CN105758942B - 基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法 - Google Patents
基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105758942B CN105758942B CN201410784710.8A CN201410784710A CN105758942B CN 105758942 B CN105758942 B CN 105758942B CN 201410784710 A CN201410784710 A CN 201410784710A CN 105758942 B CN105758942 B CN 105758942B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aptamer
- buffer
- hydrophilic
- capillary
- histone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于多种核酸适体配基的多种蛋白同时富集的在线检测方法。在该方法中，首先多种核酸适体修饰的整体材料在色谱系统上对蛋白混合物进行同时在线富集，然后利用不同蛋白与相应核酸适体结合能力的差异进行分别洗脱，进而达到分别检测的目的。本发明借助了核酸适体高特异性和高选择性的特点，专一地富集相对应的蛋白。在色谱系统上，利用梯度洗脱使不同的蛋白先后通过检测器产生色谱信号，从而提高了在线检测的通量。另外，通过质谱的分析，蛋白质上的翻译后修饰仍然能够得到很好的保留，在蛋白质组学的研究中具有较好的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及多种蛋白的同时富集和检测，具体地说是将二种及以上的核酸适体修饰于亲水毛细管整体柱上并用于多种目标蛋白的高效高选择性富集和在线灵敏检测。
背景技术
核酸适体(Aptamer，又称适配体，适配子)是单链寡核苷酸(ssDNA or ssRNA)，具有高亲和性、高特异性地结合靶标的能力。核酸适体能够与靶标通过范德华力、氢键、π-π堆积、疏水作用等分子间作用力形成较强的结合力，特异地识别靶标。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment，SELEX)筛选获得，筛选得到核酸适体具有亲和性好、选择性高、性质稳定、易于化学修饰等诸多优点，同时可以根据核苷酸序列进行大量的人工合成。目前已报道的核酸适体靶标包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞(Nature 1993,364,550-553；Trends inAnalytical Chemistry 2012,41,46-57)，应用领域广阔，有望成为一种“人工抗体”。
传统上，核酸适体都用于单一靶标的一对一检测(Analytical Chemistry 2008,80,7586–7593)。但对于多目标蛋白质体系的分析检测而言，传统的一对一模式已不能满足多蛋白同时检测的需求。因此有必要发展基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集的检测方法。
为此，我们将二种及以上的核酸适体修饰在毛细管亲水整体柱上。毛细管整体柱相对于开管柱和填充柱，具有反压小，通透性好，易于实现在线等优势，其应用非常广泛。通过亲水改性，再修饰上核酸适体，能够减少非特异性吸附，提高目标蛋白的检测回收率。修饰在亲水整体柱上的核酸适体能够在色谱系统上在线同时富集相应的蛋白，利用不同蛋白与相对应的核酸适体结合能力之间的差异分别洗脱，达到同时富集并分别检测的目的。
发明内容
将多种目标蛋白各自所对应的核酸适体混合物，通过共价键结合在毛细管亲水整体柱上，在色谱系统中同时在线富集多种目标蛋白，采用梯度洗脱模式使不同蛋白先后洗脱并经过检测器进行信号采集。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
将二种或以上核酸适体溶解于核酸适体缓冲液中，将上述溶液持续通入毛细管亲水整体柱，将核酸适体修饰于毛细管亲水整体柱上，将有核酸适体修饰的整体柱作为液相色谱柱接入液相色谱系统中；通过液相色谱对多种蛋白混合物溶液进行分离和检测。
毛细管亲水整体柱可以是硅胶基质整体柱、聚合物整体柱、有机-无机杂化整体柱中的任意一种，具体为GMA-PEGDA，MAA-MBA，BMA-EGDA、HEMA-DEGDA，LMA-PEGDA，AAm-MBA，VTMS-TMOS，VTMS-TEOS-MAA中的任意一种，内径10-500μm，长度5-20cm；亲水整体柱材料上键合有羧基、氨基、醛基、环氧基、巯基、叠氮基团、炔基、纳米金、纳米银或纳米镉中的任意一种功能基团；核酸适体通过与毛细管亲水整体柱材料的上述功能基团共价结合，修饰于毛细管亲水整体柱上。
所述核酸适体为针对组蛋白、凝血酶、Nucleolin、HIV-1surface glycoprotein(gp120)、Transcription factor HMGA1b、Vasopressin、Ghrelin、Angiogenin、Angiopoietin-2、Cytokines、IgE、Ricin、VEGF、PDGF-B、细胞色素C的核酸适体或其它蛋白筛选出来核酸适体中的任意二种或以上；核酸适体缓冲溶液中每种核酸适体终浓度为1-25μM；任意两种核酸适体之间的摩尔浓度比为0.2-5.0:1；核酸适体缓冲溶液通入毛细管亲水整体柱的持续时间为0.25-6h，温度为4-37℃。
多种蛋白混合物溶液中蛋白的总浓度为0.005-0.5μg/μL；多种蛋白混合物溶解在核酸适体缓冲液中；核酸适体缓冲液为水、PBS、Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液(以磷酸一氢根和磷酸二氢根为缓冲离子对，可适当添加其它离子)中的任意一种，pH范围为7.2-8.5，当核酸适体缓冲液为PBS、Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中的任意一种时，缓冲液中各种溶质的总浓度范围为10mM-180mM；以核酸适体缓冲液作为上样缓冲液，液相色谱上样量为1-20μL。
液相色谱上样流速为0.5-5μL/min；所用洗脱相为30-100mM的EDTA、0.2-0.5M的甘氨酸-盐酸(pH＝2.2-3.5)、质量浓度为10-25％的二氧六环、质量浓度为40-70％的乙二醇、质量浓度为75-90％的甲醇、质量浓度为25-40％的乙腈、0.5-2.0M的NaClO4或2.0-4.0M的NaCl水溶液中的任意一种；线性梯度洗脱的梯度时间为10-30min，在梯度时间内，洗脱相比例占洗脱相与上样缓冲液总体积的百分比由0％变化到100％。通过色谱工作站上观测到组分出峰时开始收集；当峰信号强度接近基线时停止收集；采用紫外检测器进行检测，检测波长为214-280nm。
经液相色谱分离收集的蛋白组分可用蛋白酶酶解生成肽段，采用液相色谱-质谱联用技术，对肽段进行分离后，进行样品分析。利用高能碰撞解离(Higher-energycollisional dissociation，HCD)模式对肽段进行二级碎裂。采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行肽段的信息分析。
本发明提供的方法可以应用于二种或以上蛋白同时富集和在线检测。
本发明具有如下优点：
1.本发明采用两种以上的核酸适体，能够在线同时富集两种以上的蛋白，提高了对目标蛋白的选择性识别能力。
2.本发明采用2M NaClO4、2.5M NaCl等洗脱能力强的溶液为洗脱相，能够先后洗脱下富集到的蛋白并得到检测，提高了实验通量。
3.本发明采用毛细管亲水整体材料，非特异吸附小，且材料刚性，机械强度好，可耐受0-40MPa的压力范围，适用pH范围宽(1-14)。
4.通过质谱的分析，富集到的蛋白上的翻译后修饰仍然能够得到很好的保留，在蛋白质组学的研究中具有较好的实用性。
附图说明
图1为同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱对凝血酶(T)、组蛋白提取物(H)以及凝血酶与组蛋白提取物的混合物(T+H)分别进行检测的液相色谱叠加图
图2为验证同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱对凝血酶(T)保留情况的SDS-PAGE图
图3为同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱对组蛋白提取物(H)中组蛋白H4的GGK(Ac)GLGK(Ac)GGAK(Ac)R肽段的质谱鉴定图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱按如下流程制备：
将巯基修饰的凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体(巯基基团与核酸适体之间由间隔臂即6个亚甲基连接，购自宝生物工程(大连)有限公司)等摩尔比(1：1)溶解在核酸适体缓冲液PBS中，其中每种核酸适体的终浓度均为25μM，连续通入内径200μm，长10cm的纳米金掺杂的毛细管亲水整体柱，室温下反应4h。
纳米金掺杂的GMA-PEGDA毛细管亲水整体柱的制备方法：GMA-PEGDA毛细管整体柱连续通入1M半胱胺溶液(采用1M NaOH溶液溶解)，于50℃下反应6小时，采用1M Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲溶液封尾2小后用纯水冲洗柱子至中性，在室温下连续通入0.25M三羧甲基磷酸溶液(用质量浓度28-30％氨水调pH至中性)还原二硫键，用纯水冲洗柱子；最后向富含巯基的整体材料中通入浓度8nM纳米金溶液(约15nm)4mL，至流出液变红为止，固载量约32pmol。实施例2
同时修饰有凝血酶核酸适体和细胞色素C核酸适体的毛细管亲水整体柱按如下流程制备：
将醛基修饰的凝血酶核酸适体和细胞色素C核酸适体(修饰的醛基基团与核酸适体之间由间隔臂即18个亚甲基连接，购自宝生物工程(大连)有限公司)以摩尔比(1:4)溶解在核酸适体缓冲液PBS中，其中凝血酶核酸适体的浓度为5μM，细胞色素C核酸适体的浓度为20μM，连续通入表面带有氨基的内径100μm，长6cmGMA-PEGDA毛细管亲水整体材料(亲水整体柱制备方法与实施例1基本相同，区别在于通入10mg/mL的PEI(Mn＝600)做修饰)，室温下反应4h。
实施例3
使用实施例1制备的同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱作为液相色谱柱，对凝血酶(T)、组蛋白提取物(H)以及凝血酶与组蛋白提取物的混合物(T+H)分别进行检测，具体测定步骤为：
1)在液相色谱系统上，采用核酸适体缓冲液PBS作为上样缓冲液，流速为2.4μL/min。依次上样10ng/μL的凝血酶(T)、组蛋白提取物(H)以及凝血酶与组蛋白提取物的混合物(T+H)各20μL，用2M NaClO4作为洗脱溶液进行梯度洗脱10min；在10min内，洗脱相比例占洗脱相与上样缓冲液总体积的百分比由0％变化到100％。采用紫外检测器进行检测，检测波长为280nm，结果如图1所示。图1中，当凝血酶(T)、组蛋白提取物(H)分别进入色谱系统时，凝血酶和组蛋白都有各自的洗脱峰(如箭头所示)；当凝血酶与组蛋白提取物的混合物(T+H)进入色谱系统时，凝血酶和组蛋白先后被洗脱下来，产生了两个洗脱峰(如箭头所示)，这表明在毛细管亲水整体材料上同时修饰了凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体，可以对凝血酶和组蛋白同时识别，选择性强，相互干扰很小。另外，收集三组实验中的凝血酶(T)洗脱组分(21-23min)进行后续分析。
2)将上述样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析：用冷冻干燥机将上述样品冻干，各加入20μL核酸适体缓冲液PBS重溶。另外再取20μL凝血酶(T)标准蛋白样品。向所有样品中加入同等体积的SDS-PAGE上样缓冲溶液，在沸水中煮沸5min后，将其加于凝胶孔道中。采用4％浓缩胶和12％的分离胶，在120V恒压条件下进行分离。结果如图2所示，T+H泳道中凝血酶的洗脱组分与T泳道中凝血酶的洗脱组分和凝血酶标准蛋白的条带一致，这表明，同时修饰了凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体材料对凝血酶的选择性富集效果很好。
实施例4
为考察同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体材料(以实施例1制备的作为分离材料)对组蛋白的富集效果，采用Thermo LTQ-Orbitrap质谱，在HCD模式下，采集二级碎裂离子质谱图，具体步骤为：
收集实施例3中，凝血酶与组蛋白提取物的混合物(T+H)上样后的洗脱组分(21min-28min)，进行SDS-PAGE分析后，对组蛋白进行胶上酶解，具体步骤为：
1)将组蛋白和凝血酶的条带分别切成1mm*1mm的小块；
2)各加入0.5mL乙腈，震荡10min，离心去上清；
3)各加入100μL 10mM DTT，56℃烘箱中放置反应30min；
4)冷却至室温(约22℃)后，各加入0.5mL乙腈，震荡10min，离心去上清；
5)各加入100μL 55mM IAA，避光静置20min；各加入0.5mL乙腈，震荡10min，离心去上清；
6)各加入150μL 5ng/μL trypsin，冰上静置2h；
7)各加入20μL 50mM NH4HCO3，放入37℃烘箱中反应14h；
8)各加入100μL提取缓冲液(5％甲酸：乙腈＝1:2，v/v)，37℃恒温震荡15min；
9)10000rpm离心15min，4℃。取上清，冻干；
10)各用20μL 0.1％FA重溶样品，用于Thermo LTQ-Orbitrap质谱分析。
在HCD模式下，采集二级碎裂离子质谱图。质谱的参数设置为：在正离子模式下，使用2.1kV的喷雾电压；加入毛细管的稳定为250℃；所有的一级质谱图和二级质谱图都基于数据依赖模式；每一个一级质谱图采集的m/z范围为300-1800，并且最多跟随15个二级质谱图；动态排除时间为40s；碰撞能量为35％。
通过质谱检测，并利用蛋白质组数据库搜索引擎进行肽段的信息分析，我们获得了多条组蛋白肽段的信息，其中图3是组蛋白H4一条肽段GGK(Ac)GLGK(Ac)GGAK(Ac)R的二级碎裂离子质谱图。结果表明，该肽段的三个乙酰化修饰得到鉴定。这说明，组蛋白不仅能够被选择性富集，组蛋白上的翻译后信息还能够得以保留，在蛋白质组学的研究中具有较好的实用性。
Claims (5)
1.一种基于两种核酸适体的两种蛋白同时在线富集检测方法，其特征在于：将两种核酸适体溶解于核酸适体缓冲液中，将该溶解了两种核酸适体缓冲液持续通入毛细管亲水整体柱，将核酸适体修饰于毛细管亲水整体柱上，将有核酸适体修饰的整体柱作为液相色谱柱接入液相色谱系统中；通过液相色谱对蛋白混合物溶液进行分离和检测；
液相色谱上样流速为0.5-5μL/min；所用上样缓冲液为PBS、Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH范围为7.2-8.5；所用洗脱相为30-100mM的EDTA、pH＝2.2-3.5的0.2-0.5M的甘氨酸-盐酸、质量浓度为10-25％的二氧六环、质量浓度为40-70％的乙二醇、质量浓度为75-90％的甲醇、质量浓度为25-40％的乙腈、0.5-2.0M的NaClO4或2.0-4.0M的NaCl中的任意一种水溶液，线性梯度洗脱的梯度时间为10-30min，在梯度时间内，洗脱相比例占洗脱相与上样缓冲液总体积的百分比由0％变化到100％；采用紫外检测器进行检测，检测波长为214-280nm；
经液相色谱分离收集的蛋白组分用蛋白酶酶解生成肽段，采用液相色谱-质谱联用技术，对肽段进行分离后，进行样品分析；采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行肽段的信息分析；
所述两种核酸适体为凝血酶和组蛋白核酸适体；所述两种蛋白为凝血酶和组蛋白。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述毛细管亲水整体柱是硅胶基质整体柱、聚合物整体柱、有机-无机杂化整体柱中的任意一种，内径10-500μm，长度5-20cm；亲水整体柱材料上键合有羧基、氨基、醛基、环氧基、巯基、叠氮基团、炔基、纳米金、纳米银或纳米镉中的任意一种功能基团。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸适体缓冲溶液中任意两种核酸适体之间的摩尔浓度比为0.2-5.0:1；核酸适体缓冲溶液通入毛细管亲水整体柱的持续时间为0.25-6h，温度为4-37℃。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白混合物溶液中蛋白的总浓度为0.005-0.5μg/μL，蛋白混合物溶解在核酸适体缓冲液中，核酸适体缓冲液pH范围为7.2-8.5；液相色谱以核酸适体缓冲液作为上样缓冲液，液相色谱上样量为1-20μL。
5.按照权利要求1-4任一所述的方法用于凝血酶和组蛋白同时富集和在线检测中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410784710.8A CN105758942B (zh) | 2014-12-16 | 2014-12-16 | 基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410784710.8A CN105758942B (zh) | 2014-12-16 | 2014-12-16 | 基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105758942A CN105758942A (zh) | 2016-07-13 |
| CN105758942B true CN105758942B (zh) | 2019-01-04 |
Family
ID=56339961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410784710.8A Active CN105758942B (zh) | 2014-12-16 | 2014-12-16 | 基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105758942B (zh) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2515576C (en) * | 2003-02-13 | 2013-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Devices for component removal during blood collection, and uses thereof |
| JP2016516562A (ja) * | 2013-03-01 | 2016-06-09 | ウェーブ ８０ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | マイクロ流体処理のための方法およびシステム |
-
2014
- 2014-12-16 CN CN201410784710.8A patent/CN105758942B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Aptamer-Modified Monolithic Capillary Chromatography for Protein Separation and Detection;Qiang Zhao等;《Anal. Chem.》;20080515;第80卷(第10期);第3915-3920页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105758942A (zh) | 2016-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5374363B2 (ja) | ペプチド混合物を評価する方法 | |
| Thulasiraman et al. | Reduction of the concentration difference of proteins in biological liquids using a library of combinatorial ligands | |
| Shinde et al. | Imprinted polymers displaying high affinity for sulfated protein fragments | |
| Li et al. | A high boronate avidity monolithic capillary for the selective enrichment of trace glycoproteins | |
| KR101826449B1 (ko) | 펩티드 단편의 조제 방법 및 그것에 사용되는 펩티드 단편 조제용 킷, 및 분석 방법 | |
| JP2005529335A (ja) | 開放チャンネルを使って生体分子を固体相として抽出するシステムと方法 | |
| CN110850099B (zh) | 一种非疾病诊断目的的血清中c反应蛋白的定值方法 | |
| US9005526B2 (en) | Narrow bore porous layer open tube capillary column and uses thereof | |
| EP2545370B1 (en) | Method for recognition and quantification of multiple analytes in a single analysis | |
| CN111537658A (zh) | 一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法及应用 | |
| CN105758942B (zh) | 基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法 | |
| CN103792315B (zh) | 一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法 | |
| Thawornpan et al. | Fly-ash as a low-cost material for isolation of phosphoproteins | |
| CA2863635A1 (en) | Selector based recognition and quantification system and method for multiple analytes in a single analysis | |
| US20090256068A1 (en) | Solution fragmentation systems and processes for proteomics analysis | |
| CN109557193B (zh) | 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法 | |
| Fischnaller et al. | Enrichment and desalting of tryptic protein digests and the protein depletion using boron nitride | |
| Moravcová et al. | Short monolithic columns for purification and fractionation of peptide samples for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry analysis in proteomics | |
| US20030153729A1 (en) | Enzyme/chemical reactor based protein processing method for proteomics analysis by mass spectrometry | |
| JP2011516463A (ja) | 複合試料からのｎ末端修飾されたペプチドの選択的濃縮 | |
| CN101813679A (zh) | 一种检测人工抗原制备成功与否的方法 | |
| US20150105280A1 (en) | Selector based recognition and quantification system and method for multiple analytes in a single analysis | |
| WO2010086386A1 (en) | Protein quantification methods and use thereof for candidate biomarker validation | |
| Cerasoli et al. | MiS-MALDI: microgel-selected detection of protein biomarkers by MALDI-ToF mass spectrometry | |
| Liu et al. | Integrated system for extraction, purification, and digestion of membrane proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |