CN105766647A - 一种公石松组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种公石松组织培养方法，以野生公石松为外植体建立无菌体系，经过诱导培养和继代培养。此技术体系克服肉质茎内生菌多，容易变色困难。继代培养阶段形成的种苗粗壮，根、茎、叶分化较完整，根部活力强。种植时发根快，成活率高(成活率在90%以上)，生长快、成色好。该发明实现了无菌条件下的种苗快繁，从而解决了公石松自然繁殖力差所导致的自然界野生资源匮乏的问题。此技术体系的建立让这具有悠久应用历史、药效确切的中草药更好地开发利用，填补了公石松组织培养的空白。

Description

一种公石松组织培养方法
技术领域
本发明属于生物细胞组织克隆技术，利用现代生物技术快繁公石松，具体涉及一种公石松组织培养方法。
背景技术
公石松：兰科植物血叶兰Ludisiadiscolor(Ker-Gawl.)A.Rich.，别名异色血叶兰、石蚕、石上藕、石面莲等，是闽南民间颇具地方特色的一味草药。该药应用历史悠久，药效确切，应用普遍。其味甘、微涩、性凉，具有清热凉血、生津降火、利水通络、止咳等功效，可用于治疗高烧不退、咽喉肿痛、无名肿痛、脾胃病和炎症等。《中华本草》记载其功效：“润肺、健脾、安神，主治肺结核咳血、神经衰弱、食欲不振”。国内主要分布于闽、粤、琼等沿海一带热带地区，因其常常生长在阴湿的岩石缝中，故取名为“公石松”。公石松对生长环境要求较苛刻，自然繁殖力差。其根状茎发达，肉质而肥厚，似莲藕状，节上生根，根多具浓密根毛。肉质茎含有较丰富的内生菌，对杀菌剂反应敏感，容易变色，组织培养没有较权威的成熟技术可以参考，现未查到有关公石松组织培养的报道。本发明以野生公石松为外植体组织培养公石松种苗，从而更好地开发利用公石松的药用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种公石松组织培养方法，以野生公石松为外植体组织培养公石松种苗，从而更好地开发利用公石松的药用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种公石松组织培养方法，包括如下：
（1）以野生公石松为外植体经过2—3天净沙培植，去除根叶的茎段，经表面清洗后，放在1wt.%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，用自来水冲洗干净，放入75％v/v酒精中灭菌30秒，再以0.1wt.％升汞灭菌7~10分钟，用无菌水冲洗4~5次；
（2）在无菌条件下，将茎切成l.5cm长茎节段，接种到诱导培养基上，每天连续光照8h，光照强度1500~2000lx，培养温度23±1℃，培养150天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的茎芽在无菌条件下移接到生长培养基，每天连续光照12h，光照强度2000~2500lx，培养温度25±1℃，培养130天，形成具有比较完整根系和茎、叶。
所述的诱导培养基为：MS基本培养基中附加IBA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、KT0.1mg/L、白糖10g/L、土豆10g/L。
所述生长培养基为1/2MS基本培养基中附加NAA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、和纳米氧化硅1g/L、白糖15g/L、土豆10g/L、蛋白胨1.5g/L。
本发明的优点在于：本发明以野生公石松为外植体建立无菌体系，经过诱导培养和继代培养。此技术体系克服肉质茎内生菌多，容易变色困难。继代培养阶段形成的种苗粗壮，根、茎、叶分化较完整（如图1），根部活力强。，种植时发根快，成活率高(成活率在90%以上)，，生长快、成色好。该发明实现了无菌条件下的种苗快繁，从而解决了公石松自然繁殖力差所导致的自然界野生资源匮乏的问题。此技术体系的建立让这具有悠久应用历史、药效确切的中草药更好地开发利用，填补了公石松组织培养的空白。
附图说明
图1组织培养苗。
图2移植土壤的苗。
图3组织培养苗形成的花蕾。
图4在土壤中形成的强活力根系。
具体实施方式
实施例1
一种公石松组织培养方法，包括如下：
（1）以野生公石松为外植体经过2天净沙培植，去除根叶的茎段，经表面清洗后，放在1wt.%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，用自来水冲洗干净，放入75％v/v酒精中灭菌30秒，再以0.1wt.％升汞灭菌7分钟，用无菌水冲洗4次；
（2）在无菌条件下，将茎切成l.5cm长茎节段，接种到诱导培养基上，每天连续光照8h，光照强度1500lx，培养温度23±1℃，培养150天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的茎芽在无菌条件下移接到生长培养基，每天连续光照12h，光照强度2000lx，培养温度25±1℃，培养130天，形成具有比较完整根系和茎、叶。
所述的诱导培养基为：MS基本培养基中附加IBA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、KT0.1mg/L、白糖10g/L、土豆10g/L。
所述生长培养基为1/2MS基本培养基中附加NAA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、和纳米氧化硅1g/L、白糖15g/L、土豆10g/L、蛋白胨1.5g/L。
实施例2
一种公石松组织培养方法，包括如下：
（1）以野生公石松为外植体经过3天净沙培植，去除根叶的茎段，经表面清洗后，放在1wt.%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，用自来水冲洗干净，放入75％v/v酒精中灭菌30秒，再以0.1wt.％升汞灭菌10分钟，用无菌水冲洗5次；
（2）在无菌条件下，将茎切成l.5cm长茎节段，接种到诱导培养基上，每天连续光照8h，光照强度2000lx，培养温度23±1℃，培养150天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的茎芽在无菌条件下移接到生长培养基，每天连续光照12h，光照强度2500lx，培养温度25±1℃，培养130天，形成具有比较完整根系和茎、叶。
所述的诱导培养基为：MS基本培养基中附加IBA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、KT0.1mg/L、白糖10g/L、土豆10g/L。
所述生长培养基为1/2MS基本培养基中附加NAA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、和纳米氧化硅1g/L、白糖15g/L、土豆10g/L、蛋白胨1.5g/L。
实施例3
一种公石松组织培养方法，包括如下：
（1）以野生公石松为外植体经过3天净沙培植，去除根叶的茎段，经表面清洗后，放在1wt.%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，用自来水冲洗干净，放入75％v/v酒精中灭菌30秒，再以0.1wt.％升汞灭菌8分钟，用无菌水冲洗5次；
（2）在无菌条件下，将茎切成l.5cm长茎节段，接种到诱导培养基上，每天连续光照8h，光照强度1700lx，培养温度23±1℃，培养150天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的茎芽在无菌条件下移接到生长培养基，每天连续光照12h，光照强度2300lx，培养温度25±1℃，培养130天，形成具有比较完整根系和茎、叶。
所述的诱导培养基为：MS基本培养基中附加IBA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、KT0.1mg/L、白糖10g/L、土豆10g/L。
所述生长培养基为1/2MS基本培养基中附加NAA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、和纳米氧化硅1g/L、白糖15g/L、土豆10g/L、蛋白胨1.5g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种公石松组织培养方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）以野生公石松为外植体经过2-3天净沙培植，去除根叶的茎段，经表面清洗后，放在1wt.%次氯酸钠溶液浸泡15分钟，用自来水冲洗干净，放入75％v/v酒精中灭菌30秒，再以0.1wt.％升汞灭菌7~10分钟，用无菌水冲洗4~5次；
（2）在无菌条件下，将茎切成l.5cm长茎节段，接种到诱导培养基上，每天连续光照8h，光照强度1500~2000lx，培养温度23±1℃，培养150天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的茎芽在无菌条件下移接到生长培养基，每天连续光照12h，光照强度2000~2500lx，培养温度25±1℃，培养130天，形成具有比较完整根系和茎、叶。
2.根据权利要求1所述的一种公石松组织培养方法，其特征在于：所述的诱导培养基为：MS基本培养基中附加IBA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、KT0.1mg/L、白糖10g/L、土豆10g/L。
3.根据权利要求1所述的一种公石松组织培养方法，其特征在于：所述生长培养基为1/2MS基本培养基中附加NAA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、纳米氧化硅1g/L、白糖15g/L、土豆10g/L、蛋白胨1.5g/L。
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