CN105755155B - Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用 - Google Patents

Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105755155B
CN105755155B CN201610302672.7A CN201610302672A CN105755155B CN 105755155 B CN105755155 B CN 105755155B CN 201610302672 A CN201610302672 A CN 201610302672A CN 105755155 B CN105755155 B CN 105755155B
Authority
CN
China
Prior art keywords
krt71
gene
lung squamous
product
squamous cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610302672.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105755155A (zh
Inventor
杨承刚
李曙光
林慧芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201610302672.7A priority Critical patent/CN105755155B/zh
Publication of CN105755155A publication Critical patent/CN105755155A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105755155B publication Critical patent/CN105755155B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了KRT71基因作为肺鳞癌转移的诊治标志物的用途。据此可将KRT71基因用于开发诊断肺鳞癌转移的产品、用于开发治疗肺鳞癌转移的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为肺鳞癌转移药物的开发提供新的药物靶点。

Description

KRT71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及KRT71基因在肺鳞癌转移的诊断、治疗中的用途。
背景技术
肺癌分为小细胞肺癌(约占肺癌总数的15％)与非小细胞肺癌(约占肺癌总数的85％)两大组织类型，后者又分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、支气管肺泡癌等。流行病学与病因学研究表明，肺癌的发生是遗传与环境相互作用的结果，环境因素导致的细胞内基因结构及表达水平的改变最终导致了肿瘤的发生，在这一过程中涉及到多基因的共同作用。肿瘤细胞的特点为6个方面，包括:无限增殖能力、对外界抑制增殖信号不敏感、抑制凋亡能力、血管形成能力、侵袭与转移能力及免疫逃逸能力。近年来针对这些方面进行的分子机理研究发现了一系列在恶性肿瘤发生演进过程中起关键作用的癌基因和抑癌基因。
在恶性肿瘤的所有特性中，侵袭与转移是造成患者预后差的重要原因。有研究表明，90％的肺鳞癌病人死于肿瘤的转移。陈首英等针对肺癌所作的5年生存率及生存因素的分析表明，存在远处淋巴转移将明显降低肺癌病人的5年生存率，是影响肺癌病人预后的主要危险因素。因此，研究肿瘤的侵袭与转移机制，以达到抑制或减少肿瘤的转移，对于提高病人生存率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于肺鳞癌转移诊断的分子标志物。使用基因标志物来诊断肺鳞癌转移的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在转移早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测KRT71基因表达的产品在制备诊断肺鳞癌转移的工具中的应用。
进一步，所述检测KRT71基因表达的产品包括检测KRT71基因mRNA水平的产品、和/或检测KRT71蛋白水平的产品。
进一步，所述检测KRT71基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测KRT71基因表达以诊断肺鳞癌转移的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括一对特异扩增KRT71基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括一对特异扩增KRT71基因的引物；所述用免疫检测诊断肺鳞癌转移的产品包括：与KRT71蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断肺鳞癌转移的产品包括：与KRT71基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肺鳞癌转移的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KRT71蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KRT71基因的核酸序列杂交的探针。
所述用实时定量PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括的一对特异扩增KRT71基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述检测KRT71基因表达的产品可以是检测KRT71基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
所述诊断肺鳞癌转移的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肺鳞癌转移的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知KRT71基因的异常与肺鳞癌转移相关也属于KRT71基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断肺鳞癌转移的工具，所述工具包括检测KRT71基因表达的试剂；所述试剂包括检测KRT71基因mRNA的引物和/或探针、检测KRT71蛋白的抗体。
所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KRT71基因转录水平的针对KRT71基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KRT71蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括KRT71基因在内的多个基因(例如，与肺鳞癌转移相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括KRT71蛋白在内的多个蛋白质(例如与肺鳞癌转移相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与肺鳞癌转移的标志物同时检测，可大大提高肺鳞癌转移诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KRT71基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KRT71蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测KRT71基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对KRT71基因的引物和/或探针。根据KRT71基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测KRT71基因表达水平的引物和探针。
所述试纸包括检测KRT71基因表达的试剂。
所述高通量测序平台包括检测KRT71基因表达的试剂。
与KRT71基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述KRT71蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KRT71蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KRT71蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述检测KRT71基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
本发明还提供了KRT71基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗肺鳞癌转移的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制KRT71基因表达的试剂、和/或抑制KRT71基因表达产物的试剂。
进一步，所述抑制KRT71基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制KRT71基因表达产物的试剂包括抑制KRT71基因mRNA的试剂、抑制KRT71蛋白的试剂。所述抑制KRT71基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制KRT71蛋白的试剂包括抑制KRT71蛋白稳定性的试剂、抑制KRT71蛋白活性的试剂、抑制KRT71蛋白功能的试剂。
进一步，抑制KRT71基因mRNA的试剂包括针对KRT71基因mRNA的双链核糖核酸；抑制KRT71蛋白功能的试剂包括KRT71抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制KRT71蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对KRT71基因mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为了确保KRT71基因能够被高效剔除或沉默，根据KRT71基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of WhiteheadInstitute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SullivanExcellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种用于治疗肺鳞癌转移的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的KRT71基因和/或其表达产物的抑制剂。
本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，其中该载体可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料其中之一或两者以上的混合。
本发明的药物组合物可用于制造治疗肺鳞癌转移的药剂。
本发明的药物组合物，其中该哺乳动物可为人类病患。
本发明的药物组合物可例如以口服、注射、涂抹或贴片其中之一方式给予至该人类病患体内。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肺鳞癌转移的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“KRT71基因”包括KRT71基因以及KRT71基因的任何功能等同物的多核苷酸。KRT71基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中KRT71基因(NC_000012.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，KRT71基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述KRT71基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，KRT71基因表达产物包括KRT71蛋白以及KRT71蛋白的部分肽。所述KRT71蛋白的部分肽含有与肺鳞癌转移相关的功能域。
“KRT71蛋白”包括KRT71蛋白以及KRT71蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KRT71蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与KRT71的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，KRT71蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述KRT71蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KRT71蛋白的融合蛋白。对于与KRT71蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KRT71蛋白的生物学活性即可。
本发明的KRT71蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留KRT71蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断肺鳞癌转移”既包括判断受试者是否已经患有肺鳞癌转移、也包括判断受试者是否存在患有肺鳞癌转移的风险。
在本发明的上下文中，“治疗肺鳞癌转移”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了KRT71基因表达与肺鳞癌转移相关，通过检测受试者组织中KRT71的表达，可以判断受试者是否患有肺鳞癌转移、或者判断受试者是否存在患有肺鳞癌转移的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-KRT71基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现肺鳞癌转移的早期诊断，从而降低肺鳞癌转移的死亡率。
附图说明
图1显示利用基因芯片检测KRT71基因在肺鳞癌组织中的表达情况；
图2显示利用Western blot检测KRT71蛋白在肺鳞癌组织中的表达情况；
图3显示利用QPCR检测肺鳞癌细胞中KRT71基因的表达；
图4显示利用QPCR检测siRNA对KRT71基因表达的影响；
图5显示利用Western blot检测siRNA对KRT71蛋白表达的影响；
图6显示干扰KRT71基因表达对肺鳞癌细胞粘附能力的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 KRT71基因的差异表达
1、样本获取：40例肺鳞癌组织(包括20例有转移样本和20例无转移样本)上述样本为肺鳞癌患者的手术切除标本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。组织样本的临床资料包括：性别、年龄、肿瘤大小、病理分级(Edmonson)、转移与否、复发与否等。
2、肺鳞癌转移组织RNA的获取
使用Trizol一步法提取肺鳞癌转移组织总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
3、基因芯片杂交及扫描
总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
4、芯片数据处理与分析
杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
5、统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。
6、结果
结果显示(如图1所示)，与未发生转移的肺鳞癌组织相比，已发生转移的肺鳞癌组织中KRT71基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 KRT71蛋白的差异表达
1、研究对象 同实施例1。
2、提取组织总蛋白
按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
3、Western blot检测
将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
4、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将KRT71蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2所示，与未发生转移的肺鳞癌组织相比，已发生转移的肺鳞癌组织中KRT71蛋白的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 KRT71基因在肺鳞癌细胞系中的表达
1、细胞培养
将肺鳞癌细胞株NCI-H520，NCI-H596，NCI-H2170、NCI-H226于DMEM培养基和10％胎牛血清中培养，将人肺上皮细胞株BEAS-2B于BEGM培养液和10％胎牛血清中培养，置于37℃、5％CO2培养箱中。
2、QPCR
2.1细胞总RNA提取：利用QINGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。
2.2逆转录
利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
2.3QPCR
(1)引物设计
根据Genbank中KRT71基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
KRT71基因：
正向引物为5’-GACTACAAGAAGAGGTATGAG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GTAAGCAGCATCCACATC-3’(SEQ ID NO.4)，
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1 PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃40s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
2.4统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰KRT71基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
2.5结果
如图3所示，与人肺上皮细胞株BEAS-2B相比，肺鳞癌细胞株NCI-H520，NCI-H596，NCI-H2170、NCI-H226中KRT71基因表达明显升高(P<0.05)。
实施例4 抑制KRT71基因表达
1、siRNA设计合成
针对KRT71的siRNA序列：
siRNA1-KRT71：
正义链为5’-UUGAUUUCCUCCUCAUACCUC-3’(SEQ ID NO.7)；
反义链为5’-GGUAUGAGGAGGAAAUCAACA-3’(SEQ ID NO.8)，
siRNA2-KRT71：
正义链为5’-UGUUCUUGCAGUUGUUCAGGU-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链为5’-CUGAACAACUGCAAGAACAAC-3’(SEQ ID NO.10)，
siRNA3-KRT71：
正义链为5’-UUCAUUCUUGGUGUUUUUGAG-3’(SEQ ID NO.11)；
反义链为5’-CAAAAACACCAAGAAUGAAAU-3’(SEQ ID NO.12)
以上siRNA与阴性对照siRNA-NC均由上海吉玛制药技术有限公司提供。
2、肺鳞癌转移细胞的培养与转染
培养NCI-H2170细胞，步骤同实施例3。
将NCI-H2170细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA与KRT71基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
3、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率。
步骤同实施例3。
结果如图4所示，与siRNA2-KRT71、siRNA3-KRT71相比，siRNA1-KRT71能够更有效的抑制KRT71基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，使用siRNA1-KRT71进行后续的实验。
4、Western blot实验检测siRNA1-KRT71的干扰效率
步骤同实施例2。
结果如图5所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA1-KRT71的细胞中KRT71蛋白的含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例5 研究KRT71基因表达对肺鳞癌细胞粘附能力的影响
1、细胞培养与转染同实施例4。
2、细胞粘附实验
将转染48h的NCI-H2170细胞使用0.25％胰酶消化成细胞悬液，以5×104个/ml接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，60min后，37℃PBS洗去未粘附的细胞，MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表粘附活细胞的相对数量。
3、结果
结果如图6所示，与siRNA-NC组相比，siRNA1-KRT71组光吸收值显著下降(P<0.05)。上述实验结果表明抑制KRT71表达能够显著抑制NCI-H2170细胞粘附能力，同时表明KRT71有利于NCI-H2170细胞粘附。
实施例6 研究KRT71基因表达对肺鳞癌细胞迁移、侵袭能力的影响
1、细胞培养与转染同实施例4。
2、迁移实验
转染48h的NCI-H2170细胞使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入transwell小室中，下层小室加入10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
3、侵袭实验
转染48h的NCI-H2170细胞使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入经过铺基质胶的transwell小室中，下层小室加入10％FBS的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
4、结果
迁移实验：与siRNA-NC组相比，siRNA1-KRT71组穿过transwell小室基底膜的细胞减少了62％。
侵袭实验：与siRNA-NC组相比，siRNA1-KRT71组穿过已经铺过基质胶的transwell小室基底膜的细胞减少了58％。
上述实验结果表明，抑制KRT71表达能够显著抑制NCI-H2170细胞迁移、侵袭能力，同时表明KRT71基因表达有利于NCI-H2170细胞的迁移和侵袭。
实施例7 肺鳞癌细胞抗体中和实验
1、细胞培养同实施例4。
2、迁移实验
将细胞分为两个处理组：
实验组1(对照组)：NCI-H2170细胞中加入无关单抗(1:50)；
实验组2：NCI-H2170细胞中加入抗人KRT71单抗(1:50)。
将NCI-H2170细胞在37℃、5％CO2培养箱孵育作用24小时后，使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入transwell小室中，下层小室加入10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
3、侵袭实验
将细胞分为两个处理组：
实验组1(对照组)：NCI-H2170细胞中加入无关单抗(1:50)；
实验组2：NCI-H2170细胞中加入抗人KRT71单抗(1:50)。
将NCI-H2170细胞在37℃、5％CO2培养箱孵育作用24小时后，使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入经过铺基质胶的transwell小室中，下层小室加入10％FBS的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
4、结果
迁移实验：与对照组相比，抗人KRT71单抗的细胞组穿过transwell小室基底膜的细胞减少了54％。
侵袭实验：与对照组相比，抗人KRT71单抗的细胞组穿过已经铺过基质胶的transwell小室基底膜的细胞减少了52％。
上述实验结果表明，抑制KRT71蛋白功能能够显著抑制NCI-H2170细胞迁移、侵袭能力，同时表明KRT71蛋白有利于NCI-H2170细胞的迁移和侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.检测KRT71基因表达的产品在制备诊断肺鳞癌转移的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测KRT71基因表达以诊断肺鳞癌转移的产品；所述用RT-PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括一对特异扩增KRT71基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括一对特异扩增KRT71基因的引物；所述用免疫检测诊断肺鳞癌转移的产品包括：与KRT71蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断肺鳞癌转移的产品包括：与KRT71基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肺鳞癌转移的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KRT71蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KRT71基因的核酸序列杂交的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断肺鳞癌转移的产品至少包括的一对特异扩增KRT71基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测KRT71基因表达的试剂；所述试剂包括检测KRT71基因mRNA的引物和/或探针、检测KRT71蛋白的抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测KRT71基因mRNA的引物包括SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
6.KRT71基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗肺鳞癌转移的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制KRT71基因表达的试剂、和/或抑制KRT71基因表达产物的试剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制KRT71基因表达产物的试剂包括抑制针对KRT71基因的siRNA、和/或KRT71蛋白的抗体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述针对KRT71基因的siRNA序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
CN201610302672.7A 2016-05-09 2016-05-09 Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用 Active CN105755155B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610302672.7A CN105755155B (zh) 2016-05-09 2016-05-09 Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610302672.7A CN105755155B (zh) 2016-05-09 2016-05-09 Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105755155A CN105755155A (zh) 2016-07-13
CN105755155B true CN105755155B (zh) 2019-08-13

Family

ID=56323769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610302672.7A Active CN105755155B (zh) 2016-05-09 2016-05-09 Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105755155B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104250297A (zh) * 2014-09-15 2014-12-31 青岛农业大学 一对特异识别绵羊krt25基因的多肽及其编码基因和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110016542A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Canine genome editing with zinc finger nucleases
US20120258125A1 (en) * 2011-04-06 2012-10-11 Lancell, L.L.C. Method to identify a novel class of immunologic adjuvants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104250297A (zh) * 2014-09-15 2014-12-31 青岛农业大学 一对特异识别绵羊krt25基因的多肽及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
先天性秃发/少毛症的遗传学研究进展;宋闯等;《临床皮肤科杂志》;20141231;第43卷(第12期);第753-758页

Also Published As

Publication number Publication date
CN105755155A (zh) 2016-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104080924A (zh) 用于治疗和诊断乳腺癌的方法和组合物
CN105779598B (zh) 一种诊治垂体瘤的分子标志物
CN105648076B (zh) Nudt11基因及其表达产物作为子宫肌瘤的诊治靶标
CN106947809B (zh) C6orf58基因在制备舌鳞癌诊治产品中的应用
CN106636443A (zh) Dnah14基因在肿瘤诊治中的应用
CN105886625B (zh) Chka基因在制备食管癌诊治产品中的应用
CN105200137B (zh) Cers2基因及其表达产物作为骨质疏松症的诊治靶标
CN105603085B (zh) 椎间盘退行性病变的诊治靶标
CN105385779B (zh) 与直肠腺癌相关的基因标记物
CN105755155B (zh) Krt71基因表达产物在制备肺鳞癌转移诊治产品中的应用
CN105648103B (zh) Vsig10l基因作为肺鳞癌转移诊治标志物的用途
CN105838797B (zh) 一种诊治食管癌的分子标志物
CN105755154A (zh) 区分转移性与非转移性肺鳞癌的分子标志物
CN105506169B (zh) 子宫肌瘤诊治标志物
CN105331690B (zh) Epb41l4b基因在帕金森病诊治中的应用
CN108034713A (zh) 绝经后骨质疏松症诊疗靶点及其应用
CN105296622B (zh) Lmnb2基因及其表达产物作为鼻咽癌的诊治靶标
CN106702002A (zh) 一种用于肺腺癌诊治的生物标志物
CN105861741B (zh) Senp3基因及其表达产物作为食管癌的诊治靶标
CN105385754B (zh) 一种与胆管癌相关的分子标记物
CN105506170B (zh) Sav1基因作为子宫肌瘤诊治标志物的用途
CN104894259A (zh) Tex19基因在胆管癌诊断和治疗中的应用
CN105734146B (zh) 一种诊治肺鳞癌转移的分子标志物
CN105648061B (zh) Hrnbp3基因及其表达产物在疾病中的新用途
CN105400895B (zh) Shisa4基因作为椎间盘退行性病变诊治标志物的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 1210, Building 3, Ronghua Xintai Building, 10 Ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

Address before: 100080 Beijing city Haidian District Shanyuan Street No. 1 cubic court building room 3103

Applicant before: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

CB02 Change of applicant information
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211117

Address after: 266000 room 2503, Qianshan building, D2, Qingdao International Innovation Park Phase II, No.1 Keyuan Weiyi Road, Laoshan District, Qingdao City, Shandong Province

Patentee after: Qingdao Yangshen biomedical Co.,Ltd.

Address before: Room 1210, building 3, Ronghua Xintai building, 10 ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Patentee before: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right