CN105693713B - 一种双黄素、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双黄素，具有如通式(Ⅰ)所示的结构。本发明还公开了该化合物的制备方法，由小檗红碱与黄芩素的合成得到。本发明还公开了该化合物在制备治疗溃疡性肠炎药物中的应用。该化合物与小檗碱和黄芩素相比，多核分子化合物的毒性得到显著降低，吸收显著提高，提高了生物利用度，延长了代谢时间，可以达到长效的效果，而且增强了抗溃疡性肠炎和抗致病菌的药效。

Description

一种双黄素、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一种双黄素，以及涉及该化合物的制备方法和在制备治疗溃疡性肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称慢性非特异性溃疡性结肠炎或特发性溃疡性结肠炎，是一种常见的慢性肠道疾病，也是一种多因素、多层次的原因不明的非特异性炎症。病变主要在结肠的黏膜及黏膜下层，呈连续性弥漫性分布，多数累及直肠和乙状结肠。主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等，部分患者有肠外表现，如关节、肝胆管类疾病及眼睛、皮肤的损伤；病程迁延不愈，轻重不等；发病的年龄段主要在20～50岁之间，但无显著性的性别差异。国内外流行病学统计数据显示，UC的发病率和和患病率均呈现明显的增高趋势。“炎症性肠病”(inflammatory bowel disease，IBD)，广义上是指特发性慢性炎症性肠道疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcertaive，UC)与克罗恩病(Crohn’sdisease，CD)。在西方社会这两种疾病加在一起的患病率约为1/1000。其中UC发病率占IBD的50％，UC是在白种人中比较高发的疾病，同时在亚洲的发病率也呈明显上升趋势，在我国UC的发病率约为11.6/10万。UC发作期与缓解期反复交替，病程冗长，且治愈难度大，治愈后复发率高，并与结肠癌发病存在一定相关性，愈合较差，被世界卫生组织列为现代难治病之一。

小檗碱(berberine)具有抗病原微生物作用：抗菌作用、抗病毒作用、抗原虫和抗毒作用；还具有对心血管系统的作用：抗心律失常、降低血压、正性肌力和对缺血性脑损伤有保护作用、降血糖作用。大量的药理及临床研究证实，小檗碱不仅有显著的降血糖作用，而且对糖尿病人伴有的合并症高血压血栓形成等有良好的防治作用、抗炎作用、抑制血小板聚集作用，具有增强免疫和抗癌功能，同时，还具有抗溃疡作用、解热作用和还具有中枢抑制和利胆等作用。

黄芩素(Baicalein)存在于中药黄芩中，具有对多种自身免疫性和炎症实验动物模型有明确的免疫调控和抗炎作用。黄芩素具有较强的抗菌作用，可能是黄芩起抗菌作用的主要成分。经研究，黄芩素和中药黄芩二者具有显著的抗菌活性，抗炎和免疫调控方面等生物活性。

目前，关于小檗碱与黄芩素的化学合成拼接成为新多核分子的专利及相关研究，还未见公开或相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毒性低、容易吸收、药效时间长的多核化合物，以得到一类新的治疗溃疡性肠炎的药物。

本发明的另一个目的还在于提供上述多核化合物的制备方法，以解决上述技术问题中的至少一个。

本发明的另一个目的还在于提供上述多核化合物的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种双黄素，其结构如式(Ⅰ)所示：

其中，式(Ⅰ)中的n为整数，且1≦n≦10。

在一些具体的实施方式中，上述的n可以优选等于4。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述双黄素的制备方法，由包括以下步骤的方法制得：

(1a)小檗红碱衍生物的合成：称取小檗红碱，加入有机溶剂，加热至沸腾后加入X(CH₂)_n Y，回流反应，将反应液浓缩，冷却结晶，过滤，得小檗红碱衍生物；

其中，步骤(1a)中的有机溶剂为乙腈或与乙腈性能相似的其他有机溶剂；上述的X(CH₂)_n Y中，X＝Y或X≠Y，X、Y独立地为O、S、F、Cl、Br或I，n为整数，且1≦n≦10。

(2a)取步骤(1a)得到的小檗红碱衍生物与黄芩素混合，加入无水碳酸钠和有机溶剂，搅拌，加热回流反应，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用DMSO(二甲基亚砜)溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用硅胶拌样，硅胶柱分离，洗脱后即得双黄素。步骤(2a)中的有机溶剂为乙腈或与乙腈性能相似的其他有机溶剂。

步骤(1a)的合成反应式为：

步骤(2a)的合成反应式为：

在一些具体的实施方式中，上述步骤(1a)可以替换为：

称取小檗红碱1重量份，加入有机溶剂150～200重量份，85℃加热至沸腾，加入1,2-二溴丁烷20～40重量份，回流反应3h，将反应液浓缩至50～100份，冷却得结晶C，过滤，用适量有机溶剂洗涤结晶C，洗涤液与滤液合并，回收有机溶剂，残渣用30重量份的甲醇溶解，冷却得结晶D，过滤，用甲醇洗涤结晶D，合并结晶C和结晶D，即得小檗红碱衍生物。此步骤中得到的小檗红碱衍生物为小檗红碱-9-氧丁基溴，其化学结构式如下：

在一些具体的实施方式中，上述步骤(2a)可以替换为：

取步骤(1a)得到的小檗红碱衍生物1.2重量份与黄芩素1重量份混合，加入无水碳酸钠2重量份、有机溶剂150重量份，搅拌，加热至85℃，回流8h，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用5重量份的DMSO溶解溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC(高效液相色谱)检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用3重量份的硅胶拌样，硅胶柱分离，用20倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，再用甲醇洗脱，回收甲醇，即得双黄素。优选地，采用C18柱进行分离；硅胶的颗粒大小可以优选为400～500目；石油醚和乙酸乙酯混合液中，石油醚和乙酸乙酯的体积比可以优选为1:1。

在一些具体的实施方式中，上述双黄素还可以由包括以下步骤的方法制得：

(1b)黄芩素衍生物的合成：取黄芩素，与无水碳酸钠混合，加入有机溶剂，再加入X(CH₂)_n Y，加热反应，得黄芩素衍生物；

其中，步骤(1b)中的有机溶剂为乙腈或与乙腈性能相似的其他有机溶剂；上述的X(CH₂)_n Y中，X＝Y或X≠Y，X、Y独立地为O、S、F、Cl、Br或I，n为整数，且1≦n≦10。

(2b)取步骤(1b)得到的黄芩素衍生物，与无水碳酸钠和小檗红碱混合，加入有机溶剂，搅拌，加热回流反应，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用硅胶拌样，硅胶柱分离，洗脱，即得双黄素；

步骤(2b)中的有机溶剂为乙腈或与乙腈性能相似的其他有机溶剂。

步骤(1b)的合成反应式为：

步骤(2b)的合成反应式为：

在一些具体的实施方式中，上述步骤(1b)中黄芩素、无水碳酸钠、X(CH₂)_n Y的摩尔比可以优选为1:2:16或者1:2:8，黄芩素与有机溶剂的摩尔体积比可以优选为1:150mol/L，反应温度可以优选为85℃，反应时间为可以优选5h；X(CH₂)_n Y可以优选为1,2-二溴丁烷。此时，生成的黄芩素衍生物为黄芩素-1-氧丁基溴，其结构式如下所示：

在一些具体的实施方式中，上述步骤(2b)可以替换为：取步骤(1b)得到的黄芩素衍生物1重量份、无水碳酸钠2重量份、小檗红碱1重量份加入反应器中，加入有机溶剂150份，搅拌，加热至85℃，回流8h，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用5重量份的DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用3重量份的硅胶拌样，硅胶柱分离，用20倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，再用甲醇洗脱，回收甲醇，即得双黄素。优选地，硅胶的颗粒大小可以为400～500目；石油醚和乙酸乙酯混合液中，石油醚和乙酸乙酯的体积比可以为1:1。

在一些具体的实施方式中，本领域技术人员可采取合适的途径获得上述的小檗红碱，例如：合成或直接在市场上购买，也可以采用以下方法制备而成：

在反应器中加入料液比为1:15～30g/L的小檗碱和DMF(富马酸二甲酯)，加入沸石，回流冷凝，在400W～800W微波辐射下，反应10～20min，取出反应器，趁热加入水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得结晶C；滤液另用大孔树脂柱分离，依次用质量百分浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的甲醇洗脱，收集质量百分浓度为70％甲醇洗脱部位，浓缩，得结晶D，将结晶C和结晶D合并，即得小檗红碱，其结构式如下所示：

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述双黄素在制备治疗溃疡性肠炎药物中的应用。

本发明提供了一种全新的多核分子化合物，即：双黄素，该多核分子化合物由小檗红碱与黄芩素合成得到，改变了单一成分或两个成分混合物的吸收、分布、代谢和排泄的药物代谢环节，所得的到多核分子化合物与小檗碱相比，毒性得到显著降低，吸收显著提高，提高了生物利用度，延长了代谢时间，可以达到长效的效果，增强了抗溃疡性肠炎和抗致病菌的药效。本发明还提供的该多核分子化合物的制备方法，工艺简单，易于操作，便于大规模工业化生产。

本发明中，黄连与黄芩形成一个中药药对，古方有“黄连黄芩汤”为代表多个黄连和黄芩为主药组成的方剂，黄连的代表成分为小檗碱(黄连素)，而黄芩的代表成分为黄芩素，主治阳明温病，干呕，口苦而渴，尚未可下者。

中药药对拼接理论的核心思想是指导如何将两个及两个以上的“天然内核分子”经过人工合成或拼接(可能是任意键或指定键)使其相互连接成具有多个核心作用的分子，称为“新多核分子”。它不同于化药的“药效团”和“孪药”概念，“药效团”是指对于活性起重要作用的结构特征的空间排列形式；“孪药”是指将两个相同或不同的先导化合物或药物经共价键连接，缀合成的新分子，在体内代谢生成以上两种药物而产生协同作用，增强活性或产生新的药理活性，或者提高作用的选择性。

中药药对配伍是中医药学的重要研究内容，唐·《神农本草经》从不同角度对两药配伍进行了论述，并将之归纳于“七情和合”中：即言药“有单行者，有相须者，有相使者，有相畏者，有相恶者，有相反者，有相杀者，凡此七情，合和视之；当用相须、相使者良，勿用相恶、相反者；若有毒宜制，可用相畏、相杀者，不尔，勿合用也。”在中药的配伍研究中，往往出现于方剂里的两味药一起相伍运用，就是药对，又称对药。亦即两味药之间一种比较固定的搭配，使用时常成对应用，其主要作用主要是增强疗效、减弱毒性及副作用。通过药对的配伍实验研究，可揭示药对间的配伍作用，探索其减毒增效的配伍机制，深化中药七情相须、相使等配伍关系。药对可以是传统意义上的中药药对，可研究两味药物之间的配伍规律，也可是研究同一药物中不同化学成分之间的“药对”相互配伍作用。

传统中医药的药对理论可指导中药(饮片)之间的配伍应用；可指导中药有效部位之间的配伍应用；也可指导中药有效成分之间的配伍应用；我们将其发展延伸应用于研究、设计和指导药物分子“天然内核分子”间的相互作用与影响，使研究中药药对中复杂药物的配伍相互作用形式转化为研究药物分子间暨“新多核分子”层面的相互作用关系。

本发明中，“天然内核分子”和“新多核分子”的定义如下：

天然内核分子：来源于自然界生物在的进化过程中为了防御某种伤害或取得某种利益经过进化、衍生出来(不论其分子量大小，结构如何复杂，包括了原生、次生代谢产物)的有核心作用的分子，其衍生、进化的核心目的是针对防御某种伤害或取得某种利益。

新多核分子：经人工将两个或两个以上的“天然内核分子”合成或拼接得到的人造多效的新分子。

基于上述对“天然内核分子”的定义，由两个以上的“天然内核分子”经过人工合成或拼接而成的“新多核分子”则具有单个“天然内核分子”的特性，同时兼有多个“天然内核分子”的药效特性；经过人工合成或拼接后的“新多核分子”对于“天然内核分子”而言至少起到了增效、减毒的作用。在单核分子的任意键或指定键上连接上作用相同或完全不同的单核(或多核)分子使其分子结构、空间构型改变；作用核心也发生改变。

附图说明

图1为小檗红碱-9-氧丁基溴的¹H NMR图。

图2为小檗红碱-9-氧丁基溴的¹³C NMR图。

图3为本发明一种双黄素的¹H NMR图。

图4为本发明一种双黄素的¹³C NMR图。

图5为急性期各组的DAI结果图。

图6为慢性期各组的DAI结果图。

图7为急性期各组小鼠的CMDI结果图。

图8为慢性期各组小鼠的CMDI结果图。

图9为急性期药效观察HS评分结果图。

图10为慢性期药效观察HS评分结果图。

图11为急性期药效观察MDA评分结果图。

图12为慢性期药效MPO考察结果图。

图13为慢性期药效SOD考察结果图。

图14为急性期结肠长度考察结果图。

图15为急性期结肠重量考察结果图。

图16为急性期结肠指数考察结果图。

图17为慢性期结肠长度考察结果图。

图18为慢性期结肠重量考察结果图。

图19为慢性期结肠指数考察结果图。

图20为慢性期脾脏系数观察结果图。

图21为慢性期肝脏系数观察结果图。

图22为慢性期肺脏系数观察结果图。

图23为急性期体重变化考察结果图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

(1a)小檗红碱衍生物的合成：称取小檗红碱1重量份，加入乙腈150(150～200均可)重量份，85℃加热至沸腾，加入X(CH₂)_n Y 40(20～40均可)重量份，回流反应3h，将反应液浓缩至50(50～100均可)重量份，冷却得结晶A，过滤，用适量乙腈洗涤结晶A，洗涤液与滤液合并，回收乙腈。滤渣用30重量份的甲醇溶解，冷却得结晶B，过滤，用甲醇洗涤结晶B，合并结晶A和结晶B，得到小檗红碱衍生物，计算得率为56.34％。其中，本实施例中的X(CH₂)_nY，X、Y均为Br，n＝4，所得小檗红碱衍生物为小檗红碱-9-氧丁基溴，其¹H NMR图如图1所示，¹³C NMR图如图2所示。其中，图1中H的归属如表1所示，图2中的C的归属如表2所示。

表1

表2

(2a)取步骤(1a)得到的小檗红碱衍生物1.2重量份与黄芩素1重量份混合，加入无水碳酸钠2重量份、乙腈150重量份，搅拌，加热至85℃，回流8h，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用5重量份的DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用3重量份的硅胶(400～500目)拌样，硅胶柱分离，用20倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯混合液(石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:1)洗脱，再用甲醇洗脱，回收甲醇，即得双黄素(下文中使用代号X4-s)。MS得到其分子量为:822.24，其¹H NMR图如图3所示，¹³C NMR图如图4所示，其中，图3中H的归属如表3所示，图4中C的归属如表4所示。

表3

表4

本实施例中步骤(1a)中的小檗红碱可直接从市场购买，也可以采用以下方法制备而成：在反应器中加入料液比为1:15～30g/L的小檗碱和DMF，加入沸石，回流冷凝，在400W～800W微波辐射下，反应10～20min，取出反应器，趁热加入水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得结晶C；滤液另用大孔树脂柱分离，依次用质量百分浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的甲醇洗脱，收集质量百分浓度为70％甲醇洗脱部位，浓缩，得结晶D，将结晶C和结晶D合并，即得小檗红碱。

实施例2

除了乙腈用量、X(CH₂)_n Y用量、反应液浓缩度不同外，本实施中的双黄素的制备方法与实施例1的基本相同。其中，本实施例的X(CH₂)_n Y，X、Y均为Cl，n＝5。

实施例3

除了乙腈用量、X(CH₂)_n Y用量、反应液浓缩度不同外，本实施中的双黄素的制备方法与实施例1的基本相同。其中，本实施例的X(CH₂)_n Y，X、Y均为S，n＝6。

实施例4

除了乙腈用量、X(CH₂)_n Y用量、反应液浓缩度不同外，本实施中的双黄素的制备方法与实施例1基本相同。其中，本实施例的X(CH₂)_n Y，X、Y均为O，n＝1。

实施例5

(1b)黄芩素衍生物的合成：取黄芩素1摩尔份，与无水碳酸钠2摩尔份混合，加入乙腈，所述乙腈与黄芩素的体积摩尔比为150:1(L/mol)，再加入X(CH₂)_n Y 16摩尔份，85℃反应5h得黄芩素衍生物。其中，所述X(CH₂)_n Y中，X、Y均为I，n＝10。

(2b)取步骤(1b)得到的黄芩素衍生物1重量份、无水碳酸钠2重量份、小檗红碱1重量份加入反应器中，加入乙腈150重量份，搅拌，加热至85℃，回流8h，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用5重量份的DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用3重量份的硅胶(400～500目)拌样，硅胶柱分离，用20倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯混合液(石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:1)洗脱，再用甲醇洗脱，回收甲醇，即得双黄素。

实施例6

本实施中的双黄素的制备方法与实施例5基本相同，其中，本实施例的X(CH₂)_n Y，X、Y均为F，n＝7。

实施例7

本实施中的双黄素的制备方法与实施例5基本相同，其中，本实施例的X(CH₂)_n Y，X、Y均为Br，n＝3。

为了验证本发明中双黄素的医药活性，特进行以下实验。

一、抗菌活性研究

1.1实验材料

1.1.1实验仪器

电热恒温培养箱、电子天平(上海恒平)、玻璃培养皿、0.25nm除菌滤膜(MP公司)、超净工作台、高压灭菌箱，试管、镊子等工具，用前均需高温灭菌。

1.1.2培养基

Mueller-Hinton营养琼脂培养基、Mueller-Hinton营养肉汤培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)

1.1.3菌种

8种细菌，菌种均来自北京卫生部生物制品研究所。分别是金黄色葡萄球菌(261112-5)、乙型溶血性链球菌(32210)、肺炎链球菌(32215)、绿脓杆菌(10211)、大肠杆菌(44113-5)、伤寒杆菌(50071-16)、白色念珠菌(98001)、乙型副伤寒杆菌。

1.1.4药物

5种药物，小檗碱(BBR，纯度96％)；黄芩苷(g，纯度96％)；黄芩素(s，96％)；X4-s(实施例1中制得的双黄素，纯度95％)；X4-g(自制，小檗红碱9位与黄芩苷在葡萄糖醛酸羧基上的结合物，纯度95％)。

1.2实验方法

1.2.1培养基的配制

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基均按照试剂说明进行，配制1000mL，三角瓶分装，包扎后120℃/30min灭菌，备用。

1.2.2药液配制

1.2.2.1小檗碱样品液的配制

精确称取小檗碱试样1000.00mg，溶于50mL含2.5％吐温及10％DMSO的水溶液中，浓度为2.0mg/mL，微孔滤膜过滤除菌，备用。

1.2.2.2黄芩苷样品液的配制

精确称取黄芩素试样1000.00mg，加入适量5％Na2CO3及蒸馏水定容至10mL，调pH＝7.2，浓度为100.0mg/mL，微孔滤膜过滤除菌，备用。

1.2.2.3黄芩素样品液的配制

精确称取黄芩素试样100.00mg，溶于50mL含5％吐温及10％DMSO的水溶液中，浓度为2.0mg/mL，微孔滤膜过滤除菌，备用。

1.2.2.4 X4-g样品液的配制：

精确称取X4-g试样80.00mg，溶于50mL含10％DMSO的水溶液中，浓度为1.6mg/mL，微孔滤膜过滤除菌，备用。

1.2.2.5 X4-s样品液的配制：

精确称取X4-s试样100.00mg，溶于50mL含10％DMSO的水溶液中，浓度为2.0mg/mL，微孔滤膜过滤除菌，备用。

注：经对照试验，4％DMSO对除乙型链球菌外均没抑制作用；2.5％DMSO对乙型链球菌无抑制作用。

1.2.3抗菌试验

空白对照为不含药物的培养基。配制好的五种药物样品液，加入培养液按倍半稀释方法，从1:2.5、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640依次稀释(X4-g从1:5开始稀释)，共9个浓度，每管总量1ml，流通蒸气灭菌。对于特殊菌种，需另外处理：(1)乙型溶血性链球菌还需另外加入1％葡萄糖。(2)肺炎链球菌还需另外加入10％兔血清。(3)白色念珠菌的试验应用沙氏培养液稀释药液。各种菌种在37℃培养培养8小时后，取0.1ml，分别加入空白对照管及各浓度药液管中，继续37℃培养24小时，观察结果，判定最小抑菌浓度(MIC)，并将结果记入表5中。

1.3实验结果

表5

由表5可见，五种药物均对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌(除黄芩苷外，MIC均≤100ug/ml)、肺炎双球菌具有一定的抑制作用。其中，黄芩素对各种菌种都有较强的抑制作用，抗菌活性最强；其次是小檗碱，再次是X4-s、X4-g，且X4-g比黄芩苷的抗菌活性强。具体每个菌种活性结果：抗金色葡萄球菌活性明显的依次有黄芩素>小檗碱>X4-s>X4-g≈黄芩苷；抗大肠杆菌的活性以黄芩素最强；抗乙型链球菌活性明显的依次有黄芩素>小檗碱>X4-g>X4-s>黄芩苷；抗肺炎双球菌活性以小檗碱及X4-s最强；抗伤寒杆菌活性较好的是黄芩素及X4-s；抗乙型副伤寒杆菌以黄芩素的活性最强；抗绿脓杆菌活性较好的是小檗碱及X4-s；抗白色念珠菌活性较好的有X4-s、小檗碱及黄芩素。

二、抗溃疡性肠炎活性研究

1.建立药理溃疡性肠炎药效小鼠动物模型和考察指标

1.1实验材料

1.1.1实验仪器

电子天平、载玻片、镊子、剪刀等工具。

1.1.2试剂及药品

葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量50000，购于MP Biomedicals公司，试验时按重量体积比配成3.5％，5％，7％的水溶液)；

隐血试剂盒购于南京建成生物研究所。

1.1.3动物

BALB/C小鼠，SPF级，雄性，7-8周龄，体重20±2g，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：SYXK(粤)2012-0125，于广东药学院动物实验中心饲养。

1.2 DSS造模浓度的考察

7-8周龄BALB/C小鼠16只，分为4组，每组4只小鼠，分别是正常组、3.5％DSS模型组、5％DSS模型组、7％DSS模型组。各模型组分别饮用3.5％、5％、7％DSS溶液7天，正常组饮用蒸馏水，于第8天处死动物，观察结肠组织的病变情况，进行CMDI评分。每天观察动物的便血，大便性状，毛发，精神活动及体重，以DAI评分标准进行评分。并计算结肠指数，结肠指数(cm/g)＝结肠长度(cm)/结肠湿重(g)。

1.3 UC模型的建立及急性期和慢性期的观察

7-8周龄BALB/C小鼠48，分为正常组及模型组，每组24只小鼠，造模前小鼠适应性饲养2周，参考Melgar和Cooper等方法建立结肠炎模型。正常组自由饮用水，而模型组饮用5％DSS溶液7天，并从第8天起开始改为自由饮用蒸馏水。

每天观察动物的便血，大便性状，毛发，精神活动及体重，以DAI评分标准进行评分。并分别于第8天、第15天、第32天处死正常组及模型组小鼠各8只，观察结肠组织的病变情况，进行CMDI评分。

1.4疾病活动指数(DAI)的测定

1.4.1 DAI评分标准

小鼠的DAI由体重下降百分比、大便性状隐血情况决定，参照Melgar和Cooper等的研究并进行适当的改进进行评分，计算小鼠DAI。

DAI＝体重下降评分+粪便性状评分+便血评分，其数值越高疾病越严重。评分标准见表6。

注：正常大便：成形大便；松软大便：不黏附于肛门的糊状、半成形大便；稀便：可黏附于肛门稀水样便。

表6：疾病活动指数评分标准

1.4.2隐血试验的测定

严格按照隐血试剂盒进行，每只小鼠取少量粪便，加在载玻片上，一次滴加3-4滴一号试剂，1-2滴二号试剂，进行显色反应及按表7进行评分。

注：2-3分隐血试验为强阳性

表7：隐血试验评分标准

1.5结肠黏膜损伤指数(CMDI)的测定

眼眶取血后，颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剖取小鼠自肛门端直肠至盲肠末端的结肠段，清理肠系膜及粘连组织，沿肠系膜纵轴剪开，生理盐水反复冲洗干净，

平铺于滤纸上，肉眼观察结肠大体炎症、出血情况等按表8进行肉眼大体黏膜损伤程度评分。

表8：CMDI评分表

建模型考察结果DSS溶度5％溶液最为合适。

2.X4-s的急性和慢性药效观察

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

12号灌胃针、1ml注射器、移液枪头、试管、微孔板、酶标仪、紫外可见分光光度计、电热恒温培养箱、电子天平、96微孔板、移液枪、倒置显微镜、镊子等工具等。

2.1.2试剂及药品

葡聚糖硫酸钠(50000，购于MP Biomedicals公司)；MPO试剂盒、隐血试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒购于南京建成生物研究所。

2.1.3动物

BALB/C小鼠56只，SPF级，雄性，7-8周龄，体重20±2g，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：SYXK(粤)2012-0125，于广东药学院动物实验中心饲养。

2.1.4药物

5种药物，小檗碱(BBR，96％)；黄芩苷(g，96％)；黄芩素(s，96％)；X4-s(实施例1中制得的双黄素，纯度95％)；X4-g(自制，小檗红碱9位与黄芩苷在葡萄糖醛酸羧基上的结合物，纯度95％)。其中，小檗碱、黄芩苷和黄芩素均购于武汉远城科技发展有限公司。

2.2实验方法

2.2.1 DSS的配制

称取DSS5g,以蒸馏水定容至1000mL，配置成5％DSS溶液。

2.2.2药液配制

2.2.2.1小檗碱样品液的配制

精确称取小檗碱试样300.00mg，以0.5％阿拉伯树胶水溶液定容至300mL，配置成1mg/mL的溶液。

2.2.2.2黄芩苷样品液的配制

精确称取黄芩苷试样300.00mg，以0.5％阿拉伯树胶水溶液定容至300mL，配置成1mg/mL的溶液。

2.2.2.3黄芩素样品液的配制

精确称取黄芩素试样300.00mg，以0.5％阿拉伯树胶水溶液定容至300mL，配置成1mg/mL的溶液。

2.2.2.4 X4-g样品液的配制

精确称取X4-g试样300.00mg，以0.5％阿拉伯树胶水溶液定容至300mL，配置成1mg/mL的溶液。

2.2.2.5 X4-s样品液的配制

精确称取X4-试样300.00mg，以0.5％阿拉伯树胶水溶液定容至300mL，配置成1mg/mL的溶液。

2.2.3动物分组

分为7组，每组8只小鼠，分别是正常组(即N组)、模型组(即M组)、小檗碱组(即B组)、黄芩苷组(即G组)、黄芩素组(即S组)、X4-g组(即XG组)、X4-s组(即XS组)。

2.2.4 UC急性期和慢性期的药效试验

造模前小鼠适应性饲养2周，参考Melgar和Cooper等方法建立结肠炎模型。

除正常组正常饮用水外，模型组及给药组均饮用5％溶液7天，造模同时给予动物药物干预，药物组灌胃给药，灌胃剂量量为0.1ml/10g，正常组及模型组则灌以0.5％阿拉伯树胶水溶液代替。每日进行DAI评分。

急性期：持续14天后，并于给药第15天处死动物，进行CMDI评分，并计算结肠指数。

慢性期：持续24天后，并于给药第25天处死动物，进行CMDI评分，计算各脏器系数、结肠指数，并测定相应的生化指标。

2.2.5检测指标

2.2.5.1疾病活动指数(DAI)及结肠黏膜损伤指数(CMDI)及结肠指数DAI及CMDI的测定参照1的“1.4”、“1.5”项下方法进行。

急性期DAI结果如图5所示。由图5可见，XG组的DAI最低，恢复得较好，与模型组有显著差异，其他组效果不佳。其中，B组，S组，XG组各出现1只小鼠死亡；XS组出现2只小鼠死亡，死亡小鼠均为便血严重，肛门口严重带血，体重减轻较大，排除灌胃所致。

慢性期DAI结果如图6所示。由图6可见，XG组及B组的DAI在急性期下降得较快，慢性期用药组的下降速度基本一致，用药组总体上均比模型组的得分较低。其中，M组出现2只小鼠死亡，B组出现3只小鼠死亡，XS组出现2只小鼠死亡。

急性期CMDI结果如图7所示。由图7可见，XG组的CMDI得分最低，与模型组有显著性差异，p<0.01；S组与模型组有差异，

p<0.05。

慢性期CMDI结果如图8所示。由图8可见，给药25天后，模型组及小檗碱组的结肠粘膜肉眼观察还有明显的炎症，较严重的溃疡仍然存在，少量充血，肠壁增厚；XG组及XS组的炎症较轻，肠壁较薄。

2.2.5.2病理组织学评分(HS)

肉眼观察结肠炎症情况，进行CMDI评分后，截取每只小鼠直肠上1cm肠段约1-2cm，以中性甲醛固定、石蜡切片、HE染色，光镜检查，进行病理组织切片观察并参照参考Melgar和Cooper研究的方法进行病理组织学评分，HS评分标准见下表其余结肠段以中端及近端分别以液氮保存。急性药效观察HS评分标准如表9所示，慢性药效观察HS评分如表10所示。

表9(急性)病理切片组织学评分标准

表10(慢性)病理切片组织学评分标准

急性期药效观察HS评分结果如图9所示。由图9可见，病理切片结果与DAI、CMDI得分并不一致，除N组外，HS结果以B组的炎症最轻。正常组粘膜完整无损伤，腺体排列有序，隐窝完整。造模组M结肠粘膜表面上皮部分脱落，不同程度被在破坏，隐窝不同程度被破坏，粘膜固有层腺体部分破坏或消失，炎症细胞浸润情况(大量中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞)，炎症主要累及黏膜和黏膜下层，累及的层面包括(黏膜、黏膜下层、浅肌层，深肌层，浆膜层)，溃疡较严重。一半病例中性粒细胞浸润至深肌层，及大量炎细胞(淋巴、浆细胞)浸润全层，肠周脂肪组织内淋巴细胞浸润明显。B组炎症累及深肌层，个别累及浅肌层，粘膜层内中性粒细胞浸润明显。G组炎症累及深肌层，粘膜层内中性粒细胞浸润明显；一半病例的部分区域隐窝完全破坏。S组、XG组、XS组粘膜层内中性粒细胞浸润明显，一半病例的部分区域隐窝完全破坏。个别病例部分区域隐窝完全破坏，累及全层。注：所有病倒均未见出血现象。

慢性期药效观察HS评分结果如图10所示。由图10可见，模型组的炎症主要累及黏膜、黏膜下层至肌层，浸润的炎症细胞以淋巴、浆细胞慢性炎症细胞为主，特别是淋巴细胞，大量地分布在粘膜下层到肌层间，极少见有中性粒细胞，部分基底2/3隐窝被破坏，炎症范围较广，少部分区域尚可观察到黏膜组织正常，慢性炎症较严重。B组的炎症情况与模型组的相似，但炎症范围较广，并没起到药效作用。XG组炎症总体比较轻，炎症主要累及黏膜、黏膜下层至肌层，一部分只累及至黏膜下层，但炎症细胞较少，隐窝破坏程度轻，大部分隐窝基本完整，部分约基底1/3隐窝被破坏，炎症范围少，大部分区域尚可观察到黏膜组织正常。XS组炎症中等，炎症累及层面同XG组，但炎症细胞数量较多，一部分炎症细胞较少，隐窝破坏程度轻，大部分隐窝基本完整，部分约基底2/3隐窝被破坏，炎症范围较M组小，部分区域尚可观察到黏膜组织正常。

2.2.5.3血清中MDA的测定

眼眶取血后，血液室温静置1h，3500rmp离心制备血清，按照试剂盒说明进行操作测定。

急性期药效观察MDA评分结果如图11所示。由图11可见，测定模型组的MDA较正常组显著降低，XG组较模型组有显著差异。其测定结果与文献报到的并不一致。在UC模型当中，MDA一般是增大，而本实验测定的MDA数值明显偏小，可能与反应温度90℃用的是恒温箱，而非水浴锅，加热效果不佳，导致显色反应不充分所致；也可能是小鼠体内MDA的真实水平。

2.2.5.4结肠组织MPO的测定

并截取每只小鼠直肠上3cm肠段约1-2cm，以重量体积比为1:19加入匀浆介质，

在冰浴中，制备5％的组织匀浆后，按照试剂盒进行测定，计算MPO活力。

计算公式：MPO活力(U/g)＝(测定OD值-对照OD值)/(11.3×取样量(g))

慢性期药效MPO考察结果如图12所示。由图12可见，模型组的MPO值比正常组的显著升高，表明炎症还一定程度上存在；同时，XG

组与模型组有显著差异，p<0.05。

2.2.5.5血清中SOD的测定

眼眶取血后，血液室温静置1h，3500rmp离心制备血清，按照试剂盒说明进行操作测定。

慢性期药效SOD考察结果如图13所示。由图13可见，模型组的SOD值比正常组的显著降低，表明炎症还一定程度上存在；B组与模型组则无显著差异。同时，XG组、XS组与模型组有显著差异，p值分别是p<0.01，p<0.05；此外，XG组比B组的SOD值明显高，有显著差异，p<0.05。

2.2.5.6结肠指数、脏器系数和体重变化的测定

称量脾脏、肝脏、肺脏的重量，计算各脏器系数。脏器系数＝脏器重量(g)/体

重(g)×100％；结肠指数＝结肠长度(cm)/结肠重量(g)。

急性期结肠长度考察结果如图14所示，急性期结肠重量考察结果如图15所示，急性期结肠指数考察结果如图16所示，慢性期结肠长度考察结果如图17所示，慢性期结肠重量考察结果如图18所示，慢性期结肠指数考察结果如图19所示，图14-19的统计结果如表11所示。

表11：给药25天各组小鼠的结肠系数

慢性期脾脏系数观察结果如图20所示，慢性期肝脏系数观察结果如图21所示，慢性期肺脏系数观察结果如图22所示，图20-22的统计结果如表12所示。

注：与正常组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与B组相比，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

表12：给药25天各组小鼠的脏器系数

给药25后，模型组的脾脏依然明显肿大，肺脏萎缩，肝脏肿大，且结肠缩短，肠壁增厚，结肠重量增加；而给药XG、XS组则上症状较轻，与模型组有显著差异；B组大部分系数与模型组差异不显著。

急性期体重变化考察结果如图23所示。由图23可见，体重变化小檗碱组的体重减轻最严重，比模型组的减轻纯度还有高，与小檗碱100mg/kg会减轻UC小鼠体重的文献报道一致而XG组体重在第二周基本恢复。

2.2.6统计学处理

采用STATVIEW软件分析，数据以表示，组间比较采用方差分析和t检验，

p<0.05为差异有显著性。

2.3实验结果

2.3.1结肠指数

2.3.1.1结肠长度变化

模型组的结肠长度明显缩短；给药组与模型组中，结肠长度以XG最长，与模型组有显著差异。

将实施例2～7中制得的双黄素，进行上述的抗菌活性试验和抗溃疡性肠炎活性试验，也得到同样的结论：本发明的双黄素具有较好的抗菌活性和抗溃疡性肠炎活性。因此，实施例2～7的试验数据就不再一一列出。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种双黄素，其结构如式(Ⅰ)所示：

其中，式(Ⅰ)中的n为整数，所述的n等于4。

2.根据权利要求1所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1a)小檗红碱衍生物的合成：称取小檗红碱，加入有机溶剂，加热至沸腾后加入X(CH₂)_nY，回流反应，将反应液浓缩，冷却结晶，过滤，得小檗红碱衍生物；

所述的X(CH₂)_n Y中，X＝Y，X、Y独立地为Br，n为整数，且n等于4；

(2a)取步骤(1a)得到的小檗红碱衍生物与黄芩素混合，加入无水碳酸钠和有机溶剂，搅拌，加热回流反应，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用硅胶拌样，硅胶柱分离，洗脱后即得双黄素。

3.根据权利要求2所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述步骤(1a)替换为：

称取小檗红碱1重量份，加入有机溶剂150～200重量份，85℃加热至沸腾，加入1,2-二溴丁烷20～40重量份，回流反应3h，将反应液浓缩至50～100份，冷却得结晶C，过滤，用适量有机溶剂洗涤结晶C，洗涤液与滤液合并，回收有机溶剂，残渣用30重量份的甲醇溶解，冷却得结晶D，过滤，用甲醇洗涤结晶D，合并结晶C和结晶D，即得小檗红碱衍生物。

4.根据权利要求2或3所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述步骤(2a)替换为：

取步骤(1a)得到的小檗红碱衍生物1.2重量份与黄芩素1重量份混合，加入无水碳酸钠2重量份、有机溶剂150重量份，搅拌，加热至85℃，回流8h，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用5重量份的DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用3重量份的硅胶拌样，硅胶柱分离，用20倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，再用甲醇洗脱，回收甲醇，即得双黄素。

5.根据权利要求1所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1b)黄芩素衍生物的合成：取黄芩素，与无水碳酸钠混合，加入有机溶剂，再加入X(CH₂)_n Y，加热反应，得黄芩素衍生物；

所述的X(CH₂)_n Y中，X＝Y，X、Y独立地为Br，n为整数，且n等于4；

(2b)取步骤(1b)得到的黄芩素衍生物，与无水碳酸钠和小檗红碱混合，加入有机溶剂，搅拌，加热回流反应，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用硅胶拌样，硅胶柱分离，洗脱，即得双黄素。

6.根据权利要求5所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述步骤(1b)中黄芩素、无水碳酸钠、X(CH₂)_n Y的摩尔比为1:2:16，所述黄芩素与有机溶剂的摩尔体积比为1:150mol/L，反应温度为85℃，反应时间为5h；所述X(CH₂)_n Y为1,2-二溴丁烷。

7.根据权利要求5或6所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述步骤(2b)替换为：取步骤(1b)得到的黄芩素衍生物1重量份、无水碳酸钠2重量份、小檗红碱1重量份加入反应器中，加入有机溶剂150份，搅拌，加热至85℃，回流8h，将反应液趁热过滤，滤液回收溶剂，用5重量份的DMSO溶解，柱分离，依次用质量百分浓度为30％、40％、50％、60％的甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集质量百分浓度为60％甲醇洗脱部分，浓缩，浓缩液再用3重量份的硅胶拌样，硅胶柱分离，用20倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，再用甲醇洗脱，回收甲醇，即得双黄素。

8.根据权利要求2所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述小檗红碱采用以下方法制备而成：

在反应器中加入料液比为1:15～30g/L的小檗碱和DMF，加入沸石，回流冷凝，在400W～800W微波辐射下，反应10～20min，取出反应器，趁热加入水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得结晶C；滤液另用大孔树脂柱分离，依次用质量百分浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的甲醇洗脱，收集质量百分浓度为70％甲醇洗脱部位，浓缩，得结晶D，将结晶C和结晶D合并，即得小檗红碱。

9.根据权利要求3所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述小檗红碱采用以下方法制备而成：

在反应器中加入料液比为1:15～30g/L的小檗碱和DMF，加入沸石，回流冷凝，在400W～800W微波辐射下，反应10～20min，取出反应器，趁热加入水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得结晶C；滤液另用大孔树脂柱分离，依次用质量百分浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的甲醇洗脱，收集质量百分浓度为70％甲醇洗脱部位，浓缩，得结晶D，将结晶C和结晶D合并，即得小檗红碱。

10.根据权利要求5所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述小檗红碱采用以下方法制备而成：

在反应器中加入料液比为1:15～30g/L的小檗碱和DMF，加入沸石，回流冷凝，在400W～800W微波辐射下，反应10～20min，取出反应器，趁热加入水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得结晶C；滤液另用大孔树脂柱分离，依次用质量百分浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的甲醇洗脱，收集质量百分浓度为70％甲醇洗脱部位，浓缩，得结晶D，将结晶C和结晶D合并，即得小檗红碱。

11.根据权利要求6所述的一种双黄素的制备方法，其特征在于，所述小檗红碱采用以下方法制备而成：

在反应器中加入料液比为1:15～30g/L的小檗碱和DMF，加入沸石，回流冷凝，在400W～800W微波辐射下，反应10～20min，取出反应器，趁热加入水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得结晶C；滤液另用大孔树脂柱分离，依次用质量百分浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的甲醇洗脱，收集质量百分浓度为70％甲醇洗脱部位，浓缩，得结晶D，将结晶C和结晶D合并，即得小檗红碱。

12.权利要求1所述的一种双黄素在制备治疗溃疡性肠炎药物中的应用。