本申请是申请日为2009年06月11日,申请号为200980131840.9,发明名称为“产过氧化氢细菌用于牙齿增白的用途”的发明专利申请的分案申请。本申请要求2008年6月13日提交的美国序号61/061,264的优先权,该文件通过引用以全文形式结合至本文。
具体实施方式
本文使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象,除非文中另外明确指出。
本发明提供了用于保持口部健康(包括,例如牙齿增白)的方法和组合物。本发明的组合物包含一种或多种分离的、非致病的、产过氧化氢的菌种或菌株和任选的缺乏LDH的变异链球菌。某些细菌可以以能增白牙齿的水平产生过氧化氢,这被本文第一次证明。本发明的组合物可影响或实现所需的牙齿表面的外观和/或结构的改变。外观和结构改变的实例包括,但不必限于,增白、漂白着色、去除着色、去除菌斑和去除牙垢。此外,本发明的组合物可向受试者提供额外的口部护理益处例如治疗和/或预防龋齿、牙周炎、口部细菌感染和疾病、口部创伤、念珠菌或真菌过度生长、口臭或口干燥引起的龋齿和相关的牙周疾病、促进创伤愈合或其组合。
本发明的组合物
本发明提供了使用组合物增白牙齿表面的方法,所述组合物包含一种或多种非致病的、产过氧化氢的绿色链球菌种或菌株和/或一种或多种非致病的、产过氧化氢的乳杆菌种或菌株和/或一种或多种非致病的、产过氧化氢的双歧杆菌种或菌株和/或一种或多种非致病的、产过氧化氢的乳球菌种或菌株和/或一种或多种非致病的、产过氧化氢的片球菌种或菌株和/或一种或多种非致病的、产过氧化氢的明串珠菌种或菌株。本发明的一个实施方案中所述菌株通常可被认为是安全的(GRAS),且能通过静电作用、范德华作用或细菌表面上的蛋白或多糖粘附素(该粘附素识别牙齿表面存在的分子并与其相互作用)短暂地附着或粘着于牙齿表面。绿色链球菌种的实例包括,但不限于,血链球菌(S.sanguis)、副血链球菌(S.parasanguis)、格氏链球菌(S.gordonii)、口腔链球菌(S.oralis)、乳房链球菌(S.uberis)、缓症链球菌(S.mitis)、鼠链球菌(S.rattus)、唾液链球菌(S.salivariaus)、前庭链球菌(S.vestibularis)、咽峡链球菌(S.angionosus)、星群链球菌(S.constellatus)、中间链球菌(S.intermedius)、变异链球菌(S.mutans)、表兄链球菌(S.sobrinus)、米氏链球菌(S.milleri)、大鼠链球菌(S.cricetus)和温和链球菌(S.mitior)。乳杆菌种的实例包括,但不限于,嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)、链状乳杆菌(L.catenaforme)、德氏乳杆菌乳亚种(L.leichmanni)、植物乳杆菌(L.plantarum)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、干酪乳杆菌(L.casei)、短乳杆菌(L.brevis)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、猪肠道乳杆菌(L.sobrius)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、类干酪乳杆菌(L.paracasei)、葡聚糖乳杆菌(L.dextranicum)和瑞士乳杆菌(L.helveticus)。双歧杆菌种的实例包括,但不限于,角双歧杆菌(B.angulatum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、星状双歧杆菌(B.asteroides)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、牛双歧杆菌(B.boum)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、豚双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、兔双歧杆菌(B.cuniculi)、齿双歧杆菌(B.dentium)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、鸡胚双歧杆菌(B.gallinarum)、蜜蜂双歧杆菌(Bindicum)、长双歧杆菌(B.longum)、大双歧杆菌(B.magnum)、瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、最小双歧杆菌(B.minimum)、假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌假长亚种(B.pseudolongum)、B.psychraerophilum、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、波伦亚双歧杆菌(B.saeculare)、B.scardovii、B.simiae、纤细双歧杆菌(B.subtile)、B.thermacidophilum、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)和B.urinali。可产生过氧化氢的其他非致病细菌的实例包括,不限于,片球菌种,例如乳酸片球菌(P.acidilactici)、明串珠菌种例如肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)、乳球菌种例如乳酸乳球菌(L.lactis)。
细菌产生的过氧化氢的量可被实验测定。参见例如Hillman和Shivers,Arch.Oral.Biol.,33:395-401(1988)。在氧存在时生长的细胞的培养液用40μg/ml辣根过氧化物酶和0.4μmol/ml邻联茴香胺孵育。2分钟后,加入0.02ml5NHCl终止反应。在410nm测量样品光密度,并且根据标准曲线计算样品的过氧化氢浓度,该标准曲线使用可靠的过氧化氢和在230nm时81M-1cm-1的消光系数制备。本发明的一个实施方案中,所述细菌可产生至少约0.5、1、2、5mM或更多的H2O2或约0.1和约5mM之间的任何范围或值。
本发明的一个实施方案中,本发明的组合物包含一种或多种分离的口腔链球菌株和/或一种或多种乳房链球菌株。本发明的组合物可任选包含一种或多种分离的缺乏LDH的变异链球菌株或菌种。非致病的、产过氧化氢的细菌和/或变异链球菌的组合提供了明显的实用优势,该组合物可用于预防和治疗,例如,龋齿、牙周炎、口部细菌感染和疾病、口部创伤、念珠菌或真菌过度生长、口臭或口干燥引起的龋齿或牙周疾病,还增白牙齿。
口腔链球菌(以前被称为血链球菌(S.sanguis)II型)和乳房链球菌为维持包含牙周菌群的微生物的正常、健康的平衡的重要组分。参见Socransky等,OralMicrobiol.Immunol.3:1-7(1988);Hillman和Shivers,Arch.Oral.Biol.,33:395-401(1988);Hillman等,Arch.Oral.Biol.,30:791-795(1985)。口腔链球菌也可发现于牙菌斑中且已被证实与牙周健康相关联,特别是通过干扰牙周病原体(例如Aggregetobacteractinomycetemcomitans、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)和直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus))群集而与牙周健康相关联。本发明的组合物可包含一种或多种分离的口腔链球菌株,例如,ATCC35037、ATCC55229、ATCC700233、ATCC700234和ATCC9811。其他口腔链球菌株包括KJ3和KJ3sm。KJ3sm为抗1mg/ml链霉素的KJ3的天然发生的遗传性变体。该链霉素抗性为有利的,因为这提供了容易分离该细菌的标记。此外,链霉素抗性菌株为轻微衰减的且在口腔中不如野生型菌株存活得长久。当目标为将该细菌非持久性地群集于动物口腔时,此性质是有用的。
乳房链球菌还可发现于牙菌斑中并被证实与牙周健康关联,特别是通过干扰牙周病原体(例如福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythensis)、微小消化链球菌、直肠弯曲杆菌和产黑素普雷沃氏菌(Prevotellamelaninogenica))群集而与牙周健康关联。本发明的组合物可包含一种或多种分离的乳房链球菌株,例如,ATCC13386、ATCC13387、ATCC19435、ATCC27958、ATCC35648、ATCC700407、ATCC9927、菌株KJ2或菌株KJ2sm。KJ2sm为抗1mg/ml链霉素并提供与口腔链球菌的链霉素抗性菌株相同的优势的KJ2的天然发生的遗传性变体。一种或多种分离的口腔链球菌株或一种或多种分离的乳房链球菌株或两者都可用于本发明的组合物和方法。
本发明的组合物可包含缺乏乳酸产生的一种或多种分离的变异链球菌种。这些菌种包括,例如,鼠链球菌、大鼠链球菌、变异链球菌、表兄链球菌、汗毛链球菌(S.downeii)、猕猴链球菌(S.macacae)和野生链球菌(S.ferus)。本发明的变异链球菌基本不产生L(+)乳酸脱氢酶(LDH)。此菌株被命名为缺乏LDH的菌株。变异链球菌的缺乏LDH的菌株比野生型变异链球菌株少产生75%、80%、90%、95%、98%、99%或100%的乳酸。缺乏LDH的变异链球菌株可为天然发生的变异链球菌株或基因改造的变异链球菌株。缺乏LDH的变异链球菌可在口腔中与病原菌竞争和/或替换病原菌,所述病原菌例如变异链球菌,其为龋齿的主要致病因素。缺乏LDH的变异链球菌株将与变异链球菌竞争相同的营养、群集位点等。因此,缺乏LDH的变异链球菌株可用于,例如,预防和/或治疗龋齿。缺乏LDH的变异链球菌株为非致病的,改变口腔的微环境以防止病原生物的群集或过度生长和/或从病原为宿主的土著菌群的一部分的口腔替换病原生物。
缺乏LDH的变异链球菌株的实例包括,例如,鼠链球菌JH145(ATCC31377)(自发的、天然发生的缺乏LDH的突变型)和JH140(ATCC31341)(化学改造的缺乏LDH的突变型)。参见,例如Stanshenko&Hillman,MicrofloraofplaqueinratsfollowinginfectionwithanLDH-deficientmutantofStreptococcusrattus(用鼠链球菌的LDH缺乏的突变型感染后的大鼠牙菌斑微生物群),CariesRes.23:375-377(1989);Hillman,LactatedehydrogenasemutantsofStreptococcusmutans:Isolationandpreliminarycharacterization(变异链球菌的乳酸脱氢酶突变型:分离和初步表征).Infect.Immun.21:206-212(1978);还参见Abhyankar等,SerotypecStreptococcusmutansmutatabletolactatedehydrogenasedeficiency(可突变成乳酸脱氢酶缺乏的血清型c变异链球菌).J.Dent.Res.64:1267-71(1985)。
变异链球菌的缺乏LDH的菌株可使用,例如,化学或物理诱变技术得自于变异链球菌。使用这些技术进行诱变的菌株被认为是遗传学上改造的菌株。例如,可使变异链球菌株经受诱变因素如亚硝酸、甲酸、硫酸氢钠、紫外线、碱基类似物诱变剂包括例如5-溴-脱氧尿苷(5BU)、烷化剂(alkylator)例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG、NG、MNNG)。参见,例如InVitroMutagenesisProtocols(体外诱变方案),Braman,Ed.,HumanaPress,2002。
天然发生的、自发的缺乏LDH的变异链球菌株可使用,例如,Hillman,LactatedehydrogenasemutantsofStreptococcusmutans:isolationandpreliminarycharacterization(变异链球菌的乳酸脱氢酶突变型:分离和初步表征).Infect.Immun.21:206-212(1978)中公开的方法制备。自发的缺乏LDH的突变型以约10-5频率的速率出现。参见Johnson等,CariogenicpotentialinvitroinmanandinvivointheratoflactatedehydrogenasemutantsofStreptococcusmutans(变异链球菌乳酸脱氢酶突变型在人体外和大鼠体内的生龋齿潜能).Arch.OralBiol.25:707-713(1980)。
天然发生的、自发的缺乏LDH的变异链球菌株可通过将细菌于葡萄糖四氮唑鎓培养基上平板培养而从产LDH的变异链球菌株区分。缺乏LDH的变异链球菌菌落将为鲜红色且在尺寸上比亲株菌落相对较大,该亲株在葡萄糖四氮唑鎓培养基上为白色并且在尺寸上相对较小。天然发生的、自发的缺乏LDH的变异链球菌株可用于本发明的组合物。
鼠链球菌的缺乏LDH的菌株已被分离。简要地讲,鼠链球菌BHT-2的培养物在ToddHewitt肉汤中过夜生长至饱和,然后将稀释的样品分散于葡萄糖四氮唑鎓培养基上以产生约300个菌落每板。野生型、产酸菌落在此培养基上为白色。缺乏LDH的突变型为鲜红色。鼠链球菌JH145为在筛选的大约100,000个白色菌落中的一个红色菌落。因此鼠链球菌JH145为天然发生的,缺乏LDH的突变型。
变异链球菌的缺乏LDH的菌株(例如鼠链球菌BHT-2的缺乏LDH的突变型)在存在葡萄糖和其他糖或多元醇情况下培养时产生较少的总的可滴定酸、在休眠和生长培养的情况在葡萄糖存在下培养时产生明显较少的乳酸、更好地粘附于羟磷灰石(hydroxyapitite)并在存在蔗糖情况下生长时累积更多的菌斑。LDH活性可如Brown&Wittenberger(J.Bacteriol.110:604,1972)描述的进行分析。
终端pH可通过在含1%葡萄糖的ToddHewitt肉汤中传代培养菌株(1:100)来测定。37℃在烛罐中培养48小时后,可测定培养物580nm的吸光度和其pH。培养物的乳酸浓度可通过气液色谱进行测定。参见Salanitro&Muirhead,Quantitativemethodforthegaschromatographicanalysisofshort-chainmonocarboxylicanddicarboxylicacidsinfermentationmedia(发酵介质中短链一元羧酸和二元羧酸气相色谱分析的定量方法).Appl.Microbiol.29:374-381(1975);Hillman等,Acetoinproductionbywild-typestrainsandalactatedehydrogenase-deficientmutantofStreptococcusmutans(变异链球菌野生型菌株和乳酸脱氢酶缺乏的突变体的乙偶姻的生成).Infect.Immun.55:1399-1402(1987)。此外,任何本领域技术人员已知的基因改造技术可用于从产LDH的变异链球菌亲株制造缺乏LDH的变异链球菌株。例如,LDH基因或LDH基因的部分可被删除或诱变处理,包括,例如,插入诱变技术。其他诱变技术包括,例如,同源重组、循环序列重组、寡核苷酸定向诱变、位点定向诱变、易错PCR、硫代磷酸酯(phosphothioate)修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失宿主株诱变、放射产生的诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、位点饱和诱变、总体诱变、循环总体诱变和嵌合核酸产生。因此,任何使LDH基因失效的基因改造技术均可用于生产缺乏LDH的变异链球菌株。本发明的一个实施方案中,缺乏LDH的菌株,不论是天然发生的还是基因改造的突变型,具有小于10-7的回复频率并产生小于约10%亲代水平的乳酸脱氢酶活性。
使用两种或多种不同的菌种可提供相对于使用单一菌种的优势。这是因为不同的菌种群集于牙齿的不同表面或部分。所以,使用超过一种细菌可用于“覆盖”牙齿的所有或大多数的表面,反之,仅使用一种细菌可导致牙齿的某些表面或部分未被群集。所以,牙齿的所有表面都暴露于增白作用下。
本发明的组合物还可包含可被所述一种或多种分离的、非致病的、产过氧化氢的菌种或菌株或所述一种或多种缺乏乳酸脱氢酶的变异链球菌种或菌株或该两种类型的菌种或菌株代谢的一种或多种碳源。碳源包括,但不限于,例如,葡萄糖、山梨醇、甘露醇、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘油或其组合。
本发明的组合物可包含药学可接受的或营养学可接受的载体。该载体与被给药的受试者的口腔生理学相容。载体可由基于固体的、干材料组成以形成片剂、胶囊、锭剂或粉末形式。载体还可由液体或基于胶的材料组成以形成液体、凝胶和口香糖形式。合适的液体或基于凝胶的载体包括但不限于:水、生理盐水、尿素、醇及其衍生物和二醇(例如乙二醇或丙二醇)。该载体的组成可进行变化,只要它不会明显妨碍本发明菌株的治疗活性。
组合物可被配置以便适合以多种方式口部给药,例如以固体、半固体、液体(包括,例如黏性液体、膏、凝胶或溶液)、干物质、牙粉、漱口液、口部冲洗剂、液体悬液、局部剂、粉末食物补充物、膏、凝胶、固体食物、口部清洗剂、包装食物、晶片、锭剂、口香糖等形式给予。其他配方对于本领域任何技术人员将是显而易见的。本发明的组合物可包含营养补充组分且可包含多种营养剂的任一种,如所公知的,包括维生素、矿物质、必需和非必需氨基酸、糖类、脂质、食品、食品补充剂等。
本发明的组合物还可包含天然的或合成的增香剂和食品质量着色剂,其全部与维持本发明的菌种或菌株生存力相容。
本发明的组合物可包含一种或多种胶凝剂,该胶凝剂可作为粘合剂以使该组合物附着于牙齿上。该胶凝剂的浓度可为大于该组合物重量的约2、4、6、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80百分比或小于该组合物重量的约80、70、60、50、40、30或20百分比。
用于本发明的合适的胶凝剂和粘合剂包括,例如,硅氧烷、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚烷基乙烯醚-马来酸共聚物(PVM/MA共聚物)例如,GantrezAN119、AN139和S-97、聚乙烯醇、聚丙烯酸、泊洛沙姆(Poloxamer)407(聚氧丙烯(Pluronic))、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(PVP/VA共聚物),例如LuviskolVA和PlasdoneSPVP/VA、聚乙烯吡咯烷酮(PVP,例如K-15至K-120)、聚季铵盐-11(Polyquaterium-11)(Gafquat755N)、聚季铵盐-39(Polyquaterium-39)(Merquat加3330)、卡波姆(carbomer)或羧基聚亚甲基(卡巴普(Carbopol))、羟基丙基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、玉米淀粉、羧甲基纤维素、明胶和藻酸盐例如藻酸钠、天然胶例如刺梧桐树胶、黄原胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、黄芪胶及其混合物。
本发明的组合物中可存在湿润剂或增塑剂。湿润剂或增塑剂包括,例如,甘油(glycerin)、甘油(glycerol)、山梨醇、聚乙二醇、丙二醇及其他可食用的多元醇。该湿润剂或增塑剂可以以组合物重量的约1%至约99%之间、约10%至约95%之间或约50%和约80%之间(或在1%和99%之间的任何范围)存在。
本发明的细菌可以在,例如,发酵罐中制备。该细菌可从发酵罐中收获且可被,例如,浓缩。本发明的细菌可通过,例如,脱水或喷雾干燥制备以供使用。喷雾干燥通常包括在容器中及在热空气蒸汽条件喷洒细菌悬液。细菌还可通过微囊化(参见例如,美国专利第6,251,478号)、冷冻干燥或通过涂以保护物质(例如脂质物质,如三酰甘油、蜡、有机酯、大豆油、棉籽油、棕榈仁油和长链脂肪酸和醇的酯)制备来使用。
增白牙齿的方法
本发明提供了传送向口腔表面提供一种或多种口部护理益处(包括牙齿增白)的组合物的方法,所述方法包括向受试者的牙齿和/或邻近的软组织施用本发明的组合物。
所述菌种或菌株可以以治疗有效量存在于本发明的组合物中。治疗有效指有效地减轻、减少、预防和/或改善一种或多种龋齿、牙周炎、细菌感染或疾病、口部创伤、念珠菌或真菌过度生长、口臭或口干燥引起的龋齿或牙周疾病的症状或永久地或临时地减轻、减少、预防或改善在牙齿上的着色或变色。治疗有效也指有效地促进口腔中创伤愈合。
治疗有效量为本发明的组合物以足够高的水平明显地改善要被预防和/或治疗的状况,但以足够低的水平避免严重的副作用(以合理的收益/风险比)的量,其在内科/牙科合理的判断范围内。本发明的组合物的治疗有效量可随待治疗的特定状况、待治疗的患者的年龄和身体状况、该状况的严重程度、治疗的持续时间、共同治疗的性质、使用的源的具体形式和施用该组合物的特定载体而变化。
本发明的组合物可以以治疗有效量施用于口腔的粘膜组织、口腔的齿龈组织、牙齿表面和/或其任何组合以治疗和/或预防着色和/或变色的牙齿。本发明的组合物可被吞咽或可在口腔周围漱洗并被吐出。治疗是指引起牙齿上变色或着色的量或强度的减少。预防是指,例如,在治疗期间,临时地(治疗后一段时间)或长期地在牙齿上基本没有额外的着色或变色形成。本发明的一个实施方案中,组合物被单独施用于牙齿表面(并任选施用于直接包围该牙齿的软组织),排除口腔中其他组织。这可通过,例如,直接将本发明的组合物直接抹至牙齿表面或通过用,例如,隔离层使本发明的组合物保持在牙齿上的适当位置来实现。
VITA3DMasterTMShadeGuide提供了一系列牙齿色调(shade),从非常亮至非常暗变化。总共有29种牙齿色调构成了在亮度范围内这两个端点之间的整个色彩范围。本发明的一个实施方案中,本发明的方法提供了约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多的(或在1和29之间的任何值或范围)VITA3DMasterTM亮度色调的变化。
本发明的菌株可形成至少部分的口腔暂住菌群或土著菌群并表现出其他有益的在口腔中的预防和/或治疗效果。本发明的组合物的其他口部护理益处包括,例如,治疗和/或预防受试者中的龋齿、牙周炎(包括,例如早发型牙周炎、局部的和全面的青少年牙周炎和快速进行性的和成人牙周炎)、口部细菌感染和疾病、口部创伤、念珠菌或真菌过度生长、口臭或口干燥引起的龋齿、促进创伤愈合或其组合。治疗是指这些疾病/状况的一种或多种症状被长期地或临时地减轻、减少或改善。
本发明的一个实施方案中,本发明的组合物可结合隔离层被施用于受试者的牙齿,以使该组合物保持与牙齿和周围的口部组织接触。隔离层可为固体或为可变形的且能保持本发明的组合物与牙齿的舌面、脸部面、咬合面和/或切面接触。隔离层可包含定制的或非定制的牙齿处理托盘,该托盘包括限定U形或L形槽的至少一个或两个侧壁和底壁。本发明的组合物存在于该隔离的槽区域且该隔离可以挨着牙齿放置以使本发明的组合物与牙齿接触。
或者,该隔离层可包含柔性的材料条。该材料条可包含任何材料,包括,例如一种或多种聚合物、聚合的膜、蜡、泡沫、天然的和合成的织造材料、非织造材料、箔、纸、橡胶及其组合。该材料条可为单一层的材料或包含多于一层的层压材料。例如,该材料条可包含两个或多个聚合膜的层压材料或可包含蜡和非织造材料。
该材料条可具有覆盖多颗牙齿的脸部面、咬合面、切面、咬合面和/或舌面和/或邻近该多颗牙齿的脸部面、切面、咬合面和/或舌面的一些软组织的任何形状和尺寸。
该材料条可被通过由本发明的组合物或施用于、涂覆于该材料条或与该材料条混合的任何其他组合物提供的粘合剂附着保持在口部表面上的适当位置。或者,该材料条可被通过来自使该材料条在牙齿的脸部面、切面、咬合面和/或舌面周围变形的机械压力而保持在适当位置。该材料条可为可溶的或易蚀的。该材料条溶解或腐蚀之后,本发明的组合物可被留在牙齿的脸部面、咬合面、切面和/或舌面和/或软组织表面以继续作用于那些表面。
组合物可被给予至受试者(例如动物,包括哺乳动物例如人、非人灵长类动物、狗、猫、大鼠、小鼠、马、山羊或兔)的口腔。
本发明的组合物可以在例如,食物、水、牙粉、凝胶、膏、乳液、气溶胶喷涂物、口香糖、锭剂、片剂、胶囊或液体悬液中经口给予。所述细菌可以事先配制入食物、水、凝胶或其他载体中或可为组合物,该组合物由使用者在使用之前添加至载体中。
本发明的一个实施方案提供了使治疗有效的细菌非持久地群集于受试者口腔的方法,所述方法包括将本发明的组合物给予受试者的口腔。本发明的一个实施方案中,给予的菌株不会长期地群集于口腔,而是在给予该细菌之后该菌株存在于口腔中约1天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约3个月或约12个月。
本发明的组合物可以以约1x103、1x105、1x107、1x109或1x1011CFU(或在约1x103和约1x1011之间的任何范围或值)的活细菌剂量给予。本发明的组合物的剂量可以以每天三次、每天两次、每天一次、隔天一次、每周两次、每周一次、两周一次或每月一次给予。可每天给予一、二或多剂量的本发明的组合物,持续约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约一年或更长时间。
本发明的组合物可每天使用,作为口部护理方案一部分。将本发明的组合物用作日常口部护理方案一部分,使得使用者能实现并维持多种需要的口部护理益处,包括但不限于白的、无牙垢的牙齿。
可将本发明的组合物施用于牙齿和/或软组织约1分钟至约8小时。某些实施方案中,该组合物可施用超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450、480分钟(或在约1和约480分钟之间的任何范围或值)和/或少于480、450、420、390、360、330、300、270、240、210、180、150、120、90、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟(或在约480和约1分钟之间的任何范围或值)及其任何组合,其中所述菌种或菌株具有该组合物重量的约0.01%和约50%之间或约0.1%至约25%或约1.0%至约10%或在0.01%和50%之间的任何范围或值的浓度。此方案可有利地每天使用一次,使用超过约一个月、两个月、四个月、六个月、十二个月、十八个月、两年、五年、八年、十年和/或少于约十五年、十年、八年、五年、两年、18个月、12个月、六个月、四个月、两个月、一个月及其任何组合。另一实施方案中此方案可有利地每天使用一次或两次,使用超过约一个月且少于约5年。
本发明的试剂盒可包含一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或12个月的本发明组合物的供应量。本发明的组合物可被包装且进而多数包装的组合物可在储存容器或外部包装或纸盒中供应。
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此外,本发明的特征和方面按照马库什组或其他可选的组合的方式描述时,本领域技术人员将认识到本发明还借此按照马库什组或其他组的任何个体成员或成员的子群描述。
实施例
天然的绿色链球菌株口腔链球菌(KJ3sm)和乳房链球菌(KJ2sm)可通过产生抑制牙周病原体生长的过氧化氢促进牙周健康。当在糖,例如葡萄糖或蔗糖的存在下培养这些微生物,且在大气中有氧存在时,过氧化氢的产生为糖酵解的正常终端产物。
将着色的牙科陶瓷材料(着色的牙釉质的代表)用口腔链球菌的悬液处理以测定是否口腔链球菌能促进牙齿增白。因此,口腔链球菌的悬液在葡萄糖和氧存在下体外培养,以确定它是否可产生足够的过氧化氢来实现对于着色的类似于牙齿的陶瓷盘的可测量的增白效果。
十个牙科陶瓷盘(Dr.KennethJ.Anusavice的惠赠,UniversityofFlorida,Gainesville,FL)用茶(Lipton)和氯己定(0.12%,HiTechPhamacalCo.,Amityville,NY)着色八周时间。将每个盘置于50ml锥形(Falcon)塑料试验管中。加入3ml调制的Lipton茶(将家庭型Lipton茶包加入200ml沸水中5min以制备)以覆盖这些盘。在室温孵育24小时后,通过滗析将茶去除,将该盘用5ml自来水漂洗,然后将茶溶液用3ml0.12%氯己定替换,持续24小时。重复步骤2和3,进行4周,周一至周五,且该盘保持在周五的溶液中经过周末。使用AChromaMeterCR-400色度计(Minolta,Ramsey,NJ)定量测量该盘的亮度。该盘的亮度值通过将该设备的测量头置于盘上直接产生。使用标准显色板校准色度计。
处理阶段在得到最终色度计读数一天后开始。九份从起子板(starterplate)接种的口腔链球菌株KJ3sm的单独培养物,在30ml补充0.1%碳酸氢钠/0.5%葡萄糖/1mg/ml硫酸链霉素的ToddHewitt肉汤(Difco;BactoCatalogNo.249240)中,在环境摇床(200rpm)中于37℃生长。过夜培养后,在室温离心收集细胞,用10mlAmies培养基洗一次,然后重悬于30ml含有或不含右旋糖(葡萄糖;FisherScientific,CatalogNo.D16)和过氧化氢酶(SigmaAldrichCatalogNo.C93225G)的Amies培养基中,如表1所示。对照(组D)包含30ml有右旋糖和钝化的过氧化氢酶的Amies培养基。在指明时,过氧化氢酶通过在沸水浴中加热5分钟钝化。将步骤2和图1描述的整个30ml部分加入至每管包含1个着色的牙科陶瓷盘的50mlFalcon管中。这些处理步骤每天重复,持续4周,周一至周五,且该盘保持于周五的溶液中经过周末。
表1
1实验的
2过氧化氢酶对照
3右旋糖对照
4Amies对照
在处理阶段每周测量每个盘的亮度值,执行该测量四周时间。使用组平均值(±S.D.;图1)将L值(亮度)作为时间的函数绘图。组A数据的趋势线具有2.37的斜率,该值明显大于组B(-0.54)、组C(0.52)和组D(-0.84)的趋势线斜率,这表明组A中的盘以比其他组的盘快得多的速率随时间变得更加光亮或更白。在4周实验期结束时,组A的陶瓷盘的变光亮或增白对于肉眼是显而易见的(图2)。
对组间和组内的L值进行比较以分析统计学显著性差异。进行4(处理:A、B、C、D)×5(时间:0、1、2、3、4周)混合模型重复测量的ANOVA,进行Greenhouse-Geisser校正,测定在不同时间各种处理对于L值的微分影响。后续分析测定每个时间点的处理效果。此后使用Bonferroni校正的t检验以测定这些处理之间的显著差异。所有的分析使用p=.05的族(family-wise)。结果表明处理(F(3,6)=6.0,p<.05)和时间(F(1.3,24)=12.7,p=.005)的显著效果,该效果被处理×时间相互作用(F(4,24)=58.7,p<.001)取代。此相互作用的分解在基线(时间0)和第1周(F(3,6)<4.4,p>.05)产生非显著的结果。在2-4周,处理组A产生比处理B和D明显更大的效果(t(3)>8.1,p<.01),且仅在第4周期间产生比处理C明显更大的效果(t(2)=4.1,p=.015)。在处理B、C和D之间未观察到显著差异(p>.05)。
有葡萄糖和空气存在时培养的口腔链球菌在将茶和氯己定着色的陶瓷盘暴露于口腔链球菌四周后对该陶瓷盘产生了统计学显著的增白效果。在培养基中包含过氧化氢酶显著减少了任何增白效果,这表明增白的机理涉及由细胞产生过氧化氢。过氧化物的产生和由此的增白效果,依赖于可代谢的碳源的存在,例如葡萄糖。组C中观察到的少量增白效果可能是由于残留的来自储存的糖类(例如细胞内多糖的形式)代谢的过氧化物的产生。图1中组A的L值作为时间函数的曲线没有达到稳定水平,这表明最大增白效果尚未在本研究的时限内出现,且使用KJ3sm的更长时间的处理将可能实现更强的增白效果。