CN105755006A - 飞蝗翅特异表皮蛋白基因及其dsRNA的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种飞蝗翅特异表皮蛋白基因及其dsRNA的应用。该基因dsRNA可沉默特定的翅表皮蛋白基因使飞蝗翅发育异常，最终死亡。具体通过对飞蝗的表皮蛋白基因进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1的翅表皮蛋白基因，RT?PCR和western blot结果显示其在飞蝗翅组织中特异性存在；然后选择序列为SEQ ID NO：2的该基因片段，用于双链RNA(dsRNA)的合成。该基因dsRNA注入飞蝗若虫体腔后，蜕皮后成虫的翅发育异常，表现为发育畸形、皱缩，最终导致死亡。本发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的靶标。

Description

飞蝗翅特异表皮蛋白基因及其dsRNA的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及飞蝗翅特异表皮蛋白基因及其dsRNA的应用。
背景技术
害虫是我国农业生产的大敌，对于一些有害昆虫而言，由于其具有翅可以在陆地之间长距离迁移飞行，从而在觅食、求偶、避敌和扩大分布效率等方面都得到大幅度提高，这一习性已成为有些害虫异地成灾的主要原因。长期施用化学杀虫剂，导致农药残留、环境污染严重、昆虫出现抗药性、危害人类身体健康等一系列问题。随着社会的发展，迫切需要新型的害虫防治方法。
近年来基于RNA干扰(RNAi)害虫防治技术正在高速发展。该方法有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。
针对有翅害虫群集性和迁飞性的特点，并且针对其独特蜕皮现象设计害虫防治方案，即可以高效除害，又避免了环境污染，安全可靠。昆虫的体壁具有十分重要的保护作用和生理功能，体壁形成相对封闭的内环境，使得虫体内部结构得到外层屏障的保护，并且能够起到抑制水分蒸发和抵御外界环境影响等作用。蛋白质是昆虫体壁的重要组成成分，其成分的缺失或含量变化都会引起表皮功能异常甚至功能丧失，从而影响昆虫的生长发育。翅表皮蛋白是昆虫翅的结构蛋白,在昆虫蜕皮过程中对翅的结构形成具有关键作用。因此，利用有害昆虫翅表皮蛋白的重要生物学功能来进行害虫防治，省时省力，安全高效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种飞蝗翅特异表皮蛋白基因及其dsRNA在致死害虫中的应用。
本发明提供的一种飞蝗翅表皮蛋白基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：1。该序列是通过对飞蝗转录组的搜索，得到1条飞蝗表皮蛋白基因片段，通过末端序列快速扩增(RACE)后，进一步克隆获得全长cDNA序列。该序列长509bp，包含444bp开放阅读框，编码147氨基酸。RT-PCR和westernblot结果显示其在飞蝗翅组织中特异性存在，表明获得的该基因是飞蝗翅特异表皮蛋白基因。
本发明提供的一种飞蝗翅特异表皮蛋白基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：2，是根据SEQIDNO：1设计的上游引物SEQIDNO：3和下游引物SEQIDNO：4，通过PCR扩增获得SEQIDNO：2，其产物含有T7启动子。产物经纯化后按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。
SEQIDNO：2合成的dsRNA在飞蝗防治中的应用：注射上述dsRNA到飞蝗若虫体腔，结果表明：SEQIDNO：2合成的dsRNA可以特异性地沉默飞蝗翅特异表皮蛋白基因LmACP7的mRNA表达，并导致成虫的翅发育异常，表现为发育畸形、皱缩，最终导致死亡。
附图说明
图1：根据SEQIDNO：1设计合成引物分别从转录水平和翻译水平检测飞蝗翅表皮蛋白基因LmACP7在成虫不同组织中的表达：A、RT-PCR从转录水平检测LmACP7在不同组织表达，B、westernblot从翻译水平检测LmACP7在不同组织表达。Epidermis：表皮；Gonad：生殖腺；Leg：足；Tentacle：触角；Wing：翅；Gut：肠道；Malpighiantubules：马氏管；Fatbody：脂肪体；Muscle：肌肉。
图2：5龄飞蝗注射SEQIDNO：2合成的dsRNA，蜕皮后成虫翅出现发育异常的表型。A：左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO：2合成的dsRNA，即dsLmACP7；B：解剖的对照组(dsGFP)和处理组(dsLmACP7)成虫前、后翅的表型图。
图3：飞蝗注射SEQIDNO：2合成的dsRNA24小时后，飞蝗翅特异表皮蛋白基因LmACP7的mRNA沉默情况，β-actin做为内参基因。**P<0.01。
具体实施方式
实施例1：飞蝗翅表皮蛋白基因的序列、组织表达及其dsRNA的获得
1、飞蝗翅表皮蛋白基因的序列获得及其组织表达分析
1)飞蝗翅表皮蛋白基因的序列在飞蝗转录组数据库的搜索
基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗翅表皮蛋白基因的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，获得飞蝗翅表皮蛋白基因的序列片段。
2)飞蝗翅表皮蛋白基因的全长cDNA序列获得
基于已获得的飞蝗翅表皮蛋白基因序列，采用primerpremier5.0软件设计5’RACE引物。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取飞蝗成虫翅的总RNA，用RACE试剂盒合成RACE模板，用于全长cDNA序列调取。经PCR后，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送去测序。结果分析后，拼接得到飞蝗翅表皮蛋白基因LmACP7cDNA全长序列，其序列为SEQIDNO：1。
3)飞蝗翅表皮蛋白基因组织表达分析
基于SEQIDNO：1，按照上述方法设计合成原核表达引物并进行原核表达获得LmACP7重组蛋白，送去北京华大蛋白质研发中心有限公司制备多克隆抗体，同时设计合成RT-PCR引物，然后解剖飞蝗成虫翅、表皮、足、触角、马氏管、肠道、肌肉、生殖腺和脂肪体组织一部分用于提取总RNA，反转录成cDNA，另一部分提取组织细胞总蛋白，分别进行RT-PCR和westernblot检测，结果显示无论是在转录水平还是在翻译水平其均在飞蝗翅组织中特异性存在(图1中A、B)，表明获得的该基因是飞蝗翅特异表皮蛋白基因。
2、飞蝗翅特异表皮蛋白基因dsRNA合成
1)飞蝗翅特异表皮蛋白基因dsRNA引物的设计
基于获得的飞蝗翅特异表皮蛋白基因序列SEQIDNO：1，采用primerpremier5.0软件设计dsRNA引物，其上下游引物序列分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
2)飞蝗翅特异表皮蛋白基因dsRNA的合成
利用上述dsRNA引物进行PCR扩增，产物经GelExtractionKit(sigma)试剂盒纯化后按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。采用NaNoDrop2000(Thermoscientific)测定dsRNA浓度，使其终浓度为2μg/μl。
实施例2：飞蝗翅特异表皮蛋白基因dsRNA致使成虫翅发育异常
1、飞蝗翅特异表皮蛋白基因dsRNA注射
将5μl(10μg)SEQIDNO：2的dsRNA用25μl规格微量注射器注射到5龄飞蝗第2日龄若虫二、三腹节之间，共注射60只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后飞蝗置于30℃恒温生化培养箱中饲养。
2、注入dsRNA后飞蝗翅组织表型的观察
5龄若虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组6天后开始蜕皮并全部成功蜕至成虫，蜕至成虫后虫体形态活力正常，并于半天后开始正常进食。注射dsLmACP7的处理组若虫共60头，与对照组若虫相比，其中大约36％成虫前后翅皱缩畸形，蜕皮困难，最终死亡(图2中A)，具体表现在前、后翅皱缩、不能展开、变薄变脆(图2中B)。
3、飞蝗翅特异表皮蛋白基因沉默检测
选择注射dsRNA后24h的5龄若虫进行沉默效率检测，若虫翅芽作为RNA提取对象，每组设置3个生物学重复。提取的总RNA并反转录成第一链cDNA，Real-timePCR检测目的基因(LmACP7)和管家基因(β-actin)的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率。结果表明，与对照组比较，注射dsRNA后，处理组飞蝗翅特异表皮蛋白基因表达量极显著降低(图3)。

Claims (5)

1.一种飞蝗翅特异表皮蛋白基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：1。
2.一种飞蝗翅特异表皮蛋白基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：2。
3.如权利要求2所述的飞蝗翅特异表皮蛋白基因合成的dsRNA。
4.如权利要求3所述dsRNA的获得方法，步骤为：根据SEQIDNO：1设计的上游引物SEQIDNO：3和下游引物SEQIDNO：4，通过PCR扩增获得SEQIDNO：2，其产物含有T7启动子；产物经纯化后按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。
5.如权利要求3所述的飞蝗翅特异表皮蛋白基因的dsRNA在飞蝗防治中的应用。
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