CN105734123A - 基于海稻作物dna变异标记的海稻作物染色体的pcr鉴定法及相关pcr引物和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR方法；具有SEQ ID NOs:1?48的序列的PCR扩增的配对引物及PCR鉴定试剂盒。

Description

基于海稻作物DNA变异标记的海稻作物染色体的PCR鉴定法及相关PCR引物和试剂盒
技术领域
本发明属于农作物海稻的鉴定领域。具体地说，本发明涉及一种基于海稻作物DNA变异标记设计PCR扩增配对引物从而鉴定海稻作物(后文也称为“海稻86，海稻”)的染色体的PCR方法及PCR鉴定试剂盒。
背景技术
海稻是1986年陈日胜先生和湛江农业专科学校罗文烈教授在遂溪县城月镇燕巢村海边芦苇荡中偶然发现，后经陈日胜先生几十年栽培研究精心选育出的株高、熟期一致、结实率高、产量高的“海稻86”新物种，以及培育一系列籼粳海稻杂交种(有待国家新品种认证)。
作物海稻是目前生长在大陆内河入海口处潮间带区域，具有1)耐盐、2)耐碱、3)耐寒、4)耐涝、5)抗台风、6)抗自然落果、7)抗病虫害、8)营养成分高等特性的亚热带气候条件物种，“三性”属晚稻品种，每年春天发芽秋天开花结果，入冬前成熟，是一年生禾本植物。经过普选而成的海稻品种最佳生长期是150天。
其特性具体表现为：1)耐盐具体表现为在盐度为0.3％到0.8％；2)耐碱具体表现为碱浓度PH值9.5内生长良好，可推广适用于大面积的推广，增加盐碱地的利用效果；3)耐寒表现经测试证明海稻比中国东北水稻品种更耐寒；4)耐涝具体表现为可耐在0.3％盐度水底下浸泡200小时，适应广东、广西、海南的海滩种植；5)抗台风具体表现为多年试验证明台风没有影响产量；6)抗自然落果具体表现为稻谷成熟后不容易脱落，没有发现自然落果现象；7)抗病虫害具体表现为没有发现过稻瘟病现象，除了个别稻穗被注心虫破坏之外，没有受到其他虫害影响；而且8)其营养成分高。
海稻根部发达、强劲，比普通水稻生长速度快一倍。根丝明显比其他水稻品种多且长，最长根丝有30到40厘米，秸秆上每个关节都长根。野生海稻有雄根，具有再生能力，第二年还能生长稻苗，并且能开花结果。
海稻叶片苗期比较长，叶脉明显，不挺拔成下垂状态，叶片有肉眼看不到毛尖，叶舌比普通水稻明显，宽又长，但是叶耳不明显，像毛尖，叶色淡绿色，剑叶比较短比较挺拔。
海稻秸秆很高，生长在潮间带区域的海稻秸秆高度在1.8到2.3米之间，生长在潮上带的海稻秸秆在1.6到2.0米之间，秸秆直径0.7到0.8厘米，没有抽穗的秸秆是清甜味道，开花之前的秸秆挺拔不倒，开花灌浆后秸秆慢慢变黄倒下。
海稻开花时很清香，花药显金黄色，花丝较长，花柱头明显暴露在外，胚珠肥大，容易受粉。穗粒一般是180到200粒之间，穗粒尾部有尖芒，尖芒长度10到13厘米。外颖坚硬，明显比普通谷子厚，千粒平均重25.12克。新的米粒显金红色，放时间长后变紫红色，口感粗糙，营养成分高，煮熟有种独特的香味。
由于海稻有耐盐、耐碱、耐寒、耐涝、抗倒伏、抗自然落果、根系发达、抗病虫害、大米营养成分高等许多独特的重要农艺性状，是国家独有的种质资源，具有重大的基因价值和经济意义。科技部、农业部和发改委对海稻的发现、海稻系列的培育和保护高度重视。并且2014年9月1日，“海稻86”通过农业部植物新品种保护办公室颁布的农业植物新品种保护公报(公告号为：CNA011782E)。2014年10月由农业部组织海稻专家组现场考察认定海稻是一种特异的水稻种质资源，具有很高的科学和研究价值，建议国家加强对海稻资源的全面保护，并大力支持开展生理、生化和分子领域的系统研究。
2014年10月27日，中国农科院野生作物专家杨庆文研究员采样鉴定，认为海稻从植物学分类学上为耐盐杂草稻(一种介于野生稻与栽培稻之间的类型)。于2014年11月，陈日胜先生组建和带领的科研团队第一次完成了海稻全基因组测序，填补了海稻分子领域的空白。为在基因组水平上综合鉴定和保护这一珍奇物种垫定了分子基础。
发明内容
如上述，海稻是具有耐盐碱、耐涝、耐寒、抗台风、抗自然落果、抗病虫害、营养成分高等特性的亚热带气候条件物种，为了确保这一珍奇物种科学、合理、规范化地应用，本发明旨在基于用在基因组水平上发现的DNA变异标记所涉及的配对引物准确鉴定被试作物是否具有海稻的部分或全部染色体遗传物质。
为此，本发明包括下述内容：
第一方面的技术方案提供了一种高效鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR方法，其用选自SEQIDNOs:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48的配对引物序列组成的组的序列，分别对被试样品的DNA提取物做24组PCR扩增，
根据各组PCR扩增获得的序列片段，判断所述被试样品是否具备海稻作物的部分或全部染色体。
第二方面的技术方案提供了一组用作PCR扩增的配对引物，其序列选自SEQIDNOs:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48的序列组成的组。
第三方面的技术方案提供了鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR试剂盒，其特征在于，包含上述用作PCR扩增的配对引物。
进一步地，上述的鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR试剂盒，其特征在于，其还包含含有在100-300bp范围内以50bp间隔的5条长度不同标记物，作为PCR产物经凝胶电泳定位判断片段长度的参照依据。
如下将更详细介绍本发明的技术方案。
本发明的第一方面的技术方案是通过以下实现的：
1.用全基因组测序以及和3000个水稻品种DNA序列比较的基因组方法，筛选农作物海稻在其12条染色体上各自区别于水稻的24个DNA变异标记。
2.基于上述海稻的DNA变异标记，设计聚合酶链式反应(PCR)的24对引物。具体序列参见SEQIDNOs:1-48。
3.用预确定的条件和方法进行24组PCR反应。
4.通过琼脂糖凝胶电泳和全自动核酸分析对PCR产物进行分析，判断是否含有部分或全部的海稻12条染色体的长臂或短臂上的独特DNA变异，从而判断是否被试作物为纯种海稻作物，或是杂交了水稻的部分染色体的海稻作物，或是经杂交获得部分海稻作物染色体的水稻作物，或者为完全区别于海稻作物的水稻作物。
为了获得第一方面的技术方案的一种高效鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR方法，本发明的第二方面的技术方案是通过以下技术方案实现的：
2.1由于海稻的分子研究属于空白，申请人首先用高通量全基因组测序的方法获得了高质量的海稻全基因组序列。
2.2将上述高质量的海稻全基因组序列和已做过完全测序的属粳亚种的水稻对照品种日本晴(OryzasativaL.japonica.varNipponbare)的DNA序列(temperatejaponicaNipponbarereferencegenome–Release7oftheuni-fied-buildreleaseOs-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0)比较，找出海稻的所有变异，包括DNA的点突变、插入和删除。
2.3为了获得在海稻品种中独有的变异，用云计算的办法对89个国家的3000个水稻品种进行了变异分析，找到水稻目前可能存在的全部变异。
2.4从海稻的所有变异中除去海稻和水稻共有的变异，剩余部分为海稻品种中独有的变异。
2.5把海稻独有的变异分为点突变(SNPs)和插入/删除(insertion-deletion，indels)。
2.6从12条染色体每条的长臂和短臂中各选一个大于25bp的插入/删除变异。为了准确鉴定，每条染色体的二个标记一般是一个插入变异，另一个是删除变异，且避免选择有重复序列的插入/删除变异。如果实际情况不适用插入变异和删除变异，则根据具体情况确定何种类型的变异。将筛选的24个插入/删除变异作为海稻DNA综合标记。
2.7根据变异位点上下游序列，用PCR引物设计软件设计目标PCR产物长度为100-300bp的PCR引物(实际PCR产物长度在104和311bp之间)，具体见序列SEQIDNOs:1-2,3-4,5-6,7-8,9-10,11-12,13-14,15-16,17-18,19-20,21-22,23-24,25-26,27-28,29-30,31-32,33-34,35-36,37-38,39-40,41-42,43-44,45-46,47-48。
在获得了本发明第二方面的有关引物的技术方案后，可将其应用于本发明第一方面的技术方案得以实施本发明。
如第一方面所述用预确定的条件和方法，分别用每对配对引物在海稻和水稻作物样品上进行24组PCR，通过琼脂糖凝胶电泳可见出，PCR产物位置不同表明其长度不等，具体见图1a，图1c，图1e，图1g。
可选地，上述的鉴定被试作物样品的PCR产物经凝胶电泳后，通过与在100-300bp范围内以50bp间隔的5条长度不同标记物的位置比对，来判断PCR产物长度是与海稻作物PCR长度还是水稻作物PCR长度对应。
可选地，用全自动核酸分析方法分析琼脂糖凝胶电泳的PCR产物长度，具体参见图1b，图1d，图1f，图1h。经计算，对应的海稻和水稻作物PCR长度差距在27-52bp的范围。
经全自动核酸分析，如果被分析品种的24个PCR产物长度分别和海稻对应的PCR产物长度相同，则表明所述被试样品具备海稻作物的全部染色体，被分析品种为海稻。如果获得任一与和海稻对应的PCR产物长度相同的PCR产物，则表明所述被试样品具备海稻作物的部分染色体，可能是杂交了水稻的部分染色体的海稻作物，或是经杂交获得部分海稻作物染色体的水稻作物，或者为完全区别于海稻作物的水稻作物。
从而达到在基因组水平上鉴定海稻的目的。该鉴定方法简单，易行，准确，可靠。
如上述，通过海稻高通量全基因组测序和云计算比较的办法获得的24个海稻独有的变异成功地应用于海稻分析鉴定上，从而完成了本发明。
为了鉴定方法简单，易行，准确，可靠地实施本发明，第三方面的技术方案是通过以下实现的：在完成上述第二方面的技术方案后，本发明提供了鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR试剂盒，其特征在于，包含上述24对用作PCR扩增的配对引物。
进一步地，上述的鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR试剂盒，其特征在于还包含含有在100-300bp范围内互相间隔的3-5条长度不同的DNA标准品，作为PCR产物经凝胶电泳定位判断其片段长度的参照依据，条带长度例如为120bp，180bp，240bp，300bp，或者100bp，150bp，200bp，250bp等之中的任一。
现有的市售DNA标准品(ladder)一般在100-300bp范围内只具有150bp、250bp两条条带。而本发明PCR产物根据预期，基本都处于在100-300bp范围内。本发明设计的在100-300bp范围内互相间隔的3-5条长度不同的DNA标准品因条带间距较小，在比对时可以相对更便捷地肉眼判定PCR产物大小，从而判断被试样本是具有海稻独有的变异还是水稻的变异。从而，减少了必须使用全自动核酸分析仪的必要性，从而在进行农科站等较为简陋的地点，可开展播种前或留种后的种子检测，幼苗抽测，避免通过杂交导致的干扰了种质、产品的高品质，影响培育过程。易于在广大农村推广。
附图说明
图1为用对12条染色体上的DNA标记设计的24对引物对被试作物的样本做PCR扩增后，用琼脂糖凝胶电泳和全自动核酸分析对PCR产物的分析结果。图1a,图1c,图1e,图1g为琼脂糖凝胶电泳结果，图1b,图1d,图1f,图1h为全自动核酸分析，奇数泳道1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47是水稻PCR产物，偶数泳道2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48是海稻PCR产物。
图2为海稻在秧田营养生长期刚播种时的幼芽期照片。
图3为海稻在秧田营养生长期至第三叶全出的幼苗期照片。
图4为海稻在大田营养生长期的分蘖期的照片。
图5为海稻在大田营养生长期的返青期的照片。
图6为海稻在生殖生长期的结实成熟期的照片。
具体实施方式
通过上述具体的技术方案，可通过与DNA标准品比对，或通过全自动核酸分析确定PCR产物长度，来判断被试作物是否是海稻或是否具有部分的海稻的染色体。该鉴定方法简单易行，准确可靠。
所述作物的样本包括但不限于植物的植物细胞、植物细胞培养物、植物材料、植物器官、植物组织等提取的遗传物质，如DNA。
这里所用的“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
这里所用的“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。
这里所用的“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。
这里所用的“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。
这里所用的“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。
这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。
作为试种种子前的筛选方法，上述鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR方法，可在播种种子之前即有效确定是否是优质纯种的海稻作物。
作为鉴定将海稻的染色体经杂交转入水稻作物时染色体杂交转入是否成功的方法，其可高效地、简单易行、准确可靠地对通过对植物的植物细胞、植物细胞培养物、植物材料、植物器官、植物组织等提取的遗传物质DNA，通过PCR方法来高效经济地鉴定是否成功获得染色体杂交转入的杂交水稻。
因此，此鉴定方法可用作播种前的选种筛选方法，为了便于批量化操作，可将上述用作PCR扩增的配对引物制作成PCR试剂盒来操作。从而，在科研单位、农科站可开展播种前或留种后的种子检测。从而保证海稻作物的品种优良，性状不退化或变为隐性。避免由于杂交干扰了种质、产品的高品质，影响培育过程。
除了前文提及的外观上的区别之外，此鉴定方法还可用于严格区别海稻粮食作物与水稻或杂交水稻的粮食作物。确保食用的海稻作物或作出的面食中不混有水稻或杂交水稻，确保其高营养价值不降低，并且保留其独特的香味。
1.海稻全基因组测序：从海稻叶片中用QiagenDNA提取试剂盒提取DNA。用KapaDNA试剂盒建了3个300bp的文库和1个2000bp的文库，用HiSeq2500测序仪进行2X100双端测序，共测102.5GB数据，测序质量Q30>93％，平均测序深度：109.475。原始测序数据通过质检后，从头组装。结果表明海稻有12条染色体，但全长略短于水稻，为373,130,791bps。
2.海稻和水稻序列比对：通过质检的海稻序列和NCBI水稻基因组序列用BWA软件进行了比对[所用水稻模板序列为JaponicaNipponbarerefer-encegenome–Release7oftheunified-buildreleaseOs-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0(IRGSP-1.0)]。将海稻93.4％的测序数据定位到水稻模板序列。
3.找出海稻和水稻模板序列相比的变异：通过GenomeAnalysisToolkit3.0-2(GATK)和PicardpackageV1.89软件，用海稻和水稻模板序列比较，共找到3800137个变异。
4.找出海稻独有变异：为了找到海稻独有的变异，通过以下途径收集了目前所有已知的水稻变异：
4.1在AmazonWebServices(AWS)上，部署了高性能计算集群，用云计算的办法对89个国家的3000个水稻品种进行了变异分析，获得全部变异。
4.2从NCBIdbSNPDatabase中取得550万个SNPs。
4.3从SNP-SeekDatabase中取得40万核心SNPs和260万个过滤的SNPs。
4.4从海稻和水稻模板序列比较找到的3800137个变异中去掉在4.1,4.2和4.3中也发现的变异。剩余64,869个海稻独有变异，其中18203个插入/删除，46611个SNPs。
5.找出24个海稻插入/删除标记：为了用PCR产物的长度来标记海稻，只从18203个插入/删除中选择插入/删除长度在27bp以上的标记。为了在基因组水平上标记海稻，从每条染色体的长臂(q)和短臂(p)的中部各选一个标记，共选24个。
6.聚合酶链式反应(PCR)引物设计：使用网络软件BatchPrimer3v1.0(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对每个标记设计PCR引物。为了检测的灵敏度，PCR产物控制在100-300个碱基左右(见下表1)。引物设计的各相关系数设置如下：引物长度18-27bp；退火温度(Tm)55℃-63℃；GC含量20％-80％；最大自互补系数6；最大3‘端互补系数3；最大3’端稳定性9；产物长度100-300bp；输入目标片段后，软件提供6对引物。利用网络数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast功能，选择物种为水稻[Oryzasativa(rice)]，将引物序列与参考序列进行匹配。匹配系数需要符合最高分值(Maxscore)大于或等于40，序列覆盖(Querycover)100％，E值(Evalue)小于或等于0.01，序列符合度(Ident)100％，并且所匹配区间必须是设计引物所在的染色体序列区间，不与其他染色体区间匹配，保证产物的特异性。如6对引物均不符合以上系数要求，重新选取新的序列，用BatchPrimer3v1.0再次设计，并用NCBI验证，直到获得所有序列区间匹配最好的引物。引物名称标记为“Chrn-1或2(1为短臂，2为长臂)-上游或下游”，n为1-12。
7.PCR反应：
水稻及海稻基因组DNA稀释至10ng/μl，放置冰上。配制PCR反应体系：dNTP(美国Amersco制)0.5μl，Taq5x缓冲液(美国NEB制)2.5μl,Taq酶(美国NEB制)0.125μl,DNA模板1μl,上下游引物各0.5μl(引物序列见附表3)，加入水至体积25μl，置于PCR仪(美国Thermo制)。PCR反应设置为：95℃30s；95℃30s,52℃30s,68℃30s(共30个循环)；68℃5min。
8.琼脂糖凝胶电泳鉴定
稀释10xTBE电泳缓冲液(美国EMDMillipore制)至1x。配制3％琼脂糖凝胶：50ml1x电泳缓冲液中加入1.5g琼脂糖粉(美国Sigma制)，加热至沸腾，混匀。待稍冷却，加入5μl核酸染料(美国Amersco制)，混匀，加入胶板中。将PCR产物从PCR仪中取出，4μl中加入1μl电泳上样缓冲液(美国Qiagen制)，DNA标准品(美国Amersco制)为预染，不用加电泳上样缓冲液。待胶冷却后，于加样孔中上样，DNA标准品4μl，PCR产物及上样缓冲液混合物5μl，电泳。电泳条件75v，60min。电泳完成后，放入凝胶成像仪(美国VWR制)成像，曝光时间1分钟。储存结果。通过和琼脂糖凝胶电泳所用标记长度比较，获得PCR产物长度。
如果全部24个PCR产物分别和预期海稻PCR产物等长，表明被测作物具有海稻的全部12条染色体的长臂和短臂上的DNA变异，也就表明该作物具有海稻的全部12条染色体，因此该作物为海稻。如果24个PCR产物中的任一与预期海稻PCR产物等长，则该作物具有与该引物对应的海稻染色体长臂或短臂上的DNA变异，也就表明该作物具有对应的海稻染色体长臂或短臂。如果全部24个PCR产物分别和预期水稻PCR产物等长，表明被测作物具有水稻的全部12条染色体的长臂和短臂上的DNA变异，也就表明被测作物具有水稻的全部12条染色体，因此该作物不可能为海稻。
9.全自动核酸分析
根据AgilentBioanalyzer2100(美国安捷伦(Agilent)制)及DNA核酸检测试剂盒DNA1000kit(美国Agilent制)使用说明进行实验。大致流程如下：将预成胶注入DNA1000芯片中，各加样孔中加入5μl缓冲液及1μlPCR产物或者1μlDNA标准品，震荡1分钟，放入AgilentBioanalyzer2100核酸分析仪中，选择程序DNA1000，开始检测。1小时后，DNA片段显示于屏幕中，储存结果。通过和AgilentBioanalyzer2100分析芯片上所用标记长度比较，获得PCR产物长度。
如果全部24个PCR产物分别和预期海稻PCR产物等长，表明被测作物具有海稻的全部12条染色体的长臂和短臂，该作物为海稻。如果24个PCR产物中的任一与预期海稻PCR产物等长，则表明被测作物具有引物对应的染色体长臂或短臂。见下表1。
表1引物对及水稻和海稻PCR产物长度
实施例
将在以下通过实施例更具体地描述本发明。不应被解释为本发明限于这些实施例或受这些实施例限制。本领域的技术人员可在本发明的技术概念内进行各种方式的修改和改进。
<实施例1>引物的设计
1.海稻全基因组测序：从海稻叶片中用QiagenDNA提取试剂盒提取DNA。用KapaDNA试剂盒建了3个300bp的文库和1个2000bp的文库，用HiSeq2500测序仪进行2X100双端测序，共测102.5GB数据，测序质量Q30>93％，平均测序深度：109.475。原始测序数据通过质检后，从头组装。结果表明海稻有12条染色体，但全长略短于水稻，为373,130,791bps。
表2)。
4.找出海稻独有变异：为了找到海稻独有的变异，通过以下途径收集了目前所有已知的水稻变异：
4.1在AmazonWebServices(AWS)上，部署了高性能计算集群，用云计算的办法对89个国家的3000个水稻品种进行了变异分析，获得全部变异。
4.2从NCBIdbSNPDatabase中取得550万个SNPs。
4.3从SNP-SeekDatabase中取得40万核心SNPs和260万个过滤的SNPs。
4.4从海稻和水稻模板序列比较找到的3800137个变异中去掉在4.1,4.2和4.3中也发现的变异。剩余64,869个海稻独有变异，其中18,203个插入/删除，46,611个SNPs。
5.找出24个海稻插入/删除标记：为了用PCR产物的长度来标记海稻，只从18,203个插入/删除中选择插入/删除长度在27bp以上的标记。为了在基因组水平上标记海稻，我们从每条染色体的长臂(q)和短臂(p)的中部各选一个标记，共选24个。
6.聚合酶链式反应(PCR)引物设计：使用网络软件BatchPrimer3v1.0(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对每个标记设计PCR引物。为了检测的灵敏度，PCR产物控制在100-300个碱基左右(表1)。引物设计的各相关系数设置如下：引物长度18-27bp；退火温度(Tm)55℃-63℃；GC含量20％-80％；最大自互补系数6；最大3‘端互补系数3；最大3’端稳定性9；产物长度100-300bp；输入目标片段后，软件提供6对引物。利用网络数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast功能，选择物种为水稻[Oryzasativa(rice)],将引物序列与参考序列进行匹配。匹配系数需要符合最高分值(Maxscore)大于或等于40，序列覆盖(Querycover)100％，E值(Evalue)小于或等于0.01，序列符合度(Ident)100％，并且所匹配区间必须是设计引物所在的染色体序列区间，不与其他染色体区间匹配，保证产物的特异性。如6对引物均不符合以上系数要求，重新选取新的序列，用BatchPrimer3v1.0再次设计，并用NCBI验证，直到获得所有序列区间匹配最好的引物。引物名称标记为“Chrn-1或2(1为短臂，2为长臂)-上游或下游”，n为1-12。具体见下表3。
表3引物名称、序列命名及具体序列
<实施例2>PCR反应：
1.材料：
·Taq酶及缓冲液(美国NEB制)
·dNTP(美国Amersco制)
·DNA模板(自水稻和海稻叶片提取)
2.方法
水稻及海稻基因组DNA稀释至10ng/μl，放置冰上。
配制48组PCR反应体系：dNTP0.5μl，Taq5x缓冲液2.5μl，Taq酶0.125μl，DNA模板1μl，Chrn-1-上游引物、Chrn-1-下游引物各0.5μl(引物序列见附表3)，加入水至体积25μl。
其中，1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47号PCR反应体系均使用水稻DNA模板；2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48号PCR反应体系均使用海稻DNA模板。
1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48号PCR反应体系各使用Chr1-1-上游/下游引物，Chr1-2-上游/下游引物……，Chr12-1-上游/下游引物，Chr12-2-上游/下游引物等24对引物。
将上述48号PCR反应体系置于PCR仪(美国Thermo制)。PCR反应设置为：95℃30s；95℃30s，52℃30s，68℃30s(共30个循环)；68℃5min。
<实施例3>琼脂糖凝胶电泳鉴定
1.材料：
·10xTBE电泳缓冲液(美国EMDMillipore制)
·琼脂糖粉(美国Sigma制)
·核酸染料(美国Amersco制)
·电泳上样缓冲液(美国Qiagen制)
·DNA标准品(美国Amersco制)
2.方法
稀释10xTBE电泳缓冲液至1x。配制3％琼脂糖凝胶：50ml1x电泳缓冲液中加入1.5g琼脂糖粉，加热至沸腾，混匀。待稍冷却，加入5μl核酸染料，混匀，加入胶板中。制作4个胶板。
将1-48号PCR产物从PCR仪中取出，各取4μl加入1μl电泳上样缓冲液(DNA标准品为预染，不用加电泳上样缓冲液)。
待上述胶板冷却后，于加样孔中上样PCR产物，DNA标准品4μl，PCR产物及上样缓冲液混合物5μl。1号胶板上样1-12号PCR产物，2号胶板上样13-24号PCR产物，3号胶板上样25-36号PCR产物，4号胶板上样37-48号PCR产物。在电泳条件75v，60min进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳完成后，放入凝胶成像仪(VWR,USA)成像，曝光时间1分钟。储存结果。通过和琼脂糖凝胶电泳所用标记长度比较，获得1-48号PCR产物各自的长度。
用上述的PCR鉴定试剂盒所提及的在100-300bp范围内互相间隔的3-5条长度不同的DNA标准品，条带长度为100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，作为PCR产物经凝胶电泳定位判断其片段长度的参照依据。
1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47这24个PCR产物分别和预期水稻PCR产物等长，表明被测作物具有水稻的全部12条染色体的长臂和短臂，该作物为水稻品种日本晴。
2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48这24个PCR产物分别和预期海稻PCR产物等长，表明被测作物具有海稻的全部12条染色体的长臂和短臂，该作物为海稻。
<实施例4>全自动核酸分析
根据AgilentBioanalyzer2100(Agilent,USA)及DNA核酸检测试剂盒DNA1000kit使用说明进行实验。
具体流程如下：将预成胶注入DNA1000芯片中，各加样孔中加入5μl缓冲液及1μl1-48号PCR产物或者1μlDNA标准品，震荡1分钟，放入AgilentBioanalyzer2100核酸分析仪中，选择程序DNA1000，开始检测。一小时后，DNA片段显示于屏幕中，储存结果。通过和AgilentBioanalyzer2100分析芯片上所用标记长度比较，获得1-48号PCR产物长度。
1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47这24个PCR产物分别和预期水稻PCR产物等长，表明被测作物具有水稻的全部12条染色体的长臂和短臂，该作物为水稻品种日本晴。
2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48这24个PCR产物分别和预期海稻PCR产物等长，表明被测作物具有海稻的全部12条染色体的长臂和短臂，该作物为海稻。

Claims (4)

1.一种高效鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR方法，其特征在于，
用选自SEQIDNOs:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48的配对引物序列组成的组的序列，分别对被试样品的DNA提取物做24组PCR扩增，
根据各组PCR扩增获得的序列片段，判断所述被试样品是否具备海稻作物的部分或全部染色体。
2.一组用作PCR扩增的配对引物，其特征在于，序列选自SEQIDNOs:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48的序列组成的组。
3.鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的用作PCR扩增的配对引物。
4.如权利要求3所述的鉴定被试作物样品是否具有海稻作物的部分或全部染色体的PCR试剂盒，其特征在于，其还包含含有在100-300bp范围内的5条长度不同的DNA标记。
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