CN105803098B - 一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU及其应用，申请人利用来自不同育成年代、国内外遗传差异较大的370份硫甙含量不同的油菜组成的关联群体，结合基因型数据及硫甙含量表型数据进行全基因组关联分析，获得了贡献率达到77.18%的单体型BnHapGLU。本发明提高了选择效率，单体型BnHapGLU位点贡献率大，检测方便快速，可快速筛选出硫甙含量高、低单株或者株系用于不同硫甙含量的油菜育种，育种选择目标明确，节约了成本。

Description

一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU及其应用
技术领域
本发明涉及遗传育种和分子生物学技术领域。具体涉及一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU及其应用。
背景技术
油菜是世界上三大油料作物之一，全世界大约13％的植物油来自于油菜。除此之外，油菜也是重要的植物蛋白来源，还是重要的潜在能源作物。作为植物食用油，油菜以实现―双低、三高、两化”(低芥酸、低硫甙，高产、高抗、高效，产业化和机械化)为首要目标；作为能源作物，油菜除了―三高”和“两化”外还追求以高不饱和脂肪酸(高亚油酸、高亚麻酸和高芥酸等)为主要目标。但是当前国际市场油菜籽供需矛盾尖锐，加拿大和法国等油菜主要出口国都基本实现了从播种到收获的全程机械化，生产成本低，菜籽的含油量也普遍比我国长江流域及黄淮冬油菜区高2-3个百分点，低投入的生产和高含油量的籽粒抵消了长途运输的成本，严重冲击我国油菜产业的发展(李加纳.我国油菜生产加工现状、面临的挑战及对策[M].北京:中国农业出版社，2002，27–31)，因此，加快我国油菜育种进程，提高我国油菜生产水平，提升国际竞争力已迫在眉睫。
硫甙葡萄糖苷(简称硫甙，Glucosinolate)是广泛存在于芸薹科植物根、茎、叶、种子中的一类含硫的阴离子亲水性次生代谢产物(Barbara AH，Jonathan G.Biology andbiochemist ry of glucosinolates.Annu Rev Plant Biol，2006，57:303-333)，尤其是在芸薹属植物中含量较高。菜籽中硫甙含有的种类主要有3-丁烯基硫甙、4-戊烯基硫、2-羟-3-丁烯基硫甙、2-羟-4-戊烯基硫甙、3-吲哚-甲基硫甙、1-甲基-3-吲哚硫甙等，在成熟的油菜籽中，硫甙主要存在于种胚中(卿中全，于炎湖.“双低”菜籽粕的营养价值评价(二)[J].粮食与饲料工业.1999年，第7期：29-31)，是油菜等芸薹科植物中的主要活性成分，决定着植物的风味和营养品质(廖永翠.白菜类作物硫代葡萄糖甙结构和含量分析及QTL定位[D].硕士学位论文，西南大学，重庆，2011)。菜籽饼和菜籽粕中的粗蛋白质含量较高，可作为畜禽的饲料，但是目前较多的研究认为过高的硫甙菜籽饼和菜籽粕作为饲料会对畜禽会产生危害，硫甙本身无毒，但是其降解产物，如噁唑烷硫酮(OZT)、硫氰酸酯、异硫氰酸酯等会破坏动物皮肤、粘膜和消化器官表面，且引起畜禽的肝、肾及甲状腺肿大，而且还会妨碍动物的生长，而低硫甙含量的菜籽粕危害较轻(Busato A，et al.Effect of feeding rapeseedmeal o n liver and thyroid gland function and histomorphology in growingpigs.J AnimPhysiolAn imNutr，1991，66：12-27；Slominski B A and Campbell LD.Influence of indoleglucosin olate on the nutritive quality of canolameal.Proc 8th Int Rapeseed Congress，1991，396-401)。但是硫甙的功能也有其有益的方面：(1)芥子甙也是一种常见的硫甙，芥子甙可以在芥子酶的作用下水解生成芥子油，芥子油具有一定程度挥发性，与皮肤接触时产生了发红剂和抗刺激剂的功效，达到止痛和消炎作用；(2)植物防御反应，硫甙及其水解产物在植物防御昆虫侵犯和食植昆虫的寄主植物定位等方面都发挥了极其重要作用(Agrawal A A，Kurashige N S.A role forisothiocyanates in plant resistance against the specialist herbivorepierisrapae[J].Chem.Eco1,2003,29(1):1403-1415；Wittstock U，et al.Successfulherbivore attack due to metabolic diversion of a plant chemical defense[J].PNAS.USA,2004,101(1):4859-4864)，根部的硫甙可以捕获根肿病菌，轮作高硫甙品种植物与芸薹科植物可以减少根肿菌对后期种植的芸薹科植物的危害(李铭.芸薹根肿菌寄主范围及硫甙葡萄糖苷与其侵染的关系研究[D].硕士学位论文.华中农业大学，武汉，2012)；(3)抗癌作用，大量动物和人体试验结果表明饮食中摄入的硫甙能抑制肿瘤和癌细胞细胞的形成(Stoewsand G S,Anderson J L,Munson L.Protective effect of dietarybrussels sprouts against mammary carcinogenesis in SpragneDawley rats[J].Cancer Lett,1988,39(1):199-207；Maniei L M,Lazzeri L,Palmieri S.In vitrofungitoxic activity of some glucosinolates and their enzyme derived productstoward plant pathogenic funsi[J].Ac.Food Chem,1997,45(1):2768-2773)。因此如何克服过量硫甙及其水解产物对动物和人体造成的不利影响，充分发挥其在植物防御反应及抗癌等药物领域的优势具有重要的意义。
除了上述在硫甙的生物学特性方面取得了较好的研究进展外，硫甙作为一类重要的次生代谢产物，在其测定方法研究方面也取得的巨大进展。常用到硫甙鉴定方法有分离测定酶解和化学分解产物的方法，如纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法(GasChromatography，GC)、气质(GC-MS)联用、高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography，HPLC)。将硫甙这种代谢物鉴定出来以后，还需要对其进行定量分析，如纸色谱法、高压电泳和等速电泳、薄层色谱法、GC法、GC-MS联用、HPLC法、核磁共振法等。目前，随着色谱技术和其他相关技术的发展，许多新方法相继被提出，如膜在测定硫甙方面的应用、对硫甙酶解产物的测定、酶联免疫吸附(ELISA)测定硫甙、使用碱降解产物测定硫甙、GC-MS法分离鉴定硫甙、离子对液相色谱和亲水作用液相色谱的应用等。但是以上的测定方法都是基于对特定组织或者成熟的油菜籽中已产生成熟的硫甙含量的测定。在油菜的分子遗传育种，利用分子标记技术可以根据基因型信息提前鉴定后期硫甙的含量，可于苗期就能对特定的单株或株系进行筛选，大大减少其人力、物力和财力。
分子标记辅助选择(MAS，marker—assisted selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，是在基因克隆或定位的基础上，借助目标基因本身或与之紧密连锁的分子标记可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择(朱玉君，樊叶杨，黄得润，庄杰云等.分子标记辅助选择在水稻育种中的应用[J].核农学报，2012，26(5):756-761)。目前，分子标记辅助选择技术主要应用在基因聚合(Gene pyramiding)、基因渗入(Gene transgression)、根据育种计划构建基因系等方面。具有以下优点：(1)可以同时对多个基因为目标进行材料筛选，将多个基因聚合到同一个材料内，使其得到优化；(2)可以根据基因型信息提前对目标性状进行筛选，减少后期工作量；(3)延迟对目标性状的鉴定，比如在对多种病虫害的抗性进行鉴定时，因某些病虫害的危害或者环境原因导致植物死亡或种子绝收，难以进行同时鉴定，且可能造成丧失在其他性状上具有优异表现的材料，这时如果采用分子标记则可先鉴定多个性状的目标基因，待收种后或下一代再分类进行表型验证。
连锁不平衡(Linkage disequilibriuln，LD)指的是不同基因座位上等位基因的非随机性组合。关联分析(Association analysis)是在植物数量性状研究和植物育种中应用的一种较新的分析方法。它以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系(Mackay I，Powell W.Methods for linkage disequllibrium mapping incrops[J].Trends Plant Sci，2007，12:57-63)。与重组群体比较(杨小红等.植物数量性状关联分析研究进展[J].作物学报，2007,33(4):523-530)，它的显著优点是高通量，即能在全基因组范围有效地检测大量的具有不同遗传背景的种质资源材料的性状控制基因位点或区域；除高通量优点外，由于全基因组关联分析一般是以现有的自然群体为材料，所以比一般的重组群体花费的时间要少很多；同时，精度高，可达到单基因的水平。
连锁不平衡的衰减距离(LD decay)决定了进行全基因组范围的关联分析时所需标记的数目以及精确度，自然群体中的LD水平一定程度上决定了全基因组关联分析的分辨率(Michael D，et al.Genetic properties of the maize nested association mappingpopulation[J].Science，2009，737:325)。位点之间的等位基因频率的大小和重组率会影响连锁不平衡的水平，所以在群体中的自然突变、重组、亚群体结构、人工选择的压力、以及遗传漂变等都会影响连锁不平衡(LD)的结构(Gupta PK,et al,Linkage disequilibriumand association in higher plants:present status and future prospects[J].PlantMolBiol,2005,57,461-485)。在进行全基因组关联分析时，群体中的亚群结构和材料之间亲缘关系使得整个关联群体的连锁不平衡程度增强，这可能会产生假阳性的结果。所以，在进行关联分析前有必要对群体结构和亲缘关系进行分析，并且要以群体结构和亲缘关系作为协变量可以有效地减少假阳性标记的产生。
单体型(Haplotype)是位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。同一染色体上的连锁不平衡的多个分子标记的情况即为单体型。而油菜籽中的硫甙含量属于简单的数量性状，开发鉴定特定硫甙相关的单体型即可于苗期对该植株和油菜籽中的硫甙含量进行初步鉴定。
本研究利用370份油菜品种组成的关联群体及其三年两点共五个环境下的硫甙含量表型数据，通过高密度SNP芯片对群体材料进行基因分型，对硫甙含量进行了全基因组关联分析，旨在定位筛选出油菜硫甙含量相关的分子标记，并构建单体型，用于油菜硫甙含量的分子标记辅助选择、分子育种及硫甙含量相关基因的克隆。
发明内容
本发明目的在于提供了一种鉴定油菜硫甙含量性状的单体型BnHapGLU，所述的单体型BnHapGLU由三个SNP分子标记构成，分别为Bn-A09-p3053860，Bn-A09-p3029767和Bn-A09-p3051349。所述的Bn-A09-p3053860对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示；所述的Bn-A09-p3029767对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；所述的Bn-A09-p3051349对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明的还有一个目的在于提供了一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU在油菜硫甙含量性状育种中的应用。这个单体型可以在油菜生长的任何时期快速鉴定油菜籽的硫甙含量，为分子标记辅助选择提供重要的依据，同时为今后硫甙相关基因的克隆提供了一定的基础。
本发明的另一个目的在于提供了基于单体型BnHapGLU三个SNP位点设计的引物或探针，优选的，其引物分别为：Bn-A09-p3053860：TAATTTTAAAGAAAGAATATGTGCC，CAAACTTTGACAGCTGGCA；Bn-A09-p3029767：CGGAGTATTAGAGTTAGGAA，GACATATTTTCTGATCATAGTTTGG；Bn-A09-p3051349：CAAATACATATCAACAGGAATG，TAACTAGTAGCGACCAGACC。优选的，其探针分别为：Bn-A09-p3053860的探针序列为：TTGTAATAAAATTTTCAAAAAGGTAATTTTAAAGAAAGAATATGTGCCAG；Bn-A09-p3029767的探针序列为：ATTATCCGGACGGAGTATTAGAGTTAGGAATTTTTGCATTAATCCGAACC；Bn-A09-p3051349的探针序列为：AGCAACAAATGAAACTATATATTAACTACTAACTAGTAGCGACCAGACCT。
本发明的最后一个目的在于提供了基于单体型BnHapGLU三个SNP位点设计的引物或探针在油菜硫甙含量性状育种中的应用。利用本发明提供的引物或探针，可对单体型BnHapGLU的类型进行鉴定，快速，准确，简单。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU的获得：
a)利用收集来自全世界主要油菜生产国的共370份甘蓝型油菜构建关联群体；
b)采用CTAB方法提取叶片总DNA(Doyle J.A rapid DNA isolation procedurefor small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin，1987，19，11-15)提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，用60KSNP芯片对群体的DNA进行SNP分型检测。c)通过对芯片质量进行检测和高质量SNP的筛选，具体标准为：call frequency≥85％，MAF≥0.05，cluster separation scored≥0.4，heterozygosity≤0.15。并将挑选出来的SNP的source序列与基因组(ChalhoubB，et al.Early allopolyploid evolution in thepost-Neolithic Bras sica napus oilseed genome.Science345，950-3(2014))进行比对，获得位置唯一的高质量SNP数据集。d)利用Structure和Tassel软件进行群体结构和亲缘关系分析，得到Q和K矩阵，用于后续的全基因组关联分析。e)待成熟时收集关联群体材料的种子进行近红外测定，测定种子中的硫甙含量。f)结合基因型和硫甙含量表型数据，在Tassel软件中进行全基因组关联分析，鉴定硫甙含量显著相关的位点，并得到与硫甙含量紧密相关的连锁的SNP，然后根据相关位点的基因型数据构建单体型BnHapGLU。
利用上述技术措施，发明人最终获得了与硫甙含量性状相关的多个显著相关的SNP位点并将最显著、贡献值大的三个SNP构建成了一个单体型BnHapGLU，具体如下：该单体型BnHapGLU，位于A09染色体，由SNP标记Bn-A09-p3053860、Bn-A09-p3029767和Bn-A09-p3051349共同构成，它们紧密连锁，其中所述的Bn-A09-p3053860对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述的Bn-A09-p3029767对应的包含SNP的序列为SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示；所述的Bn-A09-p3051349对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。利用Tassel 5.0软件分析测得三个SNP与硫甙含量性状极显著相关(P值分别为3.29×10-20、3.60×10-20、3.60×10-20，贡献率分别为：27.71％、27.60％和27.60％)，三个SNP构成单体型BnHapGLU贡献率达到77.18％。
本发明的保护内容还包括基于单体型BnHapGLU对应的包含SNP的序列中的SNP设计的引物或探针，优选的，针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的snp设计的引物为：
Bn-A09-p3053860：TAATTTTAAAGAAAGAATATGTGCC，CAAACTTTGACAGCTGGCA；
Bn-A09-p3029767：CGGAGTATTAGAGTTAGGAA，GACATATTTTCTGATCATAGTTTGG；
Bn-A09-p3051349：CAAATACATATCAACAGGAATG，TAACTAGTAGCGACCAGACC。
优选的，针对硫甙含量单体型BnHapGLU包含的SNP序列设计的探针为：
Bn-A09-p3053860的探针序列为：TTGTAATAAAATTTTCAAAAAGGTAATTTTAAAGAAAGAATATGTGCCAG；
Bn-A09-p3029767的探针序列为：ATTATCCGGACGGAGTATTAGAGTTAGGAATTTTTGCATTAATCCGAACC；
Bn-A09-p3051349的探针序列为：AGCAACAAATGAAACTATATATTAACTACTAACTAGTAGCGACCAGACCT。
硫甙含量单体型BnHapGLU或基于其SNP位点设计的引物或探针在油菜分子遗传育种中的应用，包括但不限于利用现有技术的常规方式，对待检测油菜DNA进行测序，确定是属于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的哪一种，以确定其基因型。或是利用SNP分子标记引物或探针对甘蓝型油菜DNA进行PCR扩增，来快速判断SNP位点情况，以确定基因型。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明利用全基因组关联分析方法定位了油菜中的1个影响硫甙含量性状的单体型BnHapGLU，它对油菜硫甙含量状的贡献率达到77.18％，为油菜硫甙含量性状的QTL中贡献率最高。在传统育种方法中，硫甙含量的测定要等到收获油菜籽时才能测定，且受环境影响较大。因此加大了高低硫甙育种的时间和成本。通过检测硫甙含量性状的单体型BnHapGLU，可以在苗期进行淘汰不符合育种家意愿的单株或株系，不仅节约了生产成本而且大大提高了选择效率。本发明中硫甙含量单体型BnHapGLU的位点位置明确，检测方便快速，不受环境影响，贡献率大。通过检测与硫甙含量性状相关的SNP标记即可以预测硫甙含量的高低，进而可以快速筛选出不同用途的高、低硫甙含量的油菜单株或株系，辅助育种选择目标明确，节约了育种成本。
附图说明
图1是关联群体的三年两点共5个环境下的硫甙含量经过最优线性无偏估计(BLUP)处理后的表型频率分布图。
结果表明硫甙含量表现分布呈连续性分布，但变异分布不呈正态分布，证明硫甙含量性状属于简单的数量性状，且存在主效基因位点。
图2是群体结构分析结果。
其中A：Ln(D)值在K＝1-10上的分布；B：△K在K＝2-9的分布，结果表明关联群体划分为三个亚群最为合理。
图3是关联群体亲缘关系的分布图。
结果表明整个群体的材料之间的亲缘关系较弱，适用于全基因组关联分析的研究。
图4是硫甙含量全基因组关联分析结果的曼哈顿图。
横坐标的表示不同的染色体上按位置顺序排列的SNP，纵坐标为SNP的-log10(P)值，横线代表显著性水平的阈值(-log10(P)＝6.34)，横线上的点代表与硫甙含量显著相关的SNP。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。本发明所用试剂和方法如未特别说明，均来源于商业渠道，所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
实施例1.关联群体的硫甙含量的测定
本实施例中使用的群体为来自世界主要油菜生产国的370份甘蓝型油菜材料。三年两点共五个环境的硫甙含量的测定均使用近红外扫描油菜籽获得。多年多点的数据使用最优线性无偏估计(BLUP)进行处理，得到硫甙的遗传率为：97.4％，表明硫甙含量的高低主要受遗传因子决定。关联群体的硫甙含量分布结果表明硫甙含量性状表现分布呈连续性分布，但变异分布不呈正态分布，证明硫甙含量性状属于简单的数量性状且存在主效基因位点(见图1)。
本研究中所用的关联群体由来自不同育成年代、国内外遗传差异较大的370份甘蓝型油菜构成，其中国内材料共295份，主要来自湖北、湖南、陕西、江苏等地，国外材料75份，主要来自法国、澳大利亚、日本和瑞典等国家。进行了三年两点共五个环境的硫甙含量表型的考察，硫甙含量的测定近红外扫描获得，植物叶片总DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳和DNA浓度的测定等均为常用的分子生物学技术，实验过程中涉及的所有试剂均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例2.关联群体叶片总DNA的提取
使用CTAB法提取关联群体叶片总DNA(Doyle J.A rapid DNA isolationprocedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，19，11-15)，具体方法为：
a)将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨至粉末状，装入2mL离心管中；
b)加入预热DNA提取液700μL；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；
c)加入700μL混合液(苯酚:氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀10min；室温下，10 000×g离心15min；
d)吸取上清液至新的2mL离心管中；加入等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000×g，离心15min，用枪吸取上清液到新的离心管中；
e)加入2倍体积无水乙醇，混匀后在–20℃静置1h，10000×g，离心10min，弃上清液；再加入500μL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2次洗涤沉淀后，晾干；
f)加入含有2％RNase A溶液100μL，在37℃静置1h后4℃过夜；用等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提DNA溶液，颠倒混匀，静置10min，10000×g，离心15或20min，去除RNase A，吸取上清液(约60μL)，再次离心，1min；
g)利用琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测DNA浓度、质量及完整性；
h)确定所有DNA样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。检测浓度合格后后于-20℃冰箱中保存备用。并利用60K SNP芯片对材料DNA进行基因分型。
实施例3.关联群体群体结构和亲缘关系分析
由于群体中如果存在较为明显群体结构和较近的亲缘关系有可能会对关联分析结果产生假阳性的SNP，所以在进行硫甙含量的全基因组关联分析时有必要进行群体结构及亲缘关系分析。群体结构分析使用Structure 2.3软件进行，结果表明关联群体分为三个亚群(图2)。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值。运用Tassel5.0软件进行亲缘关系(relative kinship)的评估，计算出亲缘关系值的矩阵(K矩阵)。结果表明：该群体材料之间的亲缘关系总平均值为0.1077(图3)，其中发现亲缘关系为0的为58.04％，亲缘关系为0-0.05的为7.87％，这些结果表明整个群体的材料之间的亲缘关系较弱。
实施例4.硫甙含量性状的全基因组关联分析及单体型BnHapGLU的构建
在获得硫甙含量表型及基因型数据后，在Tassel 5.0软件中运用混合线性模型(MLM)中的Q+K模型进行全基因组关联分析。结果(图4)显示在A09和C02两条染色体上检测到显著相关的峰值(p<4.57×10-7)，共检测到25个SNP，表型贡献率为：9.11-29.65％。将A09上最显著的三个紧密连锁的SNP(Bn-A09-p3053860、Bn-A09-p3029767和Bn-A09-p3051349)构建为单体型BnHapGLU，其中所述的Bn-A09-p3053860对应的包含SNP的序列为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示；所述的Bn-A09-p3029767对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；所述的Bn-A09-p3051349对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示。
针对Bn-A09-p3053860、Bn-A09-p3029767和Bn-A09-p3051349三个SNP分子标记设计引物如下：
Bn-A09-p3053860：TAATTTTAAAGAAAGAATATGTGCC，CAAACTTTGACAGCTGGCA；
Bn-A09-p3029767：CGGAGTATTAGAGTTAGGAA，GACATATTTTCTGATCATAGTTTGG；
Bn-A09-p3051349：CAAATACATATCAACAGGAATG，TAACTAGTAGCGACCAGACC。
最终370份甘蓝型油菜，通过检测，BnHapGLU的单体型类型共分为三种(表1)，当BnHapGLU的基因型为AA_GG_AA时，硫甙平均含量104.64umol/g，当BnHapGLU的基因型为AC_AG_AG时，硫甙平均含量为96.47umol/g，而当基因型CC_AA_GG时，硫甙平均含量为38.87umol/g，运用ANOVA计算单体型BnHapGLU对硫甙含量的贡献率达到77.18％。
因此，可通过单体型的类型，对待检测甘蓝型油菜硫甙含量进行预先评估，以加快育种速度。
表1 BnHapGLU的单体型类型及表型数据统计
实施例5.：
单体型BnHapGLU或基于其SNP分子标记设计的引物在油菜高低硫甙含量育种中的应用：
对中双10号、09BB193U和中双4号这三个材料在苗期分别取叶片提取DNA，利用BnHapGLU的三个SNP标记的引物序列(引物序列见实施例4)进行分子鉴定，并于后期成熟时测量种子中的硫甙含量。
结果表明：三个材料的单体型BnHapGLU都为CC_AA_GG，根据表1的结果视为低硫甙含量材料；后期成熟时检测得到种子中硫甙含量分别为34.04umol/g、22.64umol/g和24.63umol/g，与单体型检测判断相符。
用相同方对中油821、81074和07M809的单体型BnHapGLU进行检测，检测结果这三种材料的单体型BnHapGLU类型都为AA_GG_AA，根据表1的结果视为高硫甙含量材料；后期成熟时检测得到种子种硫甙含量分别为103.33umol/g、149.6519umol/g和142.51umol/g，与单体型检测判断相符。
说明分子标记筛选能在苗期根据单体型的基因型有效地初步鉴定硫甙含量。通过鉴定上述单体型BnHapGLU来预测油菜籽中硫甙的含量的高低，在苗期进行淘汰即可进行单株或株系的淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，可迅速提高油菜高、低硫甙品种的育种进程。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU的开发及其应用
<130> 一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU的开发及其应用
<160> 15
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaacttaca ttgtaataaa attttcaaaa aggtaatttt aaagaaagaa tatgtgccag 60
atgtcaaagt ttgtgtttat aatttttttt actttattat aaacataaaa traaatataa 120
a 121
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaacttaca ttgtaataaa attttcaaaa aggtaatttt aaagaaagaa tatgtgccag 60
ctgtcaaagt ttgtgtttat aatttttttt actttattat aaacataaaa traaatataa 120
a 121
<210> 3
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgttataaaa attatccgga cggagtatta gagttaggaa tttttgcatt aatccgaacc 60
aaaatccaaa ctatgatcag aaaatatgtc aaattagtta aatttattat ttttgtacac 120
a 121
<210> 4
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgttataaaa attatccgga cggagtatta gagttaggaa tttttgcatt aatccgaacc 60
gaaatccaaa ctatgatcag aaaatatgtc aaattagtta aatttattat ttttgtacac 120
a 121
<210> 5
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agttagaact amcaaataca tatcaacagg aatgtaagat tatatattgg cgtacaagtt 60
aaggtctggt cgctactagt tagtagttaa tatatagttt catttgttgc ttttaagagt 120
t 121
<210> 6
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agttagaact amcaaataca tatcaacagg aatgtaagat tatatattgg cgtacaagtt 60
gaggtctggt cgctactagt tagtagttaa tatatagttt catttgttgc ttttaagagt 120
t 121
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taattttaaa gaaagaatat gtgcc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caaactttga cagctggca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggagtatta gagttaggaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacatatttt ctgatcatag tttgg 25
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caaatacata tcaacaggaa tg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
taactagtag cgaccagacc 20
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttgtaataaa attttcaaaa aggtaatttt aaagaaagaa tatgtgccag 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
attatccgga cggagtatta gagttaggaa tttttgcatt aatccgaacc 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agcaacaaat gaaactatat attaactact aactagtagc gaccagacct 50

Claims (3)

1.一种鉴定油菜硫甙含量的单体型BnHapGLU在油菜硫甙含量性状育种中的应用，所述的单体型BnHapGLU包括三个SNP分子标记，分别为：Bn-A09-p3053860，Bn-A09-p3029767和Bn-A09-p3051349；
所述的Bn-A09-p3053860对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
所述的Bn-A09-p3029767对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；
所述的Bn-A09-p3051349对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
2.检测权利要求1中所述的单体型BnHapGLU对应的SNP的序列的引物组在油菜硫甙含量性状育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的的引物组为：
Bn-A09-p3053860的引物对为：TAATTTTAAAGAAAGAATATGTGCC和CAAACTTTGACAGCTGGCA；
Bn-A09-p3029767的引物对为：CGGAGTATTAGAGTTAGGAA和GACATATTTTCTGATCATAGTTTGG；
Bn-A09-p3051349的引物对为：CAAATACATATCAACAGGAATG和TAACTAGTAGCGACCAGACC。
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