CN105738521A

CN105738521A - 一种基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法

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Publication number: CN105738521A
Application number: CN201610109948.XA
Authority: CN
Inventors: 胡亚杰; 陈�峰; 韦建玉; 张纪利; 金亚波; 孙建生; 梁永进; 万树青; 陈泽鹏
Original assignee: South China Agricultural University; China Tobacco Guangxi Industrial Co Ltd; China National Tobacco Corp Guangdong Branch
Current assignee: South China Agricultural University; China Tobacco Guangxi Industrial Co Ltd; China National Tobacco Corp Guangdong Branch
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2016-02-29
Publication date: 2016-07-06

Abstract

本发明公开了一种烟叶中所含角鲨烯的高效液相色谱检测方法，针对烟叶样品，本发明采用三氯甲烷作为提取溶剂，结合采用科学适宜条件的超声提取，保障了很高的提取效率，再经硅胶净化后进样进行高效液相色谱法检测。本发明进一步优化了高效液相色谱检测条件，用于检测烟叶中角鲨烯时，色谱峰分离较好，具有准确、快速、高灵敏、重现性好、回收率高等优点，不仅符合定性要求，而且符合定量要求。

Description

一种基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法

技术领域

本发明涉及烟叶中成分的检测技术领域，更具体地，涉及一种烟叶中所含角鲨烯的高效液相色谱检测方法。

背景技术

角鲨烯最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene，其化学名称为2,6,10,15,19,23--六甲基--2,6,10,14,18,22--二十四碳六烯，属开链三萜类化合物。角鲨烯具有提高人体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体抗氧化性和免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能,是一种无毒性的具有防病治病作用的生物活性物质。最近研究发现角鲨烯对人体还具有解毒作用，可移除组织中的脂溶性毒素。2014年4月，国家烟草专卖局下发“关于”加快卷烟降焦减害技术成果推广应用的通知(国烟办综[2014]218号)，提出要加大卷烟减害技术重大专项研究成果的应用推广力度，要采取针对性技术措施加快卷烟降焦减害步伐。

本申请人在烟叶天然抗氧化剂角鲨烯的生态累积与减害的研究工作，发现角鲨烯可以选择性地降低烟气中苯并芘、巴豆醛、NH3等有害成分，降低卷烟危害指数，同时角鲨烯具有清除烟气中的气相和固相自由基功能由于角鲨烯具有独特生理功能，目前开发利用角鲨烯已成为科技界研究的热点。

但是，目前国内外还没有可参考的烟叶中角鲨烯定性和定量的检测方法，因此，在烟草行业建立烤烟中角鲨烯定性和定量的检测方法具有前瞻性，也是十分必要的。而在烟叶中角鲨烯的检测中，良好的样品前处理方法对获得准确科学的检测结果起到关键性作用。在确定的检测条件下，采用不同提取剂提取样品中角鲨烯，其提取效率、提取操作用时等因素都是必须考虑的重要因素，各个因素之间又是相互影响的关系，目前未见基于高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯的样品前处理研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是填补现有烟叶中角鲨烯的检测技术不足，尤其是适于高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯的样品前处理方法的不足，提供一种烟叶中所含角鲨烯的高效液相色谱检测方法。

本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

本发明以甲醇和乙腈为流动相，采用填有粒径5μm的高效固定相的柱色谱分离技术，将经本发明方法前处理后的样品注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，检测角鲨烯的吸收值，采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量；

具体地，提供一种基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，包括以下步骤：

S1.样品前处理得到样品液，在经过硅胶净化处理后得到样品待测液；

S2.配制标准溶液，建立标准曲线；

S3.检测：吸取样品待测液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器检测角鲨烯；

S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量；

其中，步骤S1所述样品前处理包括以下步骤：

S11.烟叶切丝，取烟丝加入三氯甲烷超声提取30～60分钟，收集提取液，用三氯甲烷冲洗提取后的烟丝，合并提取液和冲洗液；

S12.将步骤S11所得合并的提取液和冲洗液旋转蒸发至干，用正己烷溶解，经第二次旋转蒸发至近干，用色谱级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜得样品液；

S13.取步骤S12所述样品液过小柱净化处理，采用湿法装柱，小柱材料为0.06g硅胶和适量无水硫酸钠；

步骤S3所述检测的条件为：

Agilent1100高效液相色谱仪HPLC配紫外检测器；

色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm；

柱温：30℃；

流动相类型：甲醇∶乙腈，体积比为75/25；

流动相流速：1mL/min；

检测波长为：210nm；

进样量：10μL。

优选地，步骤S2所述配制标准溶液的方法是准确称取0.1g角鲨烯标准品，精确至0.0001g，用乙腈溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鲨烯标准溶液，充分振荡摇匀即得。

优选地，步骤S2所述角鲨烯标准曲线的建立的方法是：采用系列稀释法，分别配制成浓度为0.002、0.01、0.05、0.2、0.5mg/mL的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱进样检测；以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性回归方程。

优选地，步骤S11在加入三氯甲烷之前，先对烟丝进行涡旋处理，所述涡旋处理是涡旋1min，静止10min。

优选地，所述涡旋处理的条件为2000r/min。

优选地，步骤S11所述三氯甲烷的用量按照与烟丝的比例为1.0g烟丝：30mL三氯甲烷确定。

优选地，步骤S11所述超声提取重复3次。

优选地，步骤S11所述超声提取的超声波功率为500w。

优选地，所述超声处理的时间为30min。

本发明在净化剂中加入适量的无水硫酸钠可以很好地防止溶液冲洗硅胶，造成凹凸不平。优选地，步骤S13所述无水硫酸钠为0.5g。

本发明具有以下有益效果：

现有研究表明，卷烟燃烧后的烟气中含有近5000种化合物，根据对烟叶的氯仿提取物进行化学分析，测得其中有300多种成分，而角鲨烯的含量很低，要对其进行快速准确的检测，需要建立科学系统的检测方法。本发明针对烟叶样品，建立了一种适于高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯的样品前处理方法，采用三氯甲烷作为提取溶剂，结合采用超声提取法，保障了很高的提取效率最高。再经硅胶净化，结合优化的检测条件，所述高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯色谱峰分离较好，具有准确、快速、高灵敏、重现性好、回收率高等优点，不仅符合定性要求，而且符合定量要求。

附图说明

图1角鲨烯标准曲线图。

图2角鲨烯标准样品色谱图。

图3用氯仿提取的未添加目标物样品色谱图。

图4用氯仿提取的添加目标物样品色谱图。

图5角鲨烯(50mg/L)标准溶液色谱图。

图6本底样品色谱图。

图7本底添加样品色谱图。

图8角鲨烯标准溶液(5mg/L)色谱图。

图9样品的色谱图。

图10经硅胶净化样品的色谱图。

图11经PSA(N-丙基乙二胺固相吸附剂)净化样品的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。为方便说明，本发明实施例中使用的仪器和试剂说明如下，但并不因此限定本发明。

仪器：

(1)高效液相色谱仪HPLC(Agilent1100)，配备：脱气泵、四元泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器(美国Agilent公司)

(2)摇床振荡器：SHZ-82AB型(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)

(3)台秤：T-10000型，d＝0.1g(美国双杰兄弟(集团)有限公司)

(4)电子天平：BSA224S型，d＝0.1mg(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)

(5)旋转真空蒸发器：RE52-99型(上海亚荣生化仪器厂)

(6)真空抽滤泵：SHZ-DⅢ型(巩义市予华仪器有限公司)

(7)超声波清洗器:KQ-50型(昆山市超声仪器有限公司)

(8)涡旋仪：MS3BS25(IKA公司)

(9)恒温水浴锅：501数显型(江苏省金坛市宏华仪器厂)

(10)各种实验室通用玻璃器皿

(11)超声波清洁仪(型号kq-500型，昆山市超声仪装有限公司)

试剂：

(1)99.8％角鲨烯对照品(中国药检所)

(2)甲醇(色谱纯和分析纯)

(3)乙腈(色谱纯)

(4)正己烷(分析纯)

(5)三氯甲烷(氯仿，分析纯)

(6)石油醚(分析纯)

(7)0.22μm有机微孔滤膜(英国原产膜)

(8)丙酮(分析纯)

(9)净化剂：PSA，C18，硅胶(welchrom公司)

(10)烟丝(广西中烟工业有限责任公司，随机抽取)

实施例1

本实施例提供一种烟叶中角鲨烯的检测方法，包括以下步骤：

S1.样品前处理得到样品待测液；

S2.配制标准溶液，建立标准曲线；

S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。

其中，步骤S1所述样品前处理的方法为：

本底样品前处理方法(CK—硅胶)：分别准确称取1.0g烟丝三份，涡旋1min，静止10min,加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发，用适量的正己烷将其溶解，然后进行过柱(0.06g硅胶+0.5g无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色谱级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

样品前处理方法(硅胶)：分别准确称取1.0g烟丝三份(分别加入1mL100ppm角鲨烯标准液)，涡旋1min，静止10min，加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL过小柱(0.06g硅胶+适量无水硫酸钠(0.5g)----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色谱级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

所述检测的检测条件为：

高效液相色谱仪HPLC(Agilent1100)配紫外检测器；

色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm；

柱温：30℃；

流动相类型：甲醇∶乙腈(体积比为75/25)；

流动相流速：1mL/min；

检测波长为：210nm；

进样量：10μL。

步骤S2所述角鲨烯标准曲线的建立的方法是：采用系列稀释法，分别配制成浓度为0.002，0.01，0.05，0.2，0.5mg/mL的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱进样检测；采用外标法定量，以进样浓度(mg/L)为横坐标，峰面积(UV·S)为纵坐标(见表1所示)建立标准曲线，如附图1所示，求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性回归方程，所述回归方程为y＝40.092x+52.046，R²＝0.9999。

表1角鲨烯标准溶液浓度与峰面积的对应关系

结果表明，标准曲线的相关系数为0.9999，方法的线性良好，可以用于检出限的测定以及目标物定量的计算。

角鲨烯标准样品色谱图、用氯仿提取的未添加目标物样品色谱图、用氯仿提取的添加目标物样品色谱图、角鲨烯(50mg/L)标准溶液色谱图、本底样品色谱图、本底添加样品色谱图分别见附图2～附图7所示。

实施例2本发明检测方法和条件优越性验证试验

为进一步验证本发明检测方法和检测条件的优越性，分别进行以下实验：

2.1不同提取剂提取效率的比较(C18柱)

2.1.1样品前处理方法

对照组(CK)：取烟丝5.0g(用直径为15cm的滤纸包好)于索氏提取器中，用提取溶剂各200mL分别置于圆底烧瓶，将索氏提取器放入40℃水浴锅中，回流9个小时，收集提取液，从提取液中取30mL，放入分液漏斗中，加入30mL萃取液甲醇-水(V：V＝70:30)进行萃取，重复3次，收集萃取液，进行旋转蒸发至近干，再用5mL色谱级乙腈进行溶解，过0.22μm有机系膜，待测。

添加样品前处理：取烟丝5.0g(取0.05mL，10000mg/L角鲨烯标样于10mL正己烷中，然后将5.0g烟丝至其中，于2000r/min的涡旋仪涡旋1min，静止，自然蒸发至干(大约24h)，然后用直径为15cm的滤纸包好)于索氏提取器中，用提取溶剂各200mL分别置于圆底烧瓶，将索氏提取器放入40℃水浴锅中，回流9个小时，收集提取液，从提取液中取30mL，放入分液漏斗中，加入30mL萃取液甲醇-水(V：V＝70:30)进行萃取，重复3次，收集萃取液，进行旋转蒸发至近干，再用5mL色谱级乙腈进行溶解，过0.22μm有机系膜，放于4℃条件下保存，待测。

为免一一赘述，本实施例以提取溶剂正己烷、三氯甲烷或丙酮为例作为说明。

2.1.2不同溶剂提取效率比较的结果

不同溶剂提取效率比较的结果见表2。从表2可以看出氯仿的提取效率最高。

表2不同提取剂的提取效率比较

表中“-”表示“无添加或无回收率”

2.1.3不同溶剂提取效率比较结果的讨论

利用索氏提取法，对不同提取剂提取样品中角鲨烯的效率进行了比较，从结果的回收率可以看出，氯仿的提取效率最高，达62.27％，正己烷的次之，达36.36％丙酮的最差，达18.59％。

2.2不同流动相比例的比较(C18柱)

为了提高分析效率，本实施例实验中设计了流动相甲醇：乙腈不同比例对出峰时间的影响，包括但不限于的设计有：甲醇：乙腈＝50：50，甲醇：乙腈＝70：30，甲醇：乙腈＝90：10，甲醇：乙腈＝10：90，甲醇：乙腈＝85：15，甲醇：乙腈＝80：20，甲醇：乙腈＝30：70，甲醇：乙腈＝40：60，甲醇：乙腈＝75：25等不同比例。不同比例出峰时间及目标峰与杂质峰的分离情况见表3所示：

表3不同流动相比例对目标物与杂质峰分离的影响

优化条件下的最佳流动相条件(C18柱)：甲醇：乙腈＝75：25(30min)→甲醇100％(19min)。流速＝1mL/min，检测波长＝210nm，柱温＝30℃(试验结果见附图5～附图7所示)。

讨论：在进行流动相比例不同时，样品中目标物与杂质峰分离的效果在甲醇：乙腈＝75：25时效果较理想。

2.3不同提取方法提取效率的比较(C18柱)

在上述不同的优化条件下，氯仿作为提取剂，进行索氏提取，用萃取剂甲醇-水(V:V＝70:30)进行萃取时，样品的提取效率未达到最佳理想值，因此，为了进一步提高样品中目标物的回收率，本实施例进一步探究不同提取方法(为免赘述，以下仅以索氏提取法、冷浸提取法、超声波辅助提取法的实验数据为例进行说明)对样品中目标物提取效果的影响。结果见表4所示：

表4不同提取方法对目标物的提取效率比较

小结：通过对索氏提取法、冷浸法提取法、超声波辅助提取法等提取方法为例进行对比时可知，超声波辅助提取法的提取效率最高，且用时最少；索氏提取法次之，但耗时较长；冷浸法的提取效率最低，所以用超声波辅助提取法对样品进行提取可以获得最佳结果。

2.3.1超声波辅助提取法中提取时间对提取效率的影响(C18柱)

因前述在各优化条件下，样品的目标峰与杂质峰的分离效果仍然不够理想，因此改变样品的净化方法，选择对样品进行过柱，以减少杂质峰对目标峰的干扰。

从不同方法提取的试验结果中可以看出，在其它条件均相同的情况下，超声波辅助提取法对样品中目标物的提取效率最高，因此探究在超声辅助提取法中超声的时间对目标物的提取效率的影响具有重要意义。

2.3.1.1样品的前处理方法

本底样品前处理方法(CK)：分别准确称取1.0g烟丝6份，涡旋1min，静止10min,加入30mL氯仿，分别进行超声30min(3个重复)，60min(3个重复)后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发，用适量的正己烷将其溶解，然后进行过柱(0.06g硅胶+适量无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色谱级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。本发明在净化剂中加入适量的无水硫酸钠可以很好地防止溶液冲洗硅胶，造成凹凸不平(下同)。

样品前处理方法：分别准确称取1.0g烟丝6份(分别加入1mL100ppm角鲨烯标准液)，涡旋1min，静止10min,加入30mL氯仿，分别进行超声30min(3个重复)，60min(3个重复)后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发，用适量的正己烷将其溶解，然后进行过柱(0.06g硅胶+适量无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色谱级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

2.3.1.2超声波辅助提取法中提取时间对提取效率的影响

表5不同超声时间对样品中目标物的提取效率的影响(部分实验数据例举)

根据实验结果分析总结，由于超声的时间过长，导致目标物的降解等原因，所以，如果超声时间过长会导致提取效率降低，超声的最佳时间确定为30min。

2.4样品前处理方法

本底样品前处理方法(CK—硅胶)：分别准确称取1.0g烟丝三份，涡旋1min，静止10min,加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发，用适量的正己烷将其溶解，然后进行过柱(0.06g硅胶+0.5g无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色普级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

样品前处理方法(硅胶)：分别准确称取1.0g烟丝三份(分别加入1mL100ppm角鲨烯标准液)，涡旋1min，静止10min，加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL过小柱(0.06g硅胶+适量无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色普级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

本底样品前处理方法(CK—PSA)：分别准确称取1.0g烟丝三份，涡旋1min，静止10min,加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发，用适量的正己烷将其溶解，然后进行过柱(0.06gPSA+0.5g无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色普级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

样品前处理方法(PSA)：分别准确称取1.0g烟丝三份(分别加入1mL100ppm角鲨烯标准液)，涡旋1min，静止10min，加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发，用适量的正己烷将其溶解，取2mL过小柱(0.06gPSA+适量无水硫酸钠----湿冼装柱法)后，旋转蒸发至近干，用2mL色普级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

本底样品前处理方法(CK—直)：分别准确称取1.0g烟丝三份，涡旋1min，静止10min,加入30mL氯仿，分别进行超声30min后，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL提取液进行旋转蒸发至近干，用2mL色普级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

样品前处理方法(直)：分别准确称取1.0g烟丝三份(分别加入1mL100ppm角鲨烯标准液)，涡旋1min，静止10min，加入30mL氯仿，分别进行超声30min，分别收集提取液，用10mL氯仿冲洗烟丝，合并提取液，取2mL旋转蒸发至近干，用2mL色普级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜，待测。

2.4.1高效液相色谱条件(C18柱)

甲醇：乙腈＝75：25(30min)→甲醇100％(19min)。流速＝1mL/min，检测波长＝210nm，柱温＝30℃。

试验结果见附图8至附图11所示，其中，附图8为角鲨烯标准溶液(5mg/L)色谱图，附图9为未经净化剂净化样品的色谱图，附图10为经硅胶净化样品的色谱图，附图11为经PSA净化样品的色谱图。由附图8至附图11可知，经过净化剂净化的样品中杂质峰较未净化的减少了许多，同时硅胶的净化效果比PSA的净化效果好，所以验证了在本发明方法中确定用硅胶作为净化剂是最理想的。

Claims

1.一种基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2.配制标准溶液，建立标准曲线；

S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量；

其中，步骤S1所述样品前处理包括以下步骤：

S11.烟叶切丝，取烟丝加入三氯甲烷超声提取30～60分钟，收集提取液，

用三氯甲烷冲洗提取后的烟丝，合并提取液和冲洗液；

S12.将步骤S11所得合并的提取液和冲洗液旋转蒸发至干，用正己烷溶解，

经第二次旋转蒸发至近干，用色谱级乙腈溶解，过0.22μm有机系滤膜得样品液；

步骤S3所述检测的条件为：

Agilent1100高效液相色谱仪HPLC配紫外检测器；

色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm；

柱温：30℃；

流动相类型：甲醇∶乙腈，体积比为75/25；

流动相流速：1mL/min；

检测波长为：210nm；

进样量：10μL。

2.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，步骤S2所述配制标准溶液的方法是准确称取0.1g角鲨烯标准品，精确至0.0001g，用乙腈溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鲨烯标准溶液，充分振荡摇匀即得。

3.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，步骤S2所述角鲨烯标准曲线的建立的方法是：采用系列稀释法，分别配制成浓度为0.002、0.01、0.05、0.2、0.5mg/mL的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱进样检测；以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性回归方程。

4.根据权利要求1所述适用于检测烟叶中所含角鲨烯的样品前处理方法，其特征在于，步骤S11在加入三氯甲烷之前，先对烟丝进行涡旋处理，所述涡旋处理是涡旋1min，静止10min。

5.根据权利要求4所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，所述涡旋处理的条件为2000r/min。

6.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，步骤S11所述三氯甲烷的用量按照与烟丝的比例为1.0g烟丝：30mL三氯甲烷确定。

7.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，

其特征在于，步骤S11所述超声提取重复3次。

8.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，步骤S11所述超声提取的超声波功率为500w。

9.根据权利要求4至8任一项所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为30min。

10.根据权利要求1所述基于高效液相色谱法检测烟叶中所含角鲨烯的方法，其特征在于，步骤S13所述无水硫酸钠为0.5g。