CN105727318A - 靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针、其制备方法及由该探针标记的间充质干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针、其制备方法及由该探针标记的间充质干细胞，该分子探针包括：用于识别间充质干细胞的多肽和用于增强磁共振成像对比度的造影单元金属Gd络合物。该分子探针的一个主要特征是一个多肽探针通过树枝状分子结合1～4个金属Gd络合物分子，同时使用间隔子和连接子改善多肽与树枝状分子及树枝状分子与Gd络合物之间的空间结构。所述多肽分子影像探针能够显著增强磁共振加权成像对比度。

Description

靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针、其制备方法及由该探针标记的间充质干细胞

技术领域

本发明涉及医学影像领域，特别涉及靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，所述的多肽分子影像探针能够增强磁共振加权成像对比度。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体，它们可以通过对称性分裂维持自身细胞群的数量，也可以进一步分化成为不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织和器官。自我更新和分化是干细胞的两个主要特征。干细胞再生医疗的基本思路是通过诱导移植体内的干细胞定向分化，实现对受损组织和器官的再生修复。在干细胞研究中，实时跟踪干细胞移植体内后的存活、迁移和归巢、定向分化等生理行为，对干细胞进行准确的组织生物学分布示踪，并区分内外源干细胞、自我更新产生的干细胞及分化产生的功能细胞，从而深入认识干细胞在体内的迁移、繁殖、分化与分裂等生理过程，无论对干细胞生物学基础研究，还是在临床上进行疗效观察和功能恢复的评估，都具有非常重要的意义。

磁共振影像是研究干细胞体内维持与分化过程的重要技术手段，对人们认识干细胞在体内的迁移、繁殖、分化与分裂等过程具有不可替代的作用。磁共振影像技术是一项在现代医学、生命科学和材料科学中得到了广泛应用的无创伤检测技术，已有30多年的发展和应用历史，带来了巨大的社会和经济效益。特别是在临床诊断和生物医学基础研究等领域中，磁共振影像技术是最有潜力的非损伤活体影像技术，它是研究生物组织或活体的形态、生理、病理以及功能的必不可少的影像学工具。

磁共振影像是基于不同生物组织中水质子的自旋磁矩在均匀磁场中有序排列过程形成的磁矩受到特定的微波激发后，其纵向弛豫时间(T₁)或横向弛豫时间(T₂)可能存在差异，导致回波的信号强度不同在影像中形成的对比度差异实现对生物体的细胞、组织和器官的结构和功能成像。当不同组织的影像对比度接近时，还可以通过引入造影剂来改变特定组织如肿瘤组织中的水质子的驰豫时间，实现对该特定组织的成像，因此，磁共振造影剂是磁共振影像技术研究和应用的一个重要领域。

磁共振造影剂按照其功能可以分为T₁造影剂和T₂造影剂两类。T₁造影剂以Gd络合物为代表，主要通过显著改变水质子的纵向弛豫时间从而改变T₁加权成像的对比度实现造影功能，Gd络合物造影剂通常在T₁加权像下产生亮信号。T₁造影剂在临床医学中已经得到了广泛的应用，目前临床应用的Gd络合物造影剂可以分为两类：一类是有环状结构的DOTA及其衍生物，一类是无环结构的DTPA及其衍生物。这两类小分子造影剂由于化学结构明确稳定，可以通过化学方法精确控制与靶向分子偶联的过程和结果，因此作为分子影像探针具有很高的可靠性。但是，Gd络合物造影剂面临的一个关键问题是其弛豫率远低于T₂型造影剂超顺磁氧化铁纳米粒子的弛豫率，如商业化小分子造影剂Gd-DTPA和Gd-DOTA的纵向弛豫率r₁一般在3-5mM^-1s^-1，而商业化超顺磁氧化铁纳米造影剂的横向弛豫率r₂一般高出1-2个数量级(100～200mM^-1s^-1)。因此，为了获得足够的组织对比度，需要较大的剂量，导致对金属Gd离子在体内可能带来的安全问题的关切。

分子影像探针是现代生物影像技术发展的一个重要领域，该技术的核心是具有细胞靶向功能的不同种类和大小的分子探针，包括蛋白、抗体、多肽、化学小分子等。其中，靶向多肽分子近年来越来越引起人们的重视，特别是在肿瘤的靶向诊断和治疗研究中得到了广泛深入的研究。抗体蛋白分子量大，需要连接多个造影剂粒子或分子才能获得足够的影像对比度，这往往又影响它们与受体的结合效率，而多肽分子结构简单明确，与造影剂粒子或分子偶联后不会影响其与细胞结合的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，所述多肽分子影像探针能够增强T₁和T₂磁共振加权成像对比度，该分子探针包括：靶向间充质干细胞的多肽分子和造影单元，所述造影单元是金属Gd络合物。

在本发明的一种优选实施方式中，所述多肽分子为由20个以下的氨基酸所组成的直链或环形结构，其中每个氨基酸相互独立地为D型或L型，优选Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-Lys-Met(EM7)或Cys(二硫键)-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys(二硫键)(CC9)。

在本发明的一种优选实施方式中，所述造影单元选自Gd-DOTA，Gd-HP-DO3A，Gd-DO3A-butrol，Gd-DTPA-BMA，Gd-DTPA，Gd-DTPA-BMEA，Gd-BOPTA，Gd-EOB-DTPA或其组合。

在本发明的一种优选实施方式中，每个所述的多肽分子直接或通过树枝状分子、树枝状分子结构单元优选赖氨酸与所述的Gd络合物结合。

在本发明的一种优选实施方式中每个所述的多肽分子通过树枝状分子与所述的Gd络合物1或2或3或4个结合。

在本发明的一种优选实施方式中所述的多肽分子与树枝状分子之间嵌入有间隔子，所述的树枝状分子与Gd络合物之间嵌入有连接子。

在本发明的一种优选实施方式中，所述的间隔子和连接子选自直链状的氨基酸，优选NH₂(CH₂)_pCOOH，NH₂(CH₂CH₂O)_qCH₂COOH，其中p是0～12的整数，q是0～4的整数。当p＝0时，代表没有间隔子或连接子。

在本发明的一种优选实施方式中，每个所述的多肽分子通过其碳端或氮端与树枝状分子连接；所述Gd络合物通过其羧基或氨基与树枝状分子连接，所述羧基选自乙酰基、丙酰基或丁酰基，所述氨基选自乙胺基、丙胺基或丁胺基。

本发明还提供一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针的合成方法，其特征在于：使用交叉保护脱保护策略的固相合成方法依次合成带有或不带有间隔子的靶向间充质干细胞的多肽分子、带有或不带有间隔子或连接子的树枝状分子、和带有或不带有间隔子的造影单元，连接靶向间充质干细胞的多肽分子和造影单元。

在本发明的一种优选实施方式中，靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针的合成方法，其特征在于：将所述的靶向间充质干细胞的多肽分子、造影单元和/或树枝状分子中的一个单元的羧基转化成活泼酯与另一单元的氨基、巯基或羟基进行偶联；或者通过点击化学(clickchemistry)连接多肽分子和造影单元。

本发明还提供一种间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞被靶向该细胞的多肽分子影像探针所标记。

在本发明的一种优选实施方式中，利用所述的多肽分子影像探针引入间充质干细胞中的Gd浓度低于5×10⁹Gd/细胞时，磁共振T₁加权成像对比度得以增强；利用所述的多肽分子影像探针引入间充质干细胞中的Gd浓度高于5×10⁹Gd/细胞时，磁共振T₂加权成像对比度得以增强。

本发明提供了一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，该多肽探针对间充质干细胞具有高度的亲和力和靶向特异性，能对间充质干细胞精准定位。本发明创新地将靶向间充质干细胞的多肽探针与造影单元进行偶联，发现能够显著增强磁共振加权成像对比度。更重要的是本发明发现，间充质干细胞中的Gd浓度低于5×10⁹Gd/细胞时，磁共振T₁加权成像对比度得以增强；Gd浓度高于5×10⁹Gd/细胞时，磁共振T₂加权成像对比度得以增强，一种造影剂在两个浓度即可完成T₁和T₂加权成像，而不必使用两种造影剂，这是一个首创性的发现。另外，本发明还发现不需要较大的造影剂剂量也能获得足够的组织对比度，大大减少了金属Gd离子在体内可能带来的安全问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针的结构示意图。

图2为本发明提供的可用于增强磁共振成像对比度的造影单元金属Gd络合物的结构图。

图3为本发明提供的一种具体的多肽分子影像探针结构示意图，其中利用Gd-DOTA作为造影单元，多肽Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-Lys-Met(EM7)通过氨基与树枝状分子连接，Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子连接。树枝状分子的结构单元个数k可以是0～4的整数；连接子的个数m、n可以是0～4的整数。

图4为本发明实施例使用的一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针Gd-DOTA-EM7，造影单元为Gd-DOTA，EM7通过氨基与NH₂(CH₂)₅COOH连接，Gd-DOTA通过羧基与NH₂(CH₂)₅COOH连接。

图5为本发明实施例1使用的一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针(Gd-DOTA)₂-EM7，造影单元为Gd-DOTA，EM7通过氨基与树枝状分子相连，Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子相连，树枝状分子的结构单元是赖氨酸，结构单元个数为1，间隔子和连接子1的长度是权利要求6所述的p＝0的情况，连接子2的结构是NH₂(CH₂)₅COOH，是权利要求6所述的p＝5的情况。

图6为本发明提供的一种多肽分子影像探针的结构示意图，其中利用Gd-DOTA作为造影单元，多肽Cys(二硫键)-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys(二硫键)(CC9)通过氨基与树枝状分子连接、Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子连接。树枝状分子的结构单元个数k可以是0～4的整数；连接子的个数m、n可以是0～4的整数。

图7为本发明实施例使用的一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针结构Gd-DOTA-CC9，其中造影单元为Gd-DOTA，CC9通过氨基、Gd-DOTA通过羧基与NH₂(CH₂)₅COOH连接。

图8本发明实施例2使用的一种靶向间充质干细胞增强磁共振成像对比度的多肽分子影像探针结构，造影单元为Gd-DOTA，CC9通过氨基、Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子相连，树枝状分子的结构单元是赖氨酸，结构单元个数为1，得到探针分子(Gd-DOTA)₂-CC9，间隔子，连接子1和连接子2的结构是NH₂(CH₂)₅COOH，是权利要求6所述的p＝5的情况。

图9本发明实施例使用(Gd-DOTA)_1～4-EM7和(Gd-DOTA)_1～4-CC9为分子影像探针标记间充质干细胞的体外磁共振T₁加权和T₂加权影像效果图。最左侧图像是纯水、空白间充质干细胞(MSC)、0.025mM和0.125mM四个参比的T₁加权图像。其它从上至下每排依次为(Gd-DOTA)₁-EM7、(Gd-DOTA)₂-EM7、(Gd-DOTA)₄-EM7、(Gd-DOTA)₁-CC9、(Gd-DOTA)₂-CC9、(Gd-DOTA)₄-CC9在不同浓度系列条件下孵育所得到的MSCT₁加权和T₂加权图，图像下面的数字是MSC内Gd的浓度，单位是10⁹Gd/细胞。

图10本发明实施例使用(Gd-DOTA)₄-EM7为分子影像探针标记间充质干细胞移植小鼠体内的磁共振T₁加权影像效果图。

图11本发明实施例使用(Gd-DOTA)₄-EM7和(Gd-DOTA)₄-CC9为分子影像探针标记间充质干细胞移植小鼠体内的磁共振T₂加权影像效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种靶向间充质干细胞增强磁共振成像对比度的多肽分子影像探针，包括：用于识别间充质干细胞的多肽Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-Lys-Met(EM7)和Cys(二硫键)-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys(二硫键)(CC9)以及用于增强磁共振成像对比度的造影单元金属Gd络合物。

本发明实施例中，所述的多肽分子影像探针结构如图1所示，可以通过多肽固相合成技术直接制备；也可以分别合成各个单元，然后将某一单元的羧基转化成NHS活泼酯与另一单元进行连接，或者通过点击化学连接。比如先合成所述的造影单元金属Gd的络合配体(带保护基)、所述的多肽序列(带间隔子或连接子)、保持带有保护基的多肽序列并将需要与造影单元连接的所有的N端部分裸露(如果连接有树枝状分子将有多个氨基)，把造影单元的络合配体的羧基转化成NHS活泼酯与其氨基进行连接，脱去所有的保护基之后与金属Gd络合得到所述的多肽分子影像探针。所述的多肽序列分子可以通过其碳端与树枝状分子连接，也可以通过其氮端与树枝状分子连接。相应地，所述的Gd络合物可以通过羧基与树枝状分子连接，也可以通过氨基与树枝状分子连接。

本发明实施例中，所述的造影单元金属Gd络合物的结构可以是图2中所示的任一种络合物，也可以是图2中所示任一种络合物的衍生物，例如将金属Gd的络合配体中与树枝状分子连接的乙酰基替换为丙酰或丁酰基，也可以把乙羰基替换为乙胺基、丙胺基、丁胺基等得到的衍生物。本发明的一个实施方案中，利用Gd-DOTA作为造影单元，多肽EM7通过氨基与树枝状分子相连、Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子相连，树枝状分子的结构单元采用赖氨酸，合成的多肽分子影像探针的结构如图3所示。树枝状分子的结构单元个数k可以是0～4的整数；连接子的个数m、n可以是0～4的整数，间隔子和连接子的分子结构采用NH₂(CH₂)_pCOOH，其中p是0～12的整数。

本发明的一个实施方案中，利用Gd-DOTA作为造影单元，多肽EM7通过氨基、Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子相连，树枝状分子的结构单元采用赖氨酸，结构单元个数k＝0，n＝1，m＝0时，连接子2的结构是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的多肽分子影像探针的结构如图4所示，对应探针分子Gd-DOTA-EM7；分别为0和结构单元个数k＝1，n＝1，m＝1时，间隔子和连接子1的长度是0，连接子2的结构是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的多肽分子影像探针的结构如图5所示，对应探针分子(Gd-DOTA)₂-EM7。

本发明的一个实施方案中，利用Gd-DOTA作为造影单元，多肽CC9通过氨基、Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子相连，树枝状分子的结构单元采用赖氨酸，合成的多肽分子影像探针的结构如图6所示。树枝状分子的结构单元个数k可以是0～4的整数，连接子的个数m、n可以是0～4的整数，间隔子和连接子的分子结构采用NH₂(CH₂)_pCOOH，其中p是0～12的整数。

本发明的一个实施方案中，利用Gd-DOTA作为造影单元，多肽CC9通过氨基、Gd-DOTA通过羧基与树枝状分子相连，树枝状分子的结构单元采用赖氨酸，结构单元个数k＝0，m＝0，n＝1，间隔子为0，连接子2的结构是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的多肽分子影像探针的结构如图7所示，对应探针分子Gd-DOTA-CC9；结构单元个数k＝1，m＝1，n＝1，对应间隔子、连接子1和连接子2的长度也分别是1，间隔子和连接子的结构是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的多肽分子影像探针的结构如图8所示，对应探针分子(Gd-DOTA)₂-CC9。

在本发明的一个实施方案中，利用靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针(Gd络合物)_1～4-EM7或(Gd络合物)_1～4-CC9标记间充质干细胞，然后对标记间充质干细胞体外磁共振T₁加权成像和T₂加权成像，并测定细胞中的Gd含量。选取标记细胞Gd浓度在1～5×10⁹Gd/细胞之间的标记细胞，通过定点注射的办法移植到小鼠体内，并对细胞移植位置进行磁共振T₁加权成像。选取标记细胞Gd浓度为～1×10¹⁰Gd/细胞的标记细胞，通过定点注射的办法移植到小鼠体内，并对细胞移植位置进行磁共振T₂加权成像。

具体实施例如下：

实施例1：(Gd-DOTA)₂-EM7分子影像探针的合成

1、Bu^t ₃DOTA(1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–10-(乙酸)-1,4,7,10–四氮杂环十二烷)的合成。按以下步骤从1,4,7,10–四氮杂环十二烷(一种大环多胺)开始合成：

a)称取10.0g1,4,7,10–四氮杂环十二烷和29.3gNaHCO₃于一升的三口瓶中，加入50mL乙腈。通风橱内称取37.4g溴乙酸叔丁酯，加20mL乙腈后混合均匀，放入滴液漏斗中。在冰浴和氮气保护下把溴乙酸叔丁酯的乙腈溶液缓慢滴加至反应混合物中。滴加完毕后，室温下继续搅拌30小时。滤除固体，旋转蒸发除去乙腈，用甲苯重结晶2次，得白色固体Bu^t ₃DO3A(1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–1,4,7,10–四氮杂环十二烷)16g。

b)称取1.38gK₂CO₃和2.57gBu^t ₃DO3A于250mL的三口烧瓶中，加入50mL乙腈，N₂保护和室温搅拌下滴加1.0g溴乙酸乙酯的5mL乙腈溶液，温度升至70℃反应12-24小时。冷却至室温，过滤，旋转蒸发除去溶剂。用CH₂Cl₂/MeOH(20:1)为展开剂进行柱色谱层析分离，得到淡黄色粘稠状泡沫状产物1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–10-(乙氧羰甲基)1,4,7,10–四氮杂环十二烷(Bu^t ₃Et-DOTA)2.5g。

c)称取1.5gBu^t ₃Et-DOTA于250mL的三口烧瓶中，加入50mL二氧六环溶解，氮气保护下加入25mL1.2MNaOH水溶液，50-70℃搅拌4小时。旋转蒸发除去二氧六环，用二氯甲烷萃取三次(每次25mL)，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去溶剂，用CH₂Cl₂/MeOH(20:1)为展开剂进行柱色谱层析分离，得到淡黄色粘稠状泡沫状产物Bu^t ₃DOTA1.0g。

2、用固相合成的方法合成(DOTA)₂-EM7：步骤简述如下：按传统的Fmoc(氯甲酸芴甲酯)法在固相合成仪上合成，按图5所示的(DOTA)₂-EM7序列结构，从C端向N端依次偶联氨基酸。固相载体2-氯三苯甲基树脂1g，依次加入Fmoc保护的氨基酸进行缩合(1.1gFmoc-Met-OH，1.4gFmoc-Lys(Boc)-OH，1.06gFmoc-Leu-OH，1.82gFmoc-Gln(Trt)-OH，1.06gFmoc-Leu-OH，1.01gFmoc-Pro-OH，1.27gFmoc-Glu(otBu)-OH，2.0gFmoc-Lys(Mtt)-OH，1.06gFmoc-ε-Acp-OH，1.72gBu^t ₃DOTA)。每步的羧基和氨基缩合的条件是以50mL的DMF为溶剂，加入0.96gTBTU、0.41gHOBt缩合剂和2.5mL的碱DIPEA，25℃反应大约24小时，具体时间以茚三酮显色为准来判断羧基和氨基缩合是否结束；缩合结束之后抽干溶剂，分别用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入下一个Fmoc保护的氨基酸之前脱除上一个Fmoc的条件：25mL20％哌啶/DMF室温反应0.5小时，抽干，再加入25mL20％哌啶/DMF反应0.5小时，抽干，分别用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤三次。

缩合一分子的Bu^t ₃DOTA之后，加入50mL1％TFA/二氯甲烷脱去保护基团Mtt，抽干。分别用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤三次。加入1.72gBu^t ₃DOTA，50mL的DMF溶剂，0.96gTBTU、0.41gHOBt缩合剂和2.5mL的碱DIPEA，25℃反应，以茚三酮显色判断羧基和氨基缩合结束之后抽干溶剂，分别用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入50mL50％TFA/二氯甲烷，25℃反应40分钟。过滤，取滤液，用三乙胺将滤液pH调到中性，浓缩至干。加入乙醚，析出白色固体，得粗产品。

粗产品进一步用HPLC纯化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridgePreC185μm19×150mm,流动相为：溶剂A(0.1％TFA水)，溶剂B(0.1％TFACH₃CN)，溶剂A从50％到25％25分钟；流速10mL/分钟。得到约200mg产品(DOTA)₂-EM7，纯度95％以上。

3、将脱保护的DOTA₂-EM7与Gd³⁺络合，得到(Gd-DOTA)₂-EM7分子影像探针。具体如下：将含有38.1mg的GdCl3·6H2O的水溶液约1.0mL滴加到100mg上述DOTA₂-EM7的水溶液中混合3小时，小心用1.0M氨水调pH值到6左右，室温下静态混合器转动过夜，然后用1.0M氨水和1.0M盐酸小心调pH值到7-8，澄清水溶液冷冻干燥后得到白色粉末(Gd-DOTA)₂-EM7分子影像探针。用HPLC检测(Gd-DOTA)₂-EM7的纯度。HPLC条件，Waters2535_2707_2998，SapphireC185μm4.6×250mm,流动相为：溶剂A(0.1％TFA水)，溶剂B(0.1％TFACH₃CN)，溶剂A从80％到60％20分钟；流速1.0mL/分钟。纯度在95％以上。

实施例2：(Gd-DOTA)₂-CC9分子影像探针的合成

1、合成Bu^t ₃DOTA：1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–10-(乙酸)-1,4,7,10–四氮杂环十二烷。按以下步骤从1,4,7,10–四氮杂环十二烷开始合成：

a)按实施例1合成Bu^t ₃DO3A。

b)称取1.38gK₂CO₃和2.57gBu^t ₃DO3A于250mL的三口烧瓶中，加入50mL乙腈，N₂保护和室温搅拌下滴加1.37g溴乙酸苄酯的5mL乙腈溶液，70℃下反应12-24小时。冷却至室温，过滤除去固体，旋转蒸发除去溶剂。用CH₂Cl₂/MeOH(20:1)为展开剂进行柱色谱层析分离，得到淡黄色粘稠状泡沫状产物1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–10-(苄氧羰甲基)1,4,7,10–四氮杂环十二烷(Bu^t ₃Bz-DOTA)2.6g。

c)称取2.0gBu^t ₃Bz-DOTA于250mL的三口烧瓶中，加入50mL甲醇，N₂保护下加入20mg10％Pd/C,缓慢通入氢气，室温搅拌4小时。旋转蒸发除去甲醇，用CH₂Cl₂/MeOH(20:1)为展开剂进行柱色谱层析分离，得到淡黄色粘稠状泡沫状产物Bu^t ₃DOTA1.0g。

2、用固相合成的方法合成(DOTA)₂-CC9：步骤简述如下：按传统的Fmoc法在固相合成仪上合成，按图8所示的(DOTA)₂-CC9序列结构，从C端向N端依次偶联氨基酸。固相载体2-氯三苯甲基树脂1g，依次加入Fmoc保护的氨基酸进行缩合(1.76gFmoc-Cys(Trt)-OH，1.06gFmoc-Leu-OH，1.01gFmoc-Val-OH，1.4gFmoc-Lys(Boc)-OH，1.01gFmoc-Pro-OH，1.80gFmoc-Asn(Trt)-OH，1.20gFmoc-Thr(tBu)-OH，1.16gFmoc-Ser(tBu)-OH，1.76gFmoc-Cys(Trt)-OH，1.06gFmoc-ε-Acp-OH，1.4gFmoc-Lys(Mtt)-OH，1.06gFmoc-ε-Acp-OH，1.72gBu^t ₃DOTA)。每步的羧基和氨基缩合的条件是以50mL的DMF为溶剂，加入0.96gTBTU、0.41gHOBt缩合剂和2.5mL的碱DIPEA，25℃反应大约24小时，具体时间以茚三酮显色为准来判断羧基和氨基缩合是否结束；缩合结束之后抽干溶剂，分别用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。连接下一个Fmoc保护的氨基酸之前，需脱除上一个Fmoc保护基，具体条件：25mL20％哌啶/DMF室温反应0.5小时，抽干，再加入25mL20％哌啶/DMF反应0.5小时，抽干，分别用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤三次。

缩合一分子的Bu^t ₃DOTA之后，加入50mL1％TFA/二氯甲烷脱去保护基团Mtt，抽干。分别用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤三次。依次加入1.06gFmoc-ε-Acp-OH和1.72gBu^t ₃DOTA进行缩合，羧基与氨基缩合条件和脱除Fmoc保护基的条件同上。最后以茚三酮显色判断Bu^t ₃DOTA和氨基缩合反应结束之后抽干溶剂，分别用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入50mL50％TFA/二氯甲烷，25℃反应40分钟，过滤，取滤液。加入0.1M碘的甲醇-DMF溶液50mL，氮气保护下反应6小时。旋转蒸发浓缩之后加入乙醚，析出白色固体，得粗产品。

粗产品进一步用HPLC纯化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridgePreC185μm19×150mm,流动相为：溶剂A(0.1％TFA水)，溶剂B(0.1％TFA水CH₃CN)，溶剂A从70％到45％25分钟；流速10mL/分钟。得到约50mg产品(DOTA)₂-CC9，纯度95％以上。

3、将脱保护的DOTA₂-CC9与Gd³⁺络合，得到(Gd-DOTA)₂-CC9分子影像探针。例如：将含有33.1mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液约1.0mL滴加到100mg上述(Gd-DOTA)₂-CC9的水溶液中混合3小时，小心用1.0M氨水调pH值到6左右，室温下静态混合器转动过夜，然后用1.0M氨水和1.0M盐酸小心调pH值到7-8，澄清水溶液冷冻干燥后得到白色粉末(Gd-DOTA)₂-EM7分子影像探针。用HPLC检测(Gd-DOTA)₂-CC9的纯度。HPLC条件，Waters2535_2707_2998，SapphireC185μm4.6×250mm,流动相为：溶剂A(0.1％TFA水)，溶剂B(0.1％TFACH₃CN)，溶剂A从90％到70％20分钟；流速1.0mL/分钟。纯度在95％以上。

实施例3：多肽分子影像探针标记的间充质干细胞的制备方法

1、实施例1或2制备的多肽分子影像探针溶于培养基，配成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mM的浓度系列，于D＝90mm的培养皿中培养间充质干细胞24小时。

2、细胞计数和细胞密堆积：移去培养基，用pH为7.4的PBS(2mL×3)洗，除去未结合的分子影像探针。加入1.0mL胰酶进行消化，加入3mLPBS，吹散细胞。取20μL于细胞计数板上，在显微镜下统计细胞数量。其余细胞全部转移至10mL离心管中，并3mLPBS洗培养皿，同样移至离心管中。1200转离心5分钟，除掉PBS。用外径1.3mm的毛细管将细胞转移至内径为1.5mm的一端封口的毛细管中，1500转离心10分钟，将细胞密堆积于毛细管的底部。

3、将毛细管中的细胞在磁共振谱仪中进行T₁加权和T₂加权成像。T₁加权像采用的是饱和恢复序列，TE＝5.2ms，TR＝500ms，FOV＝12×12mm²，矩阵＝96×96，层厚度＝0.8mm，层间距＝0.2mm，累加次数＝4；T2加权像采用的是多层回声，TR＝3000ms，TE＝80ms，20个回波，FOV＝12×12mm²，矩阵＝96×96，层厚度＝0.8mm，层间距＝0.2mm，累加次数＝1。

实施例4：多肽分子探针标记的间充质干细胞中结合的金属Gd浓度测量

1、在体外细胞影像实验结束之后，回收细胞并用0.5mL浓硝酸和0.5mL30％双氧水加热沸腾进行硝化溶解，用去离子水定容到5.0mL，成为样品溶液。为保证ICP-MS测量的准确度，样品Gd浓度一般需在500ppb以下，如果超过500ppb，可进一步稀释后再测定。

2、细胞Gd含量测定：用ICP-MS测量样品Gd的浓度。工作参数为ICP功率＝1250W，冷却气流量＝13L/分钟，辅助气流量＝0.8，雾化气流量＝0.93，取样锥孔径＝0.7mm，采样锥孔径＝1.1mm，扫描方式＝跳峰，泵速＝100转/分钟，积分时间＝30ms。每个样品测量3次，取平均值。根据测得的样品溶液的Gd浓度计算得到Gd的总含量，再除以对应的毛细管中的细胞数量，得到相应的细胞Gd含量。

图9展示了不同细胞Gd含量的间充质干细胞的影像效果。本发明实施例使用(Gd-DOTA)_1～4-EM7和(Gd-DOTA)_1～4-CC9为分子影像探针标记间充质干细胞并进行体外磁共振T₁加权和T₂加权影像。最左侧图像是纯水、空白间充质干细胞(MSC)、0.025mM和0.125mM四个参比的T₁加权图像。其它从上至下每排依次为(Gd-DOTA)₁-EM7、(Gd-DOTA)₂-EM7、(Gd-DOTA)₄-EM7、(Gd-DOTA)₁-CC9、(Gd-DOTA)₂-CC9、(Gd-DOTA)₄-CC9在不同浓度系列条件下孵育所得到的MSCT₁加权和T₂加权图，图像下面的数字是MSC内Gd的浓度，单位是10⁹Gd/细胞。结果显示，当细胞Gd含量达到6×10⁸Gd/细胞时，其T₁加权像的对比度开始显现增强现象；当细胞Gd含量在1～5×10⁹Gd/细胞之间时，其T₁加权像的对比度/亮度最理想；当细胞Gd含量大于5×10⁹Gd/细胞时，其T₂加权像的对比度增强效应开始显现，当细胞Gd含量达到～1×10¹⁰Gd/细胞时，其T₂加权像的对比度/亮度趋于理想。

实施例5：多肽分子影像探针标记的间充质干细胞移植小鼠体内的活体磁共振T₁加权影像：

选取细胞内Gd浓度在1～5×10⁹Gd/细胞之间的标记细胞，通过定点注射的办法移植到小鼠体内，并对细胞移植位置进行磁共振T₁加权成像。11.7T下使用直径为38mm的鸟笼线圈，采用RARE序列参数设置：TE＝7ms,TR＝125,300,500,750,1000,1500,3000,5000ms,FOV＝20×20mm²，矩阵＝128×128,层厚度＝0.5mm，平均数＝4。得到的影像效果如图10所示。

实施例6：多肽分子影像探针标记的间充质干细胞移植小鼠体内的活体磁共振T₂加权影像：

选取细胞内Gd浓度为～1×10¹⁰Gd/细胞的标记细胞，通过定点注射的办法移植到小鼠体内，并对细胞移植位置进行磁共振T₂加权成像。11.7T下使用直径为38mm的鸟笼线圈，采用有50个回声的MSME序列。参数设置TR＝5000ms,TE＝6-300ms,FOV＝20×20mm²,矩阵＝128×128,层厚度＝0.5mm,平均数＝4。得到的影像效果如图11所示。

实施例7：多肽分子影像探针靶向移植到小鼠体内的间充质干细胞的活体磁共振影像：

1、将大约200万个无标记间充质干细胞通过定点注射的办法移植到小鼠体内。

2、按鼠的体重每克给药量0.025mg计算，通过小鼠尾静脉注射的实施例1中合成的多肽分子影像探针，并对间充质干细胞的移植位置进行磁共振T₁加权成像和T₂加权成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，该分子探针包括：靶向间充质干细胞的多肽分子和造影单元，所述造影单元是金属Gd络合物。

2.根据权利要求1所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，其特征在于：所述多肽分子为由20个以下的氨基酸所组成的直链或环形结构，其中每个氨基酸相互独立地为D型或L型，优选Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-Lys-Met(EM7)或Cys(二硫键)-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys(二硫键)(CC9)。

3.根据权利要求1所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，其特征在于：所述造影单元选自Gd-DOTA，Gd-HP-DO3A，Gd-DO3A-butrol，Gd-DTPA-BMA，Gd-DTPA，Gd-DTPA-BMEA，Gd-BOPTA，Gd-EOB-DTPA或其组合。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，其特征在于：每个所述的多肽分子直接与所述的金属Gd络合物结合，或者通过树枝状分子、优选赖氨酸与所述的金属Gd络合物、优选1或2或3或4个金属Gd络合物结合。

5.根据权利要求4所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，其特征在于：所述的多肽分子与树枝状分子之间嵌入有间隔子，所述的树枝状分子与金属Gd络合物之间嵌入有连接子。

6.根据权利要求5所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，其特征在于：所述的间隔子和连接子相互独立地选自直链状的氨基酸，优选NH₂(CH₂)_pCOOH，NH₂(CH₂CH₂O)_qCH₂COOH，其中p是0～12的整数，q是0～4的整数，当p＝0时，代表没有间隔子或连接子。

7.根据权利要求4所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针，其特征在于：每个所述的多肽分子通过其碳端或氮端与树枝状分子连接；所述金属Gd络合物通过其羧基或氨基与树枝状分子连接，所述羧基选自乙酰基、丙酰基或丁酰基，所述氨基选自乙胺基、丙胺基或丁胺基。

8.一种合成权利要求1至7中任一项所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针的方法，其特征在于：使用交叉保护脱保护策略的固相合成方法依次合成带有或不带有间隔子的靶向间充质干细胞的多肽分子、带有或不带有间隔子或连接子的树枝状分子、和带有或不带有间隔子的造影单元，连接靶向间充质干细胞的多肽分子和造影单元。

9.根据权利要求8所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针的合成方法，其特征在于：将所述的靶向间充质干细胞的多肽分子、造影单元中的一个单元的羧基转化成活泼酯与另一单元的氨基、巯基或羟基进行偶联；或者通过点击化学连接多肽分子和造影单元。

10.一种间充质干细胞，其特征在于：所述细胞被如权利要求1到7中任一项所述的靶向间充质干细胞的多肽分子影像探针所标记。

11.根据权利要求10所述的间充质干细胞，其特征在于：利用所述的多肽分子影像探针引入间充质干细胞中的Gd浓度低于5×10⁹Gd/细胞时，磁共振T₁加权成像对比度得以增强；利用所述的多肽分子影像探针引入间充质干细胞中的Gd浓度高于5×10⁹Gd/细胞时，磁共振T₂加权成像对比度得以增强。