CN105815223A - 尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法 - Google Patents

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范春节
曾炳山
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Abstract

尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，包括如下步骤：选取在增殖培养基中生长旺盛的1.5‑2.0cm的芽，放置在生根培养基上生根培养20‑30天，取无菌生根苗的叶片放置在再生诱导培养基中30~40d，将诱导的不定芽转移到不定芽伸长培养基中进行芽伸长培养，15‑20天转接一次，并选择1.5‑2.0cm的不定芽转接到生根培养基中生根诱导。本发明通过优化激素、大量元素及外植体状态等条件，以期建立稳定的、高效的尾细桉叶片再生体系，为尾细桉的细胞育种、基因工程等研究奠定技术基础，该方法不定芽诱导率高，壮苗效果好，生根率高。

Description

尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法
技术领域
本发明涉及桉树培养领域，尤其是涉及尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法。
背景技术
桉树（Eucalyptus）作为我国华南地区第一大造林树种，现有桉树人工林440万公顷（谢耀坚，2011），是华南地区国民经济不可或缺的重要部分，缓解了我国木材能源危机，间接地保护了天然林与生态林，为我国生态文明建设和木材安全保障做出重大贡献。随着栽培面积的不断扩大，出现尺蛾等虫害、青枯病等病害、栽培北移引起的冻害、除草和施肥成本大、特定材质需求等常规育种难以解决的问题。而通过转基因技术将具有特定性状的功能基因转入林木获得具有抗虫、抗旱、抗寒等一个或多个优良性状的林木新品种是植物育种的重要途径之一（施季森, 2000)。而目前植物常用的农杆菌介导法遗传转化体系依赖于高效稳定的再生体系，因此建立起高效稳定再生率的再生体系是桉树转基因新品种获得的先决条件。因此，研究者对赤桉（E. camaldulensis）、巨桉（E.grandis）、蓝桉（E.globulus）、尾叶桉（E.urophylla）等多个桉树的开展了相关研究并初步建立起再生体系（(Ahad et al. , 2014; Matsunaga et al., 2012; 范春节 et al., 2008）。同时部分桉树无性系如巨桉EG5、尾赤桉（E.urophylla×E.camaldulensis）DH201-2、尾巨桉（E.urophylla×E. grandis）DH3229等也初步建立了再生体系(邓艺 et al., 2012; 范春节 et al., 2009; 裘珍飞 et al., 2012; 孙长斌 et al., 2013）。尽管如此，仍然有一些品种或者无性系难以再生，无法建立起有效的再生体系。尾细桉(Eucalyptus urophylla×E.tereticornis)具有速生、制浆得率高，尤其是具有抗风能力强的特点使其成为广东、广西、海南、福建等省、区台风多发地区造林首选树种(彭仕尧 et al., 2013）。在前期开展的尾细桉的叶片离体再生研究中，通过对9个尾细桉无性系的再生研究发现YL02叶片离体培养时能够诱导出不定芽（范春节, 王象军, 裘珍飞, 曾炳山, 刘英 and 李湘阳. (2015). TDZ 对尾细桉叶片离体再生的影响. 热带农业科学 35,37-40.）。尽管如此，仍然发现其存在着再生率低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种建立稳定的、高效的尾细桉叶片再生体系，为尾细桉的细胞育种、基因工程等研究奠定技术基础的尾细桉叶片诱导的植株再生体系以及建立方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，包括如下步骤：切取增殖培养基上生长状态良好的1.5-2.0cm的芽苗，放置在生根培养基上生根培养20-30天，取无菌生根苗的叶片放置在再生诱导培养基中进行再生诱导30~40d，诱导的不定芽转移到不定芽伸长培养基中进行芽伸长培养，15-20天转接一次，并选择1.5-2.0 cm的不定芽转接到生根培养基中生根诱导，其中，生根培养基采用1/2MS培养基、7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖，增殖培养基为B5培养基加入0.20mg/L的6-BA，叶片再生诱导培养基以MS培养基为基础；所述增殖培养基以及再生诱导培养基中均分别含有7.0g/L的琼脂和30/g.L的蔗糖，具体培养条件为：光照时间为16h/8h，光照强度为1500-2000lx，培养温度为25±2℃。
进一步地，所述再生诱导培养基包括TDZ（Thidiazuran，噻苯隆），所述TDZ的浓度为0.005~0.05mg.L-1。
进一步地，再生诱导培养基包括0.05~0.25mg.L-1的NAA（萘乙酸）。
进一步地，再生诱导培养基包括42.5~340mg.L-1的磷酸二氢钾。
优选地，所述再生诱导培养基包括TDZ 0.025 mg.L-1以及NAA0.05 mg.L-1、7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖的含170.0mg.L-1 磷酸二氢钾的MS培养基。
优选地，在生根培养基上生长25天植株的从顶端起第1-4片叶为外植体材料进行不定芽再生诱导。
本发明通过优化激素、大量元素及外植体状态等条件，以期建立稳定的、高效的尾细桉叶片再生体系，为尾细桉的细胞育种、基因工程等研究奠定技术基础，该方法不定芽诱导率高，壮苗效果好，生根率高。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
试验材料为生根培养基上生根培养20-30天的无菌生根苗的叶片。生根培养基采用改良的MS培养基，即1/2MS培养基、7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖。增殖培养基采用改良的B5培养基，即在B5培养基加入0.20mg.L-1的6-BA，叶片再生诱导的基本培养基以改良的MS培养基为基础；在所有的培养基中分别加入7.0g.L-1的琼脂和30.0g.L-1的蔗糖。具体培养条件为：光照时间为16h/8h，光照强度为1500-2000lx，培养温度为25±2℃左右。
在再生诱导基本培养基上分别添加0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05mg.L-1的TDZ（Thidiazuran），每个处理有40-60个叶片外植体，重复3次，分析在再生诱导培养基中添加不同浓度TDZ研究其对尾细桉YL02愈伤组织诱导和植株再生的影响，结果如表1所示：TDZ浓度对不定芽再生率、不定芽诱导个数、愈伤大小存在着显著影响。TDZ浓度为0.005mg.L-1能够诱导植株再生，再生率为18.325%。随着浓度升高，其不定芽诱导再生率升高，同时再生芽个数也逐渐增加。当浓度为0.025mg.L-1时达到最高诱导效率59.41%，同时芽再生个数达到14.14个，此时愈伤组织颜色为红绿色，愈伤组织相对变大。而浓度增加到0.05mg.L-1和0.075mg.L-1时愈伤组织的颜色出现灰白色，不定芽诱导率下降，在0.075mg.L-1时不定芽诱导率仅为0.83%，不定芽数每个外植体仅为2.0个。除此之外，发现在TDZ浓度在不超过0.01mg.L-1时，不定芽能够明显抽高，而在高浓度时发现诱导的不定芽难以抽高。这些说明高浓度的TDZ不仅能够抑制了尾细桉不定芽的诱导，而且能够抑制不定芽的伸长。综合不定芽再生率、再生芽个数等因素，最佳的TDZ浓度为0.025 mg.L-1，因此在后期的实验中都以此浓度为基础。
表1 TDZ对尾细桉叶片诱导再生的影响
以0.025mg.L-1TDZ为基础，分别在再生培养基中添加0.05、0.075、0.1、0.15、0.25mg.L-1的NAA进行叶片再生诱导，结果见图1，结果表明：NAA对尾细桉YL02叶片诱导不定芽再生率影响显著，在施加0.05mg.L-1NAA时获得了最高63.33%的再生率。同时发现在培养基中加入NAA后，不定芽的高度增加，同时再生植株生长健壮。尽管如此，而随着NAA浓度的增加，再生率显著下降。因此，加入0.05mg.L-1NAA能够提高尾细桉YL02的再生率和再生芽的生长状态。
在0.025 mg.L-1TDZ和0.05 mg.L-1NAA为基础，分别施加42.5、85、170、255、340mg.L-1的磷酸二氢钾。如图2所示，不同浓度的磷酸根对尾细桉叶片诱导再生起到显著性影响。在低浓度的磷酸二氢钾时(42.5mg.L-1)，愈伤组织为黄绿色，愈伤致密，有较多的芽点出现，在85.0mg.L-1浓度时，再生率达到50.0%。随着磷酸二氢钾浓度的升高，诱导的不定芽再生率逐渐增加，在添加170 mg.L-1的磷酸二氢钾时，获得了最高65.73%的再生率。而在浓度进一步提高时，其再生率急剧下降，在255.0 mg.L-1和340 mg.L-1时仅有8.3%和3.3%，同时发现愈伤组织出现黄白色、愈伤松散。而在340 mg.L-1的磷酸二氢钾培养基中，有12.5%的叶片出现枯死现象。说明高浓度磷酸二氢钾不仅抑制了不定芽的诱导再生，而且抑制了愈伤组织的诱导。因此在进行不定芽再生诱导时合适的磷酸二氢钾的浓度是170 mg.L-1。
在叶片诱导培养过程中，在生根培养基上培养时间的长短对不定芽的诱导有一定的影响。生根诱导时间不同，叶片生长状态差异较大，时间过短，叶片尚未完全展开、叶片小导致切取叶片操作难度大；而培养时间过长会导致叶片变薄，影响操作。因此选择合适的生根诱导时间非常重要。 在生根诱导培养基上分别培养20天、25天、30天后切取叶片，在前期优化的培养基上进行叶片诱导不定芽再生，结果见图3，发现不同生根培养时间的再生率存在着显著性差异，选择生根培养基上培养25d的植株叶片获得了最高70.28%的不定芽诱导率。而在20d和30d的培养基上分别获得了41.07%和55.5%的再生效率。除此之外还发现以在生根培养基上培养20d植株的叶片为外植体时，诱导的愈伤组织颜色为红褐色，而不同于25d和30d处理时的红绿色。因此认为在进行不定芽诱导时应选择在生根培养基上培养25d的植株叶片进行再生诱导。
在前期的试验中观察发现较厚的、颜色深绿的叶片难以诱导再生出植株，因此推测不同位置的叶片存在着不同的状态，可能会对叶片诱导不定芽的再生有影响，因此在本研究中选择不同部位的叶片进行不定芽诱导再生研究。在生根诱导培养基上培养25天，分别取上部(1-4片叶）、中部（5-8片叶）、下部（8片以下叶片）三个部位叶片进行叶片诱导不定芽再生。结果见图4，表明：不同部位的叶片对不定芽诱导再生起着显著影响，上部的叶片在进行不定芽诱导时，获得了72.69%的不定芽诱导率，而以下部和中部叶片为外植体进行不定芽的诱导时，其诱导再生率为25.39%和37.01%，远低于不上部的叶片。因此需要选择上部的叶片进行不定芽的再生研究。
诱导的不定芽转移到不定芽伸长培养基中进行芽伸长培养，15-20天转接一次。选择2-3 cm的不定芽转接到生根培养基中进行生根诱导培养。
外植体在培养基上培养30d后，调查愈伤组织诱导率、芽再生率、再生芽数、再生芽状态、愈伤组织大小和愈伤颜色等指标。其中愈伤组织的大小分为4种：愈伤组织的直径不超过叶片切面直径2倍的为1；2-4倍时为2；4-10倍以上的为3；超过10倍以上的为4。 愈伤组织诱导率（%）=产生愈伤组织的外植体数/总外植体数×100%；芽再生率（％）=产生芽的外植体数/总外植体数×100%；再生芽数=外植体不定芽总数/产生不定芽外植体个数。数据分析采用SPSS18.0进行分析，显著性分析采用LSD法，α≤0.05为显著性差异。
同时，对叶片诱导再生体系进行观察，结果见图5， 图5中，A:叶片诱导不定芽初期; B: 培养10 d后的叶片; C: 叶片培养25d后的不定芽; D: 叶片培养40d后的不定芽;E: 不定芽增殖; F: 不定芽生根，由图可知，将叶片放置在诱导培养基上培养10 d 后，切口处长出黄白色愈伤组织，结构较为疏松。培养25 d 左右，愈伤组织逐渐膨大，颜色变为黄绿、浅绿色，结构较为紧密，可以看到红绿色芽点。培养40 d 时，愈伤组织开始分化出丛生芽，再生部位主要为叶柄切口，个别伤口也能分化出丛生芽(如图5。
将诱导出不定芽的外植体转移到再生植株伸长培养基上，15天后大量的芽苗抽高（图5-E）。切取2-3cm的芽转移到生根培养基中，14天后获得了85%以上的生根率，且生根苗生长状态良好（图5-F）。
由此可知，本研究通过对植物生长调节剂TDZ、NAA以及大量元素磷酸二氢钾以及植物不同生长状态和生长部位进行优化，发现在mMS（170.0mg.L-1 磷酸二氢钾）+TDZ 0.025mg.L-1+NAA0.05 mg.L-1浓度的培养基，以在生根培养基上生长25天植株的从顶端起第1-4片叶为外植体材料进行不定芽再生诱导能够获得最高的再生效率，建立起以叶片为外植体的尾细桉YL02的遗传再生体系。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。

Claims (6)

1.尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，其特征在于，包括如下步骤：切取增殖培养基上生长状态良好的1.5-2.0cm的芽苗，放置在生根培养基上生根培养20-30天，取无菌生根苗的叶片放置在再生诱导培养基中进行再生诱导30~40d，诱导的不定芽转移到不定芽伸长培养基中进行芽伸长培养，15-20天转接一次，并选择1.5-2.0 cm的不定芽转接到生根培养基中生根诱导，生根培养基采用1/2MS培养基、7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖，增殖培养基为B5培养基加入0.20mg/L的6-BA，叶片再生诱导培养基以MS培养基为基础；所述增殖培养基以及再生诱导培养基中均分别含有7.0g/L的琼脂和30/g.L的蔗糖，具体培养条件为：光照时间为16h/8h，光照强度为1500-2000lx，培养温度为25±2℃。
2.根据权利要求1所述的尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，其特征在于，所述再生诱导培养基包括TDZ，所述TDZ的浓度为0.005~0.05mg.L-1。
3.根据权利要求1所述的尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，其特征在于，再生诱导培养基包括0.05~0.25mg.L-1的NAA。
4.根据权利要求1所述的尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，其特征在于，再生诱导培养基包括42.5~340mg.L-1的磷酸二氢钾。
5.根据权利要求1所述的尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，其特征在于，所述再生诱导培养基包括TDZ 0.025 mg.L-1以及NAA0.05 mg.L-1、7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖的含170.0mg.L-1 磷酸二氢钾的MS培养基。
6.根据权利要求1所述的尾细桉叶片诱导的植株再生体系建立方法，其特征在于，在生根培养基上生长25天植株的从顶端起第1-4片叶为外植体材料进行不定芽再生诱导。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104285814A (zh) * 2014-10-29 2015-01-21 广西壮族自治区国有东门林场 一种尾巨桉dh32-43品种的组培快繁方法
CN105379624A (zh) * 2015-12-10 2016-03-09 广西壮族自治区国有东门林场 一种粗皮桉的组培快繁方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104285814A (zh) * 2014-10-29 2015-01-21 广西壮族自治区国有东门林场 一种尾巨桉dh32-43品种的组培快繁方法
CN105379624A (zh) * 2015-12-10 2016-03-09 广西壮族自治区国有东门林场 一种粗皮桉的组培快繁方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范春节等: "TDZ对尾细桉叶片离体再生的影响", 《热带农业科学》 *
邓艺等: "巨桉无性系EG5 叶片高效再生体系的建立", 《林业科学研究》 *

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