CN105754969A - β-半乳糖苷酶突变体及其相关生物材料与应用 - Google Patents

β-半乳糖苷酶突变体及其相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β?半乳糖苷酶突变体及其相关生物材料与应用。本发明所提供的β?半乳糖苷酶突变体，其名称为β?Gal?2，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有β?半乳糖苷酶活性的蛋白质。该突变体具有适应性强、耐热性高、水解能力好、金属离子对酶活性影响较小等特点。其中，耐热性这一特点极为突出，在60℃时该突变体的酶活性还能保持80％以上。且利用乳酸菌作为宿主表达该突变体不需要额外的有毒诱导剂，同时成本低廉，表达量高，具有较好的工业应用前景。

Description

β-半乳糖苷酶突变体及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的一种β-半乳糖苷酶突变体及其相关生物材料与应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)通常被称为乳糖酶，各种动植物和微生物中广泛存在。这种酶能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，同时也具有半乳糖苷的转移作用。牛奶和乳清中的主要成分就是乳糖，其大约占牛奶干物质的30％，但溶解度低，在20℃水中溶解度仅为20％，而其甜度仅及蔗糖的16％，久存的乳制品由于乳糖析出，呈砂样感觉，影响风味。此外，许多成人，特别是婴儿(因人种而异，西欧占2-8％，亚洲、非洲占60-90％)体内缺乏乳糖酶，因此他们很难消化牛奶，饮用牛奶后，乳糖到了肠里，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，使肠道膨胀，并刺激肠道蠕动，使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称作乳糖不耐受症。
乳糖酶最初是利用其水解乳糖的特性降低乳制品中的乳糖含量，后来主要用来治疗乳糖不耐受症、处理加工牛乳、乳清等，以及生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及减少环境污染等。除此之外，在软饮料、三明治和纺织品上浆中水解乳清或乳糖都起着非常重要的作用。由此可见，乳糖酶无论是在工业生产还是在食品行业都有着广泛的应用前景。然而，市场上销售的乳糖酶主要通过酵母系统表达获得，由于耐热性差，适用范围窄，无法满足食品行业的各种需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高β-半乳糖苷酶的耐热性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种β-半乳糖苷酶突变体，其名称为β-Gal-2，该酶，在40℃～60℃范围内均具有较高的酶活力。
本发明所提供的β-Gal-2，为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质；
A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有β-Gal-2活性的蛋白质。
其中，SEQIDNo.1所示的蛋白质由1026个氨基酸残基组成。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(A2)中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQIDNo.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与所述β-Gal-2相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种；
B1)编码上述β-Gal-2的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞系、含有B2)所述表达盒的重组细胞系、或含有B3)所述重组载体的重组细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述与所述β-Gal-2相关的生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)-3)中任一所示的基因：
1)核酸序列是SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子；
2)编码序列是SEQIDNo.2第14-3094位所示的DNA分子或cDNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性，且编码所述β-Gal-2的DNA分子或cDNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述β-Gal-2的DNA分子或cDNA分子。
其中，序列表中的SEQIDNo.2由3105个核苷酸组成，编码序列表中SEQIDNo.1所示的蛋白质。
上述用于编码所述β-Gal-2的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述β-Gal-2的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述β-Gal-2的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码β-Gal-2，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达β-Gal-2的DNA，该DNA不但可包括启动β-Gal-2基因转录的启动子，还可包括终止β-Gal-2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述的含有β-Gal-2基因的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pNZ8149的多克隆位点插入β-半乳糖苷酶编码基因得到的重组表达载体。所述的重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。细菌可具体为乳酸菌NZ3900或大肠杆菌E.coliDH5α。所述的转基因细胞系不包括动物植物的繁殖材料。
本发明的又一个目的是提供了上述蛋白质在作为β-半乳糖苷酶中的应用。所述应用不包括疾病诊断和/或治疗目的的应用。
本发明的再一个目的是提供了上述蛋白质及其生物材料在制备β-半乳糖苷酶中的应用。
本发明的再一个目的是提供了上述蛋白质在水解乳糖中的应用。所述应用不包括疾病诊断和/或治疗目的的应用。
本发明的再一个目的是提供了上述蛋白质及其生物材料在制备用于水解乳糖的产品中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了制备β-半乳糖苷酶的方法。
本发明所提供的制备β-半乳糖苷酶的方法包括将上述蛋白质(β-半乳糖苷酶)的编码基因在生物细胞中进行表达得到上述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
为解决上述技术问题，本发明再提供了制备表达上述蛋白质的重组微生物的方法，包括将上述蛋白质的编码基因导入受体微生物细胞，得到表达上述蛋白质的重组微生物的步骤。
上述制备表达上述蛋白质的重组微生物的方法中，所述受体微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。所述细菌可具体为乳酸菌NZ3900或大肠杆菌E.coliDH5α。
本发明中所涉及的β-Gal-2比SEQIDNo.7所示的β-半乳糖苷酶耐热。
本发明提供了一种β-半乳糖苷酶突变体，其名称为β-Gal-2，该突变体是通过将野生型β-半乳糖苷酶自N末端第523位的丝氨酸突变为精氨酸(S523R)获得的。实验证明，本发明所提供的β-Gal-2具有适应性强、耐热性高、水解能力好、金属离子对酶活性影响较小等特点。其中，耐热性这一特点极为突出，在60℃时，β-Gal-2的酶活性还能保持80％以上，而野生型β-半乳糖苷酶的酶活性仅为22.6％。并且利用乳酸菌作为宿主表达所述突变体，不需要加额外的有毒诱导剂，培养时间短，设备要求简单，同时成本低廉，表达量高，产物纯化简单。因此，具有较好的工业应用前景，值得推广使用。
附图说明
图1为酚蓝筛选空载体pNZ8149转化乳酸菌的结果。
图2为酚蓝筛选重组表达质粒pNZ8149-β-Gal-2转化乳酸菌的结果。
图3为β-半乳糖苷酶突变体的电泳分析。
其中，1为转空载体的乳酸菌菌株NZ3900/pNZ8149诱导表达β-半乳糖苷酶；2为Marker；3为转pNZ8149-β-Gal-2的乳酸菌菌株诱导表达β-半乳糖苷酶。
图4为不同金属离子对不同β-半乳糖苷酶的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
原始菌株以及载体：乳酸菌载体那pNZ8149、乳酸菌NZ3900菌株，购买北京拜尔迪生物公司。
酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，底物购自Sigma公司，其它均为国产试剂。
乳酸菌培养基：奥博星公司生产的M17、MRS培养基。
实施例1、β-半乳糖苷酶突变体及其编码基因的获得
为了提高野生型β-半乳糖苷酶(命名为β-Gal-1)的耐热性，对β-Gal-1的氨基酸序列的下列位点进行了突变：第523位的氨基由丝氨酸突变为精氨酸(S523R)；缺失第512-533位的氨基酸残基(Del(512-533))；第537位的氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺(K537N)；第414位氨基酸由甘氨酸突变为半胱氨酸(G414C)。有选择地只突变第523位氨基酸(S253R)。有选择地缺失第512-533位的氨基酸残基(Del(512-533))同时突变第537位的氨基酸(K537N)。有选择地缺失第512-533位的氨基酸残基(Del(512-533))同时突变第537位和414位的氨基酸(K537N和G414C)。具体的野生型β-半乳糖苷酶的突变体分别为β-Gal-2、β-Gal-3和β-Gal-4，具体的蛋白质突变位点如表1所示。
表1、β-半乳糖苷酶突变设计
合成SEQIDNo.8所示的β-半乳糖苷酶(野生型β-半乳糖苷酶)基因，其编码序列是SEQIDNo.8的第14-3094位所示，编码SEQIDNo.7所示的蛋白质β-Gal-1(野生型β-半乳糖苷酶)。
合成SEQIDNo.2所示的β-Gal-2基因，其编码序列是SEQIDNo.2的第14-3094位所示，编码SEQIDNo.1所示的蛋白质β-Gal-2。β-Gal-2是将β-Gal-1的第523位氨基酸残基由丝氨酸取代为精氨酸，其它氨基酸残基不变得到的野生型β-半乳糖苷酶的突变体。
合成SEQIDNo.4所示的β-Gal-3基因，其编码序列是SEQIDNo.4的第14-3031位所示，编码SEQIDNo.3所示的蛋白质β-Gal-3。β-Gal-3是将β-Gal-1的第515-523位氨基酸残基缺失，同时将第537位的氨基酸由赖氨酸取代为天冬酰胺，其它氨基酸残基不变得到的野生型β-半乳糖苷酶的突变体。
合成SEQIDNo.6所示的β-Gal-4基因，其编码序列是SEQIDNo.6的第14-3031位所示，编码SEQIDNo.5所示的蛋白质β-Gal-4。β-Gal-4是将β-Gal-3的第414位氨基酸残基由甘氨酸取代为半胱氨酸，其它氨基酸残基不变得到的野生型β-半乳糖苷酶的突变体。
实施例2、β-半乳糖苷酶的制备
一、β-半乳糖苷酶重组表达载体的构建
利用NcoⅠ和KpnⅠ分别双酶切SEQIDNo.8所示的DNA分子、SEQIDNo.2所示的DNA分子、SEQIDNo.4所示的DNA分子和SEQIDNo.6所示的DNA分子，得到分别含有β-Gal-1、β-Gal-2、β-Gal-3和β-Gal-4的编码基因的DNA片段，将含有β-Gal-1、β-Gal-2、β-Gal-3和β-Gal-4的编码基因的DNA片段进行回收纯化。
将纯化后的含有β-Gal-1、β-Gal-2、β-Gal-3和β-Gal-4的编码基因的DNA片段分别与NcoⅠ和KpnⅠ双酶切乳酸菌载体pNZ8149获得的乳酸菌载体pNZ8149大片段连接，转化DH5α感受态细胞，用酶切鉴定法挑选阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，将测序结果表明是用SEQIDNo.8第14-3094位所示的β-Gal-1的编码基因替换pNZ8149的NcoⅠ和KpnⅠ识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pNZ8149-β-Gal-1；将测序结果表明是用SEQIDNo.2第14-3094位所示的β-Gal-2编码基因替换pNZ8149的NcoⅠ和KpnⅠ识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pNZ8149-β-Gal-2；将测序结果表明是用SEQIDNo.4第14-3031位所示的β-Gal-3编码基因替换pNZ8149的NcoⅠ和KpnⅠ识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pNZ8149-β-Gal-3；将测序结果表明是用SEQIDNo.6第14-3031位所示的β-Gal-4编码基因替换pNZ8149的NcoⅠ和KpnⅠ识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pNZ8149-β-Gal-4。
二、β-半乳糖苷酶的获得
将重组表达载体pNZ8149-β-Gal-1、pNZ8149-β-Gal-2、pNZ8149-β-Gal-3、pNZ8149-β-Gal-4以及空载体pNZ8149分别转化宿主乳酸菌NZ3900，利用酚蓝颜色变化(转化成功载体能利用乳糖使酚蓝颜色变黄)进行筛选(图1和2)，获得重组菌NZ3900/pNZ8149-β-Gal-1、NZ3900/pNZ8149-β-Gal-2、NZ3900/pNZ8149-β-Gal-3、NZ3900/pNZ8149-β-Gal-4和阴性对照菌株NZ3900/pNZ8149。
取重组菌NZ3900/pNZ8149-β-Gal-1、NZ3900/pNZ8149-β-Gal-2、NZ3900/pNZ8149-β-Gal-3、NZ3900/pNZ8149-β-Gal-4和阴性对照菌株NZ3900/pNZ8149分别接种于400mLMRS培养液中，在37℃条件下，静置培养36h后，得到分别含有4种重组菌的培养液和阴性对照菌株的培养液。
将5种培养液分别离心收集上清液，进行SDS-PAGE，结果表明，β-Gal-1、β-Gal-2、β-Gal-3和β-Gal-4在乳酸菌中均得到了表达，而NZ3900/pNZ8149的培养液上清液中未检测到β-半乳糖苷酶(图3)。
同时，将4种重组菌的种培养液以10000r/min转速离心10分钟除去菌体，取上清液作为粗酶液，分别上HiTrap-Q-Sepharose-XL(AmershamPharmaciaBiotech预装柱)阴离子柱。加样2mL，先用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)洗脱平衡柱子，再用相同缓冲液配制的0.6mol/LNaCl梯度洗脱10个柱床(大约50mL)，流速为5mL/min，分步收集，每管lmL，得到4种纯化后的β-半乳糖苷酶。然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。表达后的β-半乳糖苷酶突变体经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。β-半乳糖苷酶突变体的分子量约为114kD，与其理论分子量相符。
实施例3、β-半乳糖苷酶的生物学特性检测
一、β-半乳糖苷酶的酶活性测定
通过测定水解底物ONPG释放硝基酚的量对实施例2中的4种β-半乳糖苷酶进行酶活测定。将实施例2中获得的4种纯化的β-半乳糖苷酶稀释100倍。分别取100μL稀释后的β-半乳糖苷酶稀释液和1.8mL50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)，在37℃下预热5min，然后加入100μL20mM的ONPG进行反应。反应10min后加入1mL的Na2CO3溶液(1mol/L)，反应终止。
分通过测定A420光吸收值的方法对释放的硝基酚进行定量检测。实验设3次重复。β-半乳糖苷酶活性单位定义为在37℃下，pH值为6.5的条件下，每分钟分解底物生成1μmol硝基酚所需的酶量为1个活性单位(U)。4种β-半乳糖苷酶的比活力见表2。
表24种β-半乳糖苷酶的酶活活性
名称 比活力(IU/mg)
β-Gal-1 2312.15
β-Gal-2 2360.75
β-Gal-3 1888.96
β-Gal-4 133.69
由表2可知，β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-2的酶活性好，能够达到2360.75IU/mg，与野生型β-半乳糖苷酶β-Gal-1的酶活性没有显著差异；而β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-4的酶活性最差，仅为133.69IU/mg。
二、β-半乳糖苷酶的酶学性质检测
1、pH值对β-半乳糖苷酶的影响
设置pH5.5-9.0的梯度缓冲液(pH5.5-8.0柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，pH8.0-9.0Tris-HCl系列缓冲液)，实施例2中所获得4种纯化的β-半乳糖苷酶分别在各pH梯度缓冲液中37℃条件下温育10min，测定酶活。以表2中各自的酶活力为100％，绘制酶活力pH曲线。除酶反应pH不同外，β-半乳糖苷酶酶活测定方法的其它条件与步骤一中β-半乳糖苷酶酶活测定相同。
结果表明：β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-2的最适pH值与野生型β-半乳糖苷酶β-Gal-1的一致，均为6.5；而β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-3和β-Gal-4最适pH值较野生型β-半乳糖苷酶β-Gal-1的提高了0.5个值，为7.0。并且β-Gal-2在pH值为6.5-8.5的条件下能够保持92％以上的酶活，这说明该突变体具有较好的pH稳定性。
2、温度对β-半乳糖苷酶的影响
在各自最适宜pH柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系以及不同温度(40-60℃)下进行4种β-半乳糖苷酶的酶促反应，反应30min，测定各自的酶活力。以表2中各自的酶活力为100％，计算4种酶在其它温度条件下的相对酶活力。除酶反应温度和时间不同外，β-半乳糖苷酶酶活测定方法的其它条件与步骤一中β-半乳糖苷酶酶活测定相同。
结果(表3)表明：随着温度的增加4种β-半乳糖苷酶的酶活性将逐渐损失，当温度达到60℃时，β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-2的酶活性还能保留80％以上，而野生型β-半乳糖苷酶β-Gal-1、β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-3和β-Gal-4的酶活性仅为35％以下。可见，除β-半乳糖苷酶突变体β-Gal-2以外的3种β-半乳糖苷酶的酶活性随温度的升高，酶活性损失严重。由此可见，β-Gal-2具有较好的耐热性，可以应用于牛奶的生产工艺中。
表34种β-半乳糖苷酶在不同温度下的稳定性
温度 β-Gal-1(％) β-Gal-2(％) β-Gal-3(％) β-Gal-4(％)
40℃ 83.8 98.5 90.0 83.2
50℃ 80.0 90.3 82.5 78.1
60℃ 22.6 81.3 34.6 12.1
3、金属离子对β-半乳糖苷酶的影响
通过分别在反应体系中加入5mM浓度的不同金属离子，来测定4种β-半乳糖苷酶对金属离子的抗性。结果(图4)表明，高浓度Cu2+、K+、Ca2+、Fe2+对4种β-半乳糖苷酶的酶活性均有抑制作用；而牛奶中存在的各种离子如Mn2+、Mg2+、Na2+等对4种β-半乳糖苷酶的酶活性酶活性基本没有影响，或影响轻微。
综上所述，本发明提供的β-Gal-2具有适应性强，耐热性高，且本发明采用的乳酸菌作为诱导剂诱导所述β-半乳糖苷酶表达，不需要加额外的有毒诱导剂，培养时间短，设备要求简单，同时乳酸菌是比较安全的基因工程菌宿主，培养基成本低廉，表达量高，产物纯化简单。通过测量收集到的β-Gal-2发现其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上，然后对所述β-Gal-2的活性、酶学性质、各种金属离子对所述嗜热乳糖突变酶的影响以及所述嗜热乳糖突变酶在人工胃液中的稳定性分别进行了测试，得到的结果均是β-Gal-2具有良好的活性和PH稳定性，水解能力好，耐热性好，金属离子对酶活性影响较小等特点，具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.蛋白质，为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质；
A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种；
B1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞系、含有B2)所述表达盒的重组细胞系、或含有B3)所述重组载体的重组细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)-3)中任一所示的基因：
1)核酸序列是SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子；
2)编码序列是SEQIDNo.2第14-3094位所示的DNA分子或cDNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质在作为β-半乳糖苷酶中的应用。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备β-半乳糖苷酶中的应用。
6.权利要求1所述蛋白质在水解乳糖中的应用。
7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备用于水解乳糖的产品中的应用。
8.制备β-半乳糖苷酶的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
9.权利要求4或5所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述β-半乳糖苷酶比SEQIDNo.7所示的β-半乳糖苷酶耐热。
10.制备表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物细胞，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的步骤。
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