CN105753961A - 一种抑癌142aa多肽及其载体和应用 - Google Patents

一种抑癌142aa多肽及其载体和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105753961A
CN105753961A CN201610207973.1A CN201610207973A CN105753961A CN 105753961 A CN105753961 A CN 105753961A CN 201610207973 A CN201610207973 A CN 201610207973A CN 105753961 A CN105753961 A CN 105753961A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
cancer
tumour
carrier
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610207973.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105753961B (zh
Inventor
沈爱国
万春华
林志鹏
倪润洲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZHONGSHI DUQING (SHANDONG) BIOTECH Co.,Ltd.
Original Assignee
Nantong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nantong University filed Critical Nantong University
Priority to CN201610207973.1A priority Critical patent/CN105753961B/zh
Publication of CN105753961A publication Critical patent/CN105753961A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105753961B publication Critical patent/CN105753961B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抑癌142aa多肽及其载体和应用。本发明基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径发明一段含有142个氨基酸的多肽，将多肽编码序列克隆到pcDNA3.1真核表达载体，经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，对多肽的抗肿瘤功能进行研究，细胞学实验和动物实验，表明此多肽具有抑制肿瘤细胞周期，进而抑制肿瘤细胞生长的重要抗癌功能，具有很好的药物用途。

Description

一种抑癌142aa多肽及其载体和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种抑癌142aa多肽及其载体和应用。
背景技术
据统计，全球每年约有1百万的肝癌病例被报道，并有约74.5万的肝癌患者死亡。我国是肝癌的高发地区，全球55％的肝癌发生在我国，其死亡率在肿瘤性疾病中居第三位已成为危害人类健康的主要疾病，肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是肝癌的主要类型，约占肝癌病例的90％。因此，加强治疗肝癌的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。在肝癌的进展过程中，某些基因的表达发生变化，是癌症发生发展的关键基因，成为癌症治疗的潜在靶点。
多肽药物是目前生物医药领域最具成长性的崭新领域，以其高效、安全、特异性强等特点逐渐用于癌症，传染病等预防和治疗。基因的功能最终要通过其表达产物——蛋白质来实现，生物体的一切活动或功能都离不开蛋白质的物质基础。发现和鉴定具有重要功能的蛋白质，可为新药的开发带来决定性的影响。并且多肽类药物具有分子量小，在人体内不结存，无副作用，免疫原性小，活性好等优点成为一个研究的热点。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种多肽，具有抑癌效应，满足生物医药使用需求。本发明的另一目的是提供一种表达上述多肽的载体。本发明还有一目的是提供上述多肽的用途。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑癌142aa多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述的抑癌142aa多肽的编码基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。
含有所述的抑癌142aa多肽的编码基因的载体。
所述的抑癌142aa多肽在制备抗癌药物中的应用。
在本发明人的前期研究发现，肝癌组织中的表达蛋白缺少某段多肽序列后减缓了肿瘤生长的速度，故推测此多肽具有抑癌效应。所以，在本发明中利用基因重组技术，将142个氨基酸(aminoacid)多肽对应的DNA序列重组到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。将表达多肽序列的重组真核载体转染到肿瘤细胞中，证明其独特的抑制肿瘤生长和减缓肿瘤发生的抗肿瘤效应。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径发明一段含有142个氨基酸的多肽，将多肽编码序列克隆到pcDNA3.1真核表达载体，经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，对多肽的抗肿瘤功能进行研究，细胞学和小鼠体内实验表明此多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型的发生与生长的重要抗癌功能，具有很好的药物用途。
附图说明
图1是免疫印迹检测结果图；
图2是免疫沉淀实验结果图；
图3是重组多肽对p27表达影响结果图；
图4是CCK-8实验结果图；
图5是克隆形成实验结果图；
图6是细胞周期流式分析结果图；
图7是裸鼠成瘤结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1重组肽的克隆载体构建
提取人肝癌细胞HepG2的Prdx1的mRNA，体外逆转录成cDNA(环状DNA)，以此为模板，分别连接上下游引物5’-GGATCCAGATGGTAGGCTCCCCTGGTCCTCTA-3’,5’-CTCGAGTCACTGGGGCAGAGGGGG-3’。通过PCR扩增得到142aa的目的片段，并与pGEMT-easy载体(市售)连接后，涂布于含有氨苄霉素的LB固培上培养，并挑取克隆。摇菌扩增，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。经测序，获得该多肽的氨基酸序列，如SEQIDNO.1所示，对应的编码基因的DNA序列如SEQIDNO.2所示。
实施例2重组多肽真核表达检测
将获得的正确的多肽片段质粒(实施例1制备)，通过lipofectamine2000转染至肝癌细胞系HepG2(市售)，48小时后收集蛋白，以anti-Prdx1抗体进行免疫印迹实验，结果如图1所示，证明肝癌细胞中有142aa多肽的表达。
实施例3重组多肽与p27相互作用的检测
通过lipofectamine2000转染142aa多肽至肝癌细胞系HepG2，36h后，加入裂解液后，以13000rpm,4℃离心15min后吸取上清。留取40μL上清液加入2×SDS-PAGE上样缓冲液作为Input，其余样品以proteinA/Gbeads预澄清后分为均等的三份，分别加入对照IgG、p27和Prdx1抗体后4℃轮转过夜，之后加入30μL的proteinA/Gbeads并继续孵4h，以中效裂解液洗涤两次后加入40μL至2×SDS-PAGE上样缓冲液，以免疫印迹实验测定142aa和p27相互结合情况。结果如图2所示，免疫沉淀实验显示，142aa能够与p27相互作用。
实施例4重组多肽对p27表达的影响
通过lipofectamine2000转染至control质粒，142aa多肽片段至肝癌细胞系HepG2，36h后加入裂解液后，13000rpm，4℃离心15min后吸取上清。测定蛋白浓度后，加入适量的2×SDS-PAGE上样缓冲液，进行免疫印迹实验检测p27的表达变化。结果如图3所示，在肝癌细胞HepG2中转染142aa多肽后，p27的表达量上升。
实施例5多肽抗肿瘤功能的检测
1)CCK-8实验
在96孔板中配置100μL细胞悬液，并分别转染Con，142aa多肽片段，p27，分别在第24小时、48小时、72小时、96小时，避光加入10％浓度的CCK-8溶液，继续培养1h后，通过酶标仪测定490nm处的吸光度值，绘制细胞增殖曲线。结果如图4所示，转染了142aa的肝癌细胞增殖速率明显小于对照组，与p27过表达组的抑制效应相似。
2)克隆形成实验
肝癌细胞HepG2生长至对数生长期，制备单细胞悬液，以1000个细胞/皿接种至培养皿，分别转染Control质粒、142aa多肽片段，设两个平行样，加3mL培养液，14天后经PBS洗一次、结晶紫染色后拍照，并计数集落数量。结果如图5所示，转染了142aa多肽片段的实验组，形成的集落数量明显少于对照组，142aa多肽对肝癌细胞生长有明显的抑制作用。
3)细胞周期流式分析
转染142aa多肽片段至肝癌细胞HepG2中36h后，胰酶消化收集细胞，预冷的PBS重悬洗涤两次，70％酒精重悬，-20℃固定24h，离心弃乙醇，PBS洗涤两次，200μL1％TritonX-100通透10min，避光加入400μL一定比例的RNase反应20min后，加入200μLPI染色剂后流式细胞仪检测细胞周期，分析142aa对细胞周期的调节情况。由图6可见，与对照组相比，，142aa多肽将细胞抑制于G1期，明显增加了G1期细胞的数量，S期细胞数量下降，对细胞增殖产生抑制作用。
4)裸鼠成瘤
选取对照、142aa稳定干预的肝癌细胞进行扩大培养，在各组细胞数达到4×107之后，每组2只5周裸鼠随机分组，以约4×106细胞/每只的量将细胞注入裸鼠皮下；10天后开始观察，隔5天观察一次，记录裸鼠的肿瘤的体积，绘制肿瘤大小的体积曲线，30天后空气注射处死裸鼠，取肿瘤组织拍照并用多聚甲醛固定。结果如图7所示，142aa多肽明显抑制了裸鼠体内肿瘤的生长，对肿瘤增殖产生明显的抑制作用。

Claims (4)

1.一种抑癌142aa多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的抑癌142aa多肽的编码基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。
3.含有权利要求2所述的抑癌142aa多肽的编码基因的载体。
4.权利要求1所述的抑癌142aa多肽在制备抗癌药物中的应用。
CN201610207973.1A 2016-04-05 2016-04-05 一种抑癌142aa多肽及其载体和应用 Active CN105753961B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610207973.1A CN105753961B (zh) 2016-04-05 2016-04-05 一种抑癌142aa多肽及其载体和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610207973.1A CN105753961B (zh) 2016-04-05 2016-04-05 一种抑癌142aa多肽及其载体和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105753961A true CN105753961A (zh) 2016-07-13
CN105753961B CN105753961B (zh) 2017-08-29

Family

ID=56333574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610207973.1A Active CN105753961B (zh) 2016-04-05 2016-04-05 一种抑癌142aa多肽及其载体和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105753961B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297934A (zh) * 1999-11-30 2001-06-06 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——人肌球蛋白60和编码这种多肽的多核苷酸

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297934A (zh) * 1999-11-30 2001-06-06 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——人肌球蛋白60和编码这种多肽的多核苷酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VENTER, J.C.等: "EAW65251.1", 《GENBANK》 *
WAKAMATSU, A.等: "BAG60007.1", 《GENBANK》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105753961B (zh) 2017-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ahn et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis
Zhang et al. Human-derived normal mesenchymal stem/stromal cells in anticancer therapies
Zhong et al. Adipose specific aptamer adipo-8 recognizes and interacts with APMAP to ameliorates fat deposition in vitro and in vivo
CN102973922A (zh) 一种融合蛋白的应用
CN103319605B (zh) 一种肝靶向肽与血管生成抑制因子融合蛋白及其制备方法与应用
CN105753961A (zh) 一种抑癌142aa多肽及其载体和应用
CN102174110B (zh) 狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用
CN108250269A (zh) 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN103961687A (zh) G蛋白偶联受体相互作用蛋白2在制备抗炎症药物中的应用
JP2012029674A (ja) 改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質及びその使用
Wu et al. A novel cell-permeable RDP-p53 fusion protein for specific inhibition on the growth of cancerous neural cells
CN102068448A (zh) 淫羊藿次苷ⅱ在制备抗黑色素瘤药物中的用途
Jia et al. Therapeutic injection of a C-type CpG ODN induced an antitumor immune response in C57/BL6 mice of orthotopically transplanted hepatocellular carcinoma
CN105296515B (zh) 一种干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白及其制备方法和用途
CN104131034A (zh) 一种嵌合载体及其制备方法和应用
CN111410693B (zh) 一种抗cdk5纳米抗体及其应用
CN103114104B (zh) 一种抑癌肽基因重组及其抗肿瘤应用
CN101333524B (zh) 一个小分子非编码RNA基因hsa-miR-101及其抗肿瘤用途
KR20220148567A (ko) 약물전달물질로서의 간세포암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도
Valizadeh et al. Role of tumor necrosis factor-producing mesenchymal stem cells on apoptosis of chronic b-lymphocytic tumor cells resistant to fludarabine-based chemotherapy
CN101683518A (zh) Fhl1在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途
Yan et al. EB virus-positive tumors are inhibited by rBCG expressing hGM-CSF and LMP2A
CN110279673A (zh) AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用
CN101735315A (zh) Amp-18抗原多肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用
CN104511028A (zh) Klf9基因在抑制肝癌中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wan Chunhua

Inventor after: Lin Zhipeng

Inventor after: Ni Runzhou

Inventor before: Shen Aiguo

Inventor before: Wan Chunhua

Inventor before: Lin Zhipeng

Inventor before: Ni Runzhou

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20191126

Address after: No.1, floor 3, No.319, zhanggongshan Road, Yuhui District, Bengbu City, Anhui Province

Patentee after: Bengbu guijiu Intellectual Property Service Co., Ltd

Address before: 226000 Jiangsu Province, Nantong City Chongchuan District sik Road No. 9

Patentee before: Nantong University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201116

Address after: 274108 Chenji Industrial Zone, Dingtao District, Heze City, Shandong Province

Patentee after: ZHONGSHI DUQING (SHANDONG) BIOTECH Co.,Ltd.

Address before: No.1, floor 3, No.319, zhanggongshan Road, Yuhui District, Bengbu City, Anhui Province

Patentee before: Bengbu guijiu Intellectual Property Service Co.,Ltd.