CN105803038A - 一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法及其应用 - Google Patents

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CN105803038A CN201610232147.2A CN201610232147A CN105803038A CN 105803038 A CN105803038 A CN 105803038A CN 201610232147 A CN201610232147 A CN 201610232147A CN 105803038 A CN105803038 A CN 105803038A
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Abstract

本发明公开了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。本发明还公开了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法在检测藤黄酸心脏毒性的应用。本发明具有低浓度、快速、高通量、低成本、高准确性的特点。

Description

一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物毒性检测领域，具体涉及一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法及其应用。
背景技术
现今心血管疾病的防治卓有成效，癌症成为了医学界的首要难题。肿瘤患者在化疗治疗过程中却冒着心血管病情恶化的风险。过去肿瘤疾病极大地缩小了患者的寿命，以致人们忽略了心脏并发症。现在早期诊断和治疗的介入、靶向药物的发现和使用，使得由癌症治疗引起的心脏毒性成为重点关注问题。蒽环类药物如阿霉素(Doxorubicin，Dox)和柔红霉素等，对心肌的主要毒性反应的细胞表征为诱导细胞死亡，线粒体DNA损伤，线粒体功能失常以及胞内钙稳态失衡。蒽环类药物在临床使用中因出现严重心脏毒性反应而被撤市或限制使用。ABL抑制剂如伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼等通过激活内质网的压力反应诱导心肌细胞凋亡。另一类产生心脏毒性的药物为治疗心脏疾病的药物，如第三类治疗心律失常药盐酸胺碘酮(Amiodarone，Ami)，已被FDA列入心脏毒性的名单中。因此药物的临床前心脏毒性安全性评价及预测不仅减少不必要的经济和资源的浪费，而且也可为安全用药提供实验数据支持。
藤黄(Gamboge)为藤黄科植物藤黄树(GarciniahanbaryiHook.f.)分泌的干燥树脂，其中藤黄酸是其主要有效成分。藤黄酸已被开发为一种广谱抗肿瘤药，对多种肿瘤有显著疗效，如对人肝癌细胞株的增殖有明显的抑制作用，还可明显抑制胃腺癌细胞株的增殖。藤黄酸可通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进程、抑制癌细胞转移和抑制血管生成等多方面机制达到抗癌效果。现有安全性评价研究表明，藤黄酸具有肾毒性和肝毒性。藤黄酸为具潜力的抗癌药物，其心脏毒性的评价也是必要的。
心脏毒性可以发展为急性、亚急性和慢性疾病。临床上急性和亚急性心脏毒性的特点为心室负极化的异常表现、QT间期延长、室上性以及室性心律失常。慢性心脏毒性表现为心脏无症状收缩和左心室舒张功能异常。细胞水平的急性心脏毒性则表现为心肌细胞迅速死亡。但是在较温和的环境刺激下形成的早期应答反应是胞内钙稳态的失衡，但这个过程是可逆的。如果心脏受到长期的毒性刺激，则诱发心肌肥厚，进而导致不可逆的心肌病，最终将使患者心力衰竭。心力衰竭是心肌细胞大量死亡造成的结果，其中包括细胞凋亡和坏死。导致心肌死亡的分子通路有很多，包括细胞因子的活化、线粒体诱导细胞凋亡、胞内Ca2+超载及MAPK的活化等通路。心脏毒素以多种方式影响心肌细胞行为和表型，包括干扰线粒体呼吸、细胞膜通透性以及诱发细胞死亡通路。为了同时检测多种毒性指标，高内涵提供了一个灵敏精确的方法来检测这些指标在细胞表型的微弱变化。但是这些变化却不被电生理或其他传统的体外方法所发现。虽然体内模型仍然是最被广泛认可的检测方法，但是存在低通量，高投入的弊端，并且对人体的生理反应的预测能力有限，这导致动物模型在毒理学研究中的应用减少，而高内涵细胞影像技术则越来越被重视和应用。此外，以细胞活力、线粒体完整性及活性氧的生成量为指标的高内涵检测方法等都得到了业界的认可和应用。
发明内容
基于上述现有技术中存在的问题，本发明设计开发了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，目的是通过高内涵检测技术应用于心脏毒性的评价，基于细胞表型心脏毒性多指标同步量化表征方法，在保持细胞结构和功能完整的前提下同时对多个指标进行检测，具有低浓度、快速、高通量、低成本、高准确性的特点。
本发明还设计开发了一种基于细胞表型的高内涵多指标心脏毒性的检测方法的应用，针对藤黄酸在心脏毒性检测的应用，从而为更为快速、准确、经济、有效的评价广谱抗癌药藤黄酸的心脏毒性，并且对其用药安全性提供更多的可能。
本发明提供的技术方案为：
一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。
优选的是，所述待测药物包括：阿霉素、胺碘酮及次乌头碱，计算在检测浓度为0.014～10μmol·L-1范围内对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响。
优选的是，所述待测药物样本用二甲基亚砜溶解并配成10mmol·L-1的母液，配置于离心管中，-20℃密封保存，细胞给药时用DMEM高糖培养基溶解稀释。
优选的是，所述细胞为H9c2细胞，其用含10％胎牛血清、含青霉素100kU·L-1、链霉素100mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培养基培养，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中，隔天弃去原培养基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化传代。
优选的是，所述荧光分子探针为Hoechst33342或MitotrackerDeepRedFM，所述钙离子荧光探针为Rhod2AM或Fluo4AM；在所述成像分析时，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，或者使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像。
优选的是，检测所述药物对细胞的影响时，针对阿霉素及胺碘酮，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，针对次乌头碱，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
优选的是，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入所述待测药物，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Fluo4AM或Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min；对阿霉素及胺碘酮使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，对次乌头碱使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，通过选择计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法在检测藤黄酸心脏毒性的应用，检测藤黄酸的浓度0.014～10μmol·L-1。
优选的是，针对藤黄酸，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
优选的是，在检测过程中，以高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入藤黄酸，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
附图说明
图1为阿霉素及胺碘酮的高内涵代表图像。
图2-A1为胺碘酮对细胞存活率变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-A2为胺碘酮对细胞核面积变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-A3为胺碘酮对线粒体质量变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-A4为胺碘酮对细胞内钙离子浓度变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-B1为阿霉素对细胞存活率变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-B2为阿霉素对细胞核面积变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-B3为阿霉素对线粒体质量变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图2-B4为阿霉素对细胞内钙离子浓度变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图3为次乌头碱的高内涵代表图像。
图4-A1为次乌头碱对细胞存活率变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图4-A2为次乌头碱对细胞核面积变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图4-A3为次乌头碱对细胞内钙离子浓度变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图4-A4为次乌头碱对线粒体面积变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图4-A5为次乌头碱对线粒体纹理分析变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图4-A6为次乌头碱对线粒体质量变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图5为藤黄酸和胺碘酮的高内涵代表图像。
图6-A1为藤黄酸对细胞存活率变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图6-A2为藤黄酸对细胞核面积变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图6-A3为藤黄酸细胞内钙离子浓度变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图6-A4为藤黄酸对线粒体面积变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图6-A5为藤黄酸对线粒体纹理分析变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图6-A6为藤黄酸对线粒体质量变化情况的量效关系曲线图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01。
图7为藤黄酸与阴性对照的对细胞毒性结果比对图，数据表示为：mean±SEM，n＝3，与对照组比较，，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。
在另一种实施例中，所述待测药物包括：阿霉素、胺碘酮及次乌头碱，计算在检测浓度为0.014～10μmol·L-1范围内对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响。
在另一种实施例中，所述待测药物样本用二甲基亚砜溶解并配成10mmol·L-1的母液，配置于离心管中，-20℃密封保存，细胞给药时用DMEM高糖培养基溶解稀释。
在另一种实施例中，所述细胞为H9c2细胞，其用含10％胎牛血清、含青霉素100kU·L-1、链霉素100mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培养基培养，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中，隔天弃去原培养基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化传代。
在另一种实施例中，所述荧光分子探针为Hoechst33342或MitotrackerDeepRedFM，所述钙离子荧光探针为Rhod2AM或Fluo4AM；在所述成像分析时，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，或者使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像。
在另一种实施例中，检测所述药物对细胞的影响时，针对阿霉素及胺碘酮，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，针对次乌头碱，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
在另一种实施例中，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入所述待测药物，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Fluo4AM或Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min；对阿霉素及胺碘酮使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，对次乌头碱使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，通过选择计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
本发明还提供了一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法在检测藤黄酸心脏毒性的应用，检测藤黄酸的浓度0.014～10μmol·L-1。
在另一种实施例中，针对藤黄酸，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
在另一种实施例中，在检测过程中，以高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入藤黄酸，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。实施例
1材料与方法
1.1药物、试剂和仪器
H9c2心肌细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库；DMEM高糖培养基和胰蛋白酶(含EDTA)：Gibco公司；胎牛血清和青链霉素：HyClone公司；阿霉素(Dox)和胺碘酮(Ami)：Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)：北京索莱宝科技有限公司；荧光探针Hoechst33342和MitotrackerDeepRedFM：Invitrogen公司；Rhod2AM和Fluo4AM探针：日本同仁公司；细胞培养瓶，96孔透底黑板和1.5mL离心管(EP管)：美国Corning公司；IL-161HICO2恒温培养箱：施都凯仪器设备有限公司；Operetta高内涵筛选系统：PerkinElmer仪器有限公司。
1.2细胞培养和传代
H9c2细胞用含10％胎牛血清、含青霉素100kU·L-1、链霉素100mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培养基培养，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中。隔天弃去原培养基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化传代。
1.3样品配置
将Dox、Ami、次乌头碱和藤黄酸用DMSO溶解并配成10mmol·L-1的母液，样品母液置于1.5mLEP管中，-20℃中密封保存；细胞给药时用DMEM高糖培养基逐级稀释，4种药物的浓度均稀释成0.014，0.041，0.12，0.37，1.1，3.3和10μmol·L-1。
1.4高内涵多指标心脏毒性检测方法的优化
收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h；换入各浓度的Dox、Ami、次乌头碱和藤黄酸100μL每孔培养24h；换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基；避光孵育20min；换成含有3μmol·L-1Fluo4AM或Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min；DMEM高糖培养基漂洗三次；将培养板放入高内涵筛选系统中，设定合适的成像条件，进行全自动活细胞成像。
1.5数据处理及二次分析
高内涵筛选系统结合了自动荧光显微镜成像功能，可以对单次实验进行高通量多指标分析；作为一种优选，利用Columbus高效有序的图像数据管理和分析系统对数据进行二次分析和管理，绘制剂量效应曲线。实验结果数据用表示，采用SPSS17.0数据统计软件，对数据进行正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析，分析方法为LSD，以P<0.05为具有显著性差异，以P<0.01为具有极显著性差异。最后统计出药物对细胞活力、细胞核面积、线粒体质量和胞内钙离子浓度这4种指标的结果。
2结果
2.1Dox、Ami和次乌头碱多指标心脏毒性评价
2.1.1Dox、Ami阳性对照结果
本实验在高内涵多指标心肌毒性检测方法建立过程中，选择已报道对心脏有明确毒性作用的Dox和Ami进行检测；从实验结果中可以看出，所建立的细胞影像学研究方法可以准确表现出Dox和Ami在不同浓度下对心肌细胞的影响，而且可初步判断Dox和Ami对心肌细胞影响的机制途径，抗癌药物Dox对细胞有较高的致死率，使细胞活力下降，EC50值为0.82μmol·L-1，DNA损伤使得细胞核荧光染料Hoechst33342的荧光强度降低(图1-C1，图2-B1)；同时它使细胞核胀大，细胞核面积有显著性增加(P<0.01)，其EC50为0.014μmol·L-1(图1-C1，图2-B2)；Dox诱导线粒体凋亡，使线粒体形状明显由椭圆形变成了线形，荧光强度增加，其EC50为1.21μmol·L-1(图1-C2，图2-B3)；同时Dox也影响胞内钙离子含量，导致钙稳态失衡，EC50为0.03μmol·L-1(图1-C3，图2-B4)；抗心律失常药Ami也对心肌细胞产生毒性作用，但是与Dox所致现象不同，图2-A1显示Ami在10μmol·L-1左右的浓度下对细胞有明显的杀伤作用，细胞活力也随剂量的增加呈下降的趋势，但是致毒浓度区间比Dox的要大，其EC50值为14.83μmol·L-1(图2-A1)，对线粒体也有明显的损伤；图1-B2显示，与Dox不同，H9c2细胞受到Ami的刺激后，原有的颗粒状线粒体聚集成滴状；线粒体的质量降低，EC50为4.54μmol·L-1(图2-A3)；Ami使细胞核皱缩，其EC50值为6.72μmol·L-1(图1-B1，图2-A2)，并影响胞内钙离子浓度。
2.1.2次乌头碱阴性对照结果
我们应用所建立的高内涵心脏毒性评价方法，筛选中药组分库发现已知有心脏毒性的次乌头碱对心肌细胞有较弱的毒性；图3、图4结果显示0.014～10μmol·L-1次乌头碱对细胞核和细胞内钙离子没有明显的影响，但是对线粒体有些许损伤，线粒体纹理分析(SERRidge)在0.014μmol·L-1有显著性变化(P<0.01)(图4-A5)。
2.2藤黄酸毒性评价结果
藤黄酸与阳性药Ami对细胞的影响有相似的效果。图5-C1中细胞活力指标显示藤黄酸对细胞具有较强的杀伤作用，在0.041μmol·L-1的情况下已有显著性差异(P<0.01)，半数有效剂量也较低为0.24μmol·L-1(图6-A1)，此浓度范围与Dox较为相近。藤黄酸对细胞核有皱缩作用，使细胞核面积减小，如图5-C1中的箭头所示，藤黄酸处理后的细胞核比空白组中的要圆且小，而与Ami处理的对照组相似(图5-B1)，其剂量效应半数有效值为1.16μmol·L-1(图6-A2)。结果也显示藤黄酸对心肌细胞的钙离子含量有影响，使钙离子含量降低的EC50值为0.87μmol·L-1(图5-C3，图6-A3)，导致细胞内钙稳态失衡。在中药单体评价方法中新增了线粒体面积和线粒体纹理分析两个指标，这有助于更准确更全面地描述线粒体的形态。藤黄酸的处理后三个线粒体的指标都有显著变化(P<0.01)，线粒体面积增加，纹理分析值减小，线粒体质量的减小，其EC50值分别为0.44，0.99和1.21μmol·L-1(图5-C2，图6-A4，A5，A6)。Z值平均为0.5(Z值代表评价方法体系可信度，Z值>0.4表示体系可靠，Z值>0.6表示结果可信度非常好)，P<0.05，假阳性率在可控范围内，评价方法可靠。这六种指标都证明了藤黄酸对心肌细胞H9c2有明显的损伤作用。
相比于阴性对照组(1‰DMSO溶液，不加入药物)，EC50值时藤黄酸处理细胞的综合毒性结果如图7所示，藤黄酸对细胞存活率的影响较为明显，不仅EC50值相对较低(0.24μmol·L-1)，其次，细胞核有皱缩趋势，稍微有显著性差异(P<0.05)，但是在1μmol·L-1左右时药物对胞内钙离子浓度没有显著性差异(P<0.05)，只有3～10μmol·L-1时才会有毒性作用(图6-A3)，线粒体纹理分析(SERRidge)表示的线粒体形状有明显的改变并且线粒体面积增加，但是在1μmol·L-1时，线粒体质量没有显著性变化(P<0.05)，仅有下降的趋势。所以，藤黄酸主要针对细胞核和线粒体的作用明显，其次是对胞內钙离子含量和线粒体呼吸毒性作用。
3讨论
Dox是使用最广泛的有效抗肿瘤药物之一，但是通过介导Bax蛋白和依赖p38造成细胞内氧化应激，从而引起细胞凋亡同时促进细胞坏死。图2-B1～B4的剂量效应结果显示Dox对细胞数、细胞核面积、线粒体呼吸及胞内钙离子的毒性影响；半数效应浓度在0.82μmol·L-1左右，与文献参考值较为相近；Ami属Ⅲ类抗心律失常药，已有研究指出Ami通过介导caspase2和9的通路诱导大鼠心肌细胞系H9c2细胞凋亡，最明显的特征是细胞收缩，胞核固缩，染色质凝结，细胞质致密，细胞器分布更紧凑。如图1-B1和图2-A1显示，经Ami处理细胞后导致细胞核收缩，线粒体聚集更紧密(如图1-B2)，毒性的半数有效值已到达4.50μmol·L-1。乌头是公认的对心脏有强烈毒性的中药，其成分中包含三个主要的生物碱，分别为乌头碱(aconitine)、中乌头碱和次乌头碱(hypaconitine)。研究显示这三种单体的毒性远不及乌头总毒性，而次乌头碱已被发现会造成QT间期的延长。本实验表明，与藤黄酸相比，次乌头碱的心脏毒性较弱，仅仅对线粒体的分布和形状有显著的影响，但是没有发现对细胞的致死情况。
藤黄酸作为广谱抗癌药，药物作用小鼠的肺癌细胞，药物浓度为10mg·kg-1时就有轻度疗效，20mg·kg-1已有较好抑制效果，30mg·kg-1时可以完全抑制肺癌细胞的生长。有实验发现300nmol·L-1即能有效抑制神经胶质瘤细胞的生长，抑制肝癌细胞SMMC7721生长的最大半数有效剂量为1.2或3.2μmol·L-1。为探究藤黄酸是否致心脏毒性，我们应用此方法对藤黄酸进行了综合评价。此次实验发现藤黄酸对心脏有毒性作用。不同浓度的藤黄酸处理H9c2细胞24h，得到不同指标的剂量曲线。早期有研究小鼠后腿肌肉注射藤黄酸急毒实验，电镜观察在不同时间段药物对线粒体的损伤逐渐加重，24h心肌细胞线粒体数量增多，48h心肌细胞线粒体肿胀，基质变空，72h可见畸形线粒体。近年大鼠的急毒实验和实验犬的长期毒性实验，结果证明长期给药会造成其肝、肾器官的明显毒性以及心脏的部分损伤。但是应用细胞水平的检测方法却不多。我们发现藤黄酸对正常的细胞H9c2心肌细胞有明显的杀伤作用，半数有效值在0.24μmol·L-1左右，已和抗癌有效剂量相当；细胞核明显皱缩，这是细胞凋亡的特征表现。线粒体在药物作用下发生损伤其形状和面积不同于空白组，毒性的半数有效剂量稍接近抗癌有效剂量。其次，线粒体呼吸能力有减弱倾向，在较高药物剂量时胞內钙离子浓度的含量异常。高内涵细胞水平评价心脏毒性不仅高通量、多参数，而且可以预测细胞机制。
综合以上结果，我们建立了基于高内涵多指标心脏毒性安全性评价方法，并且对藤黄中的抗癌有效成分藤黄酸的心脏毒性进行了综合评价及多指标的量化分析。藤黄酸不仅促进线粒体聚集，线粒体形状异常，线粒体质量下降，还导致胞内钙离子降低，稳态失衡，促使心肌细胞凋亡。多重影像学参数的同步评价对藤黄酸引起的心肌细胞核及线粒体的功能和形态进行较为全面的分析，并对其毒性作用机制做出初步的判断，可为用药安全性再评价及新药开发早期毒性预测提供新的技术支持。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针和对细胞内钙离子检测的钙离子荧光探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。
2.如权利要求1所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，所述待测药物包括：阿霉素、胺碘酮及次乌头碱，计算在检测浓度为0.014～10μmol·L-1范围内对细胞存活率、细胞内钙离子、细胞核及线粒体的至少一种影响。
3.如权利要求1或2所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，所述待测药物样本用二甲基亚砜溶解并配成10mmol·L-1的母液，配置于离心管中，-20℃密封保存，细胞给药时用DMEM高糖培养基溶解稀释。
4.如权利要求3所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，所述细胞为H9c2细胞，其用含10％胎牛血清、含青霉素100kU·L-1、链霉素100mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培养基培养，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中，隔天弃去原培养基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化传代。
5.如权利要求3所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，所述荧光分子探针为Hoechst33342或MitotrackerDeepRedFM，所述钙离子荧光探针为Rhod2AM或Fluo4AM；在所述成像分析时，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，或者使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像。
6.如权利要求5所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，检测所述药物对细胞的影响时，针对阿霉素及胺碘酮，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，针对次乌头碱，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
7.如权利要求1、2、4-6中任一项所述的基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法，其特征在于，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入所述待测药物，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Fluo4AM或Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min；对阿霉素及胺碘酮使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Fluo4AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体质量及细胞内钙离子浓度，考察药物对细胞的影响，对次乌头碱使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，通过选择计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
8.一种基于细胞表型的多指标量化心脏毒性检测方法在检测藤黄酸心脏毒性的应用，其特征在于，检测藤黄酸的浓度0.014～10μmol·L-1。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，针对藤黄酸，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在检测过程中，以高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括：细胞接种于孔板之后，收集对数生长期细胞，以每孔5000个细胞浓度加入96孔黑色透明底的培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换入藤黄酸，培养24h，换成含有0.1μmol·L-1的Hoechst33342和MitoTrackerDeepRedFM两种染料的DMEM高糖培养基，避光孵育20min，换成含有3μmol·L-1Rhod2AM的DMEM高糖培养基，避光培养30min，使用Hoechst33342、MitotrackerDeepRedFM和/或Rhod2AM通道进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞存活率、细胞核面积、线粒体面积、线粒体质量、细胞内钙离子浓度及线粒体纹理分析，考察药物对细胞的影响。
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