CN105675735A - 乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法，包括13种差异性代谢物(Aspartate、Glutamate、5-Oxoproline、Cystine、Glutamine、Cysteine、Hypotaurine、Asparagine、Glycerolphosphate、Glycerophosphocholine、Arachidonate、Glyoxylate、Pentosidine)及其组合作为乳腺癌早期发现和诊断的标记物、应用及其诊断标记物测定方法，是基于乳腺癌患者的血浆/血清进行液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。本发明的技术方案的诊断标记物组合具有灵敏度和特异性高的特点，对于早期乳腺癌诊断也具有较高的灵敏度和特异性，可用于乳腺癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高临床治疗效果。

Description

乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。女性乳腺癌患者的长期生存率与疾病发现和被诊断的时间及阶段密切相关，乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键，能大大减少乳腺癌的死亡率。目前使用最广泛的筛查乳腺癌的方法是乳房x光检查,该方法的灵敏度方法为54％-77％。还有其他的方法比如热敏成像法和磁共振成像(MRI)也是常用的方法，但普遍灵敏度不高。因此寻找乳腺癌早期诊断的生物标志物非常重要。现在已经确定的肿瘤标记物包括癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA15-3,CA27.29,CA125)、组织多肽抗原和组织多肽特异性抗原等，但这些标记物由于敏感性和(或)特异性较低无法被推荐用于临床乳腺癌的诊断，因而急需找到一种替代的方法。最近有关乳腺癌方面的代谢组学研究，通过研究癌症患者和健康人的血浆/血清，尿液，唾液或者组织等样本进行分析测试，寻找癌症诊断标记物。然而到目前为止，尚未有关于诊断标志物对于乳腺癌区别于乳腺病以及其他恶性肿瘤的选择性评价报道。

专利CN101493464公开了一种诊断乳腺癌的分子标记物，检测乳房正常周边组织与包块组织中的硫氧还蛋白(THIOREDOXIN，TRX)和硫氧还蛋白结合蛋2(TRX-BINDINGPROTEIN-2，TBP-2)的表达。采用蛋白免疫印迹实验检测硫氧还蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白2的表达量，在乳腺包块组织中硫氧还蛋白表达增高和硫氧还蛋白结合蛋白2表达降低，由于与正常乳腺组织存在显著的差别，硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2可以作为乳腺癌新的分子标记物，可用作为对乳腺癌临床诊断。但该专利具有疾病早期灵敏度较低及对疾病早期检测精度低的缺点。

专利CN103109187A公开了一种用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标记物。具体地，本发明涉及用于受试者对癌症治疗的反应的预测的组合物和方法。其包括a)检测来自患有乳腺癌的受试者的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)水平；b)基于所述样品中的所述CTC水平来确定作用疗程。但该专利也具有疾病早期灵敏度较低及对疾病早期检测精度低的缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法。

为达到上述目的，具体技术方案如下：

一方面，提供了一种乳腺癌诊断标记物组合，为血浆或血清差异性代谢物，包括Aspartate(天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate(谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-Oxoproline(焦谷氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Aminoacetone(氨基丙酮/丙酮基胺)、Delta-hydroxylysine(异羟赖氨酸)、Cystine(胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine(谷氨酰胺)、Cysteine(半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine(亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine(天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate(甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine(甘油磷酸胆碱)、Arachidonate(花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、nicotinurate(烟尿酸)、Octadecanoate(十八酸盐/硬脂酸盐)、Choline(胆碱)、Myristoleate(十四碳烯酸酯)、Butyrylcarnitine(丁酰基肉碱)、Propionylcarnitine(丙酰肉碱)、α-ketoglutarate(α-酮戊二酸脱氢酶)、Lactate(乳酸)、Malate(苹果酸盐(或酯))、Glyoxylate(乙醛酸)、Pentosidine(戊糖素)、Uracil(尿嘧啶/二氧嘧啶)、Quinate(奎尼酸)、Epinephrineglucuronide(肾上腺素葡(萄)糖苷酸)中的一种或多种的组合。

优选的，所述标记物包括Aspartate(天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate(谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-Oxoproline(焦谷氨酸)、Cystine(胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine(谷氨酰胺)、Cysteine(半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine(亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine(天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate(甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine(甘油磷酸胆碱)、Arachidonate(花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、Glyoxylate(乙醛酸)、Pentosidine(戊糖素)中的一种或多种的组合。

另一方面，提供了乳腺癌诊断标记物组合的应用，用于诊断乳腺癌的试剂盒。

优选的，诊断标记物的诊断样品是血浆或血清。

另一方面，提供了乳腺癌诊断标记物组合的测定方法，包括以下步骤：

步骤1，取乳腺癌病人临床血浆或者血清样本和健康人对照血浆或者血清样本；

步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法分析鉴定乳腺癌病人临床血浆/血清样本和健康人对照血浆/血清样本的初步差异性代谢物；

步骤3，在多维OPLS-DA模型的变量权重(VIP)值大于1及非参检验的P值小于0.05的选择标准下，得到进一步差异性代谢物；

步骤4，进行逻辑回归模型进行验证，得到差异性代谢物。

优选的，所述步骤1中包括不同地区的乳腺癌病人临床血浆/血清样本和健康人对照血浆/血清样本。

优选的，所述步骤1中包括乳腺癌患者、乳腺疾病患者、良性乳腺肿瘤患者和健康人对照血浆或者血清样本。

优选的，所述步骤2中的色谱质谱联用代谢组学分析方法包括液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。

优选的，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Rxi-5ms毛细管柱，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1uL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续2min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续8min，质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。

优选的，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱(4.6×150mm,5μm)，柱温：30℃。流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈(0.1％甲酸，)，流动相洗脱梯度为0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，进样量：10μL。飞行时间质谱优化条件为：(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325℃，干燥器流速11L/min；(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。在代谢物谱分析时，数据采集形式为plot和centroid同时进行，采集质量范围为50-1000Da。

优选的，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的血清样本前处理包括：取50μL血清，加入10ul氯苯丙氨酸(0.1mg/mL，水溶)和10μL十七酸(1mg/mL，醇溶)作为内标来监测样本的重现性；再加入175μL氯仿甲醇混合溶剂(1:3，v/v)，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀；然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥得到样本品。

优选的，所述步骤2中样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μLBSTFA(含1％TMCS)在70℃反应60min，静置后进行GC-TOFMS分析。

优选的，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的血清样本前处理包括：取50ul血清样本与200ul含氯苯丙氨酸(5ug/mL，水溶)的甲醇乙腈混合液(5:3，v/v)混合，涡旋振荡2min，静置10min后，用13000rpm离心20min，取上清液。

相对于现有技术，本发明的技术方首次提出Aspartate，Glutamate，5-Oxoproline，Cystine，Glutamine，Cysteine，Hypotaurine，Asparagine，Glycerolphosphate，Glycerophosphocholine，Arachidonate，Glyoxylate，Pentosidine作为乳腺癌诊断标记物，对乳腺癌的诊断具有高灵敏度和高特异性，并且对于早期乳腺腺癌诊断也具有较高的灵敏度和特异性，可用于乳腺癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高临床治疗效果。同时通过运用液相色谱质谱联用仪(LC-TOFMS)和气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)对乳腺癌病人及健康人对照血浆或血清进行代谢物全谱分析测试，结合生物信息学工具，寻找差异性代谢物，并通过验证确定其作为乳腺癌的诊断标记物，可以用于乳腺癌的早期发现和诊断，提高乳腺癌治疗效果。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A是训练集中乳腺癌患者(n＝100)和正常对照(n＝80)之间血浆代谢物差异柱形图。其中，变化倍数(FC)值通过计算在乳腺癌患者和健康人对照组中每个代谢物的平均强度比率得到。每一个柱状分别代表一个FC值，不同灰度值对应相应的P值，说明各物质的统计学意义；

图1B是训练集乳腺癌血浆样本的ROC曲线图(包含13个代谢物组合成的代谢物组Aspartate、Glutamate、5-Oxoproline、Cystine、Glutamine、Cysteine、Hypotaurine、Asparagine、Glycerolphosphate、Glycerophosphocholine、Arachidonate、Glyoxylate、Pentosidine)；

图1C是区分乳腺癌患者和健康人对照的PCA得分值的分布图。P值表示该组与正常组之间差异的统计显著性；

图1D是验证集1中乳腺癌患者和健康人对照的血清样本中13种代谢物(Aspartate、Glutamate、5-Oxoproline、Cystine、Glutamine、Cysteine、Hypotaurine、Asparagine、Glycerolphosphate、Glycerophosphocholine、Arachidonate、Glyoxylate、Pentosidine)的ROC曲线图；

图1E是验证集2中乳腺癌患者和健康人对照的血清样本中13种代谢物(Aspartate、Glutamate、5-Oxoproline、Cystine、Glutamine、Cysteine、Hypotaurine、Asparagine、Glycerolphosphate、Glycerophosphocholine、Arachidonate、Glyoxylate、Pentosidine)的ROC曲线图

图2A～2C是建立逻辑回归模型应用ROC曲线评估训练集中一、二期乳腺癌的诊断风险的结果示意图。

图3A是区分乳腺癌患者和乳腺病患者的ROC曲线图(包含13个代谢物组合成的代谢物组Aspartate、Glutamate、5-Oxoproline、Cystine、Glutamine、Cysteine、Hypotaurine、Asparagine、Glycerolphosphate、Glycerophosphocholine、Arachidonate、Glyoxylate、Pentosidine)；

图3B是区分乳腺癌患者和良性乳腺肿瘤患者的ROC曲线图(包含13个代谢物组合成的代谢物组Aspartate、Glutamate、5-Oxoproline、Cystine、Glutamine、Cysteine、Hypotaurine、Asparagine、Glycerolphosphate、Glycerophosphocholine、Arachidonate、Glyoxylate、Pentosidine)；

图4是降维因子分析得到的第一组成分得分在乳腺癌病人、乳腺病病人、良性乳腺肿瘤病人、以及健康人之间的分布图。其中，P表示两组间有显著性差异；其中：A为训练集对照样本、B为训练集乳腺癌病人、C为验证集1对照样本、D为验证集1乳腺癌病人、E为验证集2对照样本、F为验证集2乳腺癌病人，G为验证集2乳腺病病人，H为验证集2良性乳腺肿瘤病人。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下将结合附图对本发明的实施例做具体阐释。

本发明的实施例应用色谱质谱联用技术，检测血清或者血浆样本的代谢物，找到乳腺癌的诊断标记物。具体优选包括：

收集乳腺癌病人及健康人的血浆/血清样本，其中乳腺癌患者280例、乳腺疾病患者30例、良性乳腺肿瘤患者20例、健康人对照180例。样本经处理后通过色谱质谱联用仪检测分析，通过建立多维统计模型可视化地显示乳腺癌病人及健康人对照之间的代谢谱差异，获得差异性代谢物。

本发明的测定方法可以全面、综合地体现乳腺癌病人及健康人之间的代谢产物的变异状况，找到乳腺癌的诊断标记物，为乳腺癌的早期诊断和预后提供有利的技术支持。

一、实验材料和测试方法：

1.血液样本情况

采集空腹血浆/血清样本，其中包括：

(1)训练集

乳腺癌患者临床血浆样本100例，健康人对照血浆样本80例；

(2)验证集1

乳腺癌患者临床血清样本100例，健康人对照血清样本30例；

(3)验证集2

乳腺癌患者临床血清样本80例、健康人对照血清样本70例、其他乳腺疾病患者血清样本30例、乳腺良性肿瘤患者血清样本20例；

2.血清样本前处理：

(1)气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)测试血清样本前处理

取50μL血浆或者血清于1.5mL的离心管中，分别加入10ul氯苯丙氨酸(0.1mg/mL，水溶)和10μL十七酸(1mg/mL，醇溶)作为内标来监测样本的重现性。再加入175μL氯仿甲醇混合溶剂(1:3，v/v)，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀。然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥。样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μLBSTFA(含1％TMCS)在70℃反应60min。反应产物在室温下静置1h后进行GC-TOFMS分析。

(2)液相色谱质谱联用仪(LC-TOFMS)测试血浆或者血清样本前处理

取50ul血清样本与200ul含氯苯丙氨酸(5ug/mL，水溶)的甲醇乙腈混合液(5:3，v/v)混合，涡旋振荡2min，静置10min后，用13,000rpm离心20min，取上清液用于LC-TOFMS分析。

3.分析仪器测试：

(1)气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)测试

GC-TOFMS：LecoPegasusHT气相色谱串联飞行时间质谱(力可公司，美国)，色谱柱：Rxi-5ms毛细管柱(填充5％联二苯/95％二甲基聚硅氧烷,Restek,宾夕法尼亚州,美国)，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1uL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续2min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续8min。质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。数据分析处理使用ChromaTOF软件(v4.33,力可公司，美国)。

(2)液相色谱质谱联用仪(LC-TOFMS)测试

LC-TOFMS:安捷伦超高效液相色谱1200系统(安捷伦公司，美国)，配备二元溶剂控制器和样品控制器。质谱分析采用安捷伦6220MSD型飞行时间质谱仪(安捷伦公司，美国)，配备双电喷雾电离源。利用安捷伦ESI-L低浓度调谐标准品混合液，分别在正离子电喷雾电离模式(ES+)和负离子电喷雾电离模式(ES-)模式将系统调谐至最优的灵敏度和分辨率。色谱柱:AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱(4.6×150mm,5μm)，柱温：30℃。流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈(0.1％甲酸，)，流动相洗脱梯度为0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，进样量：10μL。飞行时间质谱优化条件为：(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325℃，干燥器流速11L/min；(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。在代谢物谱分析时，数据采集形式为plot和centroid同时进行，采集质量范围为50-1000Da。

二、结果：

所有乳腺癌和健康对照样本通过LC-TOFMS和GC-TOFMS进行代谢物全谱分析测试。如图1A中所示，通过多维OPLS-DA模型提供的变量权重VIP值(VIP＞1)及Mann-WhitneyU检验所提供的P值(P＜0.05)的选择标准，从训练集样本中得到用于区分乳腺癌及正常对照的28种差异性代谢物，包括Aspartate(天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate(谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-Oxoproline(焦谷氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Aminoacetone(氨基丙酮/丙酮基胺)、Delta-hydroxylysine(异羟赖氨酸)、Cystine(胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine(谷氨酰胺)、Cysteine(半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine(亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine(天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate(甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine(甘油磷酸胆碱)、Arachidonate(花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、Octadecanoate(十八酸盐/硬脂酸盐)、Choline(胆碱)、Myristoleate(十四碳烯酸酯)、Butyrylcarnitine(丁酰基肉碱)、Propionylcarnitine(丙酰肉碱)、α-ketoglutarate(α-酮戊二酸脱氢酶)、Lactate(乳酸)、Malate(苹果酸盐(或酯))、Glyoxylate(乙醛酸)、Pentosidine(戊糖素)、Uracil(尿嘧啶/二氧嘧啶)、Quinate(奎尼酸)、Epinephrineglucuronide(肾上腺素葡(萄)糖苷酸)。

利用逻辑回归模型进行验证，发现其中的13个代谢物(分别是：Aspartate，Glutamate，5-Oxoproline，Cystine，Glutamine，Cysteine，Hypotaurine，Asparagine，Glycerolphosphate，Glycerophosphocholine，Arachidonate，Glyoxylate和Pentosidine)作为乳腺癌标记物的作用尤为重要。随后应用临床诊断性能曲线(ROC曲线)对肿瘤标记物在乳腺癌血浆/血清样本进行评价。应用ROC曲线得到了满意的结果，对于训练集血浆样本AUC＝0.996,95％置信区间(CIs):0.960-1.000(图1B)，其灵敏度为97.5％，特异度为93.2％。图1C中显示了主成分分析得到第一组成分在乳腺癌病人以及正常对照中的分布图。通过训练集得到的这13个代谢物组对乳腺癌的预测概率参数使用验证集1和2的样本进行验证。用预测的概率来构建ROC曲线，其中验证集1的AUC＝0.890(95％CIs:0.831-0.950)，曲线的灵敏度为93.5％，特异度为92.0％(图1D)。验证集2的AUC＝0.993(95％CIs:0.977-1.000)，曲线的灵敏度为96.9％，特异度为100％(图1E)。而在早期乳腺癌患者(I+II期)和健康人对照的区分上，训练集的AUC＝0.971，验证集1的AUC＝0.992，验证集2的AUC＝0.999(如图2A～2C中所示)。

我们的研究数据也表明这13个代谢物组用于区分80个乳腺癌患者和30个乳腺疾病患者时AUC＝0.887，灵敏度为88.9％，特异度为80.8％(图3A)。而在区分80个乳腺癌患者和20个乳腺良性肿瘤病患者时AUC＝0.906，灵敏度为84.7％，特异度为88.9％(如图3B中所示)。

如图4所示，本实施例的这13种代谢标记物及其组合(Aspartate，Glutamate，5-Oxoproline，Cystine，Glutamine，Cysteine，Hypotaurine，Asparagine，Glycerolphosphate，Glycerophosphocholine，Arachidonate，Glyoxylate和Pentosidine)是很好的乳腺癌及乳腺癌早期诊断标记物，可用于临床诊断中，能提高乳腺癌的早期检出率，改善乳腺癌的临床治疗效果，减轻病人的痛苦，提高临床病人的生存率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (13)

1.一种乳腺癌诊断标记物组合，其特征在于，为血浆或血清差异性代谢物，包括Aspartate(天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate(谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-Oxoproline(焦谷氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Aminoacetone(氨基丙酮/丙酮基胺)、Delta-hydroxylysine(异羟赖氨酸)、Cystine(胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine(谷氨酰胺)、Cysteine(半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine(亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine(天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate(甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine(甘油磷酸胆碱)、Arachidonate(花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、nicotinurate(烟尿酸)、Octadecanoate(十八酸盐/硬脂酸盐)、Choline(胆碱)、Myristoleate(十四碳烯酸酯)、Butyrylcarnitine(丁酰基肉碱)、Propionylcarnitine(丙酰肉碱)、α-ketoglutarate(α-酮戊二酸脱氢酶)、Lactate(乳酸)、Malate(苹果酸盐(或酯))、Glyoxylate(乙醛酸)、Pentosidine(戊糖素)、Uracil(尿嘧啶/二氧嘧啶)、Quinate(奎尼酸)、Epinephrineglucuronide(肾上腺素葡(萄)糖苷酸)中的一种或多种的组合。

2.如权利要求1所述的乳腺癌诊断标记物组合，其特征在于，为血浆或血清差异性代谢物，包括Aspartate(天(门)冬氨酸盐(或酯))、Glutamate(谷氨酸盐/谷氨酸酯)、5-Oxoproline(焦谷氨酸)、Cystine(胱氨酸/双硫丙氨酸)、Glutamine(谷氨酰胺)、Cysteine(半胱氨酸/巯基丙氨酸)、Hypotaurine(亚牛磺酸/氨乙基亚磺酸)、Asparagine(天门冬素/天冬酰胺酸)、Glycerolphosphate(甘油磷酸盐/甘油磷酸酯)、Glycerophosphocholine(甘油磷酸胆碱)、Arachidonate(花生四烯酸酯/花生四烯酸盐)、Glyoxylate(乙醛酸)、Pentosidine(戊糖素)中的一种或多种的组合。

3.如权利要求1或2所述的乳腺癌诊断标记物组合的应用，其特征在于，用于诊断乳腺癌的试剂盒。

4.如权利要求3所述的乳腺癌诊断标记物组合的应用，其特征在于，诊断标记物的诊断样品是血浆或血清。

5.如权利要求1所述的乳腺癌诊断标记物组合的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，取乳腺癌病人临床血浆或者血清样本和健康人对照血浆或者血清样本；

步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法分析鉴定乳腺癌病人临床血浆/血清样本和健康人对照血浆/血清样本的初步差异性代谢物；

步骤3，在多维OPLS-DA模型的变量权重(VIP)值大于1及非参检验的P值小于0.05的选择标准下，得到进一步差异性代谢物；

步骤4，进行逻辑回归模型进行验证，得到差异性代谢物。

6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1中包括不同地区的乳腺癌病人临床血浆/血清样本和健康人对照血浆/血清样本。

7.如权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1中包括乳腺癌患者、乳腺病患者、良性乳腺肿瘤患者和健康人对照血浆或者血清样本。

8.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2中的色谱质谱联用代谢组学分析方法包括液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。

9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Rxi-5ms毛细管柱，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1uL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续2min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续8min，质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。

10.如权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱(4.6×150mm,5μm)，柱温：30℃。流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈(0.1％甲酸，)，流动相洗脱梯度为0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，进样量：10μL。飞行时间质谱优化条件为：(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325℃，干燥器流速11L/min；(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。在代谢物谱分析时，数据采集形式为plot和centroid同时进行，采集质量范围为50-1000Da。

11.如权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的血清样本前处理包括：取50μL血清，加入10ul氯苯丙氨酸(0.1mg/mL，水溶)和10μL十七酸(1mg/mL，醇溶)作为内标来监测样本的重现性；再加入175μL氯仿甲醇混合溶剂(1:3，v/v)，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀；然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥得到样本品。

12.如权利要求11所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2中样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μLBSTFA(含1％TMCS)在70℃反应60min，静置后进行GC-TOFMS分析。

13.如权利要求12所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的血清样本前处理包括：取50ul血清样本与200ul含氯苯丙氨酸(5ug/mL，水溶)的甲醇乙腈混合液(5:3，v/v)混合，涡旋振荡2min，静置10min后，用13000rpm离心20min，取上清液。