CN105779617A - 利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼检测的引物和方法 - Google Patents

利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼检测的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用微卫星标记Thymall‑02对新疆北极茴鱼检测的引物和方法。首先提取新疆北极茴鱼肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用新疆北极茴鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对新疆北极茴鱼不同地理群或新疆北极茴鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得新疆北极茴鱼的遗传多态性图谱。本发明的特点是可快捷的获得新疆北极茴鱼遗传标记Thymall‑02的遗传变异图谱，方法简便。

Description

利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼检测的引物和 方法
技术领域
本发明属于新疆北极茴鱼（Thymallus arcticus grubei）DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测新疆北极茴鱼微卫星标记Thymall-02的技术方法，具体是新疆北极茴鱼微卫星标记Thymall-02的基因型检测方法。
背景技术
新疆北极茴鱼（Thymallus arcticus grubei）属鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、茴鱼亚科(Thymallinae)、茴鱼属(Thymallus)，俗称草斑、油斑，又名棒花鱼、花翅子。体长形，侧扁，背鳍长且高大，上缘圆凸，呈旗状，有几条赤褐色斑点形成的纹带，体色鲜艳。野生资源主要分布在新疆阿勒泰市富蕴县和布尔津县额尔齐斯河的上游各支流中。北极茴鱼属典型冷水高耗氧鱼，常年生活在山涧溪流，水质清澈无污染，水流湍急，河底多砾石的地方。北极茴鱼外观华丽，肉质尤其细腻，不仅是名贵的新疆特有鱼类，也是我国重要的水产种质资源，有极高的经济开发价值。由于近年来的环境污染、森林破坏和过渡捕捞等人为因素，该鱼的资源面临枯竭，已被新疆维吾尔自治区人民政府列为新疆Ⅱ类重要水生野生保护动物。近年来，新疆生产建设兵团水产技术推广总站的向伟等研究人员已经开始了北极茴鱼的人工繁育、资源增值及人工驯化养殖研究，并取得了一定的研究成果，有望实现养殖的产业化。新疆北极茴鱼作为一种新兴的养殖品种，遗传学研究相对薄弱，还没有微卫星标记开发的报道。虽然同工酶标记、RAPD标记及AFLP标记技术也可以用于研究新疆北极茴鱼的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏新疆北极茴鱼微卫星标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取微卫星标记以进行新疆北极茴鱼遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高多态性的新疆北极茴鱼DNA分子遗传标记技术，即新疆北极茴鱼微卫星标记Thymall-02的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。
本发明的基本构思主要是利用新疆北极茴鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测新疆北极茴鱼每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物（微卫星标记Thymall-02）对新疆北极茴鱼的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从新疆北极茴鱼DNA序列中获取了一个微卫星标记，命名为Thymall-02，该微卫星标记Thymall-02可用于新疆北极茴鱼遗传多样性分析和系谱认证。
本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取新疆北极茴鱼肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用新疆北极茴鱼基因组DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对新疆北极茴鱼不同地理群或新疆北极茴鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得新疆北极茴鱼的遗传多态性图谱。
提取新疆北极茴鱼基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。
含有微卫星序列的DNA序列为：
1 cctcccgcgt ggcaggcgag aattctacca ctgaaccacc aatgcctcaa caggagagtg
61 agtgagtgag tgagtgagtg acccacccac cgcctcaaca ggtgagtgag tgagtgagtg
121 accgagtgag tgaccgagtg agtgaccgag tgagtgaccg agtgagtgag tgagtgagtg
181 acccaccgtc ctaatacttc accaggatag tgggtttaga aatcgtatca gaaaagcatt
241 agcttgaatt ccaagcgtgt ttttttccgc tatgtggact tagcgacaat tccaccacta
301 aaacaccaat gccttgcgag actgaattta agcgggggcg gggtcttcgc gatggtagca
361 gaccattttt gctaatccaa agacgtctcc gagacccccc gggcgcccgg cgggtgcatg
421 gttcaatttg tgggttatcg cttctcgg
其中微卫星核心序列为：
GAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGT
Thymall-02微卫星引物序列为：
正链5’- TACCACTGAACCACCAATGC-3’，
负链5’- TTTTAGTGGTGGAATTGTCGC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在新疆北极茴鱼遗传多样性检测中呈现多态性。
PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng新疆北极茴鱼基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ 1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH2O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃30sec，58℃45sec，72℃40sec,该反应进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
PCR产物的检测步骤：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到新疆北极茴鱼微卫星标记Thymall-02的多态性图谱。
因此, 本发明的特点是可快捷的获得新疆北极茴鱼的Thymall-02微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出新疆北极茴鱼每个个体的基因型；而应用于不同地理群或新疆北极茴鱼群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
附图说明
图1是本发明微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼20个个体的检测图谱 (编号1—20是新疆北极茴鱼的20个个体)。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明在新疆北极茴鱼Thymall-02微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取新疆北极茴鱼肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用新疆北极茴鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对新疆北极茴鱼不同地理群或新疆北极茴鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得新疆北极茴鱼的遗传多态性图谱。
1、新疆北极茴鱼基因组DNA的提取：将100µg新疆北极茴鱼肌肉加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液 500µl和20mg/ml的蛋白酶K 5µl，轻轻摇匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600µl酚氯︰仿︰异戊醇（25︰24︰1）混合液，晃动20min后12000rpm 离心10min，取上清液。再加入酚︰氯仿︰异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm 离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE 缓冲液溶解DNA，并稀释为100ng/μl，4℃保存。
2、微卫星引物的设计：在新疆北极茴鱼DNA序列基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为：正链5’- TACCACTGAACCACCAATGC-3’，负链5’-TTTTAGTGGTGGAATTGTCGC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
3、PCR扩增：首先加样，加样量如下：新疆北极茴鱼基因组DNA(100ng／L)，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ (25mmo1／L)，1.5μl；Taq酶(5u／μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo／L)，1μl；引物(各10pmol／μl)，1μl；加灭菌水至25μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：94℃变性2min；94℃30sec，58℃45sec， 72℃40sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
4、PCR产物的检测：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳仪功率为15W，电泳时间为1.5小时左右。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到新疆北极茴鱼在Thymall-02微卫星核心序列的多态性图谱，如图1所示。图1结果表明，新疆北极茴鱼的20个个体共扩增出9个等位基因，说明微卫星标记Thymall-02具有较高的多态性，适合进行新疆北极茴鱼遗传多样性和遗传结构分析、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。
<110> 新疆大学
<120> 利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼检测的引物和方法
<160> 1
<210> 1
<211> 448
<212> DNA
<213> 新疆北极茴鱼（Thymallus arcticus grubei）
<220>
<221> repeat_region
<222> (56)...(79)
<400> 1
1 cctcccgcgt ggcaggcgag aattctacca ctgaaccacc aatgcctcaa caggagagtg
61 agtgagtgag tgagtgagtg acccacccac cgcctcaaca ggtgagtgag tgagtgagtg
121 accgagtgag tgaccgagtg agtgaccgag tgagtgaccg agtgagtgag tgagtgagtg
181 acccaccgtc ctaatacttc accaggatag tgggtttaga aatcgtatca gaaaagcatt
241 agcttgaatt ccaagcgtgt ttttttccgc tatgtggact tagcgacaat tccaccacta
301 aaacaccaat gccttgcgag actgaattta agcgggggcg gggtcttcgc gatggtagca
361 gaccattttt gctaatccaa agacgtctcc gagacccccc gggcgcccgg cgggtgcatg
421 gttcaatttg tgggttatcg cttctcgg

Claims (5)

1.一组利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼基因型进行检测的引物，其特征在于，
其中所述的引物为序列：
正链5’- TACCACTGAACCACCAATGC-3’，
负链5’-TTTTAGTGGTGGAATTGTCGC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
2.利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼基因型进行检测的方法，其特征在于，首先提取新疆北极茴鱼肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用新疆北极茴鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，使用特异性引物对新疆北极茴鱼不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定新疆北极茴鱼不同个体在Thymall-02核心序列区的基因型，其中所述的新疆北极茴鱼微卫星标记Thymall-02即特异性引物为：
正链5’- TACCACTGAACCACCAATGC-3’，
负链5’-TTTTAGTGGTGGAATTGTCGC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
3.如权利要求2所述的利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼基因型进行检测的方法，其特征在于，对不同新疆北极茴鱼个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng新疆北极茴鱼基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ 1.5 mmol/L；Taq酶1u；dNTP 0.1mmol/L；权利要求1中的特异性引物各10 pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：94℃变性5min；94℃ 45sec，58℃ 1min，72℃40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
4.如权利要求2所述的利用微卫星标记Thymall-02对新疆北极茴鱼基因型进行检测的方法，其特征在于，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离, 以10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min。
5.权利要求2-4所述的方法在新疆北极茴鱼群体间遗传多态性图谱构建上的应用。
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刘云国等: "茴鱼微卫星标记开发及保护遗传学研究进展", 《水产科学》 *
马波等: "下游黑龙江茴鱼种群遗传变异及地理分化的微卫星分析", 《中国水产科学》 *

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