CN105687179A - 猫爪草提取物以组合物在制备治疗癌症的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物技术领域，具体涉及猫爪草提取物的医药新用途。本发明提供猫爪草提取物的医药应用，猫爪草中首次分离的化合物(Ⅰ)的医药应用，实验表明，猫爪草提取物不仅能诱生肿瘤坏死因子(TNF)，它能特异性地杀死肿瘤细胞，而对正常组织细胞无不良影响，从而起到肿瘤免疫和肿瘤治疗的作用。体外试验证明该化合物(Ⅰ)对前列腺癌细胞株PC3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有浓度——时间依赖性关系，可以用来开发成治疗前列腺癌的药物。

Description

猫爪草提取物以组合物在制备治疗癌症的药物中的应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及猫爪草提取物的医药新用途。
背景技术
猫爪草RanunculiTernatiRadix为毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的干燥块根。本品呈纺锤形，多5～6个簇生，形似猫爪，长3～10mm，直径2～3mm，顶端有黄褐色残茎或茎痕。表面黄褐色或灰黄色，久存色泽变深，微有纵皱纹，并有点状须根痕和残留须根。质坚实，断面类白色或黄白色，空心或实心，粉性。气微，味微甘。猫爪草别名三散草(浙江)、猫爪儿草(河南)、猫爪子(河南)、鸭脚板(安徽)、金花草(广西)。猫爪草性温，味甘、辛，入肝、肺经，具有清热解毒、消肿散结、止咳祛痰等功效，临床用于治疗肺结核、淋巴结结核、咽喉炎、疟疾等症。民间用猫爪草治疗淋巴结核，不论结核大小或是否化脓均有较好的疗效。近年来因其有较好的抗肿瘤效果而成为研究热点。
近年来针对猫爪草化学成分的研究较少，其主要含有黄酮类及苷类、生物碱、挥发油、有机酸等化合物。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种从猫爪草的猫爪草提取物在治疗癌症的药物中的应用。进一步地，本发明的发明目的还在于提供一种猫爪草干燥块根中分离得到的二萜化合物在治疗前列腺癌的药物中的应用；另外，作为和上述二萜化合物相关联的组合物，本发明还提供一种药物组合物以及药物组合在在治疗前列腺癌的药物中的应用。
本发明的上述四个目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种猫爪草提取物在制备治疗癌症的药物中的应用，所述猫爪草提取物是通过将猫爪草的干燥块根粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，再用有机溶剂萃取；再进行多次洗脱，减压浓缩获得洗脱物浸膏；最后依次采用多次正相硅胶分离和至少一次反相硅胶分离获得猫爪草提取物。
进一步的，所述癌症是前列腺癌。
作为优选，所述猫爪草提取物采用以下步骤获得：
S01将猫爪草的干燥块根粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
S02步骤S01中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
S03步骤S02中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
S04步骤S03中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
S05步骤S04中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到猫爪草提取物。
作为优选，所述步骤S01：将猫爪草的干燥块根粉碎，用80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
作为优选，所述猫爪草提取物是具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：
作为优选，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
化合物(Ⅰ)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，化合物(Ⅰ)具有下述结构式：
一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体；化合物(Ⅰ)具有下述结构式：
上述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
实验表明，本发明的猫爪草提取物不仅能诱生肿瘤坏死因子(TNF)，而肿瘤坏死因子是一组具有抗肿瘤、抗病毒、参与多种免疫调节过程的球蛋白，由于它能特异性地杀死肿瘤细胞，而对正常组织细胞无不良影响，从而起到肿瘤免疫和肿瘤治疗的作用。小鼠试验还证明猫爪草提取物对小鼠S180、S37癌株有抑制作用。
本发明化合物(Ⅰ)在医药领域新用途，可以作为抗前列腺癌药物，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。体外试验证明该化合物对前列腺癌细胞株PC3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有浓度——时间依赖性关系，因此，本发明的上述化合物(Ⅰ)可以用来开发成治疗前列腺癌的药物。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较；
图3为不同浓度化合物(Ⅰ)作用72h后PC3和DU145存活率；
图4为10.0mg/L化合物(Ⅰ)作用不同时间后PC3和DU145存活率。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：猫爪草提取物的主要成分是包含具有下述结构式二萜化合物(Ⅰ)，视分离提纯程度的不同而不同，其他成分包含少量的黄酮类及苷类、生物碱、挥发油、有机酸等化合物：
它在诱生肿瘤坏死因子特异性地杀死肿瘤细胞，而对正常组织细胞无不良影响，从而起到肿瘤免疫和肿瘤治疗的作用上功效较好。小鼠试验还证明猫爪草提取物对小鼠S180、S37癌株有抑制作用。因此，能在制备治疗癌症的药物中的具有新的医药用途。
它具体通过如下步骤制备的：
S01将猫爪草的干燥块根(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
S02步骤S01中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
S03步骤S02中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
S04步骤S03中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
S05步骤S04中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到猫爪草提取物。
上述步骤制得的二萜化合物(Ⅰ)纯度比较高。
实施例2：纯二萜化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
制备方法：(a)猫爪草的干燥块根(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用15％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(163g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(10个柱体积)、45:1(9个柱体积)、20:1(8个柱体积)、10:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分3(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1(8个柱体积)、20:1(10个柱体积)和10:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(21g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(43mg)。
结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z489.2808，结合核磁特征可得分子式为C26H42O7，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(1.16，m)，H-1(2.03，ddd，J＝13.7，8.7，1.8)，H-2(4.21，m)，H-3(1.91，m)，H-3(1.28，m)，H-4(2.20，ddd，J＝14.9，7.2，3.6)，H-6(1.48，m)，H-6(1.64，dt，J＝14.0，2.8)，H-7(1.31，m)，H-7(1.12，m)，H-8(1.45，m)，H-10(1.71，d，J＝13.7)，H-11(1.11，m)，H-11(1.34，m)，H-12(1.94，m)，H-14(6.33，dd，J＝17.6，10.9)，H-15(5.13，d，J＝17.6)，H-15(4.93，d，J＝10.8)，H-16(4.93，s)，H-16(4.82，s)，H-17(0.76，d，J＝6.8)，H-18(6.38，d，J＝7.2)，H-19(6.03，s)，H-20(0.84，s)，H-2’(2.15，td，J＝7.3，1.4)，H-3’(1.52，J＝7.3)，H-4’(0.84，t，J＝7.3)，H-2’’(1.80，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，150Hz)：29.1(CH2，1-C)，66.4(CH，2-C)，29.4(CH2，3-C)，45.3(CH，4-C)，49.2(C，5-C)，22.9(CH2，6-C)，27.0(CH2，7-C)，36.9(CH，8-C)，36.1(C，9-C)，34.7(CH，10-C)，32.3(CH2，11-C)，26.3(CH2，12-C)，144.4(C，13-C)，139.4(CH，14-C)，111.3(CH2，15-C)，114.4(CH2，16-C)，14.6(CH3，17-C)，97.2(CH，18-C)，99.2(CH，19-C)，25.7(CH3，20-C)，171.2(C，1’-C)，35.4(CH2，2’-C)，17.2(CH2，3’-C)，12.7(CH3，4’-C)，168.8(C，1’’-C)，20.5(CH3，2’’-C)；碳原子标记参见图1。13CNMR谱显示有26个信号，包含两个甲基(δC14.6，17-C；25.7，20-C)，两个共轭双键(δC144.4，13-C；139.4，14-C；111.3，15-C；114.4，16-C)，一个乙酰氧基(δC168.8，1’’-C；20.5，2’’-C)，一个丁酰氧基(δC171.2，1’-C；35.4，2’-C；17.2，3’-C；12.7，4’-C)。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，绝对构型依次为2R，4S，5R，8S，9S，10R，18S，19R；立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例3：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
前列腺癌细胞株PC3(ArCC-CRL-1435)、前列腺癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％，用二甲基亚矾(DMSO)配制成浓度为1.0g/L的储存液备用。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自Hyelone公司。青/链霉素为上海先锋药业产品。胰蛋白酶购自华美生物工程公司。二甲基亚砜(DMSO)购自上海华舜生物工程公司。琼脂(Agarose)、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)为Sigma公司产品。十二烷基磺酸钠(SDs)、三氯甲基烷基甲烷(Tris)Tris-Hcl、Tritonx-100为Promega公司产品。丙烯酞胺、过硫酸钱(AP)购于苏州化学试剂厂产品。
CO2细胞培养箱(ShellLab)，倒置相差显微镜(Nikon)，超净工作台(苏州净化设备厂)，流式细胞仪(BD)，F039300A型酶标仪(Sunrise)，高压蒸汽灭菌器(HirayamaHA-300MD)，低温超速离心机(Kubota3740)，万向摇床(江苏麒麟医用仪器厂TS-92)，电泳仪(Gibco公司)，LXJ-Ⅱ型离心机(上海医用分析仪器厂)，DK600型电热恒温水浴箱(上海精密试验设备公司)，电子天平(METTLERTOLEDO)，台式干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)，紫外分光光度仪(Beckman)。
二、试验方法
1、细胞培养与养护
1.1细胞培养
细胞株培养于肿瘤医院中心实验室。培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，另添加谷氨酞胺(2mmol/L)和抗生素(l00U/青霉素和100mg/L链霉素)，置37℃、饱和湿度、含5％CO2气体的培养箱中培养。
1.2细胞传代
①于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁，即可传代。传代前用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。②用吸管吸去培养瓶中的旧培养液，用PBS清洗3次。③加入0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶液2mL进行消化，静置约5分钟，并不时在倒置相差显微镜下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片时，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。④用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液，吸入10mL离心管中平衡离心(1000转/分)5分钟。⑤弃去上清液，加入2mL培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，1:2～3分装入新培养瓶，添加培养液适量于孵箱中继续培养。
2、细胞形态学观察
倒置显微镜观察:将对数生长期PC3和DU145细胞接种于6cm培养皿，培养24h后加入10.0mg·L-1，化合物(Ⅰ)处理24，48，72h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变并记录。
3、细胞毒试验(CCK-8法)
①培养瓶中的细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后按照3×104个细胞/孔接种于96孔板，每孔加0.lmL培养基，常规培养于37℃、含5％CO2气体的培养箱中。②试验分组:设阴性对照组(有细胞但不加药，0.1％DMSO)，空白对照组(无细胞仅有培养液)，化合物(Ⅰ)分别2.5mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L和20.0mg/L共6组。③24小时后观察细胞贴壁生长良好，分别按上述试验分组向96孔板内加药，每组设6-8个重复孔。④加药后将96孔板移入37℃、含5％CO2气体的培养箱中继续分别培养24、48和72小时。⑤每组试验结束时每孔加入CCK-810μL，37℃培养箱中继续培养4小时后酶标仪检测450每孔的吸光度(OD)值，测定波长为450nm，参考波长为600nm。⑥按照以下公式计算出细胞存活率(cellviability)，然后绘制成图表，存活率为50％时的值即为IC50。细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％。其中As为试验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔。
4、集落形成试验
①取对数生长期细胞，计数后以3×l02个接种于6孔板，每孔加2mL培养基，常规培养于37℃、含5％CO2气体的培养箱中。②24h后观察细胞贴壁生长良好，分别加入不同浓度(0，2.5，5.0，10.0，20.0mg/L)化合物(Ⅰ)处理，每组设3个重复孔。③加药后将6孔板移入37℃、含5％CO2气体的培养箱中继续14天。④10％甲醇固定，Giemsa染色，计算每孔集落数(≥50个细胞的计为一个集落)。⑤计算集落形成率:集落总数/接种细胞数×100％。
三、结果及结论
1、化合物(Ⅰ)气对PC3和DU145细胞形态的影响
镜下见对照组细胞贴壁生长，相邻细胞融合成片，细胞呈类圆形或梭形，体积较大，排列紧密，边缘光滑，胞质饱满，核膜、核仁等结构轮廓明显，细胞生长迅速；经10.0mg/L化合物(Ⅰ)处理后，细胞密度逐渐降低，生长速度明显减慢至几乎停滞，细胞逐渐脱落并漂浮于培养液中。细胞体积缩小，胞膜皱缩，成小圆形或不规则形态，胞内多见小颗粒状物质。药物作用时间越长，细胞形态学改变越明显。
2、细胞毒试验
不同浓度化合物(Ⅰ)对前列腺癌细胞株PC3和DU145的生长均有抑制作用。2.5，5.0，10.0，20.0mg/L化合物(Ⅰ)作用两种细胞24，48和72h后的存活率如下表所示(表l及表2)。其中，10.0mg/L化合物(Ⅰ)作用于PC3和DU145细胞24，45，72h后的细胞存活率分别为56.2％，42.5％，24.3％和50.8％，32.6％，20.7％；2.5，5.0，10.0，20.0mg/L，化合物(Ⅰ)作用两种细胞72h后的存活率分别为54.3％，37.7％，24.3％，13.2％和52.4％，32.8％，20.7％，11.2％(见图3及图4)。两因素方差分析示不同浓度与不同时间处理组之间差别具有统计学意义(P<0.05)，提示化合物(Ⅰ)对PC3和DU145的生长抑制呈时间浓度依赖。
3、集落形成试验
试验显示，对照组PC3和DU145的集落形成率分别为67.7和64％，而2.5，5.0，10.0，20.0mg/L化合物(Ⅰ)处理组分别为60.7％，51.3，39.3％，27.0％和49.7％，34.0％，27.7％，15.7％(见表3)。这进一步证实了化合物(Ⅰ)对PC3和DU145细胞具有增殖抑制作用。
结论，本试验中通过CCK-8法和集落形成试验来验证化合物(Ⅰ)对前列腺癌细胞株PC3和DU145的作用，且抑制作用具有浓度一时间依赖性关系。化合物(Ⅰ)可能成为晚期前列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择。
表l不同浓度化合物(Ⅰ)作用于PC3后的细胞存活率
时间/浓度 2.5mg/L 5.0mg/L 10.0mg/L 20.0mg/L
24h 0.825 0.731 0.562 0.422
48h 0.69 0.53 0.425 0.226
72h 0.543 0.377 0.243 0.132
表2不同浓度化合物(Ⅰ)作用于DU145后的细胞存活率
时间/浓度 2.5mg/L 5.0mg/L 10.0mg/L 20.0mg/L
24h 0.809 0.604 0.508 0.375
48h 0.646 0.481 0.326 0.173
72h 0.542 0.328 0.207 0.112
表3不同浓度化合物(Ⅰ)作用下PC3和DU145的集落形成率
实施例4
二萜化合物(Ⅰ)制成片剂药物的应用：按实施例2方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例5
二萜化合物(Ⅰ)制成口服液形式的药物应用：按实施例2方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例6
二萜化合物(Ⅰ)制成胶囊剂或颗粒剂形式的药物应用：按实施例2方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例7
二萜化合物(Ⅰ)制成注射液形式的药物应用：按实施例2方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例8
二萜化合物(Ⅰ)制成无菌粉剂形式的药物应用：按实施例2方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例9
猫爪草提取物制成口服液形式的药物应用：按实施例1方法先制得猫爪草提取物，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (9)

1.一种猫爪草提取物在制备治疗癌症的药物中的应用，其特征在于：所述猫爪草提取物是通过将猫爪草的干燥块根粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，再用有机溶剂萃取；再进行多次洗脱，减压浓缩获得洗脱物浸膏；最后依次采用多次正相硅胶分离和至少一次反相硅胶分离获得猫爪草提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述癌症是前列腺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述猫爪草提取物采用以下步骤获得：
S01将猫爪草的干燥块根粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
S02步骤S01中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
S03步骤S02中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
S04步骤S03中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
S05步骤S04中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的猫爪草提取物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述步骤S01：将猫爪草的干燥块根粉碎，用80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述猫爪草提取物是具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：
。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
7.化合物(Ⅰ)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，化合物(Ⅰ)具有下述结构式：
。
8.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体；化合物(Ⅰ)具有下述结构式：
。
9.权利要求8所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
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