 | 2016-01-26 | 用于处理病毒的阳离子型聚胺 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9682100B2 (zh) |
CN (1) | CN105821005A (zh) |
SG (1) | SG10201600619WA (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10154956B2 (en) * | 2015-07-28 | 2018-12-18 | Carnegie Mellon University | Methods and compounds to suppress viral genome release and packaging |
US10702572B2 (en) | 2015-07-28 | 2020-07-07 | Carnegie Mellon University | Methods and compounds to suppress viral genome release and packaging |
EP3740229A1 (fr) | 2017-12-07 | 2020-11-25 | Adocia | Solution injectable a ph 7 comprenant au moins une insuline basale dont le pi est compris entre 5,8 et 8,5 et un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes |
DE102019208832A1 (de) * | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Polymere für die Behandlung von Oberflächen |
EP4084785A1 (en) * | 2020-02-21 | 2022-11-09 | Yourchoice Therapeutics, Inc. | Use of nicolsamide formulations for antiviral therapy |
DE102020007116A1 (de) * | 2020-11-21 | 2022-05-25 | Friedrich-Schiller-Universität Jena | Funktionalisierte Polyglycin-Poly(alkylenimin)-Copolymere, deren Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Wirkstoff- und Effektstoff-Formulierungen |
DE102020007115A1 (de) * | 2020-11-21 | 2022-05-25 | Friedrich-Schiller-Universität Jena | Funktionalisierte Polyglycin-Poly(alkylenimin)-Copolymere, deren Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Formulierungen oder zur Komplexierung anionischer Wirkstoffe und Effektstoffe |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140080215A1 (en) * | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Agency For Science, Technology And Research | Branched polyamines for delivery of biologically active materials |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040142474A1 (en) | 2000-09-14 | 2004-07-22 | Expression Genetics, Inc. | Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent |
CN1305932C (zh) | 2002-02-22 | 2007-03-21 | 植入疗法公司 | 碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用 |
WO2005012407A2 (en) | 2003-06-30 | 2005-02-10 | Canji, Inc. | Polymer encapsulation of adenoviruses |
KR100806088B1 (ko) | 2007-08-09 | 2008-02-21 | 고려대학교 산학협력단 | 히알루론산과 폴리에틸렌이민으로 이루어진 양이온성고분자 접합체를 이용한 핵산 전달용 조성물 |
CN101854938B (zh) * | 2007-09-14 | 2013-06-12 | 北卡罗来纳州立大学 | 鉴别反转录病毒感染抑制剂的组合物和方法 |
EP3346005A1 (en) | 2008-01-31 | 2018-07-11 | CureVac AG | Nucleic acids of formula (i) (nuglxmgnnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agent/adjuvant |
US9109087B2 (en) | 2012-09-13 | 2015-08-18 | International Business Machines Corporation | Low molecular weight branched polyamines for delivery of biologically active materials |
JP6438406B2 (ja) | 2012-11-05 | 2018-12-12 | サーモディクス,インコーポレイテッド | 疎水性生理活性物質を送達するための組成物および方法 |
GB2528404A (en) | 2013-03-11 | 2016-01-20 | Univ North Carolina State | Functionalized environmentally benign nanoparticles |
US9399044B2 (en) | 2014-05-28 | 2016-07-26 | International Business Machines Corporation | Antimicrobial cationic polyamines |
-
2015
- 2015-01-26 US US14/605,228 patent/US9682100B2/en active Active
-
2016
- 2016-01-26 CN CN201610055363.4A patent/CN105821005A/zh active Pending
- 2016-01-26 SG SG10201600619WA patent/SG10201600619WA/en unknown
-
2017
- 2017-06-01 US US15/610,692 patent/US10485824B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140080215A1 (en) * | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Agency For Science, Technology And Research | Branched polyamines for delivery of biologically active materials |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
FARIAS: "Effect of ammonium chloride on the multiplication of infectious panacreatic necrosis virus.", 《ARCH. VIROL.》 * |
SPODEN: "Polyethylenimine is a strong inhibitor of human papillomavirus and cytomegalovirus infection.", 《AGENTS CHEMOTHER.》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10485824B2 (en) | 2019-11-26 |
US9682100B2 (en) | 2017-06-20 |
US20160213707A1 (en) | 2016-07-28 |
SG10201600619WA (en) | 2016-08-30 |
US20170266224A1 (en) | 2017-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105821005A (zh) | 用于处理病毒的阳离子型聚胺 | |
Bianculli et al. | Antiviral polymers: past approaches and future possibilities | |
Kumar et al. | Druggable targets of SARS-CoV-2 and treatment opportunities for COVID-19 | |
Soria-Martinez et al. | Prophylactic antiviral activity of sulfated glycomimetic oligomers and polymers | |
Pouyan et al. | Inhibition of Herpes Simplex Virus Type 1 Attachment and Infection by Sulfated Polyglycerols with Different Architectures | |
Andrew et al. | Marine sulfated polysaccharides as potential antiviral drug candidates to treat Corona Virus disease (COVID-19) | |
Sattin et al. | Inhibition of DC-SIGN-mediated HIV infection by a linear trimannoside mimic in a tetravalent presentation | |
Hendricks et al. | Sialylneolacto-N-tetraose c (LSTc)-bearing liposomal decoys capture influenza A virus | |
Danial et al. | Polyvalent side chain peptide–synthetic polymer conjugates as HIV-1 entry inhibitors | |
CN103491982B (zh) | 具有酶敏感性连接的多核苷酸体内递送偶联物 | |
Clayton et al. | Evaluation of the synthesis of sialic acid-PAMAM glycodendrimers without the use of sugar protecting groups, and the anti-HIV-1 properties of these compounds | |
Gambaryan et al. | Polymeric inhibitor of influenza virus attachment protects mice from experimental influenza infection | |
Kuroki et al. | Broad‐Spectrum antiviral peptides and polymers | |
KR102007278B1 (ko) | 바이러스 진단 및 치료를 위한 인지능 물질 및 이의 제조방법 | |
ES2963809T3 (es) | Compuestos virucidas y usos de los mismos | |
Karagozlu et al. | Anti-HIV activities of novel synthetic peptide conjugated chitosan oligomers | |
Ichiyama et al. | Cooperative orthogonal macromolecular assemblies with broad spectrum antiviral activity, high selectivity, and resistance mitigation | |
de M Ribeiro et al. | The role of pharmaceutical nanotechnology in the time of COVID-19 pandemic | |
CA2556032A1 (en) | Site-specific chemical modification of hiv gp41-derived peptides | |
Pachota et al. | Inhibition of herpes simplex viruses by cationic dextran derivatives | |
Flores et al. | Entry inhibitors directed towards glycoprotein gp120: an overview on a promising target for HIV-1 therapy | |
Kimura et al. | Adsorptive inhibition of enveloped viruses and nonenveloped cardioviruses by antiviral lignin produced from sugarcane bagasse via microwave glycerolysis | |
Aderibigbe | Polymeric therapeutic delivery systems for the treatment of infectious diseases | |
R Aghasadeghi et al. | Lamivudine-PEGylated chitosan: A novel effective nanosized antiretroviral agent | |
US20230099027A1 (en) | Virucidal compositions and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160803 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |