CN105726459A - 多肽螯合钙在经皮吸收制剂制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多肽螯合钙在经皮吸收制剂制备中的应用，通过皮肤吸收给机体补充钙和多肽的方式达到治疗皮肤病症的目的，经皮吸收补钙的方式能够最大程度优先补充机体所需的生理活性的离子型钙，特别是这种通过经皮吸收补充钙的方式能够直接快速实现向不存在血液循环系统的表皮系统补钙，解决了口服补钙吸收率低、吸收后先用于骨骼形成的非生理活性结合钙而导致生理活性离子钙不足的问题。本发明中可经皮吸收的多肽螯合钙可用于外用药物制剂、医疗卫生材料、外用保健品制剂、化妆品的制备。

Description

多肽螯合钙在经皮吸收制剂制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种用于经皮吸收的并治疗皮肤病症或全身系统补钙的多肽螯合钙制剂。

背景技术

人体皮肤系统普遍存在缺钙的问题是比较严重的，人体皮肤缺钙会引发多种皮肤病、皮肤屏障作用差、易感染起炎症、易损且破损后愈合周期长、皮肤干燥、敏感、水油平衡失调、加速皮肤老化、环境耐受性弱等各种皮肤问题，特别是面部肌肤处于裸露状态，受强紫外线、污染、辐射等不良环境的影响，更容易引起各种不良的皮肤状态。人体皮肤系统长期处于缺钙状态主要有以下几个方面的原因：

1、人体经口服补充的钙优先用于骨骼、牙齿等不具生理活性的结合钙的需求。

人体中的钙处于长期的动态流失状态，目前人体补钙的途径有两种，一种是通过口服的方式补钙，主要有各种补钙制剂为口服钙片类和口服液类；一种是通过静脉注射的方式补钙，但通过静脉注射的方式危险性大，必须是专业医师方可进行，所以目前通用的摄入钙方式只有口服补钙一种。

人体中钙的存在状态有两种，分别为离子状态和结合状态，结合状态的钙主要是作为组成骨骼、牙齿的主要原料，以构成人体支架维持正常的活动，这类钙不具有正常的生理活性；离子状态的钙是具有生理活性的钙，维持人体细胞正常生理状态所必需的，主要存在于血液、细胞外液、细胞中和皮肤等软组织细胞中。人体处于缺钙的状态时，经口服补充的钙剂优先用于骨骼、牙齿等所需的结合钙的补充，这时所补充的钙已经失去了生理活性，并不能补充或者只能极少量补充离子钙，但这对于调节机体的生理活性是不足的，所以在人体缺钙的情况下通过血液循环向表皮层输送钙离子来保持表皮层钙离子的平衡稳态是非常困难的。

口服钙剂难吸收、吸收率低、受影响因素多而复杂，这主要是胃肠道的复杂环境所引起的。口服补充的钙剂是通过胃肠道来消化吸收的，胃部环境属于强酸性环境，PH值在0.8～3.6之间变化，小肠环境属于弱碱性，pH值在7.2～8.0之间变化，这种酸碱环境的变化对于钙离子的吸收是不利的，如钙离子易在碱性的肠道环境中形成胶稠状氢氧化钙沉淀，使钙离子难以被人体吸收，同时，这种胶稠状物可粘附在肠壁上，进一步影响其他营养元素的吸收。特别是口服钙易受胃肠道中的阴离子污染而生成不溶性的钙，导致钙离子的吸收率大幅降低，例如摄取的食物中含有的植酸、草酸、碱性磷酸盐、脂肪、膳食纤维中的糖醛酸残基、核苷酸、尿酸等都可与钙离子反应生成不溶或难溶的草酸钙、植酸钙、碱性磷酸钙、尿酸钙盐等，不但干扰钙离子的吸收，还会引起钙在组织中沉淀成为钙化灶，在器官内不断沉积形成结石，影响身体健康。

2、人体表皮系统不存在血液循环系统，具有生理活性的钙离子输送难。

人体主要通过血液循环系统向人体各系统各部位输送所吸收的营养物质，但是在表皮系统中不存在血液系统，其营养物质的输送主要通过组织液传输，但其传输量和传输效率非常低，同时由于前述的口服钙离子优先用于结合钙的需求，所以通过口服给表皮系统补充其所需的离子钙是很困难的，具有生理活性的离子钙对维持人体表皮系统的稳态健康是非常重要的，人体表皮系统是机体抵御脱水、损伤、感染、抗病菌的第一道防线，正常的离子钙浓度是维持人体表皮屏障系统稳定、破损后修复的最主要因素，当钙离子含量缺乏或紊乱时会导致表皮屏障遭受破坏，进而引发各种皮肤问题甚至病变，所以维持表皮系统正常的钙离子浓度对于表皮屏障保持稳定或破损后的修复是非常重要的。所以直接补充易于经皮吸收的具有生理活性的离子钙特别是维持表皮系统钙平衡是具有非常重要的意义的。

3、目前市场上缺乏可外用的靶向补钙剂。

目前市场上的各种补钙剂均为口服制剂，包括各种钙片和口服液，这主要是针对胃肠道特殊的消化系统开发的，胃部的pH值在0.8～3.6之间，属于强酸环境，同时还存在各种菌类、有机酸、阴离子对钙离子存在污染变成难溶物不被人体吸收，而人体表皮正常的PH值范围在5.2～6.5之间，属于弱酸性环境，所以一般用于经胃肠道消化吸收的口服钙剂难于经皮吸收。同时，一般口服钙剂多选用无机钙、离子型有机酸钙如氯化钙、碳酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙等，这些钙剂均为离子态，同时有的钙盐还存在溶解性差的问题，在经皮吸收领域，难溶性的化合物和离子型的化合物是非常难吸收的。

同时目前尚无学者研究钙的经皮吸收问题，所以研究有利于经皮吸收的补钙剂是非常有必要的，也是非常具有创新性的研究课题，经皮吸收补钙的方式可以实现直接向机体补充具有生理活性的离子型钙，特别是可以实现优先向不存在血液循环系统表皮系统靶向补钙，且吸收效率高，而且不受胃肠道特殊而复杂的环境的影响，能够解决钙离子易受阴离子污染而导致吸收利用率低的问题。

发明内容

鉴于口服补钙的方式存在的上述问题，特别是优先补充人体表皮和其他软组织系统所需的具有生理活性离子钙所面临的困难，本发明在于提供一种新的补钙途径，以易于经皮吸收的多肽螯合钙为补钙剂，通过经皮吸收的方式直接向人体表皮系统和血液等其他软组织进行靶向补钙，解决皮肤表皮系统和其他软组织系统补钙难的问题。

本发明的一个目的是以经皮吸收途径为一种新的补钙方式，用以补充人体所需的钙，特别是可以优先补充人体维持正常生理活动所需的具有生理活性的离子型钙和及时补充不存在血液循环的机体表皮系统所需要的钙，并增加机体表皮系统中钙含量的储备。

本发明的另一个目的是研究并选择一种或者一类经皮吸收性能较好的含钙化合物，以提高钙的经皮吸收效果，达到较好的钙剂补充效果。

一般情况下，含钙化合物有离子型化合物、配位化合物，大多数都属难溶物质，例如氢氧化钙、碳酸钙、草酸钙等，离子型的含钙化合物在溶解后其中的钙以钙离子的形式存在，但是由于经皮吸收主要是通过细胞膜的“胞吞”作用来吸收物质的，细胞膜的脂性结构对所吸收的物质具有选择性，类似于“相似相溶”原理，所以离子型的物质通常是很难实现经皮给药的，只有脂溶性的物质或者即能溶于水也能溶于脂类溶剂的双亲性物质才能实现较好效果的经皮吸收，但是这些类物质必须满足的另一个条件是分子量要适宜，不能过大。配位化合物属于非离子型化合物，其溶解后的钙以非离子的形式存在，其经皮吸收效果要优于离子型化合物。

本发明研究人员通过实验发现，在含钙的配位化合物中，多肽类螯合钙相对于其他含钙化合物来说具有较好的经皮吸收效果，这可能是因为多肽中含有的氨基和羧基所致，其中含的多肽和皮肤中的卵磷脂构成比较相似，而且其中所含有的羧基成分属于亲水性基团，这就构成了多肽具有一定的双亲性能，同时钙离子作为中心离子通过配位键与多肽螯合呈分子状态，解决了离子态的钙难于吸收的问题，同时小分子量的多肽螯合钙非常符合经皮吸收对物质的选择性要求，提高钙的经皮吸收利用效果。

本发明在于提供一种或一类适应于经皮吸收补钙的多肽螯合钙，其中组成配位体多肽的氨基酸主要包括谷氨酸、胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等各种蛋白质氨基酸中的一种或多种。

本发明中可用于经皮吸收的多肽螯合钙的中心离子钙的来源可以为无机钙盐如氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硅酸钙等，也可以是非螯合型有机钙盐如乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙等，还可以为氧化钙、氢氧化钙，优选为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、氧化钙、氢氧化钙，可以来源于矿物质中的钙，也可以为生物来源如动物体的骨骼等。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙，其中配位体多肽与中心离子钙的螯合比为1:1～4:1之间，优选多肽与钙离子的螯合比为1:1与2:1，更优选为2:1。这种螯合比与不同多肽的结构本身和投料配比方式有关，多肽与钙离子的螯合比为1:1与2:1时的多肽螯合钙结构相对稳定，分子量也比较小，更容易经皮吸收，这也可能是由于同一多肽螯合钙分子中多肽的数量不同对膜结构的影响不同所引起的。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙，其中螯合体多肽可以相同也可以不同，这可以实现在通过经皮吸收补钙的同时补充不同类的多肽类物质以满足机体对多肽的需要。例如当多肽与中心钙离子的螯合比为3:1时，一个多肽螯合钙分子中的三个多肽基团可以同为一种多肽，也可以为两种或三种不同的多肽基团，这对于需要起到不同的治疗效果的要求是非常有用的。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙，其中的螯合体多肽中所含的氨基酸个数为2～100个之间，优选2～70个之间，更优选为2～40个之间，更进一步优选为2～20个之间，特别是分子量较小的寡肽，如二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽等分子量在1000以下的肽，更加特别适用于制备经皮吸收的多肽螯合钙。当被机体吸收后，多肽物质特别是寡肽因其结构简单，分子量小，不饱和，所以能够通过细胞膜的渗透以原形直接进入细胞内，不需要耗费能量，因此小分子肽的吸收、转化和利用，都是高效、完全、彻底的。且利用率远高于单个氨基酸，这是由于单个氨基酸是在机体内首先被合成肽类物质才能被机体利用，而小分子肽在体外已经合成好，进入人体后能够被直接百分之百被吸收利用。

小分子肽能直接进入细胞内，是其生物活性的重要体现。众所周知，很多营养物质和药物尚且不能直接进入细胞内，对于大多数细胞病变医学还无能为力。小分子肽却可以轻而易举地直接进入细胞内，并且透过皮肤屏障、透过血脑屏障、透过肠胃粘膜屏障，同时小分子肽还可以改善膜的通透性，增强机体细胞能够有效的吸收营养。

小分子肽对于细胞的作用是双重的，即可以补充营养需求修复缺损，又可以改善功能状态。同时具备承载工具和材料的双重职责。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙，其分子量在100～5000道尔顿之间，优选为100～4000道尔顿之间，更优选为100～2000道尔顿之间，进一步优选为100～1200道尔顿之间。

当多肽螯合钙的分子量大于5000道尔顿或者多肽中的氨基酸的个数大于100时，影响其经皮吸收效果。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙的特点之一是补充钙离子的同时还可以直接向皮肤和机体补充多肽类物质，大量的文献资料表明，直接向人体器官系统中补充小分子的肽是非常重要和有意义的。

多肽类物质对于机体的生命活动和生理功能正常进行有着非常重要的作用，是生物体内不可缺少的营养成分之一。多肽类物质据其生物活性大致分为生物活性肽和人工合成肽两类，在本发明中的多肽螯合钙中，可以选择生物活性肽或人工合成肽与钙离子进行螯合，但考虑到活性肽对人体具有非常重要的作用，所以一般情况下优选生物活性肽与钙离子进行螯合。

大量的研究资料显示，生物活性肽对人体具有非常重要的生理作用，主要控制人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢，它在人体中处于一种平衡状态，若活性肽减少后，人体的机能会发生重大变化，例如对于成年人或老年人来说，缺少活性肽会导致自身的免疫力下降、新陈代谢紊乱、内分泌失调，进而引起各种疾病的产生，如失眠、身体消瘦或浮肿、行动迟缓、全面衰老等。

在人体中，很多活性物质都是以肽的形式存在的，肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，最终产生特定的生理效应。肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质，肽在人体作为神经递质，传递信息，肽可在人体作为运输工具，将人体所食的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙及对人体有益的微量元素输送到人体各细胞、器官和组织。但现代人因各种因素使人体中的肽流失、损失，合成肽的能力大大减弱，因此现代人体缺乏肽，必须补充人工合成肽，补肽就是补活性，补肽就是补活力，补肽就是补生命。

人不同的年龄时期，各种活性肽的分泌量有非常大的差别，一般分为四个时期：①分泌充足期（20岁以前的青年期）这个时期内分泌量均衡、免疫功能强劲，人体一般不易出现疾病；②分泌不足期（失衡期）（25—50岁壮年和中年期）这一时期如果活性肽分泌不足或失衡会出现各种相关的亚健康状态和轻微疾病症状；③分泌匮乏期（严重不足期）（50岁以上中年和老年期）这一时期严重如果活性肽严重不足和严重失衡，可能出现非常突出的衰老症状，或会引起各种相关疾病发生；④分泌终止期（衰老期），这一时期很短，由于控制人体内分泌的活性肽不分泌或分泌减少，从而导致细胞功能衰退，引发器官功能衰竭和丧失。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙的特点之一是其特殊的经皮吸收利用的方式，多肽螯合钙在以分子状态被整体吸收进入细胞后，可以在细胞液的作用下重新解离成具有生理活性的离子型的钙和多肽，离子型的钙可以进入细胞中的钙库储存起来或者通过相关钙通道进入机体循环系统被加以利用，多肽可以按照机体需求被机体加以重新利用，所以多肽螯合钙既可以解决钙的经皮吸收问题，也能增强其吸收后的机体对钙和多肽的利用效率。

本发明中上述用于经皮吸收的多肽螯合钙的目的之一是提高其经皮吸收利用率，解决通过传统口服补钙时存在的不易吸收、易受胃肠道环境影响、钙离子易受阴离子污染而形成不/难溶性钙盐或化合物、易受年龄等生理因素影响、肝脏首过效应、肠胃灭活、用药个体差异大等引起的其吸收利用率低的问题。

本发明的特点之一是解决了一般的无机钙、有机酸钙等在经皮吸收上的缺陷。无机钙和有机酸钙为离子型化合物，其在溶解状态时，钙是以离子态存在的，难于经皮吸收，而溶解下以螯合的整体状态存在的多肽螯合钙，能够以整体形式被吸收。

本发明的特点之一是解决了通过传统口服补钙的方式难以补充无血液循环系统的表皮层所需钙的难题。一般情况下经口服的方式摄取的钙剂优先被用于补充骨骼、牙齿所需的结合钙，特别是在人体中钙缺乏的时候通过口服的方式补充皮肤表皮系统等软组织所需的离子钙是困难的。多肽螯合钙具有能够在细胞液的作用下重新解离成多肽和钙离子分别被利用的特性，同时经本发明实验人员研究发现特别是在一定分子量范围内的多肽螯合钙中的类脂结构特别适用于经皮吸收，达到向皮肤表皮系统靶向补充钙的效果，解决表皮层缺钙的问题。

本发明的特点之一是可通过经皮吸收的方式补充表皮系统所需的钙，同时还可以优先增加表皮系统、其他软组织系统的细胞中的“钙库”中的钙含量的储存，提高细胞中“钙库”的钙储存量，当表皮层的钙离子流失时，钙库中的钙能被释放出来，有助于缓解表皮层的钙离子流失。

本发明的特点之一是还可以通过经皮吸收的方式补充人体所需的结合钙，即非生理活性钙。当经皮吸收的钙进入血液循环系统时，可以被机体利用以补充骨骼、牙齿等所需进而形成结合钙。

本发明的特点之一是可通过多肽螯合钙达到向皮肤直接补充钙的效果的同时，还可以向皮肤直接补充多肽物质，例如二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽和其他多肽等各种肽类中的一种或多种，这些多肽物质被吸收后可直接被皮肤细胞优先利用以改善肌肤问题。

本发明的另一目的是研究促透剂对多肽螯合钙的促透效果。对于用于经皮吸收的药物有效成分来说，除了药物本身的特性是否适合用于经皮吸收以外，还可以通过添加促透剂的方式促进药物吸收，提高药物有效吸收的速率，这主要是通过改变肌肤屏障的微观结构、降低表皮细胞之间的致密程度、增强药物的溶解性来增加药物有效成分的渗透性。上述可用于多肽螯合钙的促透剂主要包括以下几类：表面活性剂类如吐温、聚氧乙烯烷基酚、十二烷基三甲基溴化胺、十二烷基磺酸钠等；有机溶剂类如乙醇、二甲基亚砜、肉豆蔻酸异丙酯等；有机酸和脂肪醇类如油酸、亚油酸、月桂醇等；香精油及萜烯类化合物如薄荷醇、各种植物精油和挥发油、樟脑、柠檬烯、桉树脑等；氮酮（Azone）及其同系物如月桂氮卓酮等；聚合物类如聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷的嵌段共聚物等；吸水保湿类如角质保湿剂尿素、吡咯酮类衍生物；多元醇类如丙二醇、戊二醇、丙三醇、丁二醇等结构中含有2～8个碳原子的短链醇；其它氨基酸类和多糖类如谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、海藻糖、透明质酸和一些多肽类物质等，可选取以上所述各种促透剂中的一种或多种作为多肽螯合钙的促透体系。当多肽螯合钙用于经皮吸收时，其中上述促透剂的添加总量占药物制剂的质量百分比小于65%，优选为小于40%，进一步优选为小于30%，更进一步优选为小于20%。

本发明的另一目的是当多肽螯合钙用于化妆品类产品时，其中的促透剂不能对皮肤有刺激作用、不能对皮肤的表皮屏障系统有破坏作用、安全性要优，要选择上述促透剂中的香精油及萜烯类化合物如薄荷醇、各种植物精油和挥发油、樟脑、柠檬烯、桉树脑等；氮酮（Azone）及其同系物如月桂氮卓酮等；聚合物类如聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷的嵌段共聚物等；吸水保湿类如角质保湿剂尿素、吡咯酮类衍生物；多元醇类如丙二醇、戊二醇、丙三醇、丁二醇等结构中含有2～8个碳原子的短链醇；其它氨基酸类和多糖类如谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、海藻糖、透明质酸和多肽类物质等各种促透剂中的一种或多种作为多肽螯合钙用于化妆品时的促透体系。以上所选可用于含多肽螯合钙的化妆品的促透剂，具有对多肽螯合钙的促进吸收的作用，同时还可以作为肌肤的营养物质如各种氨基酸、各种植物精油，或者能够作为肌肤的保湿剂如海藻糖和透明质酸等多糖类物质、多元醇类物质。其中上述促透剂的添加总量占产品的质量百分比在0～35%，优选为在0～30%之间，进一步优选为在0～25%之间，更进一步优选为在0～20%之间。

本发明的另一个特点是，在各种外用制剂产品中应用时，多肽螯合钙的添加量的质量百分含量范围在0～60%之间，优选为在0～40%之间，更优选为在0～30%之间，更进一步优选在0～10%之间。

本发明的特点之一是可以将多肽螯合钙制备成不同的外用制剂的剂型，包括喷雾剂、膏霜剂、贴膏剂、涂抹剂、凝胶剂等。

本发明的特点之一是可以制备含有多肽螯合钙的外用药物制剂，可通过经皮给药的方式治疗由钙的缺乏或紊乱引起的皮肤疾病。

本发明的特点之一是可以制备含有多肽螯合钙的外用医疗卫生材料或制剂。

本发明的特点之一是可以制备含有多肽合钙的医疗器械外用制剂。

本发明的特点之一是可以制备含有多肽螯合钙的化妆品，可以为喷雾、水乳剂、膏霜剂、贴膜等，以加快表皮修复，增强表皮屏障功能，改善皮肤纹理、干燥、皱纹、弹性、敏感等肌肤问题。

本发明的特点之一是可以制备含有多肽螯合钙的保健品外用制剂。

本发明通过皮肤吸收达到给机体补充钙和多肽的目的，经皮吸收补钙的方式能够最大程度优先补充机体所需的生理活性的离子型钙，特别是这种通过经皮吸收补充钙的方式能够直接快速实现向不存在血液循环系统的表皮系统补钙，解决了口服补钙吸收率低、吸收后首先用于骨骼形成的非生理活性结合钙而导致生理活性离子钙不足的问题。本发明中可经皮吸收的多肽螯合钙可用于外用药物制剂、医疗卫生材料、外用保健品制剂、化妆品的制备。

具体实施方式

本发明人员列举了以下实施方式，以加深对本发明的理解。

实施例1

多肽螯合钙的制备：本实验以谷胱甘肽为配位体，任意选择氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硅酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙中的一种作为提供中心离子钙的钙源制备多肽螯合钙，以做进一步实验研究，具体如下：

1、谷胱甘肽螯合钙制备

1）称取100g的谷胱甘肽，用350ml去离子水溶解在三口烧瓶中，水浴加热至60℃恒温，至谷胱甘肽完全溶解；

2）称取100g乳酸钙，完全溶解于足量的水中，调节pH至8.0；

3）将2）中配制好的乳酸钙溶液逐滴慢慢加入到1）中的谷胱甘肽溶液中，边加入乳酸钙溶液边轻轻搅拌，搅拌过程中保持恒温状态；

4）加完乳酸钙溶液后，反应约60min，反应完毕；

5）过滤去杂质，滤液可直接备用或将滤液蒸发至谷胱甘肽螯合钙析出，并干燥后粉碎备用。

2、多肽螯合钙定性检测

由于谷胱甘肽螯合钙的水溶液中钙并不是以离子形态存在，所以可以通过检测反应后所得到的物质中是否存在游离的钙离子和含有氨基酸根的游离的多肽，可以确定是否有多肽螯合钙生成，对多肽螯合钙的生成进行定性检测。本实验主要是通过二硫腙试剂与游离金属钙离子的显色反应或者茚三酮试剂与多肽的显色反应来比较反应前后的变化确定是否生成谷胱甘肽螯合钙。具体实验如下：

实验定性检测用试剂：二硫腙试剂、茚三酮试剂、硫化钠。

1）多肽螯合钙的纯化：此实验主要是排除上述制得的多肽螯合钙产品中的未反应的钙离子与谷胱甘肽的影响。

游离钙离子去除：称取少量前述制备的多肽螯合钙的样品，加入适量的无水乙醇，进行充分搅拌，后静置一段时间进行沉淀，过滤，取少量滤液中加入几滴二硫腙试剂，观察滤液是否变色，若变色则按照上述办法对多肽螯合钙继续进行洗涤纯化，直到加入二硫腙试剂后滤液不变色为止，以确定金属钙离子被完全除净；

游离谷胱甘肽去除：取已除去游离钙离子的谷胱甘肽螯合钙少许溶于水中，加入几滴茚三酮试剂，加热至溶液沸腾，若颜色溶液颜色变为蓝紫色，则样品中还存在游离的谷胱甘肽，继续以无水乙醇为纯化剂进行纯化，直到受加热的溶液颜色不变为蓝紫色为止，以确定游离的谷胱甘肽被完全除净。

2）谷胱甘肽螯合钙的定性检测：此实验主要是确定反应产物为谷胱甘肽螯合钙。

取上述1）中纯化的谷胱甘肽螯合钙样品溶解于水中，取溶液三份，分别编号为1、2、3号样品，其中1号溶液中加入定量二硫腙试剂，溶液颜色不变，说明样品中不含游离的钙离子；2号样品中加入几滴茚三酮试剂，加热至溶液沸腾3min，溶液的颜色不变，说明样品中不含游离的谷胱甘肽；3号样品中加入过量的硫化钠，搅拌均匀，静置一段时间，有白色沉淀产生，这说明硫离子置换出了处于螯合态的钙离子，生成了更加稳定的金属硫化物硫化钙，静置一段时间进行沉淀过滤，得到滤液，向滤液中加入几滴茚三酮试剂，加热至溶液沸腾3min，溶液的颜色变为蓝紫色，说明存在游离的谷胱甘肽，这是硫离子夺取产物谷胱甘肽螯合钙中的钙离子后置换出了游离的谷胱甘肽所致，所以上述1中制备的产物为谷胱甘肽螯合钙。

实施例2

本实验比较了多肽螯合钙和氨基酸螯合钙、无机钙、有机酸钙的经皮吸收效果，试验中用离体小鼠皮，所用接收液为0.9%的氯化钠水溶液，试验时间为10h。试验中选择的多肽螯合钙为实施例1中配制的谷胱甘肽螯合钙，氨基酸类螯合钙为谷氨酸螯合钙、无机钙为氯化钙，有机酸钙为葡萄糖酸钙，具体试验方法为将谷胱甘肽螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙配制成质量浓度相同的溶液，取小鼠皮的有效测试面积为直径d=1.5cm的圆形规格，取体积相同的三种溶液均匀涂抹于小鼠皮表面，以franz扩散池透皮测试仪测试并比较谷胱甘肽螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙的经皮吸收效果，具体测试结果如下表1所示：

表1、四种钙剂10h累积透皮量

通过比较谷胱甘肽螯合钙、谷氨酸螯合钙、无机氯化钙、葡萄糖酸钙水溶液的经皮吸收效果，说明了谷胱甘肽螯合钙较其他的钙制剂具有良好的经皮吸收性能，特别是在初始阶段谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收量远大于谷氨酸螯合钙、氯化钙和葡萄糖酸钙，而在6h内的吸收总量也远高于谷氨酸螯合钙、氯化钙和葡萄糖酸钙。

实施例3

本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验样品，比较了不同浓度的谷胱甘肽螯合钙溶液对透皮效果的影响。试验中用离体小鼠皮，所用接收液为0.9%的氯化钠水溶液，试验时间为6h。将谷胱甘肽螯合钙配制成不同质量浓度的溶液，取小鼠皮的有效测试面积为直径d=1.5cm的圆形规格，取体积相同的各浓度的谷胱甘肽螯合钙溶液均匀涂抹于小鼠皮表面，以franz扩散池透皮测试仪测试并比较，具体结果如下表2所示：

表2、不同浓度谷胱甘肽螯合钙透皮效果

从上表可以看出，比较了谷胱甘肽螯合钙的浓度为0.5%、1%、1.5%、2%时的经皮吸收性能，谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收性能与其浓度有关，当谷胱甘肽螯合钙的浓度增大时，其经皮吸收性能增大，特别是能够增加其在起始阶段的经皮吸收效果，在起始1h内，浓度为2%的谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收量约为浓度为0.5%时的5.5倍，约为浓度为1%时的4.6倍，这对于其在化妆品中的应用是非常重要的。同时，浓度为2%时在6h内的吸收率达到65%，远高于浓度为0.5%时的34%，浓度为2%时6h内的总吸收量为0.5%时的4.5倍。

实施例4

本实验考察pH值对多肽螯合钙经皮吸收效果的影响：本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验用样品，通过比较不同PH值体系环境下谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收效果，具体实验如下：试验中谷胱甘肽螯合钙溶液的pH值模拟人体肌肤的pH值变化范围，测试pH值分别为5.5、7.0、8.5时谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收效果，其中透皮性能的测试方法与前述实施例中的方法相同，试验时间为6h，测试结果如下表所示：

表、不同pH对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果的影响

从上述测试结果来看，不同的pH值环境对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果有一定的影响，pH值为5.5和8.5时谷胱甘肽螯合钙的透皮效果要比pH为7.0时稍好一些，pH值为5.5时最好。

实施例5

本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验用样品，考察了多元醇类促透剂对谷胱甘肽螯合钙的透皮吸收效果的影响，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，试验结果如下表所示，其中空白样为不添加促透剂的空白谷胱甘肽螯合钙样品，“丁”指丁二醇，“丙”指丙二醇，“戊”指戊二醇：

表、多元醇体系对谷胱甘肽螯合钙透皮效果的影响

从以上实验结果可以看出，多元醇作为促透剂对谷胱甘肽螯合钙具有一定的促透作用，特别是多种多元醇按照一定的配比使用时对谷胱甘肽螯合钙的促透效果非常明显，最高能够比不添加促透剂提高26.7%。

实施例6

本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验用样品，考察了多元醇促透体系添加量对谷胱甘肽螯合钙经皮吸收性能的影响，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，其中空白样为不添加促透剂的空白谷胱甘肽螯合钙样品，按照丁二醇：丙二醇：1,2-戊二醇=1：1：2配制促透液，并配制一定浓度的谷胱甘肽螯合钙溶液，其中混合多元醇促透剂的添加量分别为0，4%，6%，8%，实验结果如下表所示：

表、混合多元醇促透剂的添加量对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果的影响

从以上实验结果可以看出，多元醇促透体系的添加量对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果有较大影响，在一定范围内，促透效果随着促透剂添加量的增大而增大，特别是在初始1h内，具有明显的影响，说明多元醇促透体系在1h内对谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收效果时非常有利的。

实施例7

本实验主要考察了氨基酸对药物成分的促透作用，试验中选用谷氨酸与实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙混合溶液作为试验样品，并设置不含谷氨酸的对照组进行实验，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，实验结果如下表所示：

表、谷氨酸对谷胱甘肽螯合钙的透皮性能的影响

从以上试验结果可以看出，添加谷氨酸的试样中的谷胱甘肽螯合钙的累积透过量要大于不加谷氨酸的样品，这说明谷氨酸对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果具有促进作用。

实施例8

本实验主要考察了小分子肽对药物成分的促透作用，试验中选用谷胱甘肽与实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙混合溶液作为试验样品，并设置不含谷胱甘肽的对照组进行实验，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，实验结果如下表所示：

表、谷胱甘肽对谷胱甘肽螯合钙的透皮性能的影响

从以上试验结果可以看出，添加谷胱甘肽的试样中的谷胱甘肽螯合钙的累积透过量要大于不加谷胱甘肽的样品，这说明谷胱甘肽对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果具有促进作用。

实施例9

本实验主要考查了多糖类物质对谷胱甘肽螯合钙的促透作用，试验中选用海藻糖和透明质酸（HA）分别对谷胱甘肽螯合钙的促透效果，试验中以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验样品，并设置不含海藻糖和透明质酸的对照组进行实验，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，实验结果如下表所示：

表、不同海藻糖的添加量对谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收量的影响

表、不同透明质酸钠添加量对谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收量的影响

从以上实验结果可以看出，海藻糖和透明质酸对谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收均具有一定的促透效果，但透明质酸对谷胱甘肽螯合钙的促透作用具有量效性，即在一定浓度范围内对谷胱甘肽螯合钙具有促透效果，而高于一定浓度时，反而对谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收起抑制作用。

实施例10

本实验考察了月桂氮卓酮（Azone）对谷胱甘肽螯合钙的经皮吸收时的促透效果，试验中以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验样品，并设置Azone的对照组进行实验，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，实验结果如下表所示：

表、Azone对谷胱甘肽螯合钙的透皮性能的影响

从以上试验结果可以看出，Azone对谷胱甘肽螯合钙的透皮效果具有较好的促进作用。

实施例11

谷胱甘肽螯合钙对离体角质细胞的增殖效果影响：本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验样品，通过考察谷胱甘肽螯合钙对离体角质细胞增殖的影响来说明谷胱甘肽螯合钙对皮肤屏障作用恢复的影响。试验中以小鼠外移皮肤进行表皮屏障修复实验，使用一定浓度的谷胱甘肽螯合钙溶液处理，另设一组空白对照组，进行平行比较试验，并通过免疫荧光的方法追踪表皮角质细胞，考察24小时后在重建表皮中处于增殖过程中的角质细胞的变化情况。实验中观察并比较了一定浓度的谷胱甘肽螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙对于在重建表皮的过程中处于增殖过程中的角质细胞的变化情况，说明谷胱甘肽螯合钙在表皮屏障修复过程中对角质细胞的增殖作用，具体结果见下表：

表、不同钙剂在24h内对表皮屏障修复过程中对角质细胞的增殖作用

	空白组	谷胱甘肽螯合钙	谷氨酸螯合钙	氯化钙	葡萄糖酸钙
						角质细胞增长率/%	1.5	34.1	22.4	9.3	13.7

从以上试验结果可以看出，谷胱甘肽螯合钙对角质细胞增殖作用的影响最大，这可以说明谷胱甘肽螯合钙对皮肤表皮屏障功能的恢复性能要优于一般的氨基酸螯合钙和其他非氨基酸螯合钙组。

实施例12

本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为试验样品，通过设计空白组、比较对照组实验，考察了谷胱甘肽螯合钙对表皮屏障恢复效果的影响，直观地了解了谷胱甘肽螯合钙对表皮屏障恢复的影响，试验中通过小鼠外移皮肤进行表皮屏障修复实验，使用谷胱甘肽螯合钙喷剂对表皮进行3次/天的处理，实验过程中对表皮层进行Trichrom-Masson染色，观察其表皮厚度的变化情况，实验结果见下表：

表、不同钙剂在6d内对表皮角质层的修复作用

	空白组	谷胱甘肽螯合钙	谷氨酸螯合钙	氯化钙	葡萄糖酸钙
						角质层厚度变化/%	0.9	26.4	17.1	7.5	9.3

通过以上实验结果可以看出，使用谷胱甘肽螯合钙6天后，其表皮层的厚度明显增加，要优于不加谷胱甘肽螯合钙的空白组和其它钙剂的对照组，说明谷胱甘肽螯合钙在表皮屏障修复过程中与其它钙剂相比有着更加明显的效果。

实施例13

本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙为原料，分别制备成一定浓度的谷胱甘肽螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙水溶液，进行人体皮肤实施物理性破坏后分用配制的以上各种钙剂进行涂抹，与空白样进行对比，考察不同钙剂对破损皮肤的修复效果，具体试验方法如下所述：

人体表皮破坏试验：以健康人体前臂内侧作为试验部位，用胶带进行物理性反复撕拉15次造成皮肤表皮损伤破坏，将试验组分为四组，分别为空白组、谷胱甘肽螯合钙、谷氨酸螯合钙组、氯化钙组、葡萄糖酸钙组进行表皮损伤恢复实验，具体实验结果如下：

由以上实验结果可以看出，含钙试验组对轻度表皮损伤皮肤的修复效果要优于空白组，含钙组样品对破损肌肤的修复效果为谷胱甘肽螯合钙最优，氨基酸类螯合钙次之，葡萄糖酸钙略优于氯化钙。

实施例14

以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为原料，添加前述实施例中的促透剂，制备成喷剂，进行了志愿者测试，试验中设置空白组、对照组、试验组，考察谷胱甘肽螯合钙对皮肤的改善调节效果，并与其它无机钙、有机酸钙进行比较。测试部位为面部，测试时间为两周，受试志愿者共有64名，其中32名为干性敏感肌肤，32名为油性肌肤，受试期间未进行其他治疗方式，禁用其它护肤品。采用VISIA测试仪测试受试者面部肌肤的变化情况，包括皮肤的含水量变化、弹性值、皮脂量、面部pH值变化、面部细菌生长变化、皮肤光泽度、紧致效果、毛孔改变、抗敏效果、不同类型肌肤适应性等，综合评价谷胱甘肽螯合钙对于面部肌肤的修复调节作用。VISIA测试仪和SOFT5.5皮肤性质测试的各项指标如下：

1）水分：皮肤水分值高低用于衡量皮肤的干燥程度，也是反映皮肤屏障功能的重要指标之一，水分测试值越高，表明补水效果非常好；

2）皮脂：表示皮肤油脂分泌能力，测试值越高，表明油分含量过高；

3）弹性：测试结果值越高，表明皮肤弹性越好；

4）酸碱值：油性肌肤的PH值较低，这是由于分泌的油脂中含有游离脂肪酸的缘故；

5）皱纹：反应脸部的干纹、细纹、静态纹等状况，皱纹一般与皮肤弹性降低有密切关系；

6）纹理：反映皮肤的平滑度及饱满感，健康的角质层的“峰”和“谷”差异越小，皮肤饱满感越好，角质层的锁水保湿能力越强；

7）紫质：油性皮肤所关注的检测项之一，对控制皮肤炎症、皮脂分

泌具有重要意义，主要检测毛囊口的各种细菌如痤疮丙酸杆菌、马拉

色菌等的代谢产物，其检测结果越低，说明毛囊口处的以上细菌越少，

产品的抑菌效果明显；

1、干性肌肤应用试验效果：将干性肌肤类型的32名志愿者随机为4组，每组8人，分别为空白组、谷胱甘肽螯合钙组、谷氨酸螯合钙组、氯化钙组，进行效果对比试验，本实验结果如下表所示：

表、不同钙剂对干性肌肤的修复效果

2、油性肌肤应用试验效果：将油性肌肤类型的32名志愿者随机分为4组，每组8人，分别为空白组、谷胱甘肽螯合钙组、谷氨酸螯合钙组、氯化钙组，进行效果对比试验，本实验结果如下表所示：

表、不同钙剂对油性肌肤的修复效果

由以上试验结果可以看出，与空白组相比较，含钙组对皮肤修复效果要优于空白组，在几种不同钙剂的试验组中，含谷胱甘肽螯合钙组要明显优于氨基酸类螯合钙、氯化钙组，其对于油性肌肤和干性肌肤都是适应的。

实施例15

本实验以小鼠为实验对象，分为两组，其中一组为经口服喂食实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙，另外一组通过经皮给药的方式向皮肤补充谷胱甘肽螯合钙，采用原子吸收分光光度法分别测试并比较两种补钙途径在不同时间段时表皮系统中钙的含量变化情况。

表、不同补钙方式对皮肤中钙含量变化的影响

从以上试验结果可以看出，口服补钙的方式对于补充表皮中的钙是很困难的，经皮给药的方式能够快速有效提高表皮中的含钙量，解决表皮系统缺钙的问题。

实施例16

多肽螯合钙水溶液稳定性考察：本实验以实施例1中制备的谷胱甘肽螯合钙为原料，考察谷胱甘肽螯合钙水溶液的稳定性，要在制备的水溶液中添加防腐剂，实验结果如下所示：

表、谷胱甘肽螯合钙在不同条件下的水溶液的稳定性

从以上试验结果可以看出：谷胱甘肽螯合钙的水溶液的稳定性优，对于外用液体制剂来说，这种稳定性是十分必要的，说明其更适用于制备外用含水制剂，如喷剂、凝胶剂、涂抹剂、搽剂等。

以上所述是体现本发明研究过程及结果的实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以进行若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.多肽螯合钙在制备经皮吸收制剂中的应用，多肽螯合钙中多肽与钙离子的螯合比为1:1～4:1之间，所述的多肽可以相同也可以不同，组成多肽的氨基酸的个数在2～100个之间，其中氨基酸可以相同也可以不同；上述的多肽螯合钙在经皮吸收制剂中的质量百分含量在0～60%之间；在上述含多肽螯合钙的经皮吸收制剂中还含有质量百分含量在0～35%之间的促透剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述多肽螯合钙的分子量范围在100～5000之间，优选为100～4000之间，更优选为100～2000之间，进一步优选为100～1200之间；更确切地说在100～200、200～300、300～400、400～500、500～600、600～700、700～800、800～900、900～1000、1000～1100、1100～1200之间。

3.根据权利要求1～2所述的用于制备经皮吸收制剂的多肽螯合钙，其特征在于组成多肽的氨基酸的个数在2～100个之间，优选2～70个之间，更优选为2～40个之间，更进一步优选为2～20个之间，更确切地说为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14～20个。

4.根据权利要求1所述的用于制备经皮吸收制剂的多肽螯合钙，其特征在于其中多肽与钙离子的配位比在1:1～4:1之间，优选多肽与钙离子的螯合比为1:1与2:1，更优选为2:1。

5.一种经皮吸收制剂，其特征在于所述的制剂中活性成分为权利要求1～4任意一项所述的多肽螯合钙，质量百分含量在0～60%之间，以及质量百分含量在0～35%之间的促透剂。

6.根据权利要求5所述的经皮吸收制剂，多肽螯合钙添加量的质量百分含量在0～60%之间，优选为在0～40%之间，更优选为在0～30%之间，进一步优选为在0～10%之间，更确切地说在在0～2%、2%～4%、4%～6%、6%～8%、8%～10%之间。

7.根据权利要求5～6所述的经皮吸收制剂，其中促透剂的添加量范围以质量百分含量计在0～35%之间，优选为在0～30%之间，更优选为在0～25%之间，进一步优选为在0～20%之间，更确切地说在在0～2%、2%～5%、5%～8%、8%～11%、11%～14%、14%～17%、17%～20%之间。

8.根据权利要求5～7所述的经皮吸收制剂，促透剂包括表面活性剂类、有机溶剂类、有机酸和脂肪醇类、香精油及萜烯类化合物、氮酮及其同系物、聚合物类、吸水保湿类、多元醇类、氨基酸和多糖类、肽类中的一种或多种组成促透体系。

9.根据权利要求5～8所述的经皮吸收制剂可应用于药物外用制剂、医疗器械外用制剂、保健品外用制剂、化妆品。

10.根据权利要求9所述的应用，所述的经皮吸收制剂用于化妆品类产品，促透剂包括香精油、氮酮及其同系物、聚合物类、吸水保湿类、多元醇类、氨基酸、多糖类、多肽等各种促透剂中的一种或多种作为促透体系。

11.根据权利要求5～10所述的经皮吸收制剂中的促透剂，优选为氮酮、丙二醇、戊二醇、丁二醇、乙二醇、丙三醇、薄荷、冰片、氨基酸、多糖中的一种或多种。

12.根据权利要求9所述的应用，所述的经皮吸收制剂用于治疗或预防皮肤缺钙所引起的疾病。

13.根据权利要求12所述的应用，所述的疾病包括表皮屏障修复、皮肤损伤修复、皮肤炎症、皮肤衰老、皮肤干燥皴裂、美白、抗氧化、抗皱、增加皮肤弹性、抗敏舒敏、改善皮肤微循环、痤疮和油性肌肤调节、抑菌、色素障碍性皮肤病、营养与代谢障碍性皮肤病、变态反应性皮肤病、皮肤脉管性疾病、皮肤血管炎类疾病、红斑性皮肤病。

14.根据权利要求9所述的应用，所述的经皮吸收制剂还可以用于补充人体全身所需的钙，如提高血钙浓度，补充骨骼、牙齿所需钙，其他器官系统所需的钙。

15.根据权利要求12～13所述的应用，提供一种用于皮肤屏障修复的多肽螯合钙喷雾配方，具体如下所示：谷胱甘肽螯合钙：0.7%；丙二醇：3%；戊二醇：1.5%；海藻多糖：0.3%；透明质酸钠：0.04%；月桂氮卓酮：1.5%；脯氨酸0.3%；水：92.66%。