CN105671111A - 一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于该制备方法的具体步骤包括小球藻养殖筛选和锌、铜诱导胁迫培养及分离纯化等步骤。该制备方法制得的金属硫蛋白纯度更高，可吸附水体中的重金属离子，减少了对环境的污染，环境友好，更能满足保健、化工行业的生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及金属硫蛋白的制备方法，特别是涉及一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。
背景技术
1957年，美国科学家Margoshoes在研究金属生物学作用时，从动物器官中分离出镉的金属蛋白质。由于它是一种低分子量、高巯基含量，能大量结合重金属离子，因此称为金属硫蛋白MT。金属硫蛋白MT可应用于包括医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业等实验用品，前景十分广阔。
第一代MT制备是以兔为受体，通过免疫诱导获取MT，产率低，成本高；第二代MT制备原料以猪为主，金属硫蛋白产率比兔提升了2-3倍，但还是远远不能满足需要，且占用场地大，污染严重等问题比较突出。寻求新的替代原料，实现经济、社会和环境效益的统一，势在必行。
目前国内外主要是通过以下方法来制备金属硫蛋白：(1)以硫酸锌诱导动物，以其肝组织为原料进行MTs提取，这种方法的优点在于利用人体所需的微量元素Zn，但其生产成本昂贵；(2)通过重金属诱导微生物获得MTs，利用第二种方法获得的类金属硫蛋白成本比动物诱导(即第一种方法)的要低，但由于培养基物质复杂，操作难度高。
海洋微藻个体较小，光合速率高，具有丰富的生物多样性，在自然海域中随处可见。全球海洋的总初级生产力绝大部分由海洋浮游微藻产生，因此海洋微藻又被誉为“海洋牧草”。海洋微藻代谢产物丰富多样，能够通过生物转化或后加工形成多种形式的生物产品。海洋微藻养殖不与人争粮，不与粮争地，是实现可持续发展及经济、社会和环境效益统一的最佳选择之一。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。该制备方法包括小球藻养殖筛选、金属离子诱导以及分离提纯。通过该方法制得的金属硫蛋白纯度更高，可吸附水体中的重金属离子，减少了对环境的污染，环境友好，更能满足保健、化工行业的生产需求。
本发明解决所述技术问题的技术方案是，提供一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征是该制备方法的具体步骤是：
(1)将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h；然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次；
(2)利用0.03～0.1mol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的步骤(1)中的小球藻，培养24-120h；
(3)利用0.03～0.1mol/L的CuCl2诱导处于步骤(2)处理后的小球藻，培养24-120h；
(4)根据步骤(2)和步骤(3)确定的最佳ZnCl2和CuCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，分离藻细胞，按藻细胞干重和pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液以1:10～15(w/v)的比例混合，混匀后进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液；
(5)上清液过层析柱G-75，收集类金属硫蛋白粗提物；
(6)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到基于小球藻的金属硫蛋白制品。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用自养-异养交替方式培养小球藻，使小球藻的繁殖速率较其他培养方式高30％以上，且该方式培养的小球藻中叶绿素、类胡萝卜素以及蛋白含量均高于单一方式培养的小球藻；采用锌、铜交替胁迫诱导制备金属硫蛋白，得到金属硫蛋白的产率高达10g/250kg；同时纯化后可得到更高纯度的金属硫蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明基于小球藻的金属硫蛋白制备方法(简称制备方法)，其特征在于该制备方法的具体步骤是：
(1)将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h；然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次；
(2)利用0.03～0.1mol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的步骤(1)中的小球藻，培养24-120h；
(3)利用0.03～0.1mol/L的CuCl2诱导处于步骤(2)处理后的小球藻，培养24-120h；
(4)根据步骤(2)和步骤(3)确定的最佳ZnCl2和CuCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，分离藻细胞，按藻细胞干重和pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液以1:10～15(w/v)的比例混合，混匀后进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液；
(5)上清液过层析柱G-75，收集类金属硫蛋白粗提物；
(6)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到基于小球藻的金属硫蛋白制品。
本发明制备方法的进一步特征在于所述最佳ZnCl2胁迫浓度为0.05-0.06mol/L和最佳诱导时间为70-80h。
本发明制备方法的进一步特征在于所述最佳CuCl2胁迫浓度为0.04-0.05mol/L和最佳诱导时间为80-90h。
本发明采用自养-异养交替方式培养小球藻，使小球藻的繁殖速率较其他培养方式高30％以上，且该方式培养的小球藻中叶绿素、类胡萝卜素以及蛋白含量均高于单一方式培养的小球藻；采用锌、铜交替胁迫诱导制备金属硫蛋白，得到金属硫蛋白的产率高达10g/250kg；同时通过层析纯化后可得到更高纯度的金属硫蛋白。
本发明采用海洋小球藻代替动物细胞作为诱导产生金属硫蛋白的基质，小球藻既可以降解去除有机污染物和铵氮等含氮化合物，同时可以吸附去除水中的重金属，这在废水处理和保证水生生态系统的平衡与稳定方面都可以作为一种非常好的生物材料发挥重要作用。提取金属硫蛋白后的小球藻，可正常供饲料、保健品等行业所用，无废弃污染物，减少了动物细胞提取硫蛋白后对环境造成的污染。
实施例1
本实施例中本发明制备方法的具体步骤是：
1)将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h；重复此步骤3-10次；
2)在步骤1)中处于对数生长期的小球藻藻液中加入0.05mol/L氯化锌，控制锌在藻液中的最终浓度为5-100μmol/L范围内，继续培养小球藻24-120h，培养过程中每天定时手工摇瓶5次，每次约3min。取培养组小球藻藻液各100mL，经10000r/min离心，收集藻细胞，分别用5mmol/LEDTA-2Na和超纯水清洗藻细胞2次，加入10mmol/LTris-HCl缓冲液5mL，冰浴下超声波破碎藻细胞5min，经12000r/min离心10min，收集上清液。
3)将步骤2)中处理后的小球藻藻液中加入0.05mol/L氯化铜，控制铜在藻液中的最终浓度为5-100μmol/L范围内，继续培养小球藻24-120h，培养过程中每天定时手工摇瓶5次，每次约3min。取培养组小球藻藻液各100mL，经10000r/min离心，收集藻细胞，分别用5mmol/LEDTA-2Na和超纯水清洗藻细胞2次，加入10mmol/LTris-HCl缓冲液5mL，冰浴下超声波破碎藻细胞5min，经12000r/min离心10min，收集上清液。
4)利用TSK-gel凝胶色谱柱(G3000PWxl,7.8mmi.d.×300mm,6μm)进行色谱分离，以10mmol/LTris-HCl缓冲液为流动相，洗脱液经电感耦合等离子体质谱在线检测锌和铜信号强度，以锌和铜信号为纵坐标、保留时间为横坐标作色谱流出曲线图，通过锌信号峰、铜信号峰与对应蛋白质分子量确定小球藻锌、铜结合类金属硫蛋白峰在色谱曲线上的位置。获得不同锌、铜胁迫浓度和不同诱导时间小球藻锌结合类金属硫蛋白的诱导量，以确定锌、铜胁迫的浓度和胁迫时间。
5)在确定的培养条件下大量培养小球藻，离心收集藻细胞后，分别用5mmol/LEDTA-2Na和超纯水清洗藻细胞2次，以除去细胞壁吸附的锌。按藻泥重量和提取液体积1:10(w/v)的比例加入内含1％二硫苏糖醇、pH为7.8的10mmol/LTris-HCl，冰浴下采用间歇式超声波破碎藻细胞，破碎过程用显微镜检查直至细胞破碎完全。然后经12000r/min离心10min，收集上清液。
6)将上清液注入凝胶层析柱G-75(φ3.0×80cm)，以pH为7.8的10mmol/LTris-HCl为洗脱液，以固定每10min连续收集经G-75分离的洗脱液，检测每一收集管洗脱液在254nm的吸光度值、锌信号值和铜信号值，以收集管序号为横坐标、以254nm、锌信号值和铜信号值为纵坐标作图。可得到两个组分峰，第一个峰的254nm吸光度值高而锌和铜的信号值低，第二个峰的254nm吸光度值低而锌和铜的信号值高，因此第二个峰对应的组分即为基于小球藻的金属硫蛋白的目标物，收集过程中通入惰性气体，如氮气或氩气，以防止样品被氧化。
7)将G-75收集组分经真空冷冻干燥后，复溶于超纯水中，过G-25脱盐柱(φ1.5×30cm)，用纯水脱盐纯化，收集锌和铜结合蛋白质组分并经真空冷冻干燥即得到高纯度的基于小球藻的金属硫蛋白制品。
实施例2
本实施例中本发明制备方法的具体步骤是：
1)将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h；重复此步骤7-10次；
2)在步骤1)中处于对数生长期的小球藻藻液中加入0.05mol/L氯化锌，控制锌在藻液中的最终浓度为5-100μmol/L范围内，继续培养小球藻70-80h，培养过程中每天定时手工摇瓶5次，每次约3min。取培养组小球藻藻液各100mL，经10000r/min离心，收集藻细胞，分别用5mmol/LEDTA-2Na和超纯水清洗藻细胞2次，加入10mmol/LTris-HCl缓冲液5mL，冰浴下超声波破碎藻细胞5min，经12000r/min离心10min，收集上清液。
3)将步骤2)中处理后的小球藻藻液中加入0.04mol/L氯化铜，控制铜在藻液中的最终浓度为5-100μmol/L范围内，继续培养小球藻80-90h，培养过程中每天定时手工摇瓶5次，每次约3min。取培养组小球藻藻液各100mL，经10000r/min离心，收集藻细胞，分别用5mmol/LEDTA-2Na和超纯水清洗藻细胞2次，加入10mmol/LTris-HCl缓冲液5mL，冰浴下超声波破碎藻细胞5min，经12000r/min离心10min，收集上清液。
4)同实施例1中的步骤4)-7)。
通过本发明制备方法确定小球藻制备金属硫蛋白最佳工艺，可显著降低金属硫蛋白的生产成本(＞25％)，且金属硫蛋白的产出率达到10g/250kg，此产率均高于国内外其他方式胁迫诱导制备金属硫蛋白的产率，且本发明方法无污染、原料可循环使用，最终实现绿色化学的要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于该制备方法的具体步骤是：
(1)将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h；然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次；
(2)利用0.03～0.1mol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的步骤(1)中的小球藻，培养24-120h；
(3)利用0.03～0.1mol/L的CuCl2诱导处于步骤(2)处理后的小球藻，培养24-120h；
(4)根据步骤(2)和步骤(3)确定的最佳ZnCl2和CuCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，分离藻细胞，按藻细胞干重和pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液以1:10～15(w/v)的比例混合，混匀后进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液；
(5)上清液过层析柱G-75，收集类金属硫蛋白粗提物；
(6)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到基于小球藻的金属硫蛋白制品。
2.如权利要求1所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于所述最佳ZnCl2胁迫浓度为0.05-0.06mol/L和最佳诱导时间为70-80h。
3.如权利要求1所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于所述最佳CuCl2胁迫浓度为0.04-0.05mol/L和最佳诱导时间为80-90h。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李连平等: "小球藻锌结合类金属硫蛋白的提取和分离", 《食品与发酵工业》 * |
| 杨洪等: "锌胁迫对小球藻抗氧化酶和类金属硫蛋白的影响", 《生态学报》 * |
| 毛莹等: "铜、锌离子影响丹参金属硫蛋白MT2基因表达", 《分子植物育种》 * |
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